CN107557478A - 一种基于简并引物组合扩增长江鱼类线粒体基因全序的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于简并引物组合扩增长江鱼类线粒体基因全序的方法及其应用，所述引物组合由鲟科、银鱼科、鲤科、鲑科、鳗鲡科、鲇科、鲿科、鳉科、鱵科、合鳃鱼科、鮨科、鰕虎鱼科、鳢科、鮠科、鳅科鱼类的线粒体全序进行比对，在保守区域设计而来，包括Mt‑1F,Mt‑1R;Mt‑2F,Mt‑2R;Mt‑3F,Mt‑3R;Mt‑4F,Mt‑4R;Mt‑5F,Mt‑5R;Mt‑6F,Mt‑6R及Mt‑7F,Mt‑7R。本发明利用上述7对引物进行PCR扩增相应基因片段，经过连接转化、测序拼接得到线粒体基因全序列，引物组合少，扩增效果好，可有效的对监测鱼类、鱼卵进行分类鉴定。本发明基于鱼类线粒体保守区域设计简并引物，可得到多种鱼种的线粒体基因全序，通用性强，得到的数据可应用到鱼类线粒体基因组研究中，完善线粒体数据库。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体指一种基于简并引物组合扩增长江鱼类线粒体基因全序的方法及其应用
背景技术
传统的鱼类物种分类往往依赖于其外部形态特征，包括体长、体高、体色、鳍条数、斑纹或者身体各部分的相对测量值等。然而有些鱼类分布范围广，种类多，且在不同生长阶段形态特征变化较大，这对研究人员进行鱼类种类鉴定造成了一定的困难。另外，有些鱼类在早期发育阶段外部形态相似，在种类鉴定时往往会出现一些偏差，即使专业研究人员也难免出错。目前，有很多生态监测研究，比如人工鱼巢的增殖效果研究，需要将粘附在鱼巢上的鱼卵剥离，于室内培养至有明显性状特征的阶段才能进行物种鉴定，花费时间较长，且由于死亡量较大，导致最终的鱼巢增殖效果评价有偏差。所以，一种可以快速、准确进行鱼种分类的技术是十分必要。
鱼类mtDNA(线粒体DNA)具有分子小、结构简单、进化速度快，不同区域进化速度存在差异等特点，是一个相对独立的复制单位，正是由于这些特点，鱼类线粒体基因已经成为鱼类系统发育和群体遗传常用的研究手段，随着测序技术的推广，近年来越来越多的生态监测工作采用分析线粒体基因来研究区域内的物种组成，常用的鱼类线粒体基因片段有16srDNA、COI、Cytb1、Cytb4、D-loop，刘其根等对上述基因片段进行扩增，获取了千岛湖库区的鱼类群落结构，与历年监测调查结果相符。但由于上述片段较短，在区分一些遗传距离较为相近的鱼种时常会出现误差，所以，利用线粒体全序进行比对的结果最为可靠。目前，NCBI数据库共有7539条鱼类线粒体基因序列，其中，中国地域上传的鱼类线粒体基因序列共有2271条，主要来自于洞庭湖、鄱阳湖、香河、漓江、长江流域及各省市，整个数据库包含了大部分长江流域的鱼类线粒体基因序列，为本发明后期的鱼种鉴定奠定基础。但目前，常用的mtDNA扩增手段有2种，一种是基于近源物种设计引物、扩增获取全序；另一种基于高通量测序并进行组装获取。第一种方法过于依赖近源物种，而第二种成本过高。所以，一种强普适性的、经济可行的鱼种线粒体全序测定方法十分必要。本发明通过不断尝试，将长江水系中富有的几科鱼类：鲟科、银鱼科、鲤科、鲑科、鳗鲡科、鲤科、鲇科、鲿科、鳉科、鱵科、合鳃鱼科、鮨科、鰕虎鱼科、鳢科、鮠科、鳅科鱼类的线粒体全序进行比对，在保守区域设计简并引物，得到7对引物将全长16000bp左右的序列分割成7个片段，后期通过PCR扩增、连接转化、测序拼接得到线粒体基因的全序列，提高了鱼种鉴定的准确性，同时该方法的广泛应用也将更好的完善NCBI中长江流域鱼种线粒体基因序列数据库，除了在鱼种鉴定中的应用，该方法在鱼类种群进化、物种多样性及遗传多样性的研究中也具有非常重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于简并引物组合扩增长江鱼类线粒体基因全序的方法及其应用
为了实现本发明目的，本发明的一种用于扩增鱼类线粒体基因全序的简并引物组合，包括：
第一对引物：
Mt-1F:5’-ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
Mt-1R:5’-AGATAGAAACTGACCTGGATT-3’
第二对引物：
Mt-2F:5’-GTTCAACGATTAAAGTCCTAC-3’
Mt-2R:5’-AARRGTAGRTGRATGTCGCTG-3’
第三对引物：
Mt-3F:5’-GMAGGCCTYGATCCTRCAAA-3’
Mt-3R:5’-GCYGCRTCTTGRAAKCCTA-3’
第四对引物：
Mt-4F:5’-GTTTCAAGYCARYCRCATAA-3’
Mt-4R:5’-TRAGCCGAAATCARAKGTC-3’
第五对引物：
Mt-5F:5’-AGTAYRWGTGACTTCCAATCA-3’
Mt-5R:5’-CATAGCTKYYRCTTGGAKTTG-3’
第六对引物：
Mt-6F:5’-TAGGAACCAAAAACTCTTGGT-3’
Mt-6R:5’-ACAACGGTGGTTYTTCAAG-3’
第七对引物：
Mt-7F:5’-TGACTTGAARAACCACCGT-3’
Mt-7R:5’-ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3
其中：Y代表碱基C或T；M代表碱基C或A；R代表碱基A或G；W代表碱基A或T；K代表碱基T或G；H代表碱基A、T或C。
本发明还提供上述简并引物组合的用于扩增鱼类线粒体对应片段的天根DNA试剂盒及试剂。所述试剂包括一种或多种LA Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs。
本发明还提供所述简并引物组合在进行鱼种分类中的应用，包括以下步骤：
1)提取样品中的DNA；
2)以步骤1)中提取的DNA为模板，利用上述7对引物分别进行PCR扩增反应；
3)将步骤2)得到的7个基因片段进行切胶回收、连接转化、测序拼接，得到线粒体基因全序列；
4)在NCBI中对步骤3)得到的序列进行Blast比对，确定种类。
优选地，PCR反应体系为每25μl体系中：10xbuffer 2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTPs(10mM)1μl，浓度为100pmol/μl的正反引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，ddH2O 17.75μl。
优选地，PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，48-65℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。其中，退火温度优选55℃。
优选地，连接体系为每5μl接体系中：胶回收产物1-4μl，pEASY-T1 CloningVector 1μl，ddH2O 3μl；连接反应体系为：25℃连接20-30min；4℃保存用于转化克隆测序。其中，连接体系胶回收产物优选1μl，反应体系优选25℃连接25min。
具体地，本发明利用几种具有代表性的鲟科、银鱼科、鲤科、鲑科、鳗鲡科、鲤科、鲇科、鲿科、鳉科、鱵科、合鳃鱼科、鮨科、鰕虎鱼科、鳢科、鮠科、鳅科鱼类的线粒体基因全序进行比对，根据保守区域设计简并引物，再利用简并引物扩增已知和待测种类的鱼类线粒体基因进行验证，一方面验证所设计引物的准确性，另一方面验证该引物组合是否具有100％的的扩增效率，每对引物均能较好的扩增出相应片段。流程如下：
1)通用引物设计
从NCBI网站上下载鲟科2种、银鱼科2种、鲑科2种、鳗鲡科2种，鲤科9种、鲇科1种、鲿科2种，鳉科1种，鱵科1种，合鳃鱼科1种，鮨科2种，鰕虎鱼科1种，鳢科1种，鮠科2种、鳅科4种鱼类的线粒体基因序列：Acipenser sinensis(KJ174513.1),Acipenser dabryanus(AY510085.1),Protosalanx hyalocranius(NC_024109.1),Hemisalanx brachyrostralis(NC_029157.1),Hucho bleekeri(HM804473.1),Hucho taimen(KJ711550.1),Anguillajaponica(CM002536.1),Anguilla marmorata(NC_006540.1),Aphyocypris chinensis(NC_008650.1),Ctenopharynodon idellus(NC_025590.1),Cyprinus carpio(KU050703.1)，Xenocypris davidi(KF039718.1),Rhodeus ocellatus(DQ026430.1),Ancherythroculter nigrocauda(NC_021414.1),Coreius heterodon(NC_020042.1),Onychostoma sima(NC_021972.1),Lepturichthys fimbriata(NC_024609.1),Silurusasotus(JX256247.1),Pelteobagrus vachelli(HM746660.1),Mystus macropterus(NC_019592.1),Oryzias latipes(NC_004387.1),Tylosurus melanotus(KU605633.1),Monopterus albus(KP779625.1),Coreosiniperca roulei(NC_024432.1),Sinipercachuatsi(NC_015822.1),Rhinogobius giurinus(KU871066.1),Channa argus(KC823605.1),Tylosurus melanotus(KU605633.1),Takifugu obscurus(EF672695.1),Leptobotia elongata(JQ230103.1),Misgurnus anguillicaudatus(KM186181.1),Sinibotia superciliaris(JX683724.1),Triplophysa pappenheimi(NC_033972.1)。利用DNAMAN软件对33种序列进行比对，根据保守区域，设计7对简并引物(SeqIDNo.1-14)：
