CN107569491A

CN107569491A - 一种星孢菌素类化合物的应用

Info

Publication number: CN107569491A
Application number: CN201710765143.5A
Authority: CN
Inventors: 马忠俊; 周彪; 丁婉婧; 刘美星
Original assignee: Hangzhou Kexing Biochem Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Kexing Biochem Co Ltd
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2017-08-30
Publication date: 2018-01-12

Abstract

本发明公开了一种星孢菌素类化合物在制备治疗癌症、炎症或艾滋病的药物中的应用。本发明化合物为从一种放线菌中分离纯化得到，经鉴定为星孢菌素类化合物，经功能研究发现，这些化合物对前列腺癌细胞具有较高的活性，同时还对Brd4蛋白具有较高的抑制作用，说明本发明化合物在制备治疗肿瘤、HIV、白血病等疾病的药物方面具有良好的应用前景。

Description

一种星孢菌素类化合物的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种星孢菌素类化合物的应用。

背景技术

癌症是危害人类生命健康的重大疾病之一，具有病程长死亡率高的特点。前列腺癌是一种常见于男性泌尿生殖系统的恶性肿瘤，其发病率在西方欧美国家居所有男性肿瘤之首，死亡率仅次于肺癌，居第二位。与西方国家相比，我国前列腺癌的发病率明显偏低，但近年来由于受各种因素的影响而呈显著增长态势。世界卫生组织报告，2012年全球癌症患者和死亡病例都在持续地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。因此，癌症的预防和治疗至关重要。

星孢菌素(STA)最早是从土壤放线菌中分离得到的吲哚咔唑类化合物，之后陆续从多种海洋放线菌和无脊椎动物中发现。研究表明蛋白激酶C(PKC)是介导肿瘤细胞增殖、分化、凋亡及血管生成的信号通路中发挥至关重要的作用，PKC已经成为抗肿瘤治疗的一个靶点。STA为强PKC抑制剂(IC₅₀＝2.7nM)，主要作用于细胞信号转导通路中各种激酶、拓扑异构酶以及细胞周期调控因子，但随后证明为广谱的激酶抑制剂，选择性差，因而无法成药。而多个星孢菌素的衍生物目前正作为抗肿瘤药物处于临床研究。天然来源的星孢菌素衍生物UCN-01目前处于治疗乳腺癌和淋巴癌的II期临床研究。结构修饰得到的星孢菌素衍生物PKC-412处于急性髓性白血病的临床Ⅲ期，非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴白血病的临床Ⅱ期；口服lestaurtinib已经于2006年由FDA批准作为治疗急性髓细胞白血病的孤儿药；CEP-2563已经完成了治疗实体瘤的Ⅰ期临床研究；Enzastaurin正处于治疗淋巴瘤的Ⅲ期临床研究。上述实例表明，星孢菌素类化合物具有广阔的成药前景。

BRD4蛋白隶属于溴结构域蛋白家族中的BET亚家族，全长共1362个氨基酸残基，其氮端的第一个溴结构域，即BRD4(44-168)。它能识别结合乙酰化修饰的赖氨酸，并因此特异性地调控DNA甲基化、染色质重建和翻译相关的核小体的转录后修饰，从而进一步调控基因表达。BRD4是一个十分有潜力的药物靶标，大量文章报道显示BRD4是肿瘤、HIV和白血病等疾病治疗的很有前景的靶点。

发明内容

本发明通过对放线菌进行研究，分离纯化得到5种星孢菌素类化合物。

一种星孢菌素类化合物在制备治疗癌症、炎症或艾滋病的药物中的应用，所述星孢菌素类化合物的结构式为式I或式Ⅱ结构：

R1＝H或Me；

R2＝OH、N(Me)COH或N(Me)COMe；

R3＝O或NOH。

所述星孢菌素类化合物的结构式为以下五种中的一种：

所述癌症为前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤。

所述癌症为前列腺癌。

所述炎症为关节炎或皮肤炎。

本发明又提供了一种星孢菌素类化合物在制备Brd4蛋白抑制剂中的应用，所述星孢菌素类化合物的结构式为式I或式Ⅱ结构：

R1＝H或Me；

R2＝OH、N(Me)COH或N(Me)COMe；

R3＝O或NOH。

Brd4蛋白是肿瘤、HIV和白血病等疾病治疗的很有前景的靶点，说明本发明化合物在制备治疗肿瘤、HIV和白血病等疾病的药物中具有良好的应用前景。

所述星孢菌素类化合物的结构式为以下五种中的一种：

本发明化合物为从一种放线菌中分离纯化得到，经鉴定为星孢菌素类化合物，经功能研究发现，这些化合物对前列腺癌细胞具有较高的活性，同时还对Brd4蛋白具有较高的抑制作用，说明本发明化合物在制备治疗肿瘤、HIV、白血病等疾病的药物方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为化合物1的结构式示意图。

