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CN107475185A - 一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基 - Google Patents

一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分：重组人胰岛素：1~100ug/ml；碱性成纤维细胞生长因子：1~50ng/ml；人转铁蛋白：1~50ug/ml；亚硒酸：1~80ug/ml；丝氨酸：1~300ug/ml氯化胆碱：1~200ug/ml；腺嘌呤：1~60ug/ml；单乙酰胺：1~100ug/ml；磷酰乙醇胺：0.01~10mmol/ml；孕酮:1~40 pg/ml；三碘甲状腺氨酸:1~50pg/ml；人血浆：1~100ul/ml。本发明的培养基在培养人脂肪来源间充质干细胞和人脐带间充质干细胞中，取得了显著优于传统培养基的培养效能，具有细胞保持良好干细胞特性，细胞增殖能力、生物学性能更强的特点；降低了干细胞对胎牛血清的依赖，也减轻了胎牛血清对干细胞特性和分化的不利影响，彻底去除胎牛血清，避免因为存在动物血清质量不佳导致的病毒污染风险，更加符合临床应用。

Description

一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基。
背景技术
间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
传统的间充质干细胞培养方法使用的培养基大都含有动物血清，一方面造成成纤维细胞的污染，影响角质细胞生长，加速角质细胞分化；另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，对细胞生物学、毒理学、病理学等基础研究形成干扰；同时采用添加血清的培养基构建的人工组织进行体内移植，可以使受者体内产生抗牛蛋白抗体引起免疫反应，从而导致患者尤其在重复输注干细胞治疗后治疗失效等不安全因素。
当前也有一些公司开发的新一代无血清培养基，如Invitrogen 开发MSC SFMXenoFree 无血清培养基、加拿大stemcell 公司开发了MesenCultTM-XF Medium 无血清培养基、BD 公司开发的BDMOSAICTM Hmsc SF Medium 和CellGenix 开发的Serum-free MSCMedium 等。但这些培养基价格昂贵，在培养MSC 过程中都需要使用附属产品进行细胞培养瓶的包被处理。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种增殖能力强、适合于临床应用的间充质干细胞的无动物源成分培养基。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分，以浓度计：
重组人胰岛素：1~100ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：1~50ng/ml；
人转铁蛋白：1~50ug/ml；
亚硒酸：1~80ug/ml；
丝氨酸：1~300ug/ml；
氯化胆碱：1~200ug/ml；
腺嘌呤：1~60ug/ml；
单乙酰胺：1~100ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.01~10mmol/ml；
孕酮:1~40pg/ml
三碘甲状腺氨酸:1~50pg/ml；
人血浆：1~100ul/ml。
作为优选，本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分：
重组人胰岛素：1~50ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：1~20ng/ml；
人转铁蛋白：1~20ug/ml；
亚硒酸：1~30ug/ml；
丝氨酸：1~150ug/ml；
氯化胆碱：1~100ug/ml；
腺嘌呤：1~30ug/ml；
单乙酰胺：1~20ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.05~1mmol/ml；
孕酮:1~10pg/ml
三碘甲状腺氨酸:1~20pg/ml；
人血浆：1~50ul/ml。
更有选地，本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分：
重组人胰岛素：5ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：4ng/ml；
人转铁蛋白：5ug/ml；
亚硒酸：6.84ug/ml；
丝氨酸：105ug/ml；
氯化胆碱：89.3ug/ml；
腺嘌呤：12.2ug/ml；
单乙酰胺：14ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.1mmol/ml；
孕酮:3.145pg/ml
三碘甲状腺氨酸:13.46pg/ml；
人血浆：15ul/ml。
优选的，所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，还包括基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM 培养基。
所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基在人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞培养中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明培养基在通用型DMEM培养基的基础上，添加十余种促进细胞生长的物质，降低了干细胞对胎牛血清的依赖，也减轻了胎牛血清对干细胞特性和分化的不利影响，彻底去除胎牛血清，更加符合临床应用。
2、对比通用型间充质干细胞培养基,上述培养基具有细胞保持良好干细胞特性、细胞增殖能力更强的特点；
3、与国外某知名低血清培养基相比，培养最常使用的人脂肪来源干细胞/人脐带间充质干细胞，在细胞形态和增殖能力方面，都表现出了优势；
4、本发明培养基生产成本可以控制在国外同类型培养基价格1/10左右；
5、在培养基中加入单乙酰胺、氯化胆碱，有助于新的细胞的分裂合成。在细胞的活动中，细胞会通过单乙酰胺激酶以单乙酰胺为底物合成磷酰乙醇胺，通过胆碱激酶将胆碱转化为磷酸胆碱，同时单乙酰胺也是糖基磷脂酰肌醇的组成部分，糖基磷脂酰肌醇是细胞表面蛋白黏附的必须物质；三碘甲状腺氨酸，刺激RNA多聚酶I和II的合成，增加蛋白质的合成；丝氨酸，参加嘌呤和嘧啶的生物合成，是多种氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸等）和叶酸的前体。
附图说明：
附图1为本发明培养基成纤维细胞培养实验细胞计数分析；
附图2为本发明培养基成纤维细胞培养实验细胞形态观察图（x40）；
附图3为本发明培养基成纤维细胞培养实验细胞形态观察图（x100）。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。
实施例一
本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分，以浓度计：
重组人胰岛素：5ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：4ng/ml；
人转铁蛋白：5ug/ml；
亚硒酸：6.84ug/ml；
丝氨酸：105ug/ml；
氯化胆碱：89.3ug/ml；
腺嘌呤：12.2ug/ml；
单乙酰胺：14ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.1mmol/ml；
孕酮:3.145pg/ml
三碘甲状腺氨酸:13.46pg/ml；
人血浆：15ul/ml。
实施例二：
本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分，以浓度计：
重组人胰岛素：1ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：20ng/ml；
人转铁蛋白：50ug/ml；
亚硒酸：1ug/ml；
丝氨酸：150ug/ml；
氯化胆碱：1ug/ml；
腺嘌呤：60ug/ml；
单乙酰胺：20ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.05mmol/ml；
孕酮:1pg/ml
三碘甲状腺氨酸:1pg/ml；
人血浆：10ul/ml。
实施例三：
本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分，以浓度计：
重组人胰岛素：50ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：50ng/ml；
人转铁蛋白：1ug/ml；
亚硒酸：80ug/ml；
丝氨酸：300ug/ml；
氯化胆碱：100ug/ml；
腺嘌呤：1ug/ml；
单乙酰胺：1ug/ml；
磷酰乙醇胺：10mmol/ml；
孕酮:10pg/ml
三碘甲状腺氨酸:50pg/ml；
人血浆：100ul/ml。
实施例四：
本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，包括下列成分，以浓度计：
重组人胰岛素：100ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子：1ng/ml；
人转铁蛋白：20ug/ml；
亚硒酸：30ug/ml；
丝氨酸：1ug/ml；
氯化胆碱：200ug/ml；
腺嘌呤：30ug/ml；
单乙酰胺：100ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.01mmol/ml；
孕酮:40pg/ml
三碘甲状腺氨酸:20pg/ml；
人血浆：50ul/ml。
实施例四：无动物源成分培养基成纤维细胞培养实验
1. 以DMEM为基础培养基，共进行9组不同添加物添加培养实验，并进行细胞形态学观察和细胞计数分析。
如附图1所示，在DMEM基础培养基中添加特有的促进生长的成分后，2%FCS(胎牛血清)（培养基2~5）的添加极大促进了人成纤维细胞的增殖，远远优于添加10%FCS的常规培养基（培养基1）；而以1%（10ul/ml）人血浆（培养基9）和培养基8（本发明培养基）置换2%FCS，细胞的增殖效率更有显著提高，本发明培养基（培养基8）培养效果最好。
细胞形态比较：图2~3中的A~I分别对应培养基1~9的细胞形态，培养基1 (图A)的常规培养基，成纤维细胞胞体大，成纤维条索状；添加剂+2%FCS组（图E）细胞胞体小，呈短梭型；本发明培养基（图H）组，细胞胞体最小，呈星形多角状，细胞核浆比最大，具有更强的增殖能力。

