CN107624137A - 用于表征分子对微生物的抑制能力的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
用于确定定量分子对某类型微生物的抑制能力的量Ginhib的方法包括：‑制备(50)多个样品，其包含所述类型的微生物、用于所述微生物的营养培养基和初始量的所述分子每微生物，所述初始量作为样品分类的函数在[Qmin,Qmax]的范围内增加；‑测量(50)作为时间的函数的所述样品中所述微生物的生长；和‑确定(52)作为生长的测量的函数的量Ginhib确定(52)所述量Ginhib包括：‑对于每个样品，基于对生长的测量来计算(66)反映所述类型微生物的生长的值；‑将对于所述样品所计算的值作为所述样品分类的函数来分类(68)；和‑确定(70)作为所分类的值的变化的函数的量Ginhib。
Description
发明领域
本发明涉及分析分子对微生物生长的抑制能力、以及特别是抗生素对于细菌生长的抑制能力和抗真菌剂对酵母或霉菌的抑制能力的领域。
现有技术
抗生素对细菌的活性特别是通过"最低抑制浓度"或MIC来表征的，其定义为抗生素与细菌群混合以完全抑制其增殖的最低浓度。
用于测量MIC的第一个技术，对于实验室技术员来说由以下组成：制备若干包含初始浓度的细菌的透明壁管(所述浓度对所有管都是相同的)、用于所述细菌的营养培养基、和初始浓度(作为架中所述管安排次序的函数而增加)的抗生素。一旦已经制备了具有抗生素浓度梯度的管，技术员继而将所述管放置在温育箱。如果管内抗生素的浓度过低而不能抑制细菌的生长，该管中会出现浑浊，而浑浊会随着细菌群的增加而变得更大。在给定的温育时间之后，实验室技术员继而通过视觉检查所述管并将MIC鉴定为等于不显示任何浑浊的管中最低的抗生素浓度。很容易意识到此种方法不精确的性质。不仅仅是制备的管的数目很少(通常少于10个，其不会给出MIC高度的准确性)，另外还有对MIC的鉴定依赖于技术员对管中存在或缺乏浑浊的判断。
因此已经开发了装置和方法以用于提高样品中抗生素浓度的准确性以及样品中细菌生长检测的鲁棒性。更具体地，装置如今能够制备大量细菌样品，每个可包含其自己的抗生素浓度，并且它们能够自动准确地测量取决于样品中细菌群大小的数量，例如荧光或光密度。值得注意的是，L.Baraban等的文章"Millifluidic droplet analyser formicrobiology",Lab on Chip,2011,11,4057中所描述的装置产生了一列具有低于微升体积的小滴并且其细菌、营养培养基和抗生素的组成可以精准调节。此种装置值得注意地使得可以产生一列几百至几千恒定体积的小滴并且每个都包含固定初始计数的细菌和初始浓度(作为列中小滴位置的函数而降低)的抗生素。
参见图1中的示意图，装置10包含(用于产生所述列的小滴)：
-三个注射器12、14、16，具有可控流速并且分别含有细菌的水溶液、营养物的水溶液和抗生素的水溶液。所述注射器12、14、16以受控方式将其内容物注射至汇合处18，它们在此混合以形成水溶液；和
-两个注射器20、22，具有可控流速并且分别含有第一种油和第二种油，其与水溶液不相混溶，并且彼此不相混溶。这些注射器的内容物在汇合处24的水平注射。此汇合处也从汇合处18接收水溶液并向透明主管26开放。第一种油(例如是氢氟醚类型的，特别是)用作其中存放来自汇合处18的水溶液小滴的连续介质。第二种(矿物)油用于形成将小滴间隔开的元件。值得注意的是，在每个水溶液的小滴于第一种油中形成之后，将第二种油的小滴存放于第一种油中。
参见图2，所述注射器12、14、16、20、22是由计算机控制以便获得对于管26中细菌溶液小滴的体积和间隔而言都是一致的列。图2显示了三个细菌溶液小滴Gk-1、Gk和Gk+1，其在第一种油28中接连形成并通过第二种油构成的间隔小滴Sk-1、Sk、Sk+1来彼此间隔。应当特别注意的是所述小滴Gk-1、Gk和Gk+1是通过其在小滴列中的位置、或者等价地通过整数或指数k来进行自然标注的。整数"1"因而对应于分析者所研究的列中第一个形成的小滴。首先的三个在计算机的控制下的注射器12、14、16的内容物给出这样的小滴，其包含：
-相同初始浓度的细菌[bact]ini(k)＝常量(如曲线30所示)，或恒定初始数目N0的细菌；
-和初始浓度的抗生素[ATB]ini(k)，该浓度作为小滴列中小滴位置k的函数而降低(如曲线32所示)。
对于用于检测小滴中细菌群的部分，装置10包含：
-与主管26平行的第二管28，用于将油从注射器20注射至管26或第二管28的可控阀30，以及分别安置在主管26的开头和末尾并且在开放位置和关闭位置之间可控的两个阀32、34。所述阀30、32、34(在计算机的控制下)因而使得可以在主管26中定义两个方向相反的流"A"和"B"以及因此而定义小滴在透明管26中的往复运动36；和
-检测系统38，与管26相对安置，用于在特定的波长测量小滴的荧光。