图2为化合物2的结构式示意图。

图3为化合物3的结构式示意图。

图4为化合物4的结构式示意图。

图5为化合物5的结构式示意图。

具体实施方式

菌种来源

放线菌为链霉菌(Streptomyces sp.)，保藏号为CICC No.172617，购买自位于北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼的中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，订购网址：http://www.china-cicc.org/。

培养基

高氏一号液体培养基：以发酵培养基1L计，可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，加水至1L，调pH 7.2。

高氏一号固体培养基：以发酵培养基1L计，可溶性淀粉20g，KNO₃ 1g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，12g琼脂，加水至1L，调pH 7.2。

大米培养基：大米和海盐水按以下质量体积比：大米40g，25％的海盐水60mL，即大米∶25％的海盐水＝40g∶60mL。

实施例1

1、种子液

将上述链霉菌接种于含有250mL液体培养基的500mL锥形瓶中，每瓶含250mL高氏一号液体培养基，在摇床中28℃下以180rpm振荡培养4天，获得种子液。

2、发酵

以每瓶接种8mL的量将上述种子液接种到大米发酵培养基(由以下重量组分制成：大米40g，25％的海盐水60mL)中，28℃静置培养60天后终止发酵。

3、粗提

每瓶固体发酵物用EA(乙酸乙酯)约300mL浸泡过夜，三层纱布过滤除去菌丝体，收集滤液，减压浓缩得粗提物(油状浸膏)。

4、分离纯化

粗提物用90％甲醇水溶解，等体积石油醚萃取三遍后，90％甲醇水相减压浓缩得到醇相，甲醇相用甲醇溶解后，经1200rpm离心8min后，采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离，洗脱溶剂为含甲醇体积分数20％～100％的水溶液，TLC分析后将相似流分合并，共得到14个组分Fr.A～Fr.N。

Fr.J(365.0mg)经中压制备液相色谱梯度洗脱210min(洗脱溶剂为含甲醇加酸体积分数50％～100％的水溶液，流速为10mL/min，检测波长为292nm)，每隔10min接一流分，TLC分析后将相似流分合并得到3组分Fr.J-1～Fr.J-3。Fr.J-3经高压制备液相色谱梯度洗脱70min(洗脱溶剂为含乙腈体积分数40％～60％的水溶液，流速为10mL/min，检测波长为292nm)，得到化合物1(1.5mg，t_R＝29min)、4(6.2mg，t_R＝43min)和5(9.5mg，t_R＝45min)。

Fr.I(299.8mg)经中压制备液相色谱梯度洗脱210min(洗脱溶剂为含甲醇加酸体积分数50％～100％的水溶液，流速为10mL/min，检测波长为292nm)，每隔10min接一流分，TLC分析后将相似流分合并得到3组分Fr.I-1～Fr.I-3。Fr.I-2经高压制备液相色谱梯度洗脱60min(洗脱溶剂为含乙腈体积分数40％～60％的水溶液，流速为10mL/min，检测波长为292nm)，得到化合物2(2.5mg，t_R＝33min)和3(1.2mg，t_R＝22min)。

实施例2

(1)化合物1结构鉴定

白色粉末(CH₃OH)，紫外光下有蓝紫色荧光。根据¹H和¹³C NMR数据推测其分子式为C₂₉H₂₆N₄O₄，¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ_H7.26(1H，d，J＝7.8Hz，H-1)，7.49(1H，br t，H-2)，7.39(1H，br t，H-3)，9.43(1H，d，J＝7.9Hz，H-4)，5.03(1H，d，J＝14.7Hz，H-7a)，5.04(1H，d，J＝14.7Hz，H-7b)，7.93(1H，d，J＝7.8Hz，H-8)，7.36(1H，br t，H-9)，7.50(1H，br t，H-10)，7.76(1H，d，J＝7.9Hz，H-11)，4.02(1H，d，J＝2.0Hz，H-3’)，5.02(1H，m，H-4’)，2.52(1H，d，J＝4.4Hz，H-5’a)，2.68(1H，m，H-5’b)，6.75(1H，dd，J＝6.2&7.1Hz，H-6’)，2.52(3H，s，H-2’-CH₃)，3.42(3H，s，H-3’-OCH₃)，2.86(3H，s，H-N-CH₃)，8.14(1H，s，H-1”)，¹³C NMR(CD₃OD，100MHz)：δ_C 107.8(C-1)，125.6(C-2)，120.4(C-3)，126.8(C-4)，123.6(C-4a)，116.5(C-4b)，119.0(C-4c)，173.3(C-5)，46.2(C-7)，132.6(C-7a)，114.7(C-7b)，124.7(C-7c)，121.7(C-8)，120.8(C-9)，125.2(C-10)，112.4(C-11)，138.6(C-11a)，130.7(C-12a)，126.6(C-12b)，136.7(C-13a)，94.5(C-2’)，84.7(C-3’)，47.7(C-4’)，27.7(C-5’)，82.4(C-6’)，29.2(C-2’-CH₃)，60.5(C-3’-OCH₃)，163.5(C-1”)，32.4(N-CH₃)。根据上述数据查阅文献，确定化合物1为N-Formyl-staurosporine，结构式如图1所示。

