CN107475386A

CN107475386A - 用于诊治骨肉瘤的长链非编码rna标志物

Info

Publication number: CN107475386A
Application number: CN201710723968.0A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 石小峰
Original assignee: Gu'an Bojian Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Gu'an Bojian Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-08-22
Filing date: 2017-08-22
Publication date: 2017-12-15
Anticipated expiration: 2037-08-22
Also published as: CN107475386B

Abstract

本发明提供一种长链非编码RNA及其应用。本发明的研究表明LINP1在骨肉瘤组织中和在癌旁组织中的表达存在显著差异，据此认为LINP1可以作为诊断骨肉瘤的分子标志物。根据LINP1在骨肉瘤组织中呈现低水平表达，在骨肉瘤细胞中过表达LINP1，研究LINP1在骨肉瘤中的作用，结果表明过表达LINP1能够明显抑制骨肉瘤细胞的增殖。本发明揭示了LINP1在骨肉瘤发病机制中的重要作用，也为骨肉瘤的临床诊断、治疗和预后监测提供了新的分子标记和药物靶点。

Description

用于诊治骨肉瘤的长链非编码RNA标志物

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及用于诊治骨肉瘤的长链非编码RNA标志物。

背景技术

骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织。是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉瘤是一种罕见的(占全部恶性肿瘤的0.2％)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织。其主要发病人群集中在10～20岁青少年，具有发病率高，早期转移率高，治愈生存率低等特点。X-射线，断层摄影技术，核磁共振，血管造影技术以及动态骨闪烁摄影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生的程度及手术类型判断等等。但是利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的病情延误，错过最佳治疗时期。因此寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。

人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2％，其余98％不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾DNA”。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA，miRNA，piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(long ncRNA，LncRNA，>200nt)。

目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对LncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，LncRNA不能被翻译成蛋白质，他们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等。

最近的研究发现LncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这表明LncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，LncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用。目前，已经克隆的人类lncRNAs基因已超过4万多个，但绝大部分lncRNA的功能未知。

目前，有关LncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的研究基本空白，因此本申请利用生物信息学分析研究探讨LncRNA在骨肉瘤的发病机制、疾病诊断及治疗方面的的作用，同时为后续深入研究提供实验基础及研究方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于诊治骨肉瘤的长链非编码RNA标志物。本发明利用芯片和QPCR实验证明LINP1在骨肉瘤组织中的表达水平明显低于在癌旁组织中的水平，因此可以将LINP1作为诊断骨肉瘤的分子标志物。

为了实验上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测长链非编码RNA表达的试剂在制备骨肉瘤辅助诊断或预后预测产品中的应用；所述长链非编码RNA的Gene ID：108570035。

本发明的长链非编码RNA在NCBI中的命名为LINP1。LINP1的Genbank登录号NR_138480.1，具有838bp的长度，相应的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINP1表达量时使用的PCR扩增引物。

在本发明的具体实施方案中，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明提供了一种用于骨肉瘤辅助诊断或预后预测的产品，所述产品包括检测LINP1表达水平的试剂。

进一步，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINP1表达量时使用的PCR扩增引物。

进一步，前面所述的产品包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨肉瘤的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知非LINP1的异常与骨肉瘤相关也属于LINP1的用途，同样在本发明的保护范围之内。

所述试剂盒包括检测LINP1表达量的试剂，所述试剂包括与LINP1或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测LINP1表达量时使用的PCR扩增引物。

所述芯片包括检测LINP1表达量的试剂，所述试剂包括与LINP1或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINP1表达量的探针。

所述试纸包括检测LINP1表达量的试剂，所述试剂包括与LINP1或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测LINP1表达量的探针。

本发明提供了一种用于治疗骨肉瘤的药物组合物，所述药物组合物包括LINP1的激活剂。

进一步，所述激活剂不受限制，只要是可以增加LINP1表达水平或提高LINP1功能活性即可。

所述激活剂包括LINP1本身、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了前面所述的激活剂在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种诊断骨肉瘤的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中LINP1的表达水平；

(3)将测得的LINP1的表达水平与受试者的患病与否关联起来。

(4)与对照相比，LINP1的表达水平降低，则该受试者被判断患有骨肉瘤、或者该受试者患有骨肉瘤的风险高、或者骨肉瘤患者被判断为预后不良。

本发明还提供了一种骨肉瘤的治疗方法，所述方法包括增加LINP1表达量或者增强LINP1的调节活性。

本发明还提供了一种骨肉瘤药物的筛选方法，可以通过在对骨肉瘤细胞添加测试药物后或在对骨肉瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量LINP1的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当LINP1的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。