值得注意的是，小滴中含有的细菌天然或人工(例如通过将编码荧光蛋白的基因掺入细菌的基因组中)具有荧光的分子。作为变化，小滴的营养培养基包含可以被细菌代谢的成分(以荧光分子的形式)。因此小滴的荧光直接取决于其含有的细菌数。所述检测系统38包含一组元件和电路以在主管26上形成光点以激发荧光分子的荧光波长，并测量此激发所诱导的荧光。因而，参见图3A，其显示了小滴Gk-1、Gk和Gk+1的左向移动，它们每个都穿过系统38的检测点35。由小滴Gk-1、Gk和Gk+1在系统28前的通过而诱导的测量信号产生了如图3B中所示的信号，也即大约为选通脉冲形式的脉冲列。
装置10使得一组小滴可以快速通过点35。实际上所有小滴通过点35可能少于一分钟。在点35前通过的频率和/或测量的频率对其部分而言可以由往复运动的速度独立控制。例如，对于细菌，小滴的荧光每小时测量大约8次或者每7-8分钟测量进行大约2h至16h。
在操作中，装置10因此在主管26中产生一列N个小滴，继而对所述注射器20和阀30、32进行控制以便产生小滴在管26中的往复运动，从而使得每个小滴以规律的间隔在测量其荧光的检测系统28前通过。因而测量循环由小滴组通过对其进行测量的点35所组成。在测量循环"p"期间，在不同的时间点测量所述小滴，测量小滴的时间点"k"等于对于时间点tp，其是第p个循环期间最后的小滴的测量时间点，也即作为第p个测量循环期间往复运动方向的函数的测量时间点或
继而通过计算机来处理测量信号以将每个测量的脉冲降低至值例如每个脉冲坪(plateau de chaque impulsion)的均值，以及由此而产生的值与其获取时间点存储在计算机中。因此值代表了小滴中含有的细菌数量。对于每个小滴k，因此产生了一组测量对应于直至时间点的一组测量时间点值得注意的是，每个获取时间点对应于小滴特定的温育时间。
图4A和4B例如分别对第一个测量循环和对应于tp＝400分钟的测量循环，说明了作为小滴数k的函数的值k∈[1；N]。这些图对应于产生1300个小滴，每个小滴初始包含1000个大肠杆菌(E.coli)细菌及具有浓度从0.0015μg.mL-1-0.03μg.mL-1规律变化的或浓度精确低于10-4μg.mL-1的抗生素"头孢噻肟"(或CTX)。从这些图可见，对于一些小滴，其测量相对于其各自的初始时间点升高，因此表示其所含有的细菌群的生长，作为推论，其所含有的抗生素的初始浓度不足以完全抑制此生长。图5说明了作为0至1400分钟的一组测量时间点的函数的相同现象。
继而通过如下方式来确定最低抑制浓度MIC：将小滴温育判断为符合要求的时间，然后再将最后的测量循环p的小滴分为两组，即分为其测量信号大致上与其初始信号保持相同的那些以及其测量信号大于其初始信号的那些。因而通过将小滴分为这两组来确定数目kini。由于浓度梯度定义为小滴的数目k的函数，那么MIC浓度则等于数目kini的小滴中抗生素的初始浓度。
本发明人进行了测试，以使用刚刚描述的装置来确定MIC浓度，并且这些测试在图6A-6C中说明。所述附图说明了在存在庆大霉素(图6A)、氯霉素(图6B)或萘啶酸(图6C)时在大肠杆菌菌株的5个重复上进行的测试("重复1"至"重复5")。在这些附图中，横坐标显示了小滴的温育时间(分钟)而纵坐标显示了MIC浓度(μg.mL-1)(通过如上文所述对小滴组的"切割(decoupage)"来确定)。曲线上的点(坐标(MICp,tp))因此代表了确定作为测量循环p所获取小滴的值的函数的MIC浓度。用于所述测试的大肠杆菌菌株是参考编号ATCC25922的已知菌株，对于其所研讨的三种抗生素的MIC是已知的。这些附图中的虚线代表法国政府认可的MIC浓度，或者"监管"MIC(对于庆大霉素为0.5μg.mL-1、对于氯霉素为4μg.mL-1以及对于萘啶酸为2μg.mL-1)，而监管MIC周围的灰色条带对应于耐受范围，对于该耐受范围通过任何技术对MIC的测量都视为符合监管。监管MIC浓度是通过上文所述操作技术来确定(进行由监管所确定的18-24h的温育时间)，而耐受范围对应于围绕此浓度+1/-1的稀释。
基于这些结果，可以特别注意到的是，由所述"切割"方法所确定的MIC浓度没有收敛，并且其继续增加很长一段时间。MIC浓度的此种行为可以部分地由所使用的荧光检测类型来解释。实际上，在抑细菌性抗生素的背景下，当所测量的荧光是消化营养培养基后细菌所拒绝的分子的荧光时，这些分子的量可以增加而细菌计数却保持稳定。然而，这仅仅能极少部分地解释MIC浓度的行为。并非受任何理论的局限，本发明人认为如上文所述的装置反映出了被用于确定MIC浓度的参考技术所遮掩的现象。对"真实"最低抑制浓度(与"监管"MIC相反)的精准且强有力的确定(作为由与文章"Millifluidic droplet analyser formicrobiology"中所述的装置同样精确的装置或者能够通过精准控制其初始内容物而产生大数目"温育器"的任何其它类似装置所产生数据的函数)，因而会引发另外的问题，且因此在实践中是困难的。