第一对引物(扩增长度约为2500bp):
Mt-1F:5’-ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
Mt-1R:5’-AGATAGAAACTGACCTGGATT-3’
第二对引物(扩增长度约为2700bp):
Mt-2F:5’-GTTCAACGATTAAAGTCCTAC-3’
Mt-2R:5’-AARRGTAGRTGRATGTCGCTG-3’
第三对引物(扩增长度约为2000bp):
Mt-3F:5’-GMAGGCCTYGATCCTRCAAA-3’
Mt-3R:5’-GCYGCRTCTTGRAAKCCTA-3’
第四对引物(扩增长度约为2900bp):
Mt-4F:5’-GTTTCAAGYCARYCRCATAA-3’
Mt-4R:5’-TRAGCCGAAATCARAKGTC-3’
第五对引物(扩增长度约为2300bp):
Mt-5F:5’-AGTAYRWGTGACTTCCAATCA-3’
Mt-5R:5’-CATAGCTKYYRCTTGGAKTTG-3’
第六对引物(扩增长度约为2400bp):
Mt-6F:5’-TAGGAACCAAAAACTCTTGGT-3’
Mt-6R:5’-ACAACGGTGGTTYTTCAAG-3’
第七对引物(扩增长度约为2500bp):
Mt-7F:5’-TGACTTGAARAACCACCGT-3’
Mt-7R:5’-ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
其中：Y代表碱基C或T；M代表碱基C或A；R代表碱基A或G；W代表碱基A或T；K代表碱基T或G；H代表碱基A、T或C。其中，第一对引物扩增产物为12SRNA*,tRNA-Val,16SRNA*，有2*2*3＝12种组合形式；第二对引物扩增产物为16SRNA*,tRNA-Leu,ND1,tRNA-Ile,tRNA-Gln,tRNA-Met,ND2,tRNA-Trp,tRNA-Ala,tRNA-Asn,tRNA-Cys*，有2*2*2＝8种组合形式；第三对引物扩增产物为tRNA-Asn*,tRNA-Cys,tRNA-Tyr,COI,tRNA-Ser,tRNA-Asp,COII*，有2*2*2*2*2*2*2＝128种组合形式；第四对引物扩增产物为tRNA-Asp*,COII,tRNA-Lys,ATP8,ATP6,COIII,tRNA-Gly,ND3,tRNA-Arg,ND4L,ND4*，有2*2*2*2*2*2*2＝128种组合形式；第五对引物扩增产物为ND3*,tRNA-Arg,ND4L,ND4,tRNA-His,tRNA-Ser*，有2*2*2*2*2*2*2*2＝256种组合形式；第六对引物扩增产物为tRNA-His*,tRNA-Ser,tRNA-Leu,ND5*，有2*2*2*2*2*＝32种组合形式；第七对引物扩增产物为ND5*,ND6,tRNA-Glu,CYTB,tRNA-Thr,tRNA-Pro,D-loop,tRNA-Phe,12SRNA*，有2*2*2*2*2*2*2*3＝384种组合形式。
2)提取样品中的DNA
使用TIANGENTIANampGenomicDNAKit(血液/细胞/组织基因组DNA提取)试剂盒提取待检物种DNA。提取时，先将样品组织(鳍、肌肉、鱼卵等)剪碎，挑取少量样品于200μl缓冲液GA中，加入20μl蛋白酶K溶液，混匀，于56℃消化30-60min。加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。加入200μl无水乙醇，将所有液体转移到吸附柱中,12000rpm离心2分钟。弃废液，向吸附柱中加入500μlGD，于12000rpm离心2min。弃废液，向吸附柱加入600μl漂洗液PW，于12000rpm离心2min。重复此步骤。然后弃废液，于12000rpm离心2min，并在室温彻底晾干。将吸附柱置于新的EP管中，向吸附柱加入50μlddH2O，于12000rpm离心2min。将得到DNA置于-20度保存。
3)PCR扩增、回收、转化、克隆、测序
利用上述7对引物，分别对提取的待检物种DNA进行PCR来扩增相对应的目的片段。PCR反应体系为每25μl体系中：10xbuffer2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTPs(10mM)1μl，浓度为100pmol/μl的正反引物各0.5μl，模板DNA1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，ddH2O 17.75μl。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，48-65℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。其中，退火温度优选55℃。
将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小并切胶回收，连接，转化，测序。连接体系为每5μl体系中：胶回收产物1-4μl，pEASY-T1CloningVector1μl，ddH2O3μl；连接反应条件为：25℃连接20-30min；4℃保存用于转化。其中，连接体系胶回收产物优选1μl，反应体系优选25℃连接25min。
将5μl的连接产物转入100μlDH5α感受态细胞中，冰上放置30min，然后42℃热激40s，冰上放置2min。将转化的产物加入到800μlLB培养基中，于37℃300rpm培养90min。取100μl培养液在含氨苄的LBA培养基上涂板，37℃过夜培养，进行挑菌培养测序。
4)序列拼接，确定物种
将得到的7段序列进行拼接，得到完整的线粒体基因全序，在NCBI上Blast比对，鉴定物种信息。
本发明通过设计的7对简并引物，可较好的扩增出相对应的目的片段，经过拼接可得到鱼种线粒体基因的全部序列，利用线粒体全序可以有效的对待测鱼种进行分类鉴定。
本发明具有以下优点：
1.适用性：传统的分类学要求通过区分鱼体形态的差异来进行种类鉴定，对鉴定人员的专业要求很高，没有大量鱼类形态鉴定经验的人难以完成。而本发明的简并引物，只要操作人员具有基本的分子实验操作能力就可胜任，对分类学专业知识要求不高，具有更高的适用性。
2.高效性：传统形态鉴定需要花费大量时间，特别当采集到鱼卵时，必需暂养到可鉴别期才能进行鉴定工作，费时费力。而本发明的简并引物，不受发育期影响，只要收集到包含鱼体DNA信息的材料便可开始鉴定工作。
3.通用性：本发明针对长江鱼类线粒体保守区域设计简并引物，可以对所有长江鱼类进行有效扩增。
4.准确性：本发明设计的简并引物通过线粒体基因全序进行分子鉴定，大大提高了分子鉴定的准确性，且避免了由人为原因造成的鉴定误差。
附图说明
图1为本发明实施例2中利用上述7对简并引物扩增出的12种鱼类的7个线粒体基因片段；其中，中间泳道为DNA Marker，A～G分别为7对简并引物对应的扩增产物，1～12泳道为12个样品(其中，3,4,11,12为未知鱼种，其它为已知鱼种)。
具体实施方式
实施例1扩增鱼类线粒体基因的简并引物组合的设计
