CN107557476A - 一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，选取苏云金杆菌制剂对其活性低下的健康靶虫若干只，采集靶虫血淋巴；将苏云金杆菌制剂杀虫因子固定到分子支架上；将血淋巴加到固定有杀虫因子的分子支架上，血淋巴中能与杀虫因子结合的成分与杀虫因子结合，从而被间接固定在分子支架上，而不能与杀虫因子结合的成分则不会被固定；对血淋巴中与杀虫因子结合的成分进行分析鉴定，找出苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下的原因，据此寻找相应的克服途径。本发明可为苏云金杆菌制剂生产厂家寻求克服现有生产菌种对靶虫活性低下的方法提供依据。
Description
技术领域
本发明属于苏云金杆菌制剂分析技术领域，具体涉及一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法。
背景技术
我国是一个人口多耕地少的农业生产大国，作物的种类多，有害生物的种类亦多。提高单位耕地面积的产量是解决粮食问题的主要措施，而农药在保护农作物免受有害生物危害、改善农作物的抗性以及促进农业增产方面起着重要的作用。化学农药虽然在防治害虫上取得显著的经济效益，但随着时间的推移，其弊端(对人体健康的危害、对有益生物的杀伤、对环境和食品的污染以及害虫抗药性剧增等)日益突出，因而生物杀虫剂的应用与日俱增。
苏云金杆菌制剂是迄今最为成功的微生物杀虫剂，已被广泛应用于农林卫生害虫的防治。但是，仍然有不少重要的农林卫生害虫，现有苏云金杆菌制剂对其防效低下。每一种重要害虫的防治费用每年都数以亿计，市场空间十分巨大。尽管如此，厂家通常不会轻易更换生产菌种，其原因是缺乏相应有效的菌种或是虽有有效菌种但其发酵性能不佳或现有设备与条件无法满足其发酵等等。因此，分析苏云金杆菌制剂对靶标害虫活性低下的原因，进而寻求相应的克服方法，对苏云金杆菌制剂产业而言意义重大。
昆虫的血液是体腔内循环流动的淋巴样液体，常称为血淋巴，其含量随虫种和虫态的不同而变化很大，一般占虫体体积的15％～75％。昆虫血淋巴兼具有哺乳动物血液和淋巴液的双重功能，具有运输和机械功能、贮存与代谢功能、防卫与免疫功能。血淋巴作为昆虫防卫与免疫的重要场所，在靶标害虫与苏云金杆菌制剂的“争斗”中应当扮演了重要角色，但是目前并无相关报道，也没有通过血淋巴分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，包括：
1)选取苏云金杆菌制剂对其活性低下的健康靶虫若干只，采集靶虫血淋巴；
2)将苏云金杆菌制剂杀虫因子固定到分子支架上：称取0.18～0.22g的Sepharose加到浓度为0.8～1.2mg/mL的杀虫因子溶液中，室温下100～200rpm孵育4～6h；孵育完成后加入9～11mg Glycine，继续孵育5～7h进行封闭；封闭完成后，得到固定有杀虫因子的分子支架；
3)按照血淋巴与固定有杀虫因子的分子支架的质量比为7～9:1的比例，取血淋巴加到固定有杀虫因子的分子支架上，混匀后0～5℃孵育0.5～1.5h，孵育过程中，血淋巴中能与杀虫因子结合的成分与杀虫因子结合，从而被间接固定在分子支架上，而不能与杀虫因子结合的成分则不会被固定；然后在0～5℃下1500～2500rpm离心25～35s，分离出血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分；
4)对步骤3)得到的分子支架进行处理，使血淋巴中与杀虫因子结合的成分从分子支架上释放；
5)对步骤4)得到的血淋巴中与杀虫因子结合的成分进行分析鉴定：进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，以对蛋白、多肽类的结合成分进行分析，并采用液质联用分析仪对蛋白、多肽类成分进行结构分析鉴定；进行琼脂糖凝胶电泳及EB染色，以对核酸类的结合成分进行分析，并采用核酸测序仪对核酸类成分进行测序鉴定。
一实施例中：所述靶虫为甜菜夜蛾4龄幼虫。
一实施例中：所述杀虫因子为Cry7Ab4蛋白或Cry1Ab1蛋白中的至少一种。
一实施例中：所述步骤1)中，靶虫在采集血淋巴前，先于室内饲养：使用人工饲料饲养于程控人工气候箱中，温度25℃±1℃，相对湿度60±5％，光周期L:D＝16:8，光照强度≥6000Lux。