Claims (5)

1.一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，其特征在于，包括下列成分：
重组人胰岛素：1~100ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子： 1~50ng/ml；
人转铁蛋白：1~50ug/ml；
亚硒酸：1~80ug/ml；
丝氨酸：1~300ug/ml；
氯化胆碱：1~200ug/ml；
腺嘌呤：1~60ug/ml；
单乙酰胺：1~100ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.01~10mmol/ml；
孕酮:1~40 pg/ml；
三碘甲状腺氨酸:1~50pg/ml；
人血浆：1~100ul/ml。
2.根据权利要求1所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，其特征在于，包括下列成分：
重组人胰岛素：1~50ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子： 1~20ng/ml；
人转铁蛋白：1~20ug/ml；
亚硒酸：1~30ug/ml；
丝氨酸：1~150ug/ml；
氯化胆碱：1~100ug/ml；
腺嘌呤：1~30ug/ml；
单乙酰胺：1~20ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.05~1mmol/ml；
孕酮:1~10pg/ml；
三碘甲状腺氨酸:1~20pg/ml；
人血浆：1~50ul/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，其特征在于，包括下列成分：
重组人胰岛素：5ug/ml；
碱性成纤维细胞生长因子： 4ng/ml；
人转铁蛋白：5ug/ml；
亚硒酸：6.84ug/ml；
丝氨酸：105ug/ml；
氯化胆碱：89.3ug/ml；
腺嘌呤：12.2ug/ml；
单乙酰胺：14ug/ml；
磷酰乙醇胺：0.1mmol/ml；
孕酮:3.145pg/ml；
三碘甲状腺氨酸:13.46pg/ml；
人血浆：15ul/ml。
4.根据权利要求1~3任一项所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基，其特征在于，还包括基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM 培养基。
5.根据权利要求1~3任一项所述的一种用于培养人间充质干细胞的无动物源成分培养基在人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞培养中的应用。
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