(2)化合物2结构鉴定

白色粉末(CH₃OH)，紫外光下有蓝紫色荧光。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ_H7.33(1H，d，J＝8.1Hz，H-1)，7.42(1H，br t，H-2)，7.26(1H，br t，H-3)，9.24(1H，d，J＝7.9Hz，H-4)，4.89(1H，d，J＝17.7Hz，H-7a)，4.92(1H，d，J＝17.7Hz，H-7b)，7.94(1H，d，J＝7.9Hz，H-8)，7.33(1H，br t，H-9)，7.47(1H，br t，H-10)，7.87(1H，d，J＝8.5Hz，H-11)，4.05(1H，t，J＝2.0Hz，H-3’)，5.10(1H，ddd，J＝13.6&5.1&2.0Hz，H-4’)，2.37(1H，m，H-5’a)，2.62(1H，m，H-5’b)，6.69(1H，dd，J＝8.9&4.8Hz，H-6’)，2.43(3H，s，H-2’-CH₃)，2.41(3H，s，H-3’-OCH₃)，2.82(3H，s，H-N-CH₃)，2.12(3H，s，H-COCH₃)。根据上述数据查阅文献，确定化合物2为N-Acetyl-staurosporine，结构式如图2所示。

(3)化合物3结构鉴定

白色粉末(CH₃OH)，紫外光下有蓝紫色荧光。¹H NMR(CD₃OD，400MHz)：δ_H7.50(1H，d，J＝7.0Hz，H-1)，7.47(1H，br t，H-2)，7.29(1H，br t，H-3)，9.26(1H，d，J＝8.1Hz，H-4)，5.06(1H，d，J＝17.7Hz，H-7a)，5.07(1H，d，J＝17.7Hz，H-7b)，8.06(1H，d，J＝9.2Hz，H-8)，7.36(1H，br t，H-9)，7.49(1H，br t，H-10)，8.03(1H，d，J＝8.7Hz，H-11)，4.49(1H，d，J＝3.7Hz，H-3’)，4.28(1H，m，H-4’)，2.65(1H，m，H-5’a)，2.65(1H，m，H-5’b)，6.79(1H，dd，J＝3.8&6.8Hz，H-6’)，2.37(3H，s，H-2’-CH₃)。根据上述数据查阅文献，确定为化合物3的结构式如图3所示。

(4)化合物4结构鉴定

淡黄色粉末(CH₃OH)，紫外光下有蓝紫色荧光。根据¹H和¹³C NMR数据推测其分子式为C₂₇H₂₂N₄O₄。¹H NMR(DMSO–d₄，400MHz)：δ_H7.72(1H，d，J＝8.2Hz，H-1)，7.45(1H，br t，H-2)，7.31(1H，br t，H-3)，9.30(1H，d，J＝7.9Hz，H-4)，4.96(2H，s，H-7a)，8.02(1H，d，J＝8.6Hz，H-8)，7.32(1H，br t，H-9)，7.50(1H，br t，H-10)，7.98(1H，d，J＝7.8Hz，H-11)，4.75(1H，s，H-3’)，3.02(1H，dd，J＝5.6&14.4Hz，H-5’a)，3.62(1H，d，J＝14.4Hz，H-5’b)，7.05(1H，d，J＝5.2Hz，H-6’)，2.47(3H，s，H-2’-CH₃)，3.42(3H，s，H-3’-OCH₃)，10.45(1H，s，H-N-OH)，¹³CNMR((DMSO–d₄，100MHz)：δ_C109.0(C-1)，125.3(C-2)，119.6(C-3)，125.7(C-4)，122.9(C-4a)，115.0(C-4b)，119.2(C-4c)，171.8(C-5)，45.4(C-7)，132.3(C-7a)，114.1(C-7b)，123.9(C-7c)，120.8(C-8)，120.2(C-9)，124.7(C-10)，115.7(C-11)，139.9(C-11a)，128.1(C-12a)，124.6(C-12b)，136.0(C-13a)，96.3(C-2’)，83.6(C-3’)，145.2(C-4’)，29.8(C-5’)，82.3(C-6’)，28.7(C-2’-CH₃)，58.4(C-3’-OCH₃)。根据上述数据查阅文献，确定化合物4为TAN-1030A，结构式如图4所示。