从NCBI网站上下载鲟科2种、银鱼科2种、鲑科2种、鳗鲡科2种，鲤科9种、鲇科1种、鲿科2种，鳉科1种，鱵科1种，合鳃鱼科1种，鮨科2种，鰕虎鱼科1种，鳢科1种，鮠科2种、鳅科4种鱼类的线粒体基因序列：Acipenser sinensis(KJ174513.1),Acipenser dabryanus(AY510085.1),Protosalanx hyalocranius(NC_024109.1),Hemisalanx brachyrostralis(NC_029157.1),Hucho bleekeri(HM804473.1),Hucho taimen(KJ711550.1),Anguilla japonica(CM002536.1),Anguilla marmorata(NC_006540.1),Aphyocypris chinensis(NC_008650.1),Ctenopharynodon idellus(NC_025590.1),Cyprinus carpio(KU050703.1)，Xenocypris davidi(KF039718.1),Rhodeus ocellatus(DQ026430.1),Ancherythroculter nigrocauda(NC_021414.1),Coreius heterodon(NC_020042.1),Onychostoma sima(NC_021972.1),Lepturichthysfimbriata(NC_024609.1),Silurus asotus(JX256247.1),Pelteobagrus vachelli(HM746660.1),Mystus macropterus(NC_019592.1),Oryzias latipes(NC_004387.1),Tylosurus melanotus(KU605633.1),Monopterus albus(KP779625.1),Coreosiniperca roulei(NC_024432.1),Siniperca chuatsi(NC_015822.1),Rhinogobius giurinus(KU871066.1),Channa argus(KC823605.1),Tylosurus melanotus(KU605633.1),Takifugu obscurus(EF672695.1),Leptobotia elongata(JQ230103.1),Misgurnus anguillicaudatus(KM186181.1),Sinibotia superciliaris(JX683724.1),Triplophysa pappenheimi(NC_033972.1)。利用DNAMAN软件对33种序列进行比对，根据保守区域，设计7对简并引物(SeqIDNo.1-14)：
第一对引物(扩增长度约为2500bp):
Mt-1F:5’-ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
Mt-1R:5’-AGATAGAAACTGACCTGGATT-3’
第二对引物(扩增长度约为2700bp):
Mt-2F:5’-GTTCAACGATTAAAGTCCTAC-3’
Mt-2R:5’-AARRGTAGRTGRATGTCGCTG-3’
第三对引物(扩增长度约为2000bp):
Mt-3F:5’-GMAGGCCTYGATCCTRCAAA-3’
Mt-3R:5’-GCYGCRTCTTGRAAKCCTA-3’
第四对引物(扩增长度约为2900bp):
Mt-4F:5’-GTTTCAAGYCARYCRCATAA-3’
Mt-4R:5’-TRAGCCGAAATCARAKGTC-3’
第五对引物(扩增长度约为2300bp):
Mt-5F:5’-AGTAYRWGTGACTTCCAATCA-3’
Mt-5R:5’-CATAGCTKYYRCTTGGAKTTG-3’
第六对引物(扩增长度约为2400bp):
Mt-6F:5’-TAGGAACCAAAAACTCTTGGT-3’
Mt-6R:5’-ACAACGGTGGTTYTTCAAG-3’
第七对引物(扩增长度约为2500bp):
Mt-7F:5’-TGACTTGAARAACCACCGT-3’
Mt-7R:5’-ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
其中：Y代表碱基C或T；M代表碱基C或A；R代表碱基A或G；W代表碱基A或T；K代表碱基T或G；H代表碱基A、T或C。
实施例2已知鱼种验证简并引物扩增结果正确性及对未知鱼种的分类鉴定
1.样本采集
样本来自于中华鲟研究所及长江上游渔获物调查时采集到的鳍条样本，将鳍条保存于乙醇中带回，若时间较长要定期更换乙醇。
2.样本DNA提取
使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit(血液/细胞/组织基因组DNA提取)试剂盒提取待检物种DNA。提取时，先将样品组织(鳍、肌肉、鱼卵等)剪碎，挑取少量样品于200μl缓冲液GA中，加入20μl蛋白酶K溶液，混匀，于56℃消化30-60min。加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min。加入200μl无水乙醇，将所有液体转移到吸附柱中，12000rpm离心2分钟。弃废液，向吸附柱中加入500μl GD，于12000rpm离心2min。弃废液，向吸附柱加入600μl漂洗液PW，于12000rpm离心2min。重复此步骤。然后弃废液，于12000rpm离心2min，并在室温彻底晾干。将吸附柱置于新的EP管中，向吸附柱加入50μl ddH2O，于12000rpm离心2min。将得到DNA置于-20℃保存。
3.PCR扩增目的片段
利用上述7对引物，分别对提取的待检物种DNA进行PCR来扩增相对应的目的片段。PCR反应体系为每25μl体系中：10xbuffer 2.5μl，MgCl2(25mM)1.5μl，dNTPs(10mM)1μl，浓度为100pmol/μl的正反引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，ddH2O 17.75μl。PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，48-65℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min。其中，退火温度优选55℃。
4.测序、拼接及物种鉴定
将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小并切胶回收，连接，转化，测序。连接体系为每5μl体系中：胶回收产物1-4μl，pEASY-T1 Cloning Vector 1μl，ddH2O 3μl；连接反应条件为：25℃连接20-30min；4℃保存用于转化。其中，连接体系胶回收产物优选1μl，反应体系优选25℃连接25min。
将5μl的连接产物转入100μl DH5α感受态细胞中，冰上放置30min，然后42℃热激40s，冰上放置2min。将转化的产物加入到800μl LB培养基中，于37℃300rpm培养90min。取100μl培养液在含氨苄的LBA培养基上涂板，37℃过夜培养，进行挑菌培养测序。
将得到的7段序列进行拼接，得到完整的线粒体基因全序，在NCBI上Blast比对，鉴定物种信息。结果显示：Megalobramapellegrini(厚颌鲂),Acipenser sinensis(中华鲟),Leiocassis longirostris(长吻鮠),Myxocyprinus asiaticus(胭脂鱼),Lepturichthysfimbriata(犁头鳅),Pelteobagrus vachelli(瓦氏黄颡鱼),Pseudorasbora parva(麦穗鱼),Coreius heterokon(铜鱼,)这8种已知鱼种的线粒体基因鉴定结果与传统鉴定结果相一致，证明了简并引物鉴定结果的准确性；对其他四种待测鱼种进行分类鉴定结果显示为：Procyprisrabaudi,Erythroculter ilishaeformis,Acipenser dabryanus,Siniperca chuatsi,前两者属于鲤科鱼类岩原鲤、翘嘴红鲌，后两者依次为属于鲟科鱼类达氏鲟、鮨科鱼类鳜鱼。
根据已知及待测鱼种的鉴定，结果表明，利用本发明的简并引物组合，全部的鱼种均可扩增出条带，待测鱼种经过序列鉴定为4种，说明该简并引物具有良好的通用性，扩增效率高，且已知鱼种的鉴定验证了本发明简并引物鉴定结果的准确性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在不偏离本发明精神的基础上所做出的改进，均属本发明要求保护的范围。
其中：序列1～14分别代表Mt-1F，Mt-1R，Mt-2F，Mt-2R，Mt-3F，Mt-3R，Mt-4F，Mt-4R，Mt-5F，Mt-5R，Mt-6F，Mt-6R，Mt-7F，Mt-7R；Y代表碱基C或T；M代表碱基C或A；R代表碱基A或G；W代表碱基A或T；K代表碱基T或G；H代表碱基A、T或C。其中，第一对引物扩增产物为12SRNA*,tRNA-Val,16S RNA*，有2*2*3＝12种组合形式；第二对引物扩增产物为16S RNA*,tRNA-Leu,ND1,tRNA-Ile,tRNA-Gln,tRNA-Met,ND2,tRNA-Trp,tRNA-Ala,tRNA-Asn,tRNA-Cys*，有2*2*2＝8种组合形式；第三对引物扩增产物为tRNA-Asn*,tRNA-Cys,tRNA-Tyr,COI,tRNA-Ser,tRNA-Asp,CO II*，有2*2*2*2*2*2*2＝128种组合形式；第四对引物扩增产物为tRNA-Asp*,CO II,tRNA-Lys,ATP8,ATP6,CO III,tRNA-Gly,ND3,tRNA-Arg,ND4L,ND4*，有2*2*2*2*2*2*2＝128种组合形式；第五对引物扩增产物为ND3*,tRNA-Arg,ND4L,ND4,tRNA-His,tRNA-Ser*，有2*2*2*2*2*2*2*2＝256种组合形式；第六对引物扩增产物为tRNA-His*,tRNA-Ser,tRNA-Leu,ND5*，有2*2*2*2*2*＝32种组合形式；第七对引物扩增产物为ND5*,ND6,tRNA-Glu,CYTB,tRNA-Thr,tRNA-Pro,D-loop,tRNA-Phe,12SRNA*，有2*2*2*2*2*2*2*3＝384种组合形式。
1.利用7对简并引物获取的Erythroculter ilishaeformis(翘嘴红鲌)线粒体基因片段序列(加深部分为引物序列)
第一对引物：
