CN107459579A - 一种靶向egfr和cd47双特异性融合蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型靶向EGFR和CD47的双特异性抗体融合蛋白、制备方法及其应用。本发明所提供的一种新型双特异性抗体融合蛋白Bi‑SP具有同时结合EGFR和CD47的功能，该双特异性抗体融合蛋白在结合EGFR的同时，也可封闭或阻止CD47和SIRPα结合，将重新激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应，起到更好的抗肿瘤作用。

Description

一种靶向EGFR和CD47双特异性融合蛋白、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新型靶向EGFR和CD47的双特异性抗体融合蛋白、制备方法及其应用。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜受体酪氨酸激酶，在肿瘤进展中有着重要作用。过度的EGFR激活和肿瘤的发生及转移相关。据报道，60%-80%的结肠癌有EGFR的过度表达。另外，EGFR也是预测结直肠癌和乳腺癌的重要标志物。更重要的是EGFR位于癌细胞表面，因此是开发靶向抗体的理想靶点。抗体可以特定地结合到EGFR的胞外区III结构域，不仅阻止了配体的结合, 而且阻止了在结构域II上延伸结构域的二聚体化（Li S, et al.Structural basis for inhibition of the epidermal growth factor receptor bycetuximab[J]. Cancer Cell, 2005, 7(4):301-311.；Iida M, et al. Sym004, a novelEGFR antibody mixture, can overcome acquired resistance to cetuximab[J].Neoplasia, 2013, 15(10):1196-1206.）经FDA批准的靶向EGFR的抗体包括西妥昔单抗和帕妥木单抗。它们被用于在临床上治疗KRAS野生型的进展性结肠癌。

表皮生长因子受体（即EGFR）也称作c-erbB l/Herl，其家族成员都是生长因子受体酪氨酸激酶，它们在细胞表面与特异的生长因子或天然配体相互作用，如与EGF或TGFa相互作用，由此活化受体酪氨酸激酶。已发现的该家族第一个成员是表观分子量为 165KD 的糖蛋白。

EGFR 在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中具有重要的作用，同时在相当一部分的人类肿瘤中都有表达。在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。由此可知，如果有药物能阻断EGFR 的活性，将会抑制其磷酸化和信号传导，从而起到多重途径的抗肿瘤作用，同时也能增加化疗和放疗的抗肿瘤疗效。在一些研究中，EGFR抑制剂与多种化疗药物和放疗药物联合作用于一些肿瘤细胞株时，表现出累加和协同作用。

EGFR抑制剂主要包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、喹唑啉pyralo-/吡咯并-/吡啶并嘧啶、配体-毒素和免疫毒素联结物，以及反义核苷酸和EGFR/配体主导的疫苗等。一些体内和体外实验显示抗 EGFR 抗体成功的抑制了表达 EGFR 的肿瘤细胞株的生长。在实体瘤的治疗中，一些抗 EGFR 单克隆抗体单独应用或与传统治疗方法合并应用的治疗结果令人鼓舞。现有技术中已经描述了多种小鼠的抗 EGFR 单克隆抗体，可与EGFR高特异的结合，这些抗体大致可分为两类，一类是可与受体结合但不抑制 EGF结合的抗体，另一类是可与受体结合并且还抑制 EGF结合的抗体。但是患者对鼠源抗体产生的免疫应答限制了这些抗体在人类治疗和体内诊断中的应用。患者会产生人抗小鼠抗体反应（HAMA），从而限制了抗体到达其抗原靶标的能力，使抗体的效能降低。

一些研究人员为了减少HAMA 反应，研制出了人鼠嵌合的抗体，其中小鼠可变区（V）与人恒定区（C）连接。该抗体证明在临床上好于鼠源抗体，但是嵌合抗体的小鼠V 区中仍然含有使患者产生免疫原性的成分，限制了其应用。