在本发明的上下文中，“诊断骨肉瘤”包括判断受试者是否已经患有骨肉瘤、判断受试者是否存在患有骨肉瘤的风险、判断骨肉瘤患者对药物治疗的反应性、或者判断骨肉瘤患者的预后情况。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本发明的优点和有益效果：

本发明的发现了一种诊断骨肉瘤的分子标志物，使用该分子标志物可以在骨肉瘤发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。

本发明的包括LINP1的激活剂的治疗药物可用作新的骨肉瘤的治疗药物。

附图说明

图1显示利用QPCR检测LINP1过表达情况的统计图；

图2显示LINP1过表达对骨肉瘤细胞增殖影响的统计图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选差异表达非长链编码RNA

1、研究对象：

选取医院骨科行手术治疗精细切除的3例骨肉瘤患者的典型肿瘤标本及3例正常的癌旁组织，肿瘤标本病理诊断均证实为骨肉瘤。手术所取标本立即分管装入冻存管速冻，离体至速冻之间均小于30min。

2、组织RNA总提取

2.1组织匀浆

取约50mg组织样品放入高温灭菌处理后的研钵内，加入的1ml的Trizol溶液，充分研磨组织用移液枪移入1.5ml的离心管内，颠倒混匀10下，室温静置10分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

2.2分离阶段

4℃，12000rpm离心5-10分钟，取上清。离心得到的沉淀包含细胞外膜、多糖、高分子，上清液中含有RNA。取澄清的匀装溶液加入0.2ml的氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，使其充分混勻，室温静置5分钟。再次4℃，12000rpm离心10min，样品会分成三层，RNA主要在上层水相中，将上层水相转移到新管的新管内(约500μL)，注意不要吸到中间层和下层液体，否则会造成DNA和蛋白污染。

2.3RNA沉淀

在新管内加入0.5ml预先冷冻的异丙醇，混匀后放置于-20℃中30分钟，后4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清。离心前RNA沉淀经常不可见，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。

2.4RNA洗涤

小心倒掉上清，留取沉淀。加入1ml的75％乙醇(用DEPC水配制)，涡旋振荡混匀样品洗涤沉淀RNA，如不能涡旋混匀，可用手动剧烈颠倒混匀2分钟。然后4℃，7000rpm离心5分钟。

2.5RNA再溶解

离心后小心弃上清，可用移液器小心吸取上清，注意不要吸到沉淀。室温晾置10分钟左右干燥RNA沉淀，注意不要让RNA沉淀完全干燥以免降低RNA的溶解性。最后用适量的DEPC水溶解沉淀，待完全溶解后分成小份-70℃保存或者立即进行逆转录。

3、RNA质量检测

组织总RNA纯度和浓度的测定

使用NanoDropND-1000型紫外分光光度计测定组织总RNA的浓度和纯度，首先需要使用DEPC水进行背景调零后进行测定，操作步骤如下：

(1)滴加1μL DEPC水(调零)或者RNA样品至测量基座的表面；

(2)液滴会自动在上下基座之间形成液柱并自动完成测定，RNA浓度及质量的各种参数将会在电脑自动生成参数文件；

(3)测定完一个后，擦拭干净上下基座表面的样本液体后再进行下一个样本的测定；

(4)测定结果：

浓度计算：

A260下读值为1表示40μg RNA/ml。样品RNA浓度(计算公式为：A260*稀释倍数*40μg/ml。具体计算举例如下：

RNA溶于40μl DEPC水中，取5Μl 1:100稀释至495μl的DEPC水中，测得A260＝0.21，RNA浓度＝0.21*100*40μg/ml＝840μg/ml

取5μl用来测量后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：35μl*840μg/ml＝29.4μg；

纯度检测：

RNA溶液的A260/A280比值是一种RNA纯度检测的常用方法，理想的纯的RNA其OD260/A280的比值是1.8-2.1，纯度越高越接近2.0

OD260/A280的比值>2.1或者<1.8都认为是RNA污染。

4、组织总RNA完整性测定

经1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，紫外透射光下观察，检测RNA的完整性。

5、芯片实验

申请人选择美国Arraystar公司提供的12*135K的human LncRNA Microarray(v2.0)芯片，该芯片数据来源几乎包含了所有权威LncRNA数据库，如NCBI Refseq，UCSCKnown Gene6.0，Gencode v13，RNA db2.0，NRED，LincRNAs，同时也对mRNA序列研究，mRNA数据主要来源于The collaborative consensus coding sequence(CCDS)project。