TTACACATGCAAGTCTCCGCAACCCCGTGAGTATGCCCTCAATCCCCCGCCCGGGGACGAGGAGCGGGCATCAGGCACAAATTTTAGCCCAAGACGCCTGGCCAAGCCACACCCCCAAGGGAATTCAGCAGTGATAAACATTAAGCCATAAGTGAAAACTTGACTCAGTCAGGGTTAAAAGGGCCGGTAAAACTCGTGCCAGCCACCGCGGTTAAACGAGAGGCCCTAGTTGATAACACCACGGCGTAAAGGGTGGTTAAGGAGAATAACATATTTTTTAAAGCCAAATGGCCCTTTGGCCGTCATACGCTTCTAGGTGTCCGAAGCCCAATTACACGAAAGCAGCTTTAATAAAGCCCACCTGACCCCACGAAAGCTGAGAAACAAACTGGGATTAGATACCCCACTATGCTCAGCCATAAACCTAGACATCCAACTACAATTAGATGTCCGCCCGGGTACTACGAGCATCAGCTTGAAACCCAAAGGACCTGACGGTGCCTCAGACCCCCCTAGAGGAGCCTGTTCTAGAACCGATAACCCCCGTTAAACCTCACCACTTCTAGCCATCCCAGCCTATATACCGCCGTCGTCAGCTTACCCTGTGAAGGTAATAAAAGTAAGCAAAATGGGCACAACCCAGAACGTCAGGTCGAGGTGTAGCGCACGAAGTGGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTATCACAGAACACTACGAACATGCAACATGAAATAGTGCTTGAAGGAGGATTTAGTAGTAAAAAGGAAGCAGAGTGTCCTTTTGAACCCGGCTCTGAGGCGCGTACACACCGCCCGTCACTCTCCCCTGTCAAAACGCAACAAAGATACTTAACACTAAAGCACTGACAAGGGGAGGCAAGTCGTAACATGGTAAGTGTACCGGAAGGTGCACTTGGATTAAACCCAGGGCGTGGCTGAGTTAGTTAAGCATCTCACTTACACCGAGAAGACATCCATGCAAGTTGGATCGCCCTGAGCCAAACAGCTAGCTTAACCACCAATATAACCTAACAATGTTAATAACAAAACATGACCTAACACTACAAACTAAACCATTTTTTTACCTGAGTATGGGAGACAGAAAAGGTTCAACCCAAAGCGATAGAAAAAGTACCGCAAGGGAAAGCTGAAAGAGAAATGAAACAACCCATATAAGCACCAAAAAACAAAGACTAAACCTTGTACCTTTTGCATCATGATTTAGCCAGCACCCTCAGGCAAAGAGACCTTTAGTTTGAAACCCCGAAACCAGGTGAGCTACCCCGAGACAGCCTATTTAAATTTAGGGCTAACCCGTCTCTGTGGCAAAAGAGTGGGAAGAGCTCCGGGTAGAAGTGACAGACCTACCGAACCTGGTGATAGCTGGTTGCCTGAAAAGTGGATAGAAGTTCAGCCTCGTACACCCCAGATCAAAAAACATAACATTAAGACACAAGGGAAACATACGAGAGTTAGTTAAAGGGGGTACAGCCCCTCTAACAAAGGATACAACCTTCACAGGAGGATAAAGATCATAATATATAAAACATACTGTTTTAGTGGGCCTAAAAGCAGCCATCTAAATAGAAAGCGTTAAAGCTCAGACAGAGAGAAGTTTATTATACTGATAAAAAATCTTATTCCCCTAACAATATCAGGCTAACCCATGCCCACATGGAAGAAATTATGCTAAAATGAGTAACAAGAAGACCTGCTCTTCTCCAAGCACAAGTGTAAGCCAGATCGGACAAACCGCTGGAAATTAACGAACTCAACCCAAGAGAGTAATGTGGACAACAAAAAAACCAAGAAAAACCCACAGCTAAACTAATCGTTAACCCCACACTGGAGTGCTATTTTTAAAGGAAAGACTAAAAGAAAGGGAAGGAACTCGGCAAACACAAGCCTCGCCTGTTTACCAAAAACATCGCCTCCTGCAACTAAACTGAGTATAGGAGGTCCAGCCTGCCCAGTGACTACGGGTTCAACGGCCGCGGTATTTTGACCGTGCAAAGGTAGCGCAATCACTTGTCTTTTAAATAGAGACCTGTATGAATGGCTAAACGAGGGCTTAACTGTCTCCCCCTTCAAGTCAGTGAAATTGATTTACCCGTGCAGAAGCGGGTATAACTATACAAGACGAGAAGACCCTTTGGAGCTTAAGGTACAAAATTCAACCACGTTAAGCAACTTAATAAAAAGCAAAAACTTAGTGGAAAATGAAGTTTTACCTTCGGTTGGGGCGACCACGGAGGAAAAACAAGCCTCCGAGTGGAATGGGCCAAACCCCTAAAATTAAGAGAGACATCTCTAAGCCACAGAACATCTGACCAAAAATGATCCGGCTAATAAAGCCGATCAACGAACCAAGTTACCCTAGGGATAACAGCGCAATCCTCTCCCAGAGTCCATATCGACGAGGGGGTTTACGACCTCGATGTTGGATCAGGACATCCTAATGGTGCAGCCGCTATTAAGGGTTCGTTTGTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCAGTTTCTATCT
第二对引物：
GTTCAACGATTAAAGTCCTACGTGATCTGAGTTCAGACCGGAGCAATCCAGGTCAGTTTCTATCTGTAACGCTACTTTTCCTAGTACGAAAGGATCGGAAAAGAGGGGCCCATACTTACAGCACGCCCCACCCCTAATTAATGAAAACAAATAAATTAAACAAAGGGAGGGCCAAAACCCCAACCGCCCGAAATAAGGACATACTGGGGTGGCAGAGCATGGTAAATTGCGAAAGGCCTAAGCCCTTTAAACCAGAGGTTCAAATCCTCTTCCCAGTTTATGCTAAACACTCTAATAAACCACCTAATCAACCCCCTAGCCTATATCGTGCCTGTCCTGCTAGCAGTAGCCTTCCTAACTCTAATCGAACGTAAAGTATTAGGATATATACAACTACGAAAAGGACCAAATGTGGTCGGACCATATGGACTCCTACAACCTATCGCCGACGGAGTAAAATTATTTATCAAAGAACCAGTCCGTCCCTCTACATCTTCTCCGTTCTTATTCTTAGCCACCCCCATCCTCGCATTAACCCTGGCCATAACTCTATGAGCACCCATACCCATACCCTACCCAGTAGTCGACCTCAACTTAGGGGTCCTCTTTATCCTAGCCTTATCAAGCCTCGCAGTATATTCTATTCTAGGATCAGGATGGGCATCAAATTCAAAATATGCACTAATCGGGGCCCTACGGGCTGTAGCCCAAACAATTTCCTATGAAGTAAGCCTCGGACTAATCCTTCTATCAGTAATTATCTTCTCAGGAGGTTATACCCTACAAACATTTAGCACAGCCCAAGAAAGTATCTGACTATTAGCCCCTGCATGACCACTAGCCGCAATATGATATATCTCAACCCTAGCAGAAACTAACCGAGCACCATTTGACCTAACAGAGGGGGAATCAGAACTAGTCTCGGGCTTCAACGTAGAATATGCAGGAGGACCCTTCGCCCTTTTCTTCCTGGCCGAATACGCAAACATCCTATTAATAAATACCCTATCAGCTGTACTATTCCTAGGAACATCACACATCCACCACATCCCAGAACTAACAACAATCAGCCTTATAACTAAAGCCGCACTACTTTCTATTGTATTCCTATGAGTACGAGCCTCGTACCCACGATTCCGGTATGACCAACTAATACACCTTGTATGAAAAAACTTCCTCCCATTAACATTGGCCTTAGTACTATGACATATTGCCCTGCCAATCGCACTAGCGGGCCTTCCCCCACAACTATAATTCAGGAACTGTGCCCGAATGCCTAGGGACCACTTTGATAGAGTGGCCTATAGGGGCTAAAATCCCCTCAGTTCTTAGAAAGAAGGGGGTCGAACCCATGCCCAAGAGATCAAAACTCTTAGTGCTTCCTCTACACCACTTTCTAAGATGGGGTCAGCTAATCAAGCTTTCGGGCCCATACCCCGAACATGACGGTTAAAGTCCCTCCTCCATCAATGAACCCCTATGTACTCGCAATCCTACTATCCAGCCTAGGTTTAGGAACCACCTTAACCTTTGCCAGCTCCCACTGACTACTGGCCTGAATAGGACTAGAAATTAACACCCTGGCAATTATCCCCCTAATAGCACAACACCACCACCCTCGTGCAGTAGAAGCCACCACAAAATACTTCCTAACCCAGGCCACCGCAGCCGCAATAATTATATTTGCGAGCACAACAAACGCCTGAATCACAGGAGAATGAGACATAAACAACATATCAAACCCCCTTGCTAGCACAATGGTCATTACTGCCCTGGCACTTAAAATTGGACTAGCACCAATACACTTCTGAATGCCAGAAGTACTACAAGGACTAGACCTTCTAACAGGGCTAATTTTATCAACATGACAAAAACTCGCCCCATTCGCCCTAATCATCCAAACAGCCCAAGCCGTGGACCCCGTACTACTAACTGCCCTAGGAATCACATCCACCTTGGTCGGAGGATGAGGAGGATTAAACCAAACCCAACTCCGAAAAATCTTAGCCTACTCCTCAATTGCGCACATAGGCTGAATAATTATTATTCTCCAATACACCCCACAACTCACCCTTGTCGCCCTAGGAACATACATTTTTATGACATCCGCAGCATTCCTTACTCTAAAAACATCATCCGCCACAAAAATCAACACCCTCTCAATAGTCTGATCAAAAAGCCCAATCCTAACAACAACCACTGCTCTAGTACTGTTATCACTAGGTGGCCTGCCCCCACTAACAGGATTCATGCCAAAATGACTAATCCTGCAAGAATTGGCAAAACAAAACCTTCCAGCTACTGCCACAATCATAGCCCTGGCTGCCTTACTAAGCCTTTACTTCTACCTGCGCCTCTGTTATGCAATAACACTCACAATCTCTCCCAATACAATCAACTCAATCACCCCCTGACGAACCCAAACAACCCAATCCTCCCTCCCCCTTACCCTATCTACCACAATCGCCCTAGGACTTTTACCTATAACCCCAGCTATTCTAATACTAGCCACCTAGGGACTTAGGATAACATCAGACCAAGAGCCTTCAAAGCTCTAAGCAGAAGTGAAAATCTTCTAGTCCCTGATAAGACCTACAAGAGTCTATCTTGCATTTTCTGATTGCAAATCAAATGTTTTTATTAAACTAAGGCCTTACTAGATGGGAAGGCCTCGATCCTACAAACTCTTAGTTAACAGCTAAGCGCTCAAACCAGCGAGCATCCATCTACTTTT
第三对引物：
GAAGGCCTCGATCCTACAAACTCTTAGTTAACAGCTAAGCGCTCAAACCAGCGAGCATCCATCTACTTTTCCCGCCTATGGCCTAGTAAGGCGGGAAAAGCCCCGGCAGACTACTAATCTACGTCTCTGGATTTGCAATCCAACATGTTTCTTCACCACGGGGCTGATGATAAGGAGAGGACTTAAACCTCTGTCTTCGGGGCTACAACCCGCCGCCTAAGCACTCGGCTACCCTACCTGTGGCAATTACGCGCTGATTCTTTTCTACAAACCACAAAGACATTGGTACCCTTTATCTTGTATTTGGTGCCTGAGCCGGAATAGTGGGAACCGCTCTAAGCCTTCTCATTCGAGCCGAACTAAGCCGACCTGGATCACTTCTGGGCGACGATCAAATCTATAATGTCATTGTCACTGCCCATGCCTTCGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCAATTCTAATCGGAGGATTTGGAAACTGACTCGTACCACTAATAATCGGGGCACCTGATATGGCATTCCCGCGAATAAATAACATGAGTTTCTGACTTCTACCCCCCTCTTTTCTCCTACTGTTGGCCTCCTCTGGTGTCGAAGCCGGAGCTGGACAGGGTGAACAGTCTACCCACCACTCGCAGGCAACCTTGCCCACGCGGGAGCATCCGTAGACCTGACAATTTTCTCGCTTCACCTAGCAGGTGTTTCATCAATTTTAGGTGCAATTAACTTTATCACCACAACTATTAACATAAAACCACCAGCCATCTCTCAATATCAAACACCCCTGTTTGTTTGAGCTGTACTTGTAACAGCCGTACTTCTTCTCCTATCTCTACCAGTCCTAGCCGCTGGAATTACTATACTCCTTACAGACCGAAATCTAAATACCACATTCTTTGACCCGGCAGGCGGGGGAGACCCAATCCTGTATCAACACCTGTTCTGATTCTTCGGCCACCCAGAAGTTTATATTCTCATCTTACCTGGATTTGGAATCATCTCCCACGTTGTAGCCTACTACGCAGGCAAAAAAGAACCATTCGGCTACATAGGAATGGTCTGAGCTATAATGGCCATTGGTCTCCTGGGATTTATTGTATGGGCTCACCATATGTTCACTGTCGGAATGGACGTAGACACTCGTGCATACTTCACATCCGCAACAATAATTATTGCTATCCCAACCGGTGTAAAAGTGTTTAGCTGATTAGCCACACTCCATGGAGGGTCTATTAAATGAGAAACACCTATATTATGAGCCCTCGGATTTATTTTCCTCCTCACAGTAGGTGGACTAACAGGAATTGTTCTAGCCAACTCATCACTCGATATTGTTCTTCACGACACATACTACGTAGTTGCACACTTCCACTACGTATTGTCAATAGGTGCTGTATTTGCCATCATGGCAGCTTTCGTTCACTGATTCCCCCTATTTACAAGGTACACTTTAAATGACACCTGAACAAAAATTCACTTCGGAGTAATATTCATTGGTGTCAATCTTACATTCTTCCCACAACACTTCCTAGGTCTGGCAGGAATGCCACGACGATACTCTGACTACCCAGATGCCTACACCCTGTGAAATACAGTATCATCCATCGGGTCACTTATCTCCCTAGTAGCAGTAATTATGTTCCTATTCATTTTATGAGAAGCCTTCGCCGCTAAACGGGAAGTATCCTCAGTAGAGTTAACTATAACAAACGTAGAATGGCTTCATGGCTGTCCTCCACCATACCACACATTTGAAGAACCCGCATTCGTCCAAGTTCAATCAAACTAACGAGAAAGGAAGGAATTGAACCCCCGTATACTGGTTTCAAGCCAGTCACATAACCACTCTGTCACTTTCTTCTAAAGACATTAGTAAAATACGCAAATTACATCACCTTGTCGAGGTGAAATTGCAGGTTAAACCCCTGTATGTCTTAAGCCCTAAAGCTTAATGGCACATCCCACGCAACTAGGATTCCAAGACGCGGC
第四对引物：
GTTTCAAGCCAGTCACATAACCACTCTGTCACTTTCTTCTAAAGACATTAGTAAAATACGCAAATTACATCACCTTGTCGAGGTGAAATTGCAGGTTAAACCCCTGTATGTCTTAAGCCCTAAAGCTTAATGGCACATCCCACGCAACTAGGATTCCAAGACGCGGCATCACCCGTTATAGAAGAACTTCTTCACTTCCATGACCACGCCCTAATAATCGTGTTCTTAATTAGCACTCTAGTACTTTACATTATTATTGCAATGGTTTCAACTAAGCTTACCAACAAATATATCCTAGACTCTCAAGAGATCGAAATCGTATGAACTATTTTACCAGCCGTAATTCTAGTTTTGATTGCTCTACCCTCCCTTCGAATTTTATACCTTATAGACGAAATCAATGACCCCCATCTAACAATTAAAGCCATAGGACATCAATGATATTGAAGCTATGAGTATACAGACTACGAAGATCTGGGCTTCGACTCCTACATAATCCCGACCCAAGACCTTACACCAGGCCAATTCCGACTCCTAGAAACAGACCACCGGATAGTAGTCCCCATAGAATCACCAGTTCGTGTCCTAGTATCTGCCGAAGATGTATTACACTCCTGAGCCGTCCCATCTTTAGGCGTAAAAATAGACGCAGTGCCAGGCCGACTAAACCAAACTGCCTTCATTGCCTCACGCCCAGGTGTGTTTTACGGACAATGCTCTGAAATTTGCGGAGCGAACCACAGCTTTATACCCATTGTAGTTGAAGCAGTTCCACTAGAACACTTCGAGAGCTGATCCTCATTAATACTAGAAGACGCCTCACTAGAAAGCTAATTATTGGACAAAGCGTTGGCCTTTTAAGCCAAAGTTTGGTGCCTGCCGACCACCTCTAGTGAAATGCCCCAATTAAACCCCAACCCCTGATTTGCAATTCTAGTATTCTCCTGAATCGTCTTTCTTACCATTATCCCAACTAAAATTTTAAATCACACCACACCAAATGAACCAACCCCAATAAGTGAAGAAAAACACAAAACAGAGCCCTGAGACTGACCATGATAATAAGCTTTTTTGACCAATTCGCAAGCCCATCCTTCCTAGGCATTCCACTTATTGCTATTGCAATCGCACTACCATGACTCCTCTTCCCAACCCCGCCATCCCGGTGAATCAACAACCGACTCATCACTCTCCAAACATGGTTCATTAACCGATTTACTAATCAACTAATAATGCCCTTAAATGTAGGAGGACATAAATGAGCGCTTCTACTGGCCTCATTAATAGTATTCCTTATTACTATTAATATATTAGGCCTCCTCCCATATACTTTTACACCCACAACACAACTGTCGCTAAATATAGGATTTGCTGTACCACTGTGACTCGCCACCGTAATTATTGGAATGCGAAATCAGCCAACAGTTGCCCTCGGACACCTTCTACCAGAAGGAACGCCTATTCCTCTAATCCCCGTACTAATTATTATCGAAACAATTAGCCTATTTATTCGACCATTAGCCCTGGGTGTTCGACTTACAGCCAACTTAACTGCCGGCCACTTATTAATTCAACTCATCGCCACAGCTGTATTTGTTTTACTGCCAATAATACCTACAGTAGCCATCCTAACCGCCACCGTTCTCTTCCTCCTAACACTCCTAGAAGTCGCAGTAGCAATAATTCAAGCTTATGTATTTGTACTACTCCTAGGCCACTACCTGCAAGAAAACGTCTAATGGCCCACCAAGCACATGCATATCATATGGTTGATCCAAGCCCATGACCACTAACCGGAGCCGTCGGTGCTCTATTAATAACATCCGGCCTAGCAATCTGGTTCCACTTCCACTCAACAACATTAATAACCCTTGGGGTAATTCTTTTACTTCTTACAATATTCCAATGATGACGTGACATTATTCGAGAAGGAACATTCCAAGGCCACCACACACCACCAGTACAAAAAGGACTACGTTATGGAATAATTCTGTTTATTACCTCAGAGGTGTTCTTCTTCCTAGGATTCTTCTGAGCTTTCTATCACTCAAGCTTAGCACCAACACCAGAACTGGGAGGATGCTGACCCCCAACAGGAATCACTACATTAGACCCCTTCGAGGTTCCCCTCCTCAACACAGCCGTTCTACTAGCATCAGGGGTAACAGTCACATGAGCCCACCATAGCATTATAGAAGGTGAGCGAAAACAAGCCATCCAATCCCTTGCACTCACAATTCTGCTCGGACTCTACTTCACTGCCCTTCAAGCCATAGAATACTATGAAGCACCTTTTACAATCGCAGACGGAGTATACGGCTCTACATTCTTCGTGGCCACAGGGTTCCACGGGCTACATGTCATTATTGGATCATCATTCCTGGCTGTTTGCCTCCTCCGCCAAATCCAATACCACTTTACATCTGAACATCATTTCGGCTTTGAAGCCGCCGCCTGATATTGACATTTCGTTGACGTAGTATGACTATTCCTCTACGTATCCATCTATTGATGAGGCTCATAATCTTTCTAGTATCAAAGTTAGTACAAGTGACTTCCAATCATTTAGTCTTGGTTAAACCCCAGGGAAAGATAATGAACTTAATTATAACTATTCTTACCATCACAATAGCCCTATCCTCAATCCTGGCAATCGTATCTTTCTGACTGCCGCAAATAAACCCAGACGCAGAAAAACTATCTCCCTATGAATGCGGATTCGACCCACTAGGGTCCGCCCGGCTGCCCTTTTCATTACGATTCTTCCTAGTAGCAATCCTATTCCTCCTATTTGACCTAGAAATTGCCCTCCTCCCCCCCCTACCATGAGGAGATCAACTCCATAACCCCACCGGAACATTCTTCTGAGCCACTACAGTCCTAATTCTGTTAACCCTAGGACTGATCTATGAGTGAACTCAAGGTGGCCTAGAATGAGCAGAATAGGGGGTTAGTCCAAAACAAGACCTCTGATTTCGGCTCA
第五对引物：
AGTACAAGTGACTTCCAATCATTTAGTCTTGGTTAAACCCCAGGGAAAGATAATGAACTTAATTATAACTATTCTTACCATCACAATAGCCCTATCCTCAATCCTGGCAATCGTATCTTTCTGACTGCCGCAAATAAACCCAGACGCAGAAAAACTATCTCCCTATGAATGCGGATTCGACCCACTAGGGTCCGCCCGGCTGCCCTTTTCATTACGATTCTTCCTAGTAGCAATCCTATTCCTCCTATTTGACCTAGAAATTGCCCTCCTCCCCCCCCTACCATGAGGAGATCAACTCCATAACCCCACCGGAACATTCTTCTGAGCCACTACAGTCCTAATTCTGTTAACCCTAGGACTGATCTATGAGTGAACTCAAGGTGGCCTAGAATGAGCAGAATAGGGGGTTAGTCCAAAACAAGACCTCTGATTTCGGCTCAGAAAATTATGGTTTAAGTCCATGATCCCCTTATGACACCAGTACACTTTAGCTTTAGCTCAGCATTCATTTTAGGACTAATAGGGCTAGCATTCCACCGCACCCACCTGCTCTCCGCACTCCTATGCTTAGAAGGAATAATATTATCCCTGTTTATTGCACTAGCCCTATGGGCCCTACAATTCGAATCGACAAGCTTCTCCGCAGCCCCTATGCTATTACTAGCCTTCTCCGCCTGCGAAGCAAGCACGGGCCTTGCACTCCTAGTAGCCACAGCCCGAACCCATGGAACTGATCGTTTACAAAACCTTAATCTCCTACAATGCTAAAAGTATTAATCCCCACTGTTATATTATTCCCAACAATTTGATTAACCTCCCCCAAGTGACTATGAACAACCACAACTGCACATAGCCTCCTAATCGCCCTCATCAGTCTCACATGACTAAAATGGACATCAGAAACCGGATGAACCACATCCAACTCATATCTAGCCACAGATCCCCTCTCAACCCCCCTCTTAGTGTTAACATGTTGACTTCTCCCATTGATAATTCTAGCCAGCCAAAACCACGTTAACCCAGAACCTGTCAGCCGACAACGTTTATACATCACTCTCCTCACCTCACTACAAACCTTTCTAATTATGGCATTCGGCGCCACCGAAATTATTATATTTTATATCATATTTGAAGCCACGCTCATCCCAACCCTTATTATTATTACCCGATGAGGAAACCAAACCGAACGCCTCAATGCAGGGACCTATTTTCTATTCTACACCCTAGCAGGGTCCCTCCCGCTACTAGTTGCCCTCCTTCTACTTCAACAATCTACTGGGACTCTATCCATGCTAGTTATCCAATACTCCCAGCCATTACTTCTAGACTCCAGAGGCCACAAAATCTGATGAGCCGGCTGCTTAATTGCATTCTTAGTGAAAATACCATTATACGGAGTACACCTCTGACTACCAAAAGCCCACGTCGAAGCCCCAGTCGCAGGATCCATGGTACTAGCAGCAGTTCTATTAAAACTAGGGGGACACGGAATAATACGAATAATAATTATGCTAGACCCACTATCCAAAGAACTAGTATACCCATTTATTATTCTGGCATTATGAGGCATTATCATGACTGGATCAATTTGCCTTCGACAAACAGACCTCAAGTCCCTAATCGCCTACTCATCTGTCAGCCACATGGGACTTGTAGCGGGAGGAATTCTAATCCAAACCCCATGAGGATTCTCAGGGGCTATTATTCTAATAATCGCCCACGGACTAGTGTCTTCAATACTATTCTGCTTAGCCAACACAGCCTATGAACGAACCCACAGCCGAACCATAATTCTTGCGCGAGGACTACAAATAATTTTCCCATTAACGGCAGTATGATGATTCATCGCCAACCTAGCCAACCTAGCGCTACCCCCACTACCTAACCTAATAGGAGAACTAATAATTATTACAACATTATTCAACTGATCGCCATGAACTATTGCACTCACGGGTGCAGGAACACTAATTACAGCGGGCTACTCCTTATATATATTCCTTATGTCTCAACGGGGCCCAACACCAAACCATATCACTAAACTCCCACCATTTCACACCCGAGAACACCTACTAATAGCCCTTCACCTAATCCCAGTAATTCTCCTTGTAGCAAAGCCAGAACTTATATGAGGCTGATGCTACTAGTAAGTATAGTTTAACCAAAACATTAGATTGTGATTCTAAAAACAGGGGTTAAAATCCCCTTACTCACCAAGGAAGGACAGAAATCAATAAGTACTGCTAATCCTTATGCACCGCGGTTAAAATCCGCGGCTTCCTCACGCTTCTGAAGGATAACAGTTCATCCATTGGTCTTAGGAACCAAAAACTCTTGGTGCAAATCCAAGTGGAAGCTATG
