CN107429267A

CN107429267A - 葡糖淀粉酶共混物

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Publication number: CN107429267A
Application number: CN201580076455.4A
Authority: CN
Inventors: V·夏尔马; P·J·M·特尼森
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2014-12-19
Filing date: 2015-12-18
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2035-12-18
Also published as: WO2016100871A1; US11130975B2; US10612058B2; US20180273995A1; CN113403357A; US20200270660A1; CN107429267B; BR112017013172A2; CN113403357B; EP3234166A1

Abstract

提供了用于糖化淀粉底物的方法，所述方法包括使该淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，该葡糖淀粉酶包括轮枝镰孢菌葡糖淀粉酶(Fv‑GA)的氨基酸序列或由其组成，并且进一步使该淀粉底物与至少一种另外的葡糖淀粉酶接触。提供了使用Fv‑GA和至少一种另外的葡糖淀粉酶的组合来糖化和发酵淀粉底物，以产生终产物、生物化学终产物和发酵饮料的另外的方法。

Description

葡糖淀粉酶共混物

序列表

还附上包含SEQ ID NO:1-12的序列表并且将这些序列表以其全文通过引用结合在此。

技术领域

本披露总体上涉及葡糖淀粉酶(GA)，并且还描述了在与生产糖、糖浆、和生物化学品(包括乙醇)相关的工艺中使用这些GA(特别是在共混物中)的方法。

背景技术

工业发酵主要使用葡萄糖作为用于生产大量蛋白质、酶、醇和其他化学终产物的原料。典型地，葡萄糖是淀粉加工的产物，该淀粉加工常规是催化淀粉分解的两步酶工艺，涉及液化和糖化。

在液化期间，将不溶性颗粒状淀粉在水中成浆，进行加热凝胶化，并通过热稳定的α-淀粉酶进行水解。在糖化期间，在液化中产生的可溶性糊精被葡糖淀粉酶进一步水解，产生包含高于95％葡萄糖的高葡萄糖浆。

葡糖淀粉酶是外切作用糖酶，能够水解淀粉(例如，直链淀粉和支链淀粉)的直链和支链糖苷键，从而自淀粉(例如，酶-液化淀粉底物)产生可发酵糖。这些可发酵糖，例如，低分子量的糖(如葡萄糖)然后可以通过其他酶(例如，葡萄糖异构酶)被转化为果糖；进行结晶；或在发酵中使用以产生许多终产物(例如，醇、谷氨酸一钠、琥珀酸、维生素、氨基酸、1,3-丙二醇、以及乳酸)。

鉴于葡糖淀粉酶在从淀粉产生葡萄糖中发挥的核心作用，在本领域中提供用于这一转化的具有改进特性的葡糖淀粉酶(GA)的新共混物将是有利的。GA共混物的改进特性的实例包括但不限于：生产糖、糖浆、和生物化学品(包括但不限于乙醇)。

发明内容

提供了用于糖化淀粉底物的方法，所述方法包括使该淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，该葡糖淀粉酶包括轮枝镰孢菌葡糖淀粉酶(Fv-GA)的氨基酸序列或由其组成，并且进一步使该淀粉底物与至少一种另外的葡糖淀粉酶接触。提供了使用Fv-GA和至少一种另外的葡糖淀粉酶的组合来糖化和发酵淀粉底物，以产生终产物、生物化学终产物和发酵饮料的另外的方法。

本发明的实施例包括：

1.一种用于糖化淀粉底物的方法，该方法包括使该淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，该葡糖淀粉酶由Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列组成，该葡糖淀粉酶与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列具有至少85％同一性，与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的催化结构域具有至少85％同一性，与接头和Fv-GA(SEQ ID NO:1)的催化结构域具有至少85％同一性，或与具有葡糖淀粉酶活性的Fv-GA(SEQ ID NO:1)的活性片段具有至少85％同一性，并且使该淀粉底物与至少一种另外的葡糖淀粉酶接触。

在方法1的一些实施例中，第一个列出的葡糖淀粉酶与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列具有90％、95％、98％、或99％同一性。

2.如1中所述的方法，其中该另外的葡糖淀粉酶包括Afu-GA(SEQ ID NO:3)或An-GA(SEQ ID NO:7)。

3.如1或2所述的方法，其中该另外的葡糖淀粉酶是Afu-GA(SEQ ID NO:3)或是与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的葡糖淀粉酶。

4.如1或2所述的方法，其中该另外的葡糖淀粉酶是An-GA(SEQ ID NO:7)或是与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的葡糖淀粉酶。

5.如1-4中任一项所述的方法，其中糖化该淀粉底物导致高葡萄糖浆。

6.如1-5中任一项所述的方法，其中该高葡萄糖浆包含一定量的葡萄糖，其选自以下列表，该列表由以下各项组成：至少95.5％葡萄糖、至少95.6％葡萄糖、至少95.7％葡萄糖、至少95.8％葡萄糖、至少95.9％