此同样的发现也将适用于任何用来对分子对微生物(细菌、酵母、霉菌等)的抑制能力进行表征的量，例如细菌的生长速率、生长迟缓期、通过体积的最大细菌计数、部分抑制的抗生素浓度范围等。
发明概述
本发明的目的是通过提出更强有力且更精准的确定分子对微生物的抑制能力(例如真实MIC浓度)来解决前述问题。
为此目的，本发明涉及用于确定定量分子对预先确定类型的微生物的抑制能力的量Ginhib的方法，包括：
-制备多个样品，每个样品包含至少一种所述类型的微生物、用于所述微生物的营养培养基和初始量的所述分子/样品中存在的所述类型微生物，所述初始量作为预先确定的样品分类的函数在[Qmin,Qmax]的范围内增加；
-温育所述样品；
-对于每个样品，对所述样品中作为时间函数的微生物生长测量预先确定的温育时间；和
-确定作为所述样品中微生物生长的测量的函数的量Ginhib，
根据本发明，确定量Ginhib包括：
-对于每个样品，计算反映所述类型微生物的生长的值，所述值作为所述样品中微生物生长的测量的函数；
-将对于所述样品计算的值作为所述样品分类的函数来分类；和
-确定作为所分类的值的变化的函数的量Ginhib。
换言之，确定量Ginhib并不是对值或与其直接相关的任何其它量(例如对时间tP或给定的循环P作为这些值的函数来计算的细菌群大小)进行的。细菌生长动力学信息首先作为值的函数来确定，然后正是通过对此信息进行处理来确定量Ginhib。
基于所述细菌行为的现有知识来对此信息进行有利地搜寻，特别是使用我们鉴定了含有关于生长动力学信息的至少一个参数的生长模型。如下文中将会详细给出，更精准且可重复地快速确定量Ginhib。另外，整个过程是自动化的并因此更少地依赖于操作者的解读。
根据一个实施方案：
-微生物的生长通过作为时间的函数的生长模型来建模，包括：
■持续时间λ的第一迟缓期；
■随后是对数区间中最大斜率μ的第二指数生长期；和
■随后是最大值A的第三静止期；
-以及作为时间的函数的反映所述类型微生物生长的值是最大斜率μ的估计和/或是迟缓期持续时间λ的估计。
换言之，生长特征对应于Rosso L.在论文"Modeling and predictivemicrobiology:development of a new tool for the food-processing industry"(博士论文,University Claude Bernard Lyon 1,1995)中所提议的特征。斜率μ和迟缓期λ实际上每个都直接与细菌生长的动力学相关联。
根据一个实施方案：
-所述量Ginhib包含样品中微生物的生长至少部分被抑制的范围
-作为所述样品的分类的函数的所述分子的初始量包含：
■对于若干样品是恒定的且等于Qmin的第一部分，范围[Qmin,Qmax]的下限Qmin是经过选择的从而对所述样品中微生物的生长没有抑制；
■随后是严格从Qmin增加至Qmax的第二部分；
■随后是对于若干样品是恒定的且等于Qmax的第三部分，范围[Qmin,Qmax]的上限Qmax是经过选择的从而对所述样品中微生物的生长有完全抑制；
-以及对范围的确定包括：
■在所分类的值的变化中在所述变化的两个大致平稳极端区之间鉴定过渡区；和
■将范围确定为对应于所鉴定过渡区的样品的范围。
换言之，由于样品的特定设计，可以更加容易地鉴定所述范围其中。此范围(其是所述分子的抑制作用的过渡区，在无抑制作用和完全抑制作用之间)本身是有用的量Ginhib并且另外包含其它类型的有用信息，例如MIC浓度。
值得注意的是，对过渡区的鉴定包括对所鉴定值的变化的两个拐点进行确定，所述过渡区由所确定的两个拐点界定。值得注意的是，对过渡区的鉴定包括通过分段线性连续函数来对所分类的值的变化进行建模，所述分段线性连续函数仅包含两个极端直线区段和在该两个极端直线区段之间的中间直线区段，所述中间直线区段是过渡区。
根据有利的实施方案，量Ginhib包含完全抑制微生物生长的最低初始量分子QMIC，所述初始最低抑制量QMIC经过选择以等于范围的上限
根据一个实施方案，范围[Qmin,Qmax]的下限Qmin是量为零的所述分子(例如抗生素)。
根据一个实施方案：
-对于样品中细菌生长的测量以及对作为所述测量的函数的量Ginhib的确定进行了渐增的温育时间，从而获得作为所述样品温育时间的函数的量Ginhib的数列；
-所述方法包括对作为温育时间的函数的所述数列的稳定性的分析；和
-一旦所述数列已经稳定，则量Ginhib是所述数列的值。
换言之，本发明使得可以确定对应于收敛的量Ginhib的数列，其使得可以利用稳定性测试、以及因此而可以利用使得能够进行检测并自动停止温育和/或数据处理的测试。值得注意的是，评估的准确性随着数列的长度而增加。
根据一个实施方案，所述样品每个都初始包含至少100个微生物、且优选至少500个微生物。换言之，提供最小的细菌初始数目避免了加重特定细菌的特定性质。当然，由于本发明，如果我们特别想要知晓所述分子对此微生物的作用，也可以研究更小的群体、或者甚至是一个微生物，例如用于研究细菌的异质抗性(hétéro-résistance)现象。