第六对引物：
TAGGAACCAAAAACTCTTGGTGCAAATCCAAGTGGAAGCTATGAATCCAACAACCTTAATCATATCATCCTCACTTACTCTAGTTCTTATTATCCTCATACTTCCTCTACTAACAACACTAAACCCTAAACCACAAAAACCAGAATGAGCAAGTACACACGTCAAAACCGCCGTCAGCACCTCGTTCTTCATCAGCCTTCTCCCACTCATAATCTTTCTAGATCAAGGAATAGAAAGCATCACCACAAACTGACAGTGAATAAACACACACATATTTGATACAAATATCAGCTTCAAATTCGACCACTACTCCCTTATTTTCACCCCTATTGCCCTCTACGTCACCTGGTCTATTCTAGAGTTCGCACTATGATATATGCACTCTGACCCAAATATGAACCGATTTTTCAAATACCTACTTCTATTCCTAGTAGCCATAATTACCCTGGTCACAGCCAACAACATATTCCAACTGTTCATCGGCTGAGAAGGCGTTGGAATTATATCATTCCTACTAATCGGATGGTGGTACGGACGGGCAGATGCTAACACAGCAGCCCTCCAGGCCGTTATCTACAACCGAGTAGGGGACATCGGACTGATTCTAAGCATAGCATGATTCGCAATAAACCTTAACTCCTGAGAAATCCAACAAATCTTCTTCCTATCAAAAAACTTTGACATGACAATCCCCCTAATCGGTCTAATCCTTGCAGCAACAGGAAAATCGGCCCAATTCGGCCTACATCCCTGACTCCCTTCTGCCATGGAGGGCCCTACGCCAGTATCCGCCCTACTCCATTCCAGCACCATGGTCGTTGCAGGAATCTTCCTATTAATTCGCCTCCACCCCCTCATAGAAAACAACGGCCTGGCGCTGACAATCTGCCTCTGCTTAGGAGCACTTACTACACTATTCACAGCCACCTGCGCCCTAACTCAAAATGATATTAAAAAAATCGTAGCTTTCTCAACATCCAGTCAACTAGGCCTGATAATAGTTACAATTGGGTTAAACCAACCACAACTAGCATTCCTCCACATCTGCACACATGCATTCTTCAAAGCTATGCTATTCCTGTGCTCCGGATCAATTATTCACAGCCTAAATGATGAACAAGACATCCGAAAAATAGGAGGCCTTCACAACCTAATACCCGCCACCTCGACCTACCTCACAATTGGTAGCCTGGCACTAACAGGAACCCCATTCTTAGCCGGGTTCTTCTCAAAAGATGCCATCATTGAAGCCCTAAACACCTCTTACCTTAACGCCTGAGCCCTAACCCTTACACTAATCGCCACATCATTCACCGCGGTCTATAGCTTCCGAGTAGTATTTTTCGTAACCATGGGGTCCCCCCGATTTCTGCCACTATCCCCTATTAACGAAAACAATCCATTAGTCATCAACCCTATCAAACGACTTGCCTGAGGAAGCATTATTGCAGGACTTATCATTACATCTAACTTCCTACCCTCAAAAACACCCATTATGACAATACCAACCACCCTAAAATTAGCAGCCCTCATAGTAACTATCATCGGACTTCTAGTGGCCATAGAACTCACAGCCATAACCAATAAACAAGTCAAAATTACCCCCACAATCCCCATACACCACTTTTCAAACATACTAGGGTACTTCCCCGCAATAATCCACCGACTCCCTCCCAAACTTAACTTAACCCTAGGACAATCAGTCGCCACTAAGCTCGACCAAACATGACTTGAAATTACAGGACCAAAAGGACTAGCATTAACCCAAATAATGATATCAAAAATTACAAGCGACATTCAACGAGGTATAATTAAAACCTACCTAACTATTTTCCTCCTAACCCTGACCCTAGCCATTCTTCTAACTCTTATCTAAACGGCTCGAAGAGTCCCACGACTTAAGCCCCGAGTAAGCTCCAACACCACAAGTAGAGTTAAAAGTAATACTCACGCACAAATAACCAACATCACCCCACCAAAAGAATATATAACAGCCACGCCACTAACATCTCCACGTAGTATAGAAAACTCCTTCAACCCGTCAACAACTACCCAAGAACCCTCATATCACCCCCCTCAAAATAACCCGGCCGCTAACACAACACCTAGAAGGTAGACTAACACATACCCAGCTACAGAACGACTTCCCCAGGCCTCCGGAAAAGGCTCAGCAGCCAAGGCTGCTGAATAGGCAAACACCACGAGCATCCCCCCCAAATAAATTAAAAAGAGAACCAAAGACAAGAAAGAACCCCCATAACCAACTAAAATCCCACACCCAACCCCCGCTGCTACTACCAAGCCTAAAGCAGCAAAATAAGGCGTAGGATTAGAAGCAACAGCAATTAAACCCACAACCAGAGCTACCAATAACAAAAACATAAAATAAGTCATAATTCTTGCTCGGATTCTAACCGAGACCAGTGACTTGAAGAACCACCGTTGT
第七对引物：
TGACTTGAAGAACCACCGTTGTAGTTCAACTACAAGAACAATAATGGCAAGCCTACGAAAAACCCACCCACTAATAAAAATCGCCAACGACGCACTAGTTGACCTCCCCACACCATCTAACATTTCCGTATGATGAAATTTCGGGTCTCTCCTGGGGTTGTGTTTAATTACTCAAATCCTAACCGGATTGTTCCTAGCCATACACTATACCTCTGACATCTCAACCGCATTTTCATCAGTAGTCCACATCTGCCGAGACGTGAACTATGGCTGACTTATCCGTAATATTCACGCCAACGGGGCATCATTCTTTTTTATCTGTATTTATATACACATTGCCCGCGGCCTATACTATGGATCCTACCTGTATAAAGAAACCTGAAACATTGGGGTAGTCCTTCTCCTGTTAGTTATAATAACAGCCTTTGTTGGCTACGTCCTTCCATGAGGACAAATATCCTTTTGAGGTGCCACAGTAATTACAAATCTACTATCAGCAGTCCCCTACATAGGGGACACCCTCGTTCAATGAATCTGAGGTGGCTTCTCAGTAGACAACGCGACACTAACACGGATCTTCGCATTCCACTTCCTATTACCATTCATCGTCGCCGCCGCGACCATCCTACACCTACTTTTCCTCCACGAAACAGGCTCGAACAACCCAGCCGGGCTAAACTCCGACGCAGACAAAATCTCCTTCCACCCATACTTCTCATATAAAGACCTTCTAGGATTTGTAGTGATATTATTAGCCCTCACATCATTAGCACTATTCTCTCCAAATCTCCTGGGAGACCCAGAGAATTTCACCCCTGCAAACCCACTAGTCACCCCTCCACATATCAAGCCAGAATGATACTTCCTATTTGCTTACGCCATTCTACGGTCTATCCCGAACAAACTAGGAGGGGTCCTTGCATTGCTATTCTCTATTTTAGTCCTAATGGTGGTACCAATTTTACACACCTCAAAACAACGAGGACTAACATTCCGCCCGATCACTCAATTCCTATTCTGAACCCTAGTAGCAGATATAATTATCCTAACATGAATTGGAGGCATACCTGTAGAACATCCATACATTATCATCGGACAAATTGCATCAGTCCTTTACTTCGCATTATTCCTCATCCTCACTCCACTAGCAGGATGACTAGAAAATAAAGCACTAAAATGAGCTTGCCCTAGTAGCTTAGTATTAAAGCATCGGTCTTGTAATCCGAAGATCGGAGGTTATAGTAACCTATATGGTTTAATACATATATATGTATTATATTACATAATGCATTAGTACAGATATATGTATTATCACCATTCATTTATATTAACCATAAAGCAAGTACTAACGTTCAAGACGTACATAAACCAAAATATTAAAACTCACAAATAATTTATTTAGACCCGGGAAATAGATTATTCCCCTATAATTGGCCCTCAAATATTTCCTTGAAATAATCAACTAGGATTTAACTCAACCATATTAATGTAGTAAGAGACCACCAACTGGTTTATATTAAGGTATATCCTGCATGATAGGATCAGGGACACAAATTGTGGGGGTAACACAGAATGAACTATTACTTGCATCTGGCTTCAATCTCAGGAACATAACTGTAAAATTCCACCCTCGGATAATTATGTCTGGCATATGGTTAAATGATGTGAGTACATACTCCTCATTAACCCCACATGCCGGGCATTCTTTTATATGCATAGGGGTTCTCCTTTTTGGTTACCTTTCACCTTGCATCTCAGAGTGCAGGCTCAAATGACAAATCAAGGTTGAACATATTCCTTGCTTGAATTCGAGTAGGTCAATTATTAAAAGACATAACTTAAGAATTACATACTTTTAACTCAAGTGCATAACACATTCATTCCTTCTTCAACTTACCCCTATATATATGCCCCCCCTCTCGGTTTCTGCGCGACAAACCCCCCTACCCCCTACGCTCAGCAAATCCTGTTATCCTTGTCAAACCCCGAAACCAAGGAAGGTTCGAGAACGTATAAGCTAGCAAGTTGATTTATGGGCTAGCTATCCGCATTATATATATATATATACATACACATCGCATTAATTTGCCGCAAATTTCTCCAAATATTGGCCTAAAAGTCCCTATTAAATTTTTAGGGCGCGCCCCAATGCTAAAAAGTCCAACATTAAAAAGCGCTAGCGTAGCTTAATACAAAGCATAACACTGAAGATGTTAAGATGGGCCCTGAGAAGCTCCGCATGCATAAAGGCATGGTCCCGACCTTATTATCAGCTCTTACCCGACTTACACATGCAAGTCTCCGCAGTCCCGTGAGTATGCCCTCAATCCCCCGCCCGGGGACGAGGAGCGGGCATCAGGCACAAATTTTAGCCCAAGACGCCTGGCCAAGCCACACCCCCAAGGGAATTCAGCAGTGATAAACATTAAGCCATAAGTGAAAACTTGACTCAGTCAGGGCTAAGAGGGCCGGTAAAACT
翘嘴红鮊线粒体DNA全序：
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agatagaaac tgacctggat t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gttcaacgat taaagtccta c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
aarrgtagrt gratgtcgct g 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
gmaggcctyg atcctrcaaa 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
gcygcrtctt graakccta 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 7
gtttcaagyc arycrcataa 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
tragccgaaa tcarakgtc 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
agtayrwgtg acttccaatc a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 10
catagctkyy rcttggaktt g 21
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 11
taggaaccaa aaactcttgg t 21
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
acaacggtgg ttyttcaag 19
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
tgacttgaar aaccaccgt 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 14
arwtttaccg gcccthtta 19
Claims (9)
1.用于扩增鱼类线粒体基因全序的简并引物组合，其特征在于，包括：
第一对引物：
Mt-1F: 5’- ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
Mt-1R: 5’-AGATAGAAACTGACCTGGATT-3’
第二对引物：
Mt-2F: 5’- GTTCAACGATTAAAGTCCTAC-3’
Mt-2R: 5’- AARRGTAGRTGRATGTCGCTG-3’
第三对引物：
Mt-3F: 5’- GMAGGCCTYGATCCTRCAAA-3’
Mt-3R: 5’- GCYGCRTCTTGRAAKCCTA-3’
第四对引物：
Mt-4F: 5’- GTTTCAAGYCARYCRCATAA-3’
Mt-4R: 5’- TRAGCCGAAATCARAKGTC-3’
第五对引物：
Mt-5F: 5’- AGTAYRWGTGACTTCCAATCA-3’
Mt-5R: 5’- CATAGCTKYYRCTTGGAKTTG-3’
第六对引物：
Mt-6F: 5’- TAGGAACCAAAAACTCTTGGT-3’
Mt-6R: 5’- ACAACGGTGGTTYTTCAAG-3’
第七对引物：
Mt-7F: 5’- TGACTTGAARAACCACCGT-3’
Mt-7R: 5’- ARWTTTACCGGCCCTHTTA-3’
其中：Y代表碱基C或T；M代表碱基C或A；R代表碱基A或G；W代表碱基A或T；K代表碱基T或G；H代表碱基A、T或C。
2.含有权利要求1所述简并引物组合的用于扩增鱼类线粒体对应片段的TIANGENTIANamp Genomic DNA Kit（血液/细胞/组织基因组DNA提取）试剂盒及试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，包括一种或多种LA Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、dNTPs。
4.权利要求1所述简并引物组合在进行鱼种鉴定中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取样品中的DNA；
2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用权利要求1中的7对引物分别进行PCR扩增反应；
3）将步骤2）得到的7个基因片段进行切胶回收、连接转化、测序拼接，得到线粒体基因全序列；
4）在NCBI中对步骤3）得到的序列进行Blast比对，确定种类。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR扩增反应体系为每25μl体系中：10xbuffer 2.5 μl，MgCl2（25mM）1.5μl，dNTPs（10mM）1μl，浓度为100pmol/μl的正反引物各0.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶（5U/μl）0.25μl，ddH2O 17.75μl。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，48-65℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸10min，其中，退火温度优选55℃。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包含用于切胶回收的OMEGA胶回收试剂盒以及用于连接转化的
pEASY-T1 Cloning Kit。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，1）连接体系为每5μl体系中：胶回收产物1-4μl，pEASY-T1 Cloning Vector 1μl，剩余ddH2O 补充；2）连接反应体系为：25℃ 连接20-30min；4℃保存用于转化克隆测序；其中，连接体系胶回收产物优选1μl，反应体系优选25℃连接25min。
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