CN107557438A

CN107557438A - 一种基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法

Info

Publication number: CN107557438A
Application number: CN201710946112.XA
Authority: CN
Inventors: 段翠兰; 张徐祥; 赵艳婷; 叶林; 陈焕根; 王苗苗
Original assignee: Fishery Technology Popularization Center Of Jiangsu Province; Nanjing University
Current assignee: Fishery Technology Popularization Center Of Jiangsu Province; Nanjing University
Priority date: 2017-10-12
Filing date: 2017-10-12
Publication date: 2018-01-09

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，包括：DNA提取：提取待检测青虾肠道的DNA；PCR扩增：针对细菌16S rRNA基因高可变区V3‑V4区域设计引物，以所述的DNA为模板进行PCR扩增；高通量测序：将PCR扩增的产物纯化后构建基因文库，进行高通量测序；数据处理：测序的数据经前处理后，进行统计分析，获得微生物的群落结构、物种组成比例及丰度，进一步查阅文献，确定属水平上不同的乳酸菌，并在微生物群落结构数据中查找相应的乳酸菌，确定乳酸菌丰度。本发明相较于传统的培养分离法、分子水平检测方法而言，具有高灵敏度、快速定量、成本低廉等优势，在评估不同样品中乳酸菌丰度具有实际应用价值。

Description

一种基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法

技术领域

本发明属于水产养殖微生物技术应用领域，更具体地说，是结合现代生物学技术和生物信息学分析领域，是一种基于高通量测序技术检测青虾肠道乳酸菌的方法。

背景技术

乳酸菌(Lactic acid bacterium，LAB)是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称，它通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表面成分等物质具有一定生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等产生作用，为动物和人的胃肠道中的优势菌群，已广泛应用于食品、医药、轻工业和畜牧业等领域(庄耿,张华,王兴仿,王玉群.乳酸菌在水产上的应用[J].科学养鱼,2014,(12):88.)。乳酸菌应用于水产养殖可改善水体环境、在宿主体内定植而抑制病原菌的增殖、补充必要的营养物质、维持微生态平衡及增强机体免疫机能，且能在水体环境中良好生存并发挥优势菌群作用(高鹏飞,张善亭,赵树平,李晶,王晓伟,张和平.乳酸菌在水产养殖业中的应用[J].家畜生态学报,2014,(07):82-86)，并代替抗生素在水质改良、治疗水产动物疾病、水产动物免疫上逐步开始得到应用(张家国,刘翠玲.乳酸菌代替抗生素在水产养殖上的应用[J].中国水产,2014,(07):66-68.)。也有研究表明，乳酸菌可以提高水产动物如石斑鱼、牙鲆、黑鲷、草鱼和鲫鱼的生长性能和存活率(周晓波,黄燕华,曹俊明,邝哲师,王国霞,黄文庆,刘小玲.5种乳酸菌对罗非鱼生长性能、体成分、血清生化指标及肠道菌群的影响[J].动物营养学报,2014,(07):2009-2017.)。目前，已有研究报告，乳酸菌作为一种微生态复合菌制剂在对虾养殖中得到了应用(侯树宇,张清敏,多淼,王兰,钟欢,任富海.微生态复合菌制剂在对虾养殖中的应用研究[J].农业环境科学学报,2004,(05):904-907.)。所以，在肠道微生物的群落结构的研究过程中，乳酸菌丰度的研究显得尤为重要。

现今，微生物的检测方法主要有传统培养分离法、分子水平检测方法和高通量测序技术等。培养分离方法采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少(仅占环境微生物总数的0.1％～10％)。而且，此方法繁琐耗时，不能用于监测种群结构的动态变化(车玉伶,王慧,胡洪营,梁威,郭玉凤.微生物群落结构和多样性解析技术研究进展[J].生态环境,2005,(01):127-133.)。

分子水平检测方法主要包括聚合酶链式反应技术(PCR技术)、实时荧光定量聚合酶链式反应技术(qPCR技术)、变性梯度凝胶电泳技术(DGGE技术)等。PCR技术是利用特异性引物扩增少量特定DNA片段的技术。qPCR技术是以定性PCR为基础，利用荧光染料或探针与DNA链上的碱基结合释放荧光信号来分析PCR反应产物的技术。DGGE技术是利用不同分子大小以及携带电荷的双链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的不同迁移行为对DNA分子进行分析，进而用于菌群群落组成的分析鉴定的一种技术。但是这种方法只能分析样品中少数优势微生物类群，而且操作复杂要求高，重复性也较差。

发明内容

发明目的：针对传统的微生物检测方法存在方法繁琐耗时、操作复杂要求高、重复性较差并存在局限性等问题，结合乳酸菌对机体的生理功能和目前在水产养殖中的广泛应用，本发明提供了一种基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法。

技术方案：本发明所述的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，包括：

(1)DNA提取：提取待检测青虾肠道的DNA；

(2)PCR扩增：针对细菌16S rRNA基因高可变区V3-V4区域设计引物，以所述的DNA为模板进行PCR扩增；

(3)高通量测序：将PCR扩增的产物纯化后构建基因文库，进行高通量测序；

(4)数据处理：测序的数据经前处理后，进行统计分析，获得微生物的群落结构、物种组成比例及丰度，进一步查阅文献，确定属水平上不同的乳酸菌，并在微生物群落结构数据中查找相应的乳酸菌，确定乳酸菌丰度。

所述DNA提取时，采用美国MP Biomedicals公司的 SPIN Kit for Soil试剂盒。

所述的引物为：上游引物5’CCTACGGGNGGCWGCAG 3’；下游引物5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3’。

所述PCR扩增的反应体系为：5μL的模板DNA(50ng/μL)、2.5μL的前端引物(上游引物)、2.5μL的末端引物(下游引物)、5μL的双蒸水、15μL的 High-Fidelity PCRMaster Mix with GC Buffer(美国New England Biolabs公司)。

所述PCR扩增的程序为：95℃预变性2min；95℃变性20s,51℃退火30s,72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸5min。

所述PCR扩增的产物用QIAquick PCR Purification Kit(德国QIAGEN公司)试剂盒纯化。

高通量测序过程中的基因文库的构建及测序过程为常规方法，本发明将PCR产物送至江苏中宜金大分析检测有限公司进行建库和Miseq platform(Illumina,USA)高通量测序。

所述数据的前处理包括：下机数据用make.contigs命令在Mothur上将两端测序得到的等量序列拼接到一起，并用chimera.Uchime命令去除PCR过程中出现的错误扩增序列；处理后的高质量序列用QIIME按照97％相似率划分为不同的OUT，低丰度的OUT分类(＜3条序列)被认定为是测序噪声并被移除，代表序列的分类由Ribosomal Database Project网站上的RDP Classifier完成。

本发明中，乳酸菌包括：Lactobacillus，Lactococcus，Lactovum,Atopostipes,Eremococcus,Atopobacter,Streptococcus,Enterococcus,Lacticigenium,Pilibacter,Trichococcus,Weissella,Abiotrophia,Pediococcus,Globicatella,Vagococcus,Carnobacterium,Melissococcus,Aerococcus,Bavariicoccus,Alloiococcus,Paralactobacillus,Isobaculum,Facklamia,Desemzia,Dolosicoccus。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，相较于其他传统的培养分离法、分子水平检测方法而言，具有高灵敏度、快速定量、成本低廉等优势。在评估不同样品中乳酸菌丰度具有实际应用价值。

本发明基于高通量测序技术研究青虾肠道中的微生物群落结构，并评估青虾肠道中乳酸菌的丰度，为乳酸菌将能更科学、更规范的应用于青虾养殖业以及获得更加广阔的发展前景提供理论依据。

本发明的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，通过DNA提取、PCR扩增、高通量测序及生物信息学分析的方式评估青虾肠道中属水平上不同乳酸菌的类型和相对丰度。根据此方法对青虾肠道乳酸菌的分析，一方面为乳酸菌能更科学、更规范的应用于青虾养殖业中提供理论依据，另一方面，以此为例可满足不同机体(人或其他动物)在不同环境下的肠道乳酸菌丰度的评估，具有潜在的良好社会效益和推广应用价值。

附图说明

图1为不同乳酸菌在青虾肠道中的相对丰度(log₁₀)；

图2为青虾肠道中乳酸菌总的相对丰度。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明的利用高通测序技术评价乳酸菌丰度的方法主要是针对评价青虾肠道中乳酸菌丰度研究的。乳酸菌为动物和人的胃肠道中的优势菌群，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等产生作用。所以，评估其他动物和人肠道中的乳酸菌丰度基于的原理与本发明一致，也适用于本发明的技术方案。

实施例1

(1)青虾样品的采集。选取江苏省六个不同青虾养殖场(分别标号为LY、SZ、WX、XH、YZ、PK)，每个养殖场随机选择养殖塘，每个塘随机采集约50只虾混合作为一个样品的三个平行样，最终共收集40个青虾样品运回实验室。

(2)取青虾肠道。取大约10只青虾的肠道提取DNA。解剖前青虾用酒精无菌清洗，解剖器械用火焰灼烧灭菌。前处理结束后的青虾肠道样品于-20℃的冰柜中保存。

(3)DNA的提取。使用 SPIN Kit for Soil(美国MP Biomedicals公司)试剂盒提取经过前处理的青虾肠道样品中DNA。并采用Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国NanoDropTechnologies公司)来鉴定提取液中DNA的浓度，并用琼脂糖凝胶电泳来检测提取DNA的浓度及质量。

(4)PCR扩增。本技术主要通过样品中所有细菌16S rRNA基因高可变区V3-V4的PCR扩增进行菌群结构解析。PCR扩增上下游引物分别为341F(SEQ ID NO.1)：5’CCTACGGGNGGCWGCAG 3’和806R(SEQ ID NO.2)：5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3’(华大基因合成部)。PCR扩增中的反应体系一共30μL，其中包括5μL的模板DNA(50ng/μL)、2.5μL的前端引物、2.5μL的末端引物、5μL的双蒸水、15μL的 High-Fidelity PCR Master Mixwith GC Buffer(北京，全式金)。PCR的热循环步骤包括预变性阶段95℃2min，以及接下来的30个循环，每个循环包括95℃变性20s,51℃退火(复性)30s,72℃延伸60s，所有循环结束后进入的最后延伸阶段为72℃5min。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(德国QIAGEN公司)试剂盒纯化，并用Invitrogen 2.0Fluorometer(美国Thermo Fisher公司)定量。

(5)高通量测序和数据前处理。PCR产物经纯化后被送到江苏中宜金大分析检测有限公司(Jingsu Zhongyijinda Analytical&Testing Co.,Ltd)进行建库和Miseqplatform(Illumina,USA)高通量测序。下机数据用make.contigs命令在Mothur上将两端测序得到的等量序列拼接到一起(Schloss,Patrick D.,et al."Introducing mothur:open-source,platform-independent,community-supported software for describing andcomparing microbial communities."Applied and environmental microbiology 75.23(2009):7537-7541.)，并用chimera.Uchime命令去除PCR过程中出现的错误扩增序列。处理后的高质量序列用QIIME按照97％相似率划分为不同的OUT。低丰度的OUT分类(＜3条序列)被认定为是测序噪声并被移除。代表序列的分类由Ribosomal Database Project(http://rdp.cme.msu.edu/)网站上的RDP Classifier完成。

(6)分析青虾肠道微生物群落结构的丰度特征。根据分类学统计结果分析肠道微生物的群落结构、物种组成比例及丰度。

确定乳酸菌丰度。结合已有文献中报道的乳酸菌(H.,J.,2009.Lactic acid bacteria,Biology of Microorganisms on Grapes,in Must and inWine.Springer,pp.3-29；沙玉杰.乳酸菌对凡纳滨对虾益生机理的研究[D].中国科学院研究生院(海洋研究所),2016；苏晨阳.海水养殖有益菌微生物的筛选鉴定及应用[D].中国海洋大学,2015.)在青虾肠道微生物中筛选出相应的乳酸菌及其丰度。在青虾肠道样品中共发现26个乳酸菌属(Lactobacillus,Lactococcus,Lactovum,Atopostipes,Eremococcus,Atopobacter,Streptococcus,Enterococcus,Lacticigenium,Pilibacter,Trichococcus,Weissella,Abiotrophia,Pediococcus,Globicatella,Vagococcus,Carnobacterium,Melissococcus,Aerococcus,Bavariicoccus,Alloiococcus,Paralactobacillus,Isobaculum,Facklamia,Desemzia,Dolosicoccus.)，其中，Lactobacillus(乳杆菌属)和lactococcus(乳球菌属)占主导地位。青虾肠道中具体乳酸菌的丰度见图一。在青虾肠道中乳酸菌的相对丰度可高达13.84％，不同地点养殖场的青虾肠道中总乳酸菌丰度存在差异，见图二。

序列表

<110> 江苏省渔业技术推广中心

南京大学

<120> 一种基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctacgggng gcwgcag 17

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggactachvg ggtwtctaat 20

Claims

1.一种基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，其特征在于，包括：

(1)DNA提取：提取待检测青虾肠道的DNA；

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，其特征在于，所述的引物为：上游引物5’CCTACGGGNGGCWGCAG 3’；下游引物5’GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3’。

3.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为：5μL模板DNA、2.5μL上游引物、2.5μL下游引物、5μL双蒸水、15μL 2× High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer。

4.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性2min；95℃变性20s,51℃退火30s,72℃延伸60s，共30个循环；72℃延伸5min。

5.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，其特征在于，所述数据的前处理包括：下机数据用make.contigs命令在Mothur上将两端测序得到的等量序列拼接到一起，并用chimera.Uchime命令去除PCR过程中出现的错误扩增序列；处理后的高质量序列用QIIME按照97％相似率划分为不同的OUT，低丰度的OUT分类被认定为是测序噪声并被移除，代表序列的分类由Ribosomal Database Project网站上的RDP Classifier完成。

6.根据权利要求1所述的基于高通量测序检测青虾肠道乳酸菌的方法，其特征在于，乳酸菌包括：Lobacillus,Lactococcus,Lactovum,Atopostipes,Eremococcus,Atopobacter,Streptococcus,Enterococcus,Lacticigenium,Pilibacter,Trichococcus,Weissella,Abiotrophia,Pediococcus,Globicatella,Vagococcus,Carnobacterium,Melissococcus,Aerococcus,Bavariicoccus,Alloiococcus,Paralactobacillus,Isobaculum,Facklamia,Desemzia,Dolosicoccus。