根据一个实施方案，所述样品每个都包含初始量的能够抑制微生物生长的不同的第二分子，特别是对于所有样品都相同的初始量。换言之，本发明使得可以研究抑制剂(例如抗生素)之间的协同效应。
根据一个实施方案，每所述类型微生物所述分子的最小量是样品中所述分子的浓度，样品中所述类型微生物的初始浓度作为样品分类的函数是恒定的。
根据一个实施方案，所述微生物是细菌，并且所述分子是抗生素。作为变化，所述微生物是酵母或霉菌，并且所述分子是抗真菌剂。
根据一个实施方案，所述营养培养基包含能够被所述微生物代谢为荧光分子形式的成分，并且对所述样品中微生物的生长的测量是对于所述样品的荧光的测量。作为变化，样品的吸收是作为样品中存在的微生物量的函数的变量，以及在于测量所述样品中微生物的生长是测量光密度。
根据一个实施方案，制备多个样品包括制备形成多个油中样品的一列小滴。
本发明还涉及装置，所述装置用于通过定量分子对预先确定类型的微生物的抑制能力来评估量Ginhib，所述装置包含：
-用于制备多个样品的部件，每个样品包含至少一个所述类型的微生物、用于所述微生物的营养培养基和初始量的所述分子/样品中存在的所述类型微生物，所述初始量作为预先确定的样品分类的函数在范围[Qmin,Qmax]内增加；
-用于温育所述样品的部件；
-用于对每个样品中作为时间函数的微生物的生长测量预先确定的温育时间的部件；和
-用于确定作为所述样品中微生物生长的测量的函数的量Ginhib的计算部件，
根据本发明，所述计算部件能够进行：
-对于每个样品，计算所述类型微生物参数生长模型中参数的值(作为所述样品中微生物生长的测量的函数)；
-将对于所述样品所计算的值作为所述样品的分类的函数来分类；和
-确定作为所分类的值的变化的函数的量Ginhib。
值得注意的是，所述装置能够进行前文所述类型的方法。
附图简述
阅读对下文提供的说明(由附图对其提供支持)将会更好地理解本发明，其中在所述附图中：
-图1是文章"Millifluidic droplet analyser for microbiology"中描述的分析仪的简化示意图；
-图2是由图1的分析仪所产生的小滴的实例；
-图3是对由图1的分析仪所产生的荧光信号进行描述的图示；
-图4A和4B是荧光测量作为所产生的小滴数目的函数的图示(分别在0分钟和400分钟)；
-图5是荧光测量作为所产生的小滴数目以及时间的函数的图示；
-图6A至6C是说明通过现有技术的切割方法确定最低抑制浓度的示意图(对于用三种不同抗生素在大肠杆菌上进行的测试)；
-图7是本发明方法一个实施方案的流程图；
-图8是说明在本发明方法期间生成的小滴中抗生素初始浓度谱的示意图；
-图9是说明图1分析仪的所述注射器流速设置的示意图，其作为图8中所示谱的函数而生成；
-图10是通过图9中的设置所产生的小滴的荧光测量作为时间函数的图示；
-图11是说明荧光测量作为不同测量时间点小滴数目的函数的示意图；
-图12A和12B是说明对两个不同测试的小滴中抗生素真实初始浓度进行评估的示意图；
-图13是说明在营养物存在下细菌生长(以及作为时间的函数)的示意图；
-图14是说明荧光测量转换为细菌最大生长速率数列(作为小滴数目的函数)的示意图；
-图15是说明荧光测量转换为细菌生长迟缓期时间的数列(作为小滴数目的函数)的示意图；
-图16A和16B是分别说明最大生长速率数列中的过渡期以及通过分段线性函数而对所述最大生长速率的数列的近似的示意图；
-图17和18是说明分别在最大生长速率数列和迟缓期时间数列上所获得的过渡区的示意图；和
-图19A至19C是说明对于图6A-6C中用三种不同抗生素在大肠杆菌上进行的测试，根据本发明对最低抑制浓度进行确定的示意图。
发明详述
实施方案实施例
本发明方法的实施方案现在将依照图7的流程图来进行说明，此方法的步骤在图8至19中说明。所述方法用于通过文章"Millifluidic droplet analyser formicrobiology"中所述的装置10(且上文依照图1进行了简述)来确定细菌生长的最低抑制浓度MIC。对此装置部件的控制以及对测量的处理通过常规数据处理单元例如计算机进行。
所述方法包括在抗生素梯度的存在下在50产生对于细菌生长的实验数据，以及对所产生数据在52分析以确定MIC浓度。
产生步骤50包括确定用于产生数据的参数的第一步骤54。步骤54特别包括对浓度范围[Cmin；Cmax]的定义，推定其包括所述MIC浓度，也即Cmin＜MIC＜Cmax。此范围确定为之前研究的函数，特别是作为监管MIC浓度或临床研究的函数。值得注意的是，所述浓度Cmax是抗生素完全抑制细菌生长且在MIC浓度之上的浓度。作为变化，下文所述的方法用于调整范围[Cmin；Cmax]。例如，如果所确定的MIC浓度距离最大浓度Cmax很远，那么降低最大浓度Cmax并将所述方法再进行一次。类似地，如果MIC浓度太接近最大浓度Cmax，那么提高最大浓度Cmax并重新开始所述方法。优选地，对最低浓度Cmin进行选择从而确保细菌或多或少地可以自由生长，所述自由生长随后在数据处理中进行探究，下文将更详细描述。例如，所述浓度Cmin等于0。