一实施例中：所述步骤1)中，采集靶虫血淋巴的方法包括：捉取生长正常的靶虫于冰上放置处理10min，用眼科剪轻轻夹住靶虫头部，悬于无菌容器上方，用另一支眼科剪于腹足处剪开小口，收集靶虫的血淋巴滴入无菌容器内。
一实施例中：所述步骤2)中，称取0.2g的Sepharose加到浓度为1mg/mL的杀虫因子溶液中，室温下150rpm孵育5h；孵育完成后加入10mg Glycine，继续孵育6h进行封闭。
一实施例中：所述步骤3)中，血淋巴与固定有杀虫因子的分子支架的质量比为8:1；血淋巴加到固定有杀虫因子的分子支架上后在4℃孵育1h；然后在4℃下2000rpm离心30s，分离出血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分。
一实施例中：所述步骤4)中，对分子支架的处理方法为加热。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明通过鉴定靶标害虫的血淋巴中是否含有可以与苏云金杆菌制剂的杀虫因子发生结合的分子，来分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下的原因，可为苏云金杆菌制剂生产厂家克服现有生产菌种对靶虫活性低下提供依据和思路。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法的流程示意图，分别体现了选择靶标害虫(靶虫)→采集靶虫血淋巴→将苏云金杆菌制剂的杀虫因子固定在分子支架上，使血淋巴中可以结合杀虫因子的成分与其他成分分离开来→利用分析仪器鉴定血淋巴中结合了杀虫因子的成分是什么，找到苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下的原因。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，包括：
1)选取苏云金杆菌制剂对其活性低下的健康靶虫若干只，采集靶虫血淋巴：本实施例之中，选用的靶虫为甜菜夜蛾4龄幼虫；具体的，
室内饲养健康靶虫：使用人工饲料饲养于程控人工气候箱中，温度25℃±1℃，相对湿度60±5％，光周期16:8(L:D)，光照强度≥6000Lux；
捉取生长正常的靶虫数十只，于冰上放置处理10min，用眼科剪轻轻夹住靶虫头部，悬于灭菌后的1.5mL EP管上方，用另一支眼科剪于腹足处剪开小口，让靶虫的血淋巴滴入EP管内。一共收集30只甜菜夜蛾的血淋巴，分装于3个EP管中，将其放入-80℃冰箱进行冻存备用；
2)将苏云金杆菌制剂杀虫因子固定到分子支架上：本实施例之中，选用的分子支架为GE公司的Sepharose，杀虫因子为Cry7Ab4蛋白；具体的，
称取0.2g的Sepharose加到浓度为1mg/mL的Cry7Ab4蛋白溶液中，室温(25℃)下150rpm孵育5h；孵育完成后加入10mg Glycine，继续孵育6h，封闭Sepharose中未结合Cry7Ab4蛋白的基团；封闭完成后，得到固定有杀虫因子的分子支架；
3)按照血淋巴与固定有杀虫因子的分子支架的质量比为8:1的比例，取血淋巴加到固定有杀虫因子的分子支架上，混匀后4℃孵育1h，孵育过程中，血淋巴中能与杀虫因子结合的成分与杀虫因子结合，从而被间接固定在分子支架上，而不能与杀虫因子结合的成分则不会被固定；然后在低温(4℃)下低速(2000rpm)短暂离心(30s)，离心后，分子支架以及结合在分子支架上的血淋巴中能与杀虫因子结合的成分位于下层，血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分位于上层，分离上下层，去除上层即血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分；
4)对步骤3)得到的下层，即分子支架进行60～100℃加热处理，使血淋巴中与杀虫因子结合的成分从分子支架上释放；
5)对步骤4)得到的血淋巴中与杀虫因子结合的成分进行分析鉴定，具体的，
对步骤4)释放的血淋巴中与杀虫因子结合的成分加入蛋白质上样缓冲液，进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，显示蛋白、多肽类的结合成分并进行分析，并采用液质联用分析仪对蛋白、多肽类成分进行鉴定；
对步骤4)释放的血淋巴中与杀虫因子结合的成分加入核酸上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳及EB染色，显示核酸类的结合成分并进行分析，并采用核酸测序仪对核酸类成分进行鉴定。
