CN107501405B - 一种细胞自噬抑制多肽 - Google Patents
一种细胞自噬抑制多肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107501405B CN107501405B CN201710874503.5A CN201710874503A CN107501405B CN 107501405 B CN107501405 B CN 107501405B CN 201710874503 A CN201710874503 A CN 201710874503A CN 107501405 B CN107501405 B CN 107501405B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polypeptide
- autophagy
- inhibiting
- cells
- gfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 37
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 33
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 33
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 abstract description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 35
- 102100020689 Autophagy-related protein 13 Human genes 0.000 description 17
- 101000785138 Homo sapiens Autophagy-related protein 13 Proteins 0.000 description 17
- 101710189963 RB1-inducible coiled-coil protein 1 Proteins 0.000 description 16
- 102100023588 RB1-inducible coiled-coil protein 1 Human genes 0.000 description 15
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 8
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 7
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 7
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 101100057159 Caenorhabditis elegans atg-13 gene Proteins 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000004642 autophagic pathway Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N Gln-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- ZGHMRONFHDVXEF-AVGNSLFASA-N Gln-Ser-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O ZGHMRONFHDVXEF-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asp Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BMVFXOQHDQZAQU-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 101150011918 ATG13 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108010014380 Autophagy-Related Protein-1 Homolog Proteins 0.000 description 1
- 102000016956 Autophagy-Related Protein-1 Homolog Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- SWJYSDXMTPMBHO-FXQIFTODSA-N Cys-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SWJYSDXMTPMBHO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N Glu-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O YQPFCZVKMUVZIN-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- 101100101731 Homo sapiens ULK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O FNGOXVQBBCMFKV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 210000004957 autophagosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012822 autophagy inhibitor Substances 0.000 description 1