目前已有全人源抗体Panitumumab（WO9850433）被应用于治疗生长因子过度表达的疾病中。Panitumumab（E7.6.3，ABX-EGF，AMG954，商品名：Vectibix，中文名：帕尼单抗）为全人源单克隆抗体，其结构为IgG2κ，其作用靶点为表皮生长因子受体（EGFR，ErbB-1或HER1） ，该抗体主要用于治疗表达表皮生长因子受体的转移性结直肠癌。Panitumumab是利用XenoMouse技术制备的全人源抗体，不良免疫应答的发生几率很低。

通过结合到EGFR的胞外区，单克隆抗体介导了直接的效应机制，导致了封闭配体结合，受体下调，细胞周期阻滞及诱导凋亡的作用，并且引起了针对癌细胞的免疫调节机制，例如ADCC效应及CDC效应。然而并非所有的抗体都可以介导ADCC效应，IgG1比IgG2有更强的引发ADCC效应的能力。

帕尼单抗是一种全人的IgG2型单克隆抗体，可以特异性地结合EGFR，且有较高的亲和力。使用帕尼单抗进行治疗具有免疫原性低及超敏反应发生率低的优势。Vogit等的实验结果表明了帕尼单抗在EGFR上的结合位点与西妥昔并非完全一致（Voigt M,Functional dissection of the epidermal growth factor receptor epitopestargeted by panitumumab and cetuximab. Neoplasia 2012; 14:1023-31），但对西妥昔耐药的患者对帕尼治疗敏感（西妥昔耐药：第492位丝氨酸突变为精氨酸），与上述结论相一致，这解释了对西妥昔耐药的患者对帕尼治疗敏感的原因（Montagut C, Identificationof a mutation in the extracellular domain of the Epidermal Growth FactorReceptor conferring cetuximab resistance in colorectal cancer. Nat Med 2012;18:221-3）然而，作为一种全人的IgG2型抗体，它缺乏了巨噬细胞和NK-细胞介导的经典的ADCC效应。最近的研究结果表明，缺乏ADCC效应可能会限制帕尼在体内发挥功能效应。

CD47即整合素相关蛋白(integrin-associated protein, IAP)，表达于细胞表面，可结合巨噬细胞表面的信号调节蛋白-α (signal-regulatory protein α, SIRPα)进而磷酸化SIRPα的胞质内免疫受体酪氨酸抑制性基序(immunoreceptor tyrosine-basedinhibition motifs, ITIMs)，招募磷酸酶SHP-1后向巨噬细胞发出“别吃我（Do not eatme）”的抑制性信号。一方面，对正常细胞而言，这是一种“自我保护”信号，可保护正常细胞免遭巨噬细胞的吞噬清除。另一方面，CD47在多种淋巴瘤及实体肿瘤细胞表面的广泛表达抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。这也导致了在肿瘤患者体内，巨噬细胞失能而无法清除杀灭肿瘤细胞。因此，以CD47为靶点开发可封闭或阻止其和SIRPα结合的药物将重新激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应。研究显示，靶向CD47的单克隆抗体Ab400在体内和体外都显示了对肝细胞癌生长和进展的抑制效应（Xiao Z, et al. Antibodymediated therapy targeting CD47 inhibits tumor progression of hepatocellularcarcinoma. Cancer Lett 2015; 360:302-9.）。在乳腺癌，结肠癌等其他类型的实体肿瘤治疗的临床前研究中，抗CD47抗体也显示了较强的抑瘤效果。另外，将抗CD47抗体和靶向CD20的利妥昔单抗(Rituximab)联用对清除非霍奇金淋巴瘤细胞具有协同效应（Chao MP,et al. Anti-CD47 antibody synergizes with rituximab to promote phagocytosisand eradicate non-Hodgkin lymphoma. Cell 2010; 142:699-713）。研究人员开发的可靶向CD20和CD47的双特异性抗体在体外和体内试验中也显示了较之针对单一靶点抗体更强的抑瘤效果（Piccione EC, A bispecific antibody targeting CD47 and CD20selectively binds and eliminates dual antigen expressing lymphoma cells. MAbs2015:0）。最近的研究表明，工程化改造的SIRPα突变体，具有较之SIRPα野生型更高的对CD47的亲和力且显示出对多种肿瘤的抑制效应, 是一种潜在可开发的CD47拮抗剂。更为重要的是，SIRPα突变体与抗EGFR抗体（西妥昔单抗）联合使用时也有着协同效应，可进一步增强西妥昔单抗的抑瘤效果（Weiskopf K, et al. Engineered SIRPalpha variants asimmunotherapeutic adjuvants to anticancer antibodies. Science 2013; 341:88-91）。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种新型靶向EGFR和CD47的双特应性抗体融合蛋白、制备方法及其应用。本发明以Pan（Panitumumab帕尼单克隆抗体IgG1改型）和SIRPα突变体为基础，通过基因工程技术构建新型双特异抗体融合蛋白，将其命名为Bi-SP，其结构示意图如图1所示。