根据鉴定出的蛋白、多肽、核酸类成分，找出苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下的原因，据此寻找相应的克服途径。
本发明的另一实施例之中，针对甜菜夜蛾，按照上述方法针对杀虫因子Cry1Ab1蛋白进行分析之后，找到了与杀虫因子Cry1Ab1结合的成分，鉴定结果是贮存蛋白。
除此之外，也可以对步骤3)离心分离出的上层，即血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分进行类似分析，以进一步确定苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下的原因。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (8)
1.一种分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：包括：
1)选取苏云金杆菌制剂对其活性低下的健康靶虫若干只，采集靶虫血淋巴；
2)将苏云金杆菌制剂杀虫因子固定到分子支架上：称取0.18～0.22g的Sepharose加到浓度为0.8～1.2mg/mL的杀虫因子溶液中，室温下100～200rpm孵育4～6h；孵育完成后加入9～11mg Glycine，继续孵育5～7h进行封闭；封闭完成后，得到固定有杀虫因子的分子支架；
3)按照血淋巴与固定有杀虫因子的分子支架的质量比为7～9:1的比例，取血淋巴加到固定有杀虫因子的分子支架上，混匀后0～5℃孵育0.5～1.5h；然后在0～5℃下1500～2500rpm离心25～35s，分离出血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分；
4)对步骤3)得到的分子支架进行处理，使血淋巴中与杀虫因子结合的成分从分子支架上释放；
5)对步骤4)得到的血淋巴中与杀虫因子结合的成分进行分析鉴定：进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，以对蛋白、多肽类的结合成分进行分析，并对蛋白、多肽类成分进行结构分析鉴定；进行琼脂糖凝胶电泳及EB染色，以对核酸类的结合成分进行分析，并对核酸类成分进行测序鉴定。
2.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述靶虫为甜菜夜蛾4龄幼虫。
3.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述杀虫因子为Cry7Ab4蛋白或Cry1Ab1蛋白中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述步骤1)中，靶虫在采集血淋巴前，先于室内饲养：使用人工饲料饲养于程控人工气候箱中，温度25℃±1℃，相对湿度60±5％，光周期L:D＝16:8，光照强度≥6000Lux。
5.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述步骤1)中，采集靶虫血淋巴的方法包括：捉取生长正常的靶虫于冰上放置处理10min，用眼科剪轻轻夹住靶虫头部，悬于无菌容器上方，用另一支眼科剪于腹足处剪开小口，收集靶虫的血淋巴滴入无菌容器内。
6.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述步骤2)中，称取0.2g的Sepharose加到浓度为1mg/mL的杀虫因子溶液中，室温下150rpm孵育5h；孵育完成后加入10mg Glycine，继续孵育6h进行封闭。
7.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述步骤3)中，血淋巴与固定有杀虫因子的分子支架的质量比为8:1；血淋巴加到固定有杀虫因子的分子支架上后在4℃孵育1h；然后在4℃下2000rpm离心30s，分离出血淋巴中不能与杀虫因子结合的成分。
8.根据权利要求1所述的分析苏云金杆菌制剂对靶虫活性低下原因的方法，其特征在于：所述步骤4)中，对分子支架的处理方法为加热。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180109 |
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