(5)化合物5结构鉴定

淡黄色粉末(CH₃OH)，紫外光下有蓝紫色荧光。¹H NMR(CDCl₃，400MHz)：δ_H7.27(1H，d，J＝8.5Hz，H-1)，7.43(1H，br t，H-2)，7.33(1H，br t，H-3)，9.41(1H，d，J＝7.9Hz，H-4)，4.97(2H，s，H-7a)，7.95(1H，d，J＝8.6Hz，H-8)，7.39(1H，br t，H-9)，7.50(1H，br t，H-10)，7.84(1H，d，J＝7.7Hz，H-11)，4.55(1H，s，H-3’)，3.60(1H，dd，J＝7.0&14.0Hz，H-5’a)，3.62(1H，d，J＝14.0Hz，H-5’b)，7.09(1H，d，J＝7.0Hz，H-6’)，2.57(3H，s，H-2’-CH₃)，3.57(3H，s，H-3’-OCH₃)。根据上述数据查阅文献，确定为化合物5为Des(hydroxyimino)-TAN-1030A，结构式如图5所示。

实施例3

人前列腺癌细胞株PC3细胞的增殖抑制实验。

取对数生长期的细胞，配置成5×10⁴个/mL，以100μL/孔铺于96孔培养板，CO₂培养箱中培养24小时，取出培养板后于每孔中加入不同浓度的待测样品，每个浓度设3个复孔，加药完成后，置于CO₂培养箱中继续培养72小时后取出培养板，弃去培养液，每孔加入100μL4℃冰箱预冷的10％的三氯醋酸(TCA)固定，静置5分钟后，再将培养板移至4℃冰箱过夜。倒掉固定液，每孔用去离子水洗涤5遍，甩干，空气干燥。每孔加入70μL SRB溶液，室温放置20分钟，去上清液，用1％醋酸洗涤5次，空气干燥。结合的SRB用100μL/孔10mmol/L Tris碱液(pH＝10.5)振荡溶解。置于酶标仪中测定各孔光吸收，测定波长为515nm。根据各孔OD值计算药物对细胞增殖抑制率：抑制率＝[1－(OD_515给药孔/OD_515对照孔)]×100％，根据各浓度抑制率计算半数抑制浓度IC₅₀。

结果各化合物的IC₅₀值如表1所示。

表1

化合物	IC₅₀(μg/mL)
		1	1.72
2	2.03
		3	5.24
4	9.84
		5	10.14

实施例4

采用BRD4bromodomain 1TR-FRET assay kit(Cisbio)，以(+)-JQ1位阳性药测定各化合物对BRD4蛋白的抑制活性。TR-FRET值通过测定BRD4蛋白在经340nm紫外光激发后620nm和665nm的荧光比值获得，即TR-FRET值T＝[F665nm/F620nm]×10⁴。BRD4蛋白％抑制率＝((T待测)-(Tmin))/((Tmax)-(Tmin))×100，Tmax为反应液的TR-FRET值，Tmin为没有BRD4蛋白的空白反应液TR-FRET值。各化合物在浓度为10μg/mL对Brd4蛋白的抑制率分别如表2所示。

表2

化合物	抑制率％
		1	41％
2	37％
		3	5％
4	33％
		5	60％

Claims

1.一种星孢菌素类化合物在制备治疗癌症、炎症或艾滋病的药物中的应用，所述星孢菌素类化合物的结构式为式I或式Ⅱ结构：

R1＝H或Me；

R2＝OH、N(Me)COH或N(Me)COMe；

R3＝O或NOH。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述星孢菌素类化合物的结构式为以下五种中的一种：

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述癌症为前列腺癌、结肠癌、非小细胞肺癌、白血病、肝癌、肾癌、甲状腺癌、皮肤癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、间皮瘤或者外周神经鞘膜瘤。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述癌症为前列腺癌。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症为关节炎或皮肤炎。

6.一种星孢菌素类化合物在制备Brd4蛋白抑制剂中的应用，所述星孢菌素类化合物的结构式为式I或式Ⅱ结构：

R1＝H或Me；

R2＝OH、N(Me)COH或N(Me)COMe；

R3＝O或NOH。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述星孢菌素类化合物的结构式为以下五种中的一种：