- XDHNQDDQEHDUTM-UHFFFAOYSA-N bafliomycin A1 Natural products COC1C=CC=C(C)CC(C)C(O)C(C)C=C(C)C=C(OC)C(=O)OC1C(C)C(O)C(C)C1(O)OC(C(C)C)C(C)C(O)C1 XDHNQDDQEHDUTM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000003334 potential effect Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N sodium metavanadate Chemical compound [Na+].[O-][V](=O)=O CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 229910000166 zirconium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明涉及一种细胞自噬抑制多肽，其氨基酸序列为LPDISLKDLQFLQSFCPSEVQ。所述细胞自噬抑制多肽可通过人工合成或宿主细胞表达的方法制备。所述多肽可以用于制备治疗肿瘤药物。本发明的细胞自噬抑制多肽仅有21个氨基酸，无论是人工合成该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行，利于大规模推广利用；且该多肽来源于生物体内固有的蛋白质，用于动物实验不会造成免疫排除，对细胞毒性更小，也更为特异；该抑制多肽可通过慢病毒或转染等手段将编码该多肽的基因片段导入细胞内进行稳定表达，操作方便，有利于细胞水平和动物水平的研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种细胞自噬“开关”起始蛋白复合体多肽抑制剂的制备及应用。
背景技术
细胞自噬通路是一种新型的肿瘤药物治疗靶点，经典细胞自噬过程见图1所示。近年来，癌细胞“吃自己为了生存”的观点表明自噬在肿瘤发生和发展过程中可能发挥重要作用。例如在肿瘤细胞周围还没有形成丰富的血管之前，自噬降解途径所产生的营养物质能够为肿瘤细胞提供能量，从而维持其在极端压力和缺乏营养情况下的生存。另有大量研究证实，在一些肿瘤细胞中使用抗癌药物和X射线照射后，自噬体数量通常有所增加，且增加的程度与肿瘤细胞的生存能力呈正相关。细胞自噬的发生是肿瘤细胞自身对肿瘤治疗的一种自我防御反应，成为一种重要的肿瘤细胞耐药机制。这些研究结果表明自噬在恶性肿瘤治疗过程中扮演着非常重要的角色，因此细胞自噬成为肿瘤治疗的重要靶点。
目前针对自噬通路国内外众多研究者对以肿瘤细胞自噬为靶点的肿瘤治疗研究进行了大量的探索。其中最为成功的一个标志是以氯喹(Chloroquine，CQ)为代表的细胞自噬抑制剂被证实对多种肿瘤模型具有良好的抑制效果。目前氯喹在美国已经进入I/II期临床试验阶段，显示了良好的临床应用前景。尽管如此，动物试验发现氯喹只有在高浓度给药条件下才能够阻断体内肿瘤细胞自噬的发生。此外，氯喹抑制细胞自噬的特异性较低，其还具有其它生物学功能，如氯喹可阻止DNA的复制和RNA的转录，这些可能成为患者预后差及发生不良反应的潜在因素，从而限制氯喹的临床应用。为了克服这些难题，开发更为高效、低毒和特异的抑制细胞自噬的药物成为肿瘤治疗领域的努力方向。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种自噬起始复合物的抑制多肽，其能特异性的抑制自噬复合物的形成，从而发挥抑制自噬的功能。
前期研究发现，细胞自噬的发生首先是由胞内FIP200和ATG13-ULK1蛋白相互作用形成一种被称为FIP200-ATG13-ULK1的稳定复合体，然后再由这种蛋白复合体启动细胞自噬的发生。然而，进一步研究发现，ULK1基因被敲除后，细胞仍然可以诱导自噬的发生，而FIP200基因被敲除后，自噬则被完全抑制。本发明人在实验中发现，FIP200能与atg13蛋白特异性直接相互作用(定位FIP200和atg13相互作用的缺失突变体图见图2)，而不与ULK1蛋白发生直接相互作用。在进一步的研究中，发明人将FIP200分成8段，FIP200-N段638aa结构域能特异性的与ATG13蛋白相互结合这一研究结果表明FIP200蛋白在自噬诱导过程中起着关键性作用。由此，我们利用免疫沉淀方法，找到了介导FIP200和ATG13相互作用的关键功能区域位于550aa-638aa氨基酸序列中间。随后利用截短突变技术，成功的将此多肽序列定位到574-594aa，Western blot结果显示表达这个缺失突变体区域可以显著抑制细胞饥饿引起的自噬的发生，我们将574-594aa多肽序列命名为FIP-AI。
技术方案
一种细胞自噬抑制多肽，所述多肽的氨基酸序列为：Leu Pro Asp Ile Ser LeuLys Asp Leu Gln Phe Leu Gln Ser Phe Cys Pro Ser Glu Val Gln(SEQ ID No.1)。
本申请中记载的自噬多肽抑制剂为FIP200蛋白中的一部分序列，由21个氨基酸构成。
上述抑制多肽可通过人工合成或宿主细胞表达制备，均非常方便易行。
上述抑制多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用。
有益效果：本发明的细胞自噬抑制多肽仅有21个氨基酸，无论是人工合成该多肽还是运用宿主细胞表达制备均非常方便易行，利于大规模推广利用；且该多肽来源于生物体内固有的蛋白质，用于动物实验不会造成免疫排除，对细胞毒性更小，也更为特异；该抑制多肽可通过慢病毒或转染等手段将编码该多肽的基因片段倒入细胞内进行稳定表达，操作方便，有利于细胞水平和动物水平的研究。
附图说明
图1是细胞自噬通路发生的细胞自噬过程示意图；
图2是定位FIP200和ATG13相互作用的缺失突变体图；
图3是免疫共沉淀法鉴定FIP200中与ATG13相互作用的区段图；
图4是免疫共沉淀法鉴定GFP-FIP200中N端截断突变体与ATG13相互作用图；
图5是Western blot分析FIP-AI-P2A-GFP对细胞自噬的抑制作用；
图6是FIP-AI-P2A-GFP的连接图谱；
图7是将FIP-AI-P2A-GFP构建到pLVX-puro慢病毒载体的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