接着如图8所示生成作为随后产生的小滴数目k的函数的抗生素初始浓度谱[ATB]ini。此谱包含：
-第一平台其中
-随后是斜坡R梯度，其中浓度[ATB]ini(k)从最低浓度Cmin线性增加至最大浓度Cmax，即
-随后是第二平台其中
对平台和的长度进行选择，从而自动鉴定出斜率大致为0的直线部分(作为随后处理的数据中数目k的函数)。这些长度例如取决于所使用算法的准确度。然而本发明人注意到，等于大约100个小滴的平台长度使得可以进行质量良好的鉴定。对于斜坡R梯度的长度，其定义为在用于产生小滴的装置所施加的限制中，所期望的MIC浓度精准性的函数。
接着在56产生对注射器12、14、16的流速设置(作为抗生素初始浓度谱[ATB]ini的函数)。这些设置在图9中说明。值得注意的是，细菌溶液注射器12的流速设置是恒定的，以便产生包含大致同样初始数目细菌的小滴。有利地，此数目大于500，从而不会加重每个细菌的特定特性，例如1000个细菌。抗生素注射器16的流速设置对其部分而言遵循谱[ATB]ini，而营养培养基注射器18的流速设置具有反转谱，以便产生恒定体积的小滴。
同时，制备了细菌溶液、营养培养基溶液以及抗生素溶液并继而置于其各自的注射器中。有利地，以及任选地，还将已知浓度的荧光标记物(例如磺酰罗丹明)加入至所述抗生素溶液。此标记物(其荧光可通过检测系统28测量，有利地在不同于用于测量细菌群体的波长的波长)使得可以确定每个小滴中抗生素的真实浓度，下文将详细描述。此额外的荧光由检测系统38测量，其例如装配有一组滤波器用于选择测量的波长，例如文献"Millifluidic droplet analyser for microbiology"所述。
在下一步骤60中，将装置10控制为如此所定义的流速设置的函数，以便产生一列N个小滴，并且每个小滴的荧光用上文所述的往复运动来定期测量。而在60，对来自检测系统28的测量信号进行处理以产生并存储对于获取时间点每个小滴的荧光值量的实例在图10和11中说明，作为时间的函数(图10)或者作为不同测量循环的小滴数目的函数(图11)。
对其部分而言，数据处理步骤52包括对小滴中抗生素真实初始浓度的评估(在62)。实践中，流速设置与真实流速之间有差异，从而在期望的谱[ATB]ini与真实浓度谱之间会有差异。值得注意地，真实谱可以不是完美线性。在小滴温育开始时，从测量的磺酰罗丹明荧光估计抗生素的真实浓度。值得注意地，测量循环L在细菌迟缓期内，并且例如是第一个测量循环。在此时间点，细菌还未开始生长并且它们在小滴中诱导恒定或零荧光。荧光在值中的变化因此对应于添加至抗生素溶液中的磺酰罗丹明的荧光。知晓磺酰罗丹明的浓度，则其荧光因此就与抗生素的初始浓度[ATB]ini成比例。
对于真实浓度的估计特别是如下计算：
-在测量上应用平滑滤波器，例如标准Loess平滑滤波器，从而获得平滑测量
-在所述平滑测量中鉴定抗生素梯度的起始和终点。例如，鉴定平滑测量的最小值且梯度的起始鉴定为小滴(其平滑测量比值高X％，例如高1％)的最小数类似地，鉴定出平滑测量的最大值并且梯度的终点鉴定为小滴(其平滑测量比值低X％，例如99％)的最大数当然，可以使用任何确定梯度起始和终点的方法；
-设:
其中以及存储评估的浓度用于如上文所述的之后用途。
因而已知浓度Cmin和Cmax用作荧光梯度在范围之内进行线性转换成范围[Cmin；Cmax]内的浓度梯度的锚定点。值得注意的是，这使得可以保留由小滴生产中的误差所引起的初始浓度真实谱的非线性。图12A和12B说明了对两个大肠杆菌菌株分别进行的两个实验的浓度谱[ATB]ini的评估。有噪音的曲线代表所测量的荧光叠加在有噪音的曲线上的平滑曲线(粗线)对应于平滑荧光而锚定在值Cmin和Cmax上的曲线(由细线显示)是评估的浓度这些附图，以及特别是图12B，显示出所测量荧光可观的非线性(由装置10的瑕疵所引起)和浓度的评估其在换算系数内重现了荧光谱。
处理52还包括与测量步骤60并行进行的步骤64，即每次，新测量循环P给出小滴荧光的新测量只要未满足下文所述的停止标准就进行下去。当触发步骤64时，对应于在先测量循环1,2,…,P-1的测量因此对每个小滴k都已经得以存储。
更具体地，对每个小滴k，步骤64包括将从所存储的具有小滴新荧光测量的数列的拼接所衍生的数列 转换为含有关于小滴k中细菌生长动力学信息(对于在t1和tP之间的温育时间)的值Dk(tP)的第一步骤66。此转换的目标是，对于时间点tP的测量循环，考量直至执行此循环时荧光的历史，该历史有利地通过生长模型定性合格。
有利地，通过营养培养基中细菌生长模型、更优选图13中的模型(其说明了作为时间函数的细菌群体的自然对数)来将此历史纳入考量。如所知，细菌的生长包括：
-持续时间λ的第一迟缓期，在此期间细菌合成其将会需要以利用营养培养基的酶，并且其中并没有细菌的细胞分裂；
-随后是指数生长期：在加速之后，生长达到最大生长速率μ，或者等同地，生长曲线具有最大斜率μ；