5.1LncRNA芯片杂交：

主要步骤如下：

(1)合成双链互补cRNA：

使用Invitrogen SuperScript ds-cDNA合成试剂盒，取5μg总RNA加入100pmol的oligo dT primers(特制引物)，按照Invitrogen SuperScript ds-cDNA合成试剂盒手册合成；

(2)标记纯化双链互补cDNA

ds-cDNA严格按照Nimblegen gene expression analyisis操作手册纯化和标记，简单来说，先把4μg的RNase加入到ds-cDNA中在37℃中孵育10分钟，然后用苯酚-氯仿-异戊醇混合液清洗接着用冰冻乙醇进行沉淀；标记ds-cDNA按照Nimblegen gene expressionanalyisis操作手册使用Nimblegen One-Color DNA标记试剂盒，先取1μg的ds-cDNA，加入1OD的Cy3引物在98℃中孵育10分钟，然后加入100pmol三磷酸脱氧核糖核酸和DNA聚合酶羧基端大片段(并充分混合在37℃中孵育2小时。最后加入0.1体积的0.5MEDTA反应液终止反应，最后用异丙醇乙醇沉淀进行纯化；

(3)标记效率质量检测：用NanoDropND-1000对ds-cDNA进行效率质量检测；

(4)芯片杂交：

将4μg标记有Cy3荧光染料的ds-cDNA和Microarrays芯片放进Nimblegenhybridization buffer液中，在杂交培植室内42℃孵育16-20小时，将杂交后的芯片在ozone-free环境下按照Nimblegen wash buffer试剂盒手册进行清洗；

5.2图像采集和数据分析

清洗后的芯片放入Axon genepix 4000B芯片扫描仪，打开genepix6.0软件以5μm像素的分辨率进行扫描，获得的扫描图像以TIFF格式输入到NimbleScan软件进行网格对齐和数据分析。这些数据需要通过分位数标准化和稳健多芯片平均标准化分析，从而获得标准化的芯片表达数据，再把数据输入到Agilent genespring GX软件进行分析，图像定量和标准化数据处理全部完成后以列表形式输出数据，获得的mRNA和LncRNA数据，经过折叠倍率筛选，筛选出差异表达的mRNA和LncRNA数据重新制作成差异表达的mRNA和LncRNA数据，表达差异巨大的mRNA和LncRNA用散点图和火山图(标示出来，同时应用软件Agilentgenespring GX软件的聚类分析图表对数据进行聚类分析。

13、结果

经过图像采集和数据分析后得到了mRNA和LncRNA的数据，设定表达差异的标准：Fold chang≥2.0，P值≤0.05。根据这个标准筛选得到两组之间差异表达的mRNA和LncRNA。筛选获得的数据显示，骨肉瘤组织和正常组织相比，有875个LncRNA差异表达，其中上调569个，下调306。

实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因

基于实施例1的筛选结果，根据P value的大小，选择LINP1进行验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集骨肉瘤组织及正常癌旁组织各50例。

2、在转录水平上进行验证

试剂：反转录试剂盒(DDR037A)购自宝生物工程(大连)有限公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBR Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseHPlus)试剂盒为日本Takara公司生产。

2.1提取组织RNA

步骤同实施例1。

2.2引物设计

根据LINP1转录本序列，通过NCBI的引物设计工具(Primer BLAST)设计引物，上游引物：5’-GAATAAGACAGACCAACT-3’(SEQ ID NO.2)；下游引物：5’-GCTGACAATATCTAAGGA-3’(SEQ ID NO.3)。

根据GAPDH(内参基因)序列设计引物，上游引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.4)；5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.5)。

2.3反转录反应

以提取的总RNA(1μg)为模板，加入以下反应体系，具体为：Buffer4μL，RT Enzyme Mix 1μL，Oligo dT Primer(50μM)1μL，Random 6mers(100μM)1μL，以无RNA酶的ddH₂O将反应体积补足为20μL。将上述混合液置于37℃15min，85℃5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。

2.4Real-time PCR

按日本Takara公司的Premix Ex Taq^TM(Tli RNaseH Plus)试剂盒推荐的引物最适浓度(10μM)，将LINP1引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：SYBR PremixEx Taq^TM(2×)25μL，ROX Reference Dye(50×)1μL，PCR上游引物(10μM)1μL，PCR下游引物(10μM)1μL，cDNA 4μL，灭菌ddH₂O 18μL。以95℃20s预变性，按95℃10s变性、60℃20s退火、70℃10s延伸过程循环40次，获得Ct值。结果釆用相对定量法，运用公式2^-△△ct计算。实验重复3次。