图1是细胞自噬通路发生的细胞自噬过程示意图，图2是定位FIP200和atg13相互作用的缺失突变体图。
实施例1
一、含有FIP200及其各截断突变体与ATG13蛋白的相互作用测试，目的在于鉴定出潜在的介导FIP200与ATG13蛋白相互需要的最小结构域：
主要实验材料：
1)细胞
本实验选择293T细胞。该细胞培养方便，生长较快，体外脂质体转染自噬活性较高，在自噬诱导情况下，通过免疫共沉淀，可以显著地检测到FIP200与ATG13蛋白的相互作用，而且在自噬标记物LC3ii条带较易检测。
293T，细胞，购置ATCC公司，培养基DMEM Gibico,含10％胎牛血清life tech公司，在5％CO2,37度，95％湿度的细胞培养箱中培养，3)、抗体，flag抗体sigma，1：2000，HA-beads sigma，GFP抗体，FIP200抗体，LC3抗体，cell signal technology公司。
首先是通过常规的PCR为基础的截断突变方法，以全长的pcDNA-HAFIP200为模板，得到如下一系列截断突变体如：HA-FIP(N250,N450,N550,N638,N859，WT)，然后测序鉴定以后，用lipofectamin2000，在HEK293细胞中分别转染HA-FIP(N250,N450,N550,N638,N859,WT)36小时后，用裂解液裂解(含20mM Tris(pH 7.5),135mM NaCl,2mM EDTA,2mM DTT,25mMβ-glycerophosphate,2mM焦磷酸钠，10％甘油，1％Triton X-100，1mM钒酸钠和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。冰置20分钟后，15,000g，4℃离心10分钟。用HA-beads sigma进行免疫共沉淀，将beads与裂解液4度孵育4小时，用裂解液洗4次。免疫沉淀复合物经4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，再用ATG13抗体检测二者结合情况，结果如图3和4所示。
图3是免疫共沉淀法鉴定FIP200中与ATG13相互作用的区段图；表明FIP200N端含有638氨基酸残基的功能区能与ATG13相互作用，然而当缺失了550aa-638aa之间的N550aa突变体就失去与ATG13相互作用的能力，这显示550aa-638aa这段氨基酸序列含有蛋白相互作用的必要的肽序列间的N550aa突变体就失去与ATG13相互作用的能力，这显示550aa-638aa这段氨基酸序列含有蛋白相互作用的必要的肽序列图；图4是免疫共沉淀法鉴定GFP-FIP200中N端截断突变体与ATG13相互作用图。表明FIP200N端含有594氨基酸残基的功能区能与ATG13相互作用，然而当缺失了573aa-594aa之间的21个氨基酸，N573aa突变体就失去与ATG13相互作用的能力，这显示574aa-594aa这段氨基酸序列含有蛋白相互作用的必要的肽序列图。
根据鉴定结果，本发明人进一步构建了一系列更小的截短突变体，以全长的GFP-FIP200载体为模板，通过PCR方法截断突变体。如：GFP-FIP200-N573AA，GFP-FIP200-N594AA。经测序鉴定后，用以上类似的IP方法，将构建好的GFP-FIP200-573AA，突变体和GFP-FIP200-594AA突变体表达质粒分别转染到293细胞中，转染24小时后，分别用以上相同的IP裂解液裂解细胞，离心。用GFP抗体进行免疫共沉淀。将beads与裂解液4度孵育4小时，用裂解液洗4次。免疫沉淀复合物经4-12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上。再用ATG13抗体检测二者结合情况，结果显示574aa-594aa是潜在的介导FIP200与ATG13蛋白相互作用的关键氨基酸残基，因此如果特异性在体内过表达该短肽，可能竞争性的阻断FIP200与ATG13蛋白的相互作用，因此下一步需构建过表达该多肽的载体。
二、pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP慢病毒载体构建：
主要实验材料：
1)实验试剂及菌株
宿主菌Stbl3由本实验室保存。pLVX-puro慢病毒载体，购自Addgene；XhoⅠ和XbaⅠ限制性内切酶，T4连接酶购自NEB公司，质粒大提试剂盒和割胶回收试剂盒购自Qiagen公司，Tyrptone、酵母提取物购自OXOID公司，质粒小提试剂盒购自Promega，HEK293T细胞购自ATCC公司；培养基DMEM购自Gibico；胎牛血清购自life tech。
2)5’-XhoI-FIP-AI-P2A-XbaI-3’序列的制备
首先通过人工全基因合成FIP-AI-P2A序列。(由于该片段较短，不需要PCR方法扩增)，该片段与GFP基因的N段有15个碱基重叠，用于重叠PCR反应。FIP-AI-P2A序列如下所示：CTTCCAGATATTTCATTAAAAGATTTACAGTTTCTGCAATCATTTTGTCCTTCGGAAGTTCAGGGATCCGGCGCAACAAACTTCTCTCTGCTGAAACAAGCCGGAGATGTCGAAGAGAATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAG
然后以PEGFP-C3质粒为模板，通过PCR扩增GFP片段，引物序列如下：
GFP-F1:5’-AATCCTGGACCGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
GFP-R1:5’-TCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3’，将扩增好的PCR产物
进行割胶回收，得到的产物用于下一步PCR反应的模板；
最后，以全基因合成FIP-AI-P2A序列、GFP片段为模板，通过重叠PCR，同时在序列中引入Xho I和Xba I酶切位点。用引物PCR扩增出FIP-AI-P2A-EGFP片段，得到带Xho I和Xba I酶切位点的片段，所得到的片段经PCR产物试剂盒纯化回收，用于下一步克隆反应，FIP-AI-P2A-GFP的连接图谱见图6。所用的引物序列如下所示：