-随后是静止期，其对应于营养培养基的耗竭。生长减缓并且变成大致为零，细菌群体大致上稳定在值A。在营养物完全耗竭后，静止期随后是退化期(此处未显示)。
迟缓、生长和静止期例如通过下表中的一种和/或其它的时间模型y(t)来评估：
其中e是欧拉常数。
对于每个测量循环P以及对于每个小滴k，步骤66因而由以下组成：鉴定模型y(t)(含有作为对于小滴所测的荧光的函数的动力学信息)的至少一个参数，且特别是对于此数列(Dk(tP)＝μk(tP)或Dk(tP)＝λk(tP))的最大斜率μk(tP)和/或迟缓时间λk(tP)。对于模型(t)的参数的鉴定是通过在鉴定领域中本身已知的方式(例如通过非线性最小平方)进行的，所述模型(t)的鉴定包括最小化测量的向量和评估测量 的向量之间的差异形成的估计误差。
作为变化，不使用模型y(t)来鉴定参数，例如通过由对数列 进行近似的样条法来计算多项式。继而通过经验估计参数λ和μ，例如通过有限差分法。例如，如下获得最大斜率μ：计算对所述数列进行近似的多项式的导数以及选择导数的最大值作为斜率μ。作为另一变化，可以混合所述模型或方法。
对细菌群体生长的参数的鉴定是现有技术中熟知的。例如，可以使用"grofit"软件包进行此鉴定，所述软件包由Kahm M.等"grofit:Fitting Biological Growth Curvewith R",Journal of Statistical Software,Vol.33(7),February 2010描述，可下载自URL http://cran.r-project.org/web/packages/grofit/index.html。
由于参数的计算有统计学性质，优选一获得最少数目的测量之后就进行鉴定。测量循环的最小数目例如等于10，因此一旦达到此最小数目就对测量循环进行步骤64。
在对细菌生长参数进行计算的步骤66结束时，因此会产生如下数列：
M(tP)＝{μ1(tP),μ2(tP),...,μk(tP),...,μN(tP)}
A(tP)＝{λ1(tP)，λ2(tP)，...，λk(tP)，...，λN(tP)}
数列Μ(tP)和数列Λ(tP)分别在图14和15中说明(作为小滴数目k的函数，时间点tP等于6小时)。
在68继续处理52，对于时间点tP确定真实最低抑制浓度MIC(tP)，其作为至少一个所确定的参数的数列的函数，例如数列Μ(tP)。此确定基于搜索在包含浓度MIC(tP)的参数的数列中的过渡区。此区定义为抗生素对细菌生长具有可观测抑制作用的最小宽度的抗生素初始浓度范围。参见图16A，其说明了作为小滴数目k的函数的图14的数列Μ(tP)，观测到曲线Μ(tP)在范围[1；N0]大致上是恒定的且等于μmax，其中类似地，曲线Μ(tP)在范围大致上为零，其中具有抗生素初始浓度Cmax的小滴的因此范围对应于过渡区，此范围的上限对应于所需的浓度
步骤66中对过渡区的鉴定可以通过任何已知数学方法进行，特别是用于在曲线上鉴定拐点、并因此用于鉴定在过渡区旁侧的两个拐点的任何方法。
例如，曲线Μ(tP)通过依照以下关系式的分段线性连续函数来近似：
其中参数N0,α,β,a,b,c,d,和的值以本身已知为优化问题(最小化数列Μ(tP)和数列之间的估计误差)最优解的方式来计算。
数列Μ(tP)的其它近似是可能的，例如多项式近似，特别是通过样条法获得的。
接着在70继续步骤64，其中根据以下关系式确定并存储对应于小滴数目的抗生素初始浓度：
在接下来的步骤72中，进行浓度MIC(tP)的稳定性测试。该测试例如由以下组成：验证从T个最后的荧光测量循环(例如最后3个循环)计算的浓度MIC(tP)所形成的数列是否稳定。对于最后T个测量时间点，例如当浓度变化少于S％(例如5％)时则视为浓度是稳定的。该稳定性测试特别使得可以在最早的时刻停止所述过程，从而不需要选择先验最小温育时间。
图17和18说明了对于图14和15中数列Μ(tP)和Λ(tP)分别计算范围对于数列Μ(tP)所确定的范围等于[157；196]，其对应于浓度范围[0.97；2.17]。对于数列Λ(tP)确定的范围等于[189；199]，其对应于浓度范围[0.97；2.3]。注意对于两个参数确定的数目很接近(分别为196和199)。对于此部分而言，通过过渡区比数列Μ(tP)的过渡区更加陡峭的数列Λ(tP)所确定的范围具有更高的准确性。
如果浓度MIC(tP)不稳定，那么步骤72返回步骤66以计算作为新荧光测量的函数的浓度MIC(tP)。相反，如果浓度MIC(tP)稳定，那么在74指令测量停止。那么所计算和存储的最后的浓度MIC(tP)就是抗生素对于作为测量目标的细菌的最低抑制浓度。
图19A至19C说明了刚刚描述的实施方案的结果。测量的产生与图6A至6C关联进行描述。更特别地，这些附图中描述的测量形成了上文所述(使用数列Μ(tP)计算浓度MIC(tP))处理步骤52中数据处理的对象。如所见，浓度MIC(tP)快速达到监管MIC耐受范围内的稳定值。关于图19B中的重复3，特定形式的MIC(tP)得自后验检测的小滴产生系统的校准误差。