本发明所提供的一种新型双特异性抗体融合蛋白Bi-SP具有同时结合EGFR和CD47的功能，该双特异性抗体融合蛋白在结合EGFR的同时，也可封闭或阻止CD47和SIRPα结合，将重新激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应，起到更好的抗肿瘤作用。

在本研究中，为了达到重新激活巨噬细胞吞噬表达CD47肿瘤细胞的目的，我们发展了这种新型双特异性抗体融合蛋白，命名为Bi-SP。

为了获得更有效的针对EGFR阳性癌症的靶向抗体制剂，我们采用基因工程技术构建抗EGFR抗体Pan和SIRPα-Fc蛋白组成的双特异性抗体融合蛋白并使其在哺乳动物细胞中获得高效表达，此抗体制剂可以同时结合肿瘤细胞表面的EGFR和CD47分子，在特异性靶向肿瘤细胞的同时封闭了CD47和巨噬细胞表面SIRPα之间的“别吃我”信号传导，强有力的激活了巨噬细胞的对肿瘤细胞的吞噬。我们通过体内外实验证明此双特异性抗体融合蛋白的抗肿瘤作用显著强于Panitumumab抗体，为EGFR阳性癌症（如肺癌及结直肠癌等），尤其是对西妥昔单抗治疗耐受癌症的临床治疗提供一种新型高效抗体制剂，并为其他抗肿瘤基因工程抗体的研发提供新的思路。

综上所述，Bi-SP作为一种有潜力发展成为新型治疗药物的候选药物，可以进一步增强抗-EGFR治疗的临床疗效及减少肿瘤治疗中的副反应。

本发明公开了：

一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，融合蛋白分别结合EGFR和CD47。

如上所述一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含突变的IgG1的Fc端，EGFR结合区，和CD47结合区。

如上所述一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述EGFR结合区具有SEQ IDNO：6所述的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：8所述的重链氨基酸序列。

如上所述一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述CD47结合区具有SEQ IDNO：10所述的氨基酸序列。

如上所述一种双特异性抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括：全基因合成SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9碱基序列，连接入表达载体、转染、表达、分离纯化。

一种组合物，含有如上所述的双特异性抗体融合蛋白，和药学上可接受的载体。

如上所述一种双特异性抗体融合蛋白在制备抗体肿瘤药物中的用途。

如上所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

如上所述的任一用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。

本发明公开上述全人源抗EGFR 和CD47双特异性抗体融合蛋白，和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的全人源抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解（包括但不限于凝聚、脱氨或氧化）。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2°C-8°C条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30°C至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述一种全人源抗EGFR 和CD47双特异性抗体融合蛋白的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯（吐温20或80）；poloxamer（如poloxamer 188）；Triton；十二烷基硫酸钠（SDS）；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使双特异性抗体的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含全人源抗EGFR 和CD47双特异性抗体融合蛋白的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明中全人源抗EGFR 和CD47双特异性抗体融合蛋白及其组合物在对包括人在内的动物给药，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明公开的全人源抗EGFR 和CD47双特异性抗体融合蛋白及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物（1）作用于DNA化学结构的药物 ： 烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类 ； 铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等 ；丝裂霉素（MMC）； （2）影响核酸合成的药物： 二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤（MTX）和Alimta等； 胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类（5FU、FT－207、卡培他滨）等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6－巯基嘌呤（6－MP）和6－TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲（HU）等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷（Ara-C）和健择（Gemz）等；（3）作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；（4）主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；（5）其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成； 2、激素类 抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨 RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤 干扰素； 白细胞介素－2 ；胸腺肽类；4、单克隆抗体：西妥昔 Cetuximab (C225) ；Panitumumab帕尼单抗（ABX-EGF，AMG954）；5、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物； 细胞分化诱导剂如维甲类； 细胞凋亡诱导剂。本发明公开的全人源抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