3、结果

结果显示，以正常组织中LINP1相对表达水平为1，骨肉瘤组织中LINP1表达水平是0.42±0.14，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例3LINP1过表达

1、质粒构建

通过实施例2的方法获得LINP1的cDNA，扩增序列如SEQ ID NO.1所示的LINP1的cDNA序列。将上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-LINP1用于后续实验。

2、骨肉瘤细胞的培养与转染

2.1细胞培养

将骨肉瘤细胞株143B用含10％胎牛血清，青、链霉素各100U/ml的RPMI1640于37℃、5％CO₂的饱和湿度箱中培养。

2.2细胞转染

(1)转染前一天将0.5-2*10⁵个肿瘤细胞悬浮于500μl不含抗生素的培养基，接种至24孔培养板。

(2)转染当天细胞密度应达80％-90％，准备以下复合物A：将1μg质粒DNA稀释于无血清培养基中，轻轻混匀；复合物B：取4μl Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混匀。

(3)将复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育。

(4)将100μl脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37℃含5％CO₂培养箱孵育5-7小时。

(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小时。

3、利用QPCR实验检测pcDNA3.1-LINP1的过表达情况

3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。

3.2逆转录

步骤同实施例2。

3.3QPCR

步骤同实施例2。

3.4结果

结果如图1所示，pcDNA3.1-LINP1能够成功过表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4LINP1的表达对骨肉瘤细胞增殖能力的测定

1、步骤：

将转染24小时后的骨肉瘤细胞143B接种于96孔细胞培养板中，每孔2*10³个细胞/孔/200μl，细胞分组如下：

实验组1(对照组)：骨肉瘤细胞转染pcDNA3.1；

实验组2：骨肉瘤细胞转染pcDNA3.1-LINP1。

将细胞在37℃、5％CO₂培养箱再次孵育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

结果如图2所示，相比于实验组1，实验组2的细胞增殖减缓，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，LINP1表达可以抑制骨肉瘤细胞增殖。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 固安博健生物技术有限公司

<120> 用于诊治骨肉瘤的长链非编码RNA标志物

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 838

<212> DNA

<213> 人源(Homo sapiens)

<400> 1

ccctccgtct ccttgactct gggtgggctg tgtgactttt ccttgctcaa tagaatgaga 60

aggaggtggc gcaccggcta caaggctaga ccgggggctc gcatatctcc acttgcagct 120

gccactgcca ttagaagaac ttgctcagcc agctcctggg ccccaggaaa aggacaagtg 180

tcacccagaa cagagccacc tccagctgca ctcagctcca gaagctggcc cagccggtcc 240

agtacacctt ttaaataatg tcctctacgt gccggtgtgg aagtagcccg gatgcaattg 300

aatgaacaac agacggtgct ttccaggacg gcgctgtgct ttccaggatg gtgctgtgct 360

ttcattcatt tgggtagctc ctctgtgagc ctcccagcgc cgactgcaga gcccccactc 420

tccagcctgc aagaccccga aattcaagcc acacaaagaa aggaggaggg ggccgttggc 480

atttactgaa ccttataaaa ctgtcagcaa aacagccctt aggcttggac tccctgctag 540

ccgggtttta cggtgctgaa gtcagcatct tgattcagct gcataaataa tctcctgcag 600

tcctgcaagg cctggggtag gagagggtat ggggaccagg gcactctgta agggctggga 660

taggaacccc agggaataag acagaccaac tgcgggactt cagactccac tgcagccggg 720

atcgggttgt tgttaatttc ttaagcaatt tctaaattct gtattgactc tctcatgcat 780

gtaactgatc cttagatatt gtcagccaaa tgactaaagg atttagaaat aaaaaaaa 838

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaataagaca gaccaact 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctgacaata tctaagga 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctctggtaaa gtggatattg t 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims

1.检测长链非编码RNA表达的试剂在制备骨肉瘤辅助诊断或预后预测产品中的应用；所述长链非编码RNA是LINP1，所述长链非编码RNA的相应DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括利用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。

5.一种用于骨肉瘤辅助诊断或预后预测的产品，其特征在于，所述产品包括检测权利要求1-4中任一项所述的长链非编码RNA表达的试剂。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测所述长链非编码RNA表达量时使用的PCR扩增引物。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

8.一种用于治疗骨肉瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-4中任一项所述的长链非编码RNA的激活剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述激活剂包括增加长链非编码RNA水平的激活剂，或提高所述长链非编码RNA功能活性的激动剂。

10.权利要求8或9所述的激活剂在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。