变化
已经描述了本发明的特定实施方案。显然本发明并不局限于此实施方案。值得注意的是以下变化(单独或组合)构成了本发明的一部分。
该实施方案描述为应用于评估抗生素抑制细菌生长的最低浓度以及抑制浓度的范围。本发明还适用于确定作为抗生素抑制能力特征的其它量。
已经描述了特定的实施方案，适用于抗生素对细菌生长抑制能力的分析。本发明以同样的方式适用于任何分子对微生物抑制能力的分析，特别是抗真菌剂对于霉菌、真菌或酵母的抑制作用的分析。
已经描述了特定的实施方案，其中单一类型的抗生素存在于样品中。作为变化，所述样品可以包含已知浓度的第二种抗生素。因而可以进行对抗生素协同性的研究。例如，对不同浓度的第二种抗生素来进行本发明的方法。
已经描述了实施方案，其中细菌初始是大数目的以避免加重特定特征。作为变化，更小的细菌计数、或者甚至是单细菌存在于样品中，以便特定研究后者。
已经描述了实施方案，其中产生了抗生素的初始浓度梯度。作为变化，抗生素的浓度是恒定的并且产生了细菌浓度梯度。通常，本发明因而涉及形成所述分子每微生物的初始量的梯度(在最小量Qmin和最大量Qmax之间)。
已经描述了从初始值到最终值线性增加的梯度。线性梯度使得每个浓度区都能以相等的重要性来进行考量。其它类型的梯度，特别是非线性的，当然也是可能的。例如，平台梯度，其中对于分布在所研讨的抗生素的浓度范围[Cmin；Cmax]的有限数目的浓度值(例如大约10个)产生大量小滴(例如几十至大约上百)。有利地，这些浓度值作为与参照方法的应用相关的监管机构推荐值的函数来通过微稀释法进行选择，所述监管机构如CA-SFM(Antibiogram Committee of the French Society of Microbiology)或EUCAST(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing)，从而在单一实验中进行微稀释实验的多个重复(几十至大约上百，取决于每个平台小滴的数目)。
已经描述了对荧光测量xk的处理。当然，本发明也适用于对从测量xk双射推导出的任何值所进行的处理，例如细菌数目，其已本身已知的方式计算为xk的函数。
已经描述了对生长模型的参数的计算，以用于在对数量(例如MIC)的确定中将细菌生长的历史进程纳入考量。
作为变化，通过计算作为时间函数的测量xk的差异Vk来将历史进程纳入考量。例如，此差异Vk(tP)等于或者等于均值或者等于对作为Vk(tP)的函数的MIC(tP)的计算是通过与值μk(tP)和λk(tP)相关的描述中相同或相似的方式进行的。
另外，对作为参数(μk(tP)或λk(tP))的函数的所述量的确定已经有描述。作为变化，对于一组参数的每个参数都可以计算数量(例如MIC)，并且最终MIC计算为所计算的MIC值的函数、或者选自所计算的MIC值。例如，最终MIC等于MIC的均值。
已经描述了实施方案，其中所述MIC等于所计算的视为稳定的最后的值。作为变化，一旦所述MIC已经收敛则所述方法继续若干循环并且最终MIC计算为一旦已获得收敛时所计算的MIC值的平均值。
已经使用文章"Millifluidic droplet analyser for microbiology"中所述分析仪描述了实施方案。当然，本发明适用于产生多个样品(具有抑制剂梯度和/或对所述抑制剂敏感的微生物梯度)的任何类型的装置和方法。值得注意的是，本发明例如适用于不具有相同体积的样品。
对MIC的确定已经进行了描述，即视为真实的MIC，后者等于范围的上限。当然，监管MIC(例如由法国政府或美国政府所确定的)也可以或者另外从此范围来评估。实际上，由于此范围的确定是稳定的，因而可以在此范围和监管MIC之间确定对应表、或任何其它适宜的转换规则。作为实例，可以根据监管分类(在人类可耐受分子的临界浓度处比较MIC)来确定微生物对于所述分子是否是敏感的、中性的或抗性的。此类型的监管分类例如可通过CA-SFM(Antibiogram Committee of the French Society ofMicrobiology)或EUCAST(European Committee on Antimicrobial SusceptibilityTesting)建立。
Claims (18)
1.用于确定定量分子对预先确定类型的微生物的抑制能力的量Ginhib的方法，包括：
-制备(50)多个样品，每个样品包含至少一个所述类型的微生物、用于所述微生物的营养培养基和初始量的所述分子/样品中存在的所述类型微生物，所述初始量作为预先确定的样品分类的函数而在[Qmin,Qmax]的范围内增加；
-温育所述样品；
-对于每个样品，对所述样品中作为时间的函数的微生物生长测量(50)预先确定的温育时间；和
-确定(52)作为所述样品中微生物生长的测量的函数的量Ginhib，
特征在于确定(52)量Ginhib包括：