本发明中所涉及的定义如下：Pan： IgG1型的帕尼单抗；Bi-SP: 全人源抗EGFR 抗体和CD47受体融合蛋白； EGFR：表皮生长因子受体； IgG：免疫球蛋白 G；ELISA：酶联免疫吸附试验；SPR：表面等离子共振技术；CI：置信区间；LC，抗体轻链；HC，抗体重链；EGFRVIII：EGFRIII类突变体；CRC：结肠癌；ECD：细胞外区域；SEC：分子筛层析；CCK-8：活细胞计数试剂盒 8。

附图说明

图1、Bi-SP结构示意图

图2、Bi-SP、Pan、SIRPα的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图谱

图3、流式细胞术(FACS)分析Bi-SP对EGFR阳性的231细胞的结合活性（1、阴性对照：PBS；2、阳性对照：Pan；3、样品：Bi-SP；4、阴性对照：SIRPα）

图4、流式细胞术(FACS)分析Bi-SP对CD47阳性的HL-60细胞的结合活性（1、阴性对照：PBS；2、阴性对照：Pan；3、样品：Bi-SP；4、阳性对照：SIRPα）

图5、流式细胞术测定Bi-SP促进巨噬细胞吞噬作用的效果（A：H292-R细胞；B：A431-R细胞）

图6、小鼠体内Bi-SP的抑瘤试验结果（A：H292-R细胞；B：A431-R细胞）

图7、Bi-SP在小鼠体内的分布与肿瘤靶向性（A：H292-R细胞；B：A431-R细胞）

图8、Bi-SP对肿瘤内巨噬细胞浸润的促进效果（A：H292-R细胞；B：A431-R细胞）

图9、Bi-SP治疗后荷瘤小鼠血清TNFa水平测定结果（A：H292-R细胞；B：A431-R细胞）。

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述。

实施例1：新型双特异性抗体融合蛋白Bi-SP的构建

采用“Knob-in-hole”抗体重链恒定区突变技术，将抗EGFR的Pan一侧Fc段及SIRPα突变体-Fc段（简称SIRPα-Fc）进行突变，使抗EGFR的Pan一侧与CD47受体SIRPα突变体-Fc段（简称SIRPα-Fc）一侧可以正确配对组装成双特异性抗体融合蛋白的结构。新型双特异性抗体融合蛋白Bi-SP的结构如图1所示。

Fc段突变体Hole具有SEQ ID NO:1碱基序列，EQ ID NO:2所述的氨基酸序列。

Fc段突变体Knobs具有SEQ ID NO:3碱基序列，EQ ID NO:4所述的氨基酸序列。

如上所述的突变的抗EGFR的Pan轻链具有SEQ ID NO:5的碱基序列，SEQ ID NO:6所述的氨基酸序列；Pan重链具有SEQ ID NO:7的碱基序列，SEQ ID NO:8所述的氨基酸序列。

采用“Knob-in-hole”抗体重链恒定区突变技术：将可以高亲和力靶向CD47的SIRPα突变体与人IgG Fc段序列连接后，连入真核表达载体pCDNA3.1(+)，在其重链恒定区CH3引入两个突变(T368W, S354C)。构建pCDNA3.1(+)-Pan，在其重链恒定区CH3引入四个突变(T366S, L368A, Y497V, Y349C)。通过DNA测序鉴定这些突变位点。恒定区上经过突变的氨基酸可以形成类似于“锁匙模型”的结构，保证了双特异性抗体融合蛋白的正确组装。

SIRPα突变体-Fc段（简称SIRPα-Fc）具有SEQ ID NO:9的碱基序列，SEQ ID NO:10所述的氨基酸序列。

将上述基因片段连接入表达载体，转染、表达、筛选，选取正确表达的克隆。

实施例2：新型双特异性抗体融合蛋白Bi-SP的表达及纯化

将验证正确的克隆基因与表达载体连接，转入CHO细胞进行双特异性抗体融合蛋白的表达。利用斑点印迹法(Dot Blotting)，可筛选获得具有较高表达水平的CHO细胞单克隆，进行扩增，收获培养上清。利用Protein A亲合层析技术，纯化获得90%以上纯度的双特异性可溶性抗体融合蛋白Bi-SP。SDS-PAGE结果见图2，泳道1为分子量标准，泳道2为Pan，泳道3为SIRPα突变体，泳道4为Bi-SP。

实验例1：Bi-SP的体外生物学功能研究

1、获得对西妥昔耐受的肺癌H292细胞(简称H292-R)及表皮癌A431细胞（简称A431-R）

在培养H292细胞和A431细胞的培养基中添加西妥昔单抗至1 μg/mL的浓度，持续培养6个月，通过体外和体内生长抑制试验验证成功培养耐药细胞株。

2、Bi-SP的体外生物学功能研究

(1)SDS-PAGE表征Bi-SP的分子量与纯度。

(2)通过流式细胞术(FACS)分析Bi-SP对EGFR阳性的231细胞和CD47阳性的HL-60细胞的结合活性（图3、图4）。

(3)通过Biacore分析测定Bi-SP的解离常数。

(4)通过流式细胞术测定Bi-SP促进巨噬细胞吞噬作用的能力。

用PKH67GL（绿色荧光）标记从外周血中提取的巨噬细胞，PKH26GL（红色荧光）标记H292-R细胞和A431-R细胞，将巨噬细胞和癌细胞以15:1的比例在分别加入Bi-SP、Pan、SIRPα、对照（PBS）的培养基中共培养24小时，流式细胞术测定被巨噬细胞吞噬的癌细胞比例（图5）。

Biacore分析测定Bi-SP的解离常数结果见表1。

表1、Biacore分析测定Bi-SP的解离常数

上述体外实验的结果表明，本发明的双特异性抗体融合蛋白Bi-SP对EGFR阳性的231细胞和CD47阳性的HL-60细胞具有较高的结合活性，巨噬细胞的吞噬作用较单独使用Pan、SIRPa的作用强。

实验例2：Bi-SP的体内生物学功能研究

NOD-SCID小鼠为免疫缺陷性小鼠，缺失有功能的T、B和NK细胞，但保留巨噬细胞活性。其巨噬细胞表达的SIRPα可与人肿瘤细胞的CD47结合，故利用NOD-SCID小鼠建立异种移植肿瘤模型。

在NOD-SCID小鼠皮下接种A431-R细胞和H292-R细胞，待其肿瘤长至直径10mm时，以腹腔给药的方式注射Bi-SP双特异性抗体或亲本抗体，以PBS为阴性对照，每周2次，连续治疗4周。定期观测各组小鼠肿瘤大小的变化，评价Bi-SP的抗肿瘤治疗效果。

实验结果见图6，该结果表明双特异性抗体融合蛋白Bi-SP的体内抗肿瘤作用明显。

实验例3：Bi-SP的抗肿瘤作用机制研究

1、比较Bi-SP和SIRPα-Fc的靶向性：对Bi-SP或亲本抗体标记荧光探针后，注射入荷瘤NOD-SCID小鼠体内后观测其在肿瘤组织的分布与定位，根据荧光强度与荧光面积的积分数值，计算肿瘤组织与其他组织的抗体分布并进行对比，评估靶向性，结果见图7，该结果表明双特异性抗体融合蛋白Bi-SP的靶向性较强。