FIP-F2:5’-gtgCTCGAGATGCTTCCAGATATTTCATTAAAAGATTTAC-3’，
FIP-R2:5’-gagTCTAGACTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’。
三、pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP构建
图7为将FIP-AI-P2A-GFP构建到pLVX-puro慢病毒载体的示意图，如图所示，在多克隆位点通过XhoⅠ和XbaⅠ连接入上述FIP-AI-P2A-GFP序列。过程如下：
1.pLVX-puro慢病毒载体酶切
酶切体系(30μl)：
置37℃水浴锅酶切过夜(>3h)。1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，用Nanodrop 2000测回收产物浓度。
2.PCR产物酶切
酶切体系(30μl)：
置37℃水浴锅酶切过夜(>6h)。1％琼脂糖凝胶电泳，割胶回收，用Nanodrop 2000测回收产物浓度。
3.连接
连接反应体系10μl：
置16℃水浴锅连接16h。
4.连接产物转化
A,将20μl连接产物加到200μl制备好的stbl3感受态细胞中，轻轻混匀置冰上30min-1h；
B,42℃水浴热激90s后立即冰置5min；
C,加入预热的800μl LB液体培养基，37℃振荡培养1.5h-2h；
D,4000rpm，室温离心5min，留200μl培养基重悬菌体，用涂布棒将其均匀涂与平板中，37℃倒置培养过夜。
5.基因测序
将构建成功的pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP质粒用通用pLVX-puro的通用引物进行基因测序，由上海Invitrogen公司测序。
6.慢病毒包装
以pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP：psPAX2：pMD2.G＝4:3:3的比例转染至HEK293FT细胞中，48小时后，收集细胞上清液，超速离心，得到浓缩的病毒颗粒，备用。
通过上述方法可以制得细胞自噬抑制多肽，序列为LPDISLKDLQFLQSFCPSEVQ，该多肽还可以进行人工合成。
性能测试
FIP-AI-P2A-GFP对细胞自噬抑制作用的测试：
实验材料及试验方法：
1)细胞
293T，细胞，购置ATCC公司，培养基DMEM Gibico,含10％胎牛血清life tech公司，在5％CO2,37度，95％湿度的细胞培养箱中培养，
2)抗体，
LC3抗体cell signal technology，1：1000
3)将上述包装成功的pLVX-Puro–FIP-AI-P2A-GFP质粒，用于直接转染293细胞，并用GFP空质粒做空白对照，进行鉴定体内表达该21氨基酸多肽抑制自噬作用的研究。待细胞感染36小时后，更换自噬培养基(Hank’s balanced salt solution[HBSS])饥饿2小时。BafA1(100nM)，是一种溶酶体抑制剂，在饥饿的同时加入2小时，然后裂解细胞，收集上清，Western blot检测目前自噬公认的标志物LC3II，结果见图5。由图5可以看出：该多肽可以显著抑制LC3II的聚集，说明该多肽具有潜在的抑制细胞自噬的活性。
序列表
<110> 江苏护理职业学院
<120> 一种细胞自噬抑制多肽
<140> 2017108745035
<141> 2017-09-25
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 293T细胞(HEK293)
<400> 1
Leu Pro Asp Ile Ser Leu Lys Asp Leu Gln Phe Leu Gln Ser Phe Cys
1 5 10 15
Pro Ser Glu Val Gln
20
Claims (2)
1.一种细胞自噬抑制多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的细胞自噬抑制多肽用于抑制细胞自噬的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710874503.5A CN107501405B (zh) | 2017-09-25 | 2017-09-25 | 一种细胞自噬抑制多肽 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710874503.5A CN107501405B (zh) | 2017-09-25 | 2017-09-25 | 一种细胞自噬抑制多肽 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107501405A CN107501405A (zh) | 2017-12-22 |
| CN107501405B true CN107501405B (zh) | 2020-12-25 |
Family
ID=60698547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710874503.5A Expired - Fee Related CN107501405B (zh) | 2017-09-25 | 2017-09-25 | 一种细胞自噬抑制多肽 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107501405B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022186690A1 (en) * | 2021-03-02 | 2022-09-09 | Biotempt B.V. | Chemotactic autophagy-inhibiting peptide, compositions and methods related thereto. |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11229680B2 (en) | 2017-11-14 | 2022-01-25 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Autophagy inhibitors |