-对于每个样品，基于所述样品中微生物生长的测量来计算(66)反映所述类型微生物生长的值；
-将对于所述样品所计算的值作为所述样品分类的函数来进行分类(68)；和
-确定(70)作为所分类值的变化的函数的量Ginhib。
2.权利要求1的方法，特征在于：
-所述微生物的生长通过作为时间的函数的生长模型建模，包括：
■持续时间λ的第一迟缓期；
■随后是对数区间中最大斜率μ的第二指数生长期；和
■随后是最大值A的第三静止期；
-并且反映作为时间的函数的所述类型微生物的生长的值是最大斜率μ的估计和/或是迟缓期的持续时间λ的估计。
3.权利要求1或2的方法，特征在于：
-所述量Ginhib包含范围对于该范围，样品中所述微生物的生长至少部分被抑制；
-作为所述样品分类的函数的所述分子的初始量包含：
■对于若干样品是恒定的且等于Qmin的第一部分，范围[Qmin,Qmax]的下限Qmin是经过选择的从而不抑制所述样品中所述微生物的生长；
■随后是严格从Qmin增加至Qmax的第二部分；
■随后是对于若干样品是恒定的且等于Qmax的第三部分，范围[Qmin,Qmax]的上限Qmax是经过选择的从而完全抑制所述样品中所述微生物的生长；
-以及确定范围包括：
■在所分类值的变化中鉴定在所述变化的两个大致静止极端区之间的过渡区；和
■确定范围对应于所鉴定的过渡区的样品的范围。
4.权利要求3的方法，特征在于鉴定过渡区包括确定所分类的值的变化的两个拐点，过渡区由所确定的两个拐点界定。
5.权利要求3或4的方法，特征在于鉴定过渡区包括通过分段线性连续函数对所分类的值的变化进行建模，所述分段线性连续函数仅包含两个末端直线区和介于该两个末端直线区之间的中间直线区，所述中间直线区是过渡区。
6.权利要求3、4或5的方法，特征在于量Ginhib包含完全抑制所述微生物生长的最低初始量QMIC的分子，以及特征在于所述初始最低抑制量QMIC经过选择以等于范围的上限
7.前述权利要求任一项的方法，特征在于范围[Qmin,Qmax]的下限Qmin是所述抗生素的量为零。
8.前述权利要求任一项的方法，特征在于：
-对于样品中所述细菌的生长的测量以及对作为所述测量的函数的量Ginhib的确定进行了渐增的温育时间，从而获得作为所述样品温育时间的函数的量Ginhib的数列；
-所述方法包括对作为温育时间的函数的所述数列的稳定性的分析；和
-一旦所述数列已经稳定，则量Ginhib是所述数列的值。
9.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述样品每个都初始包含至少100个微生物、且优选至少500个微生物。
10.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述样品每个都包含初始量的能够抑制所述微生物生长的不同的第二分子，特别是对于所有样品都相同的初始量。
11.前述权利要求任一项的方法，特征在于每所述类型的微生物的所述分子的最小量是样品中所述分子的浓度，样品中所述类型的微生物的初始浓度作为样品分类的函数是恒定的。
12.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述微生物是细菌，以及特征在于所述分子是抗生素。
13.权利要求1-11任一项的方法，特征在于所述微生物是酵母或霉菌，以及特征在于所述分子是抗真菌剂。
14.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述营养培养基包含能够被所述微生物代谢为荧光分子形式的成分，以及特征在于测量所述样品中微生物的生长是测量所述样品中的荧光。
15.权利要求1-13任一项的方法，特征在于所述样品的吸收是作为样品中存在的微生物的量的函数的变量，以及特征在于测量所述样品中微生物的生长是测量光密度。
16.前述权利要求任一项的方法，特征在于产生多个样品包括制备形成油中样品的一列小滴。
17.用于评估定量分子对预先确定类型的微生物的抑制能力的量Ginhib的装置，包括：
-用于制备多个样品的部件，每个样品包含至少一个所述类型的微生物、用于所述微生物的营养培养基和初始量的所述分子/所述样品中存在的所述类型的微生物，所述初始量作为预先确定的样品分类的函数而在[Qmin,Qmax]的范围内增加；
-用于温育所述样品的部件；
-用于在预先确定的温育时间内测量每个样品中作为时间函数的微生物生长的部件；和
-用于确定对作为所述样品中微生物生长的测量的函数的量Ginhib的计算部件，
特征在于所述计算部件能够用于进行：
-对于每个样品，对于作为所述样品中微生物生长的测量的函数的值进行计算，所述值反映所述类型微生物的生长；
-将对于所述样品所计算的值作为所述样品分类的函数来分类；和
-确定作为所分类的值的变化的函数的量Ginhib。
18.权利要求17的装置，特征在于其适宜用于进行权利要求2-16任一项的方法。
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