2、比较Bi-SP和SIRPα-Fc或Pan的招募巨免疫组织化学试验噬细胞效能。将Bi-SP或亲本抗体治疗后荷瘤小鼠身上的肿瘤取出，利用CD68标志物染色标记巨噬细胞，对显微视野内组织切片中的巨噬细胞进行计数，比较各治疗组中肿瘤内巨噬细胞的浸润情况，实验结果见图8，结果显示双特异性抗体融合蛋白Bi-SP就有较强的招募巨噬细胞能力。

3、利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测经过Bi-SP治疗的荷瘤小鼠体内（血液）相关的免疫因子如：TNF-α等的表达是否上调，从而进一步验证对巨噬细胞的激活。实验结果见图9，结果进一步确认双特异性抗体融合蛋白Bi-SP就有较强的巨噬细胞的激活性能。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海张江生物技术有限公司

<120> 一种靶向EGFR和CD47双特异性融合蛋白、制备方法及应用

<130> 2016

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 705

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60

gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120

acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180

aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240

tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300

ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360

atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt gcaccctgcc cccatcccgg 420

gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tcctgcgccg tcaaaggctt ctatcccagc 480

gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540

cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctcgtgagca agctcaccgt ggacaagagc 600

aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660

tacacgcaga agagcctctc cctgtccccg ggtaaatgag aattc 705

<210> 2

<211> 232

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

1 5 10 15

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

20 25 30

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

35 40 45

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

50 55 60

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

85 90 95

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

100 105 110

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

115 120 125

Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

130 135 140

Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

145 150 155 160

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

165 170 175

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val

180 185 190

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

195 200 205

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

210 215 220

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210> 3

<211> 1615

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcttcacg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 60

acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 120

acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 180

cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 240

acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa 300

gttggtgaga ggccagcaca gggagggagg gtgtctgctg gaagccaggc tcagcgctcc 360

tgcctggacg catcccggct atgcagcccc agtccagggc agcaaggcag gccccgtctg 420

cctcttcacc cggaggcctc tgcccgcccc actcatgctc agggagaggg tcttctggct 480

ttttccccag gctctgggca ggcacaggct aggtgcccct aacccaggcc ctgcacacaa 540

aggggcaggt gctgggctca gacctgccaa gagccatatc cgggaggacc ctgcccctga 600

cctaagccca ccccaaaggc caaactctcc cactccctca gctcggacac cttctctcct 660

cccagattcc agtaactccc aatcttctct ctgcagagcc caaatcttgt gacaaaactc 720

acacatgccc accgtgccca ggtaagccag cccaggcctc gccctccagc tcaaggcggg 780

acaggtgccc tagagtagcc tgcatccagg gacaggcccc agccgggtgc tgacacgtcc 840

acctccatct cttcctcagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900

ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020

cataatgcca agacaaagcc gcgggaagag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080

gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140

aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg tgggacccgt 1200

ggggtgcgag ggccacatgg acagaggccg gctcggccca ccctctgccc tgagagtgac 1260

cgctgtacca acctctgtcc ctacagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc 1320

cccatgccgg gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt 1380

ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa 1440

gaccacgcct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt 1500

ggacaagagc aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct 1560

gcacaaccac tacacgcaga agagcctctc cctgtctccc ggtaaatgag aattc 1615

<210> 4

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 5

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacatcagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaaactcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatattt ctgtcaacac tttgatcatc tcccgctcgc tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa acgtactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642

<210> 6

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln His Phe Asp His Leu Pro Leu

85 90 95

Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 7

<211> 1963

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccgtcagc agtggtgatt actactggac ctggattcgg 120

cagtccccag ggaagggact ggagtggatt ggacacatct attacagtgg gaacaccaat 180

tataacccct ccctcaagag tcgactcacc atatcaattg acacgtccaa gactcagttc 240

tccctgaagc tgagttctgt gaccgctgcg gacacggcca tttattactg tgtgcgagat 300

cgagtgactg gtgcttttga tatctggggc caagggacaa tggtcaccgt ctcttcagct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tggtgagagg 660

ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 720

tcccggctat gcagccccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 780

gaggcctctg cccgccccac tcatgctcag ggagagggtc ttctggcttt ttccccaggc 840

tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 900

tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 960

ccaaaggcca aactctccca ctccctcagc tcggacacct tctctcctcc cagattccag 1020

taactcccaa tcttctctct gcagagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac 1080

cgtgcccagg taagccagcc caggcctcgc cctccagctc aaggcgggac aggtgcccta 1140

gagtagcctg catccaggga caggccccag ccgggtgctg acacgtccac ctccatctct 1200

tcctcagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 1260

gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 1320

gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1380

acaaagccgc gggaagagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1440

ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1500

ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaaggtg ggacccgtgg ggtgcgaggg 1560

ccacatggac agaggccggc tcggcccacc ctctgccctg agagtgaccg ctgtaccaac 1620

ctctgtccct acagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catgccggga 1680

tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga 1740

catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc 1800

cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag 1860

gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1920

cacgcagaag agcctctccc tgtctcccgg taaatgagaa ttc 1963

<210> 8

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly

20 25 30

Asp Tyr Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Asp Arg Val Thr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 9

<211> 1164

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagcttgccg ccaccatgga gcccgccggc ccggcccccg gccgcctcgg gccgctgctc 60

tgcctgctgc tcgccgcgtc ctgcgcctgg tcaggagtgg cgggtgaaga agaactgcag 120

atcatccagc cggacaaatc tgtttctgtt gcggcgggtg aatctgcgat cctgcactgc 180

accatcacct ctctgttccc ggttggtccg atccagtggt tccgtggtgc gggtccggcg 240

cgtgttctga tctacaacca gcgtcagggt ccgttcccgc gtgttaccac cgtttctgaa 300

accaccaaac gtgaaaacat ggacttctct atctctatct ctaacatcac cccggcggac 360

gcgggcacct actactgcat caaattccgt aaaggttctc cggacaccga atttaaatct 420

ggtgcgggca ccgaactgtc tgttcgtgcg aaaccgtctg agcccaaatc ttctgacaaa 480

actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 540

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 600

gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 660

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 720

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 780

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 840

ccccgagaac cacaggtgtg caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 900

gtcagcctgt cctgcgccgt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 960

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1020

tccttcttcc tcgtgagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1080

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1140

ctgtccccgg gtaaatgaga attc 1164

<210> 10

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu

20 25 30

Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly

35 40 45

Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro Val Gly

50 55 60

Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu Ile Tyr

65 70 75 80

Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Glu Thr

85 90 95

Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn Ile Thr

100 105 110

Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys Gly Ser

115 120 125

Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val Arg

130 135 140

Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

145 150 155 160

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

165 170 175

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

180 185 190

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

195 200 205

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

210 215 220

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

225 230 235 240

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

245 250 255

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

260 265 270

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg

275 280 285

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly

290 295 300

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

305 310 315 320

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

325 330 335

Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

340 345 350

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

355 360 365

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375 380

Claims (9)

1.一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，融合蛋白分别结合EGFR和CD47。

2.根据权利要1所述一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含突变的IgG1的Fc端，EGFR结合区，和CD47结合区。

3.根据权利要1、2所述一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述EGFR结合区具有SEQ ID NO：6所述的轻链氨基酸序列和SEQ ID NO：8所述的重链氨基酸序列。

4.根据权利要1、2所述一种双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述CD47结合区具有SEQ ID NO：10所述的氨基酸序列。

5.根据权利要1、2所述一种双特异性抗体融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括：全基因合成SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9碱基序列，连接入表达载体、转染、表达、分离纯化。

6.一种组合物，含有如权利要求1、2、5所述的双特异性抗体融合蛋白，和药学上可接受的载体。

7.根据权利要求1、2、5、6所述一种双特异性抗体融合蛋白在制备抗体肿瘤药物中的用途。

8.根据权利要求6所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求7、8所述的任一用途，还包括和其他的抗肿瘤药物联合使用。