| KR102119197B1 (ko) * | 2018-04-23 | 2020-06-05 | 주식회사 엘베이스 | 세포에서의 자가포식작용 억제용 조성물, 및 이를 포함하는 종양성 질환의 예방 또는 치료용, 또는 항암제 내성 억제용 약학적 조성물 |
| CN112646009B (zh) * | 2019-08-27 | 2022-02-08 | 上海交通大学 | 灵芝免疫调节蛋白突变体及应用 |
| CN112359034B (zh) * | 2020-11-16 | 2023-02-07 | 北京大学深圳研究生院 | 一种多肽抑制剂及其用途 |
| CN112516288B (zh) * | 2020-12-22 | 2023-04-18 | 西藏阿那达生物医药科技有限责任公司 | N-糖基化修饰之灵芝免疫调节蛋白的应用 |
| CN114196706A (zh) * | 2021-10-26 | 2022-03-18 | 深圳先进技术研究院 | 筛选自噬降解辅助蛋白的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2571530A4 (en) * | 2010-05-20 | 2014-03-05 | Univ Rochester | METHOD AND COMPOSITIONS FOR AUTOPHAGIA MODULATION |
| CN104258394B (zh) * | 2014-09-28 | 2018-05-29 | 中国科学技术大学 | 纳米银联合自噬抑制剂杀伤肿瘤 |
-
2017
- 2017-09-25 CN CN201710874503.5A patent/CN107501405B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022186690A1 (en) * | 2021-03-02 | 2022-09-09 | Biotempt B.V. | Chemotactic autophagy-inhibiting peptide, compositions and methods related thereto. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107501405A (zh) | 2017-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107501405B (zh) | 一种细胞自噬抑制多肽 | |
| CN109517820B (zh) | 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法 | |
| CN102121023A (zh) | 突变型人纤溶酶原kringle5及其制备方法及应用 | |
| CN112048018B (zh) | 一种嵌合t细胞生长因子及其应用 | |
| CN117210438B (zh) | 一种突变的核糖核酸酶r及其应用 | |
| CN101643511B (zh) | 抑制端粒酶活性的融合蛋白、其制备及应用 | |
| CN101302526A (zh) | 重组可溶性溶血链球菌溶血素o基因、重组蛋白及其制备方法 | |
| US5925516A (en) | Medicaments for the treatment of papillomavirus diseases | |
| CN109609551A (zh) | 一种利用CRISPR/Cas9+AAV制备通用型CAR-T细胞的方法 | |
| KR100417026B1 (ko) | 클로버황색엽맥바이러스프로테아제유전자 | |
| CN117487009B (zh) | 抗鸡pml单克隆抗体及其应用 | |
| CN114057861A (zh) | 一种靶向UBE2C的bio-PROTAC人工蛋白 | |
| CN109331171B (zh) | 一种疟原虫蛋白的制备方法及其在抗肿瘤方面的应用 | |
| CN114957399B (zh) | 一种多肽、多肽衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用 | |
| CN112779262B (zh) | 猪RagC基因的应用 | |
| CN110893240B (zh) | Nme2基因在抑制禽呼肠病毒复制中的应用 | |
| CN109182341B (zh) | 一种抗肿瘤蛋白质及其应用 | |
| CN107828749A (zh) | 一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法 | |
| CN113563474B (zh) | EpCAM-CD16-NKG2D三特异性抗体及其应用 | |
| Chang et al. | Expression of human aldehyde dehydrogenase-3 associated with hepatocellular carcinoma: promoter regions and nuclear protein factors related to the expression. | |
| CN119874871B (zh) | 宿主蛋白brap肽段与冠状病毒互作鉴定及应用 | |
| CN112359060B (zh) | 含有靶向突变型kras融合基因的重组载体、融合蛋白及蛋白质复合物及其构建方法和应用 | |
| CN112538108B (zh) | 高亲和pvr突变体 | |
| CN112546239B (zh) | 一种蛋白质纳米颗粒用于制备抗病毒产品的用途 | |
| CN109160941B (zh) | 蛋白序列17e11及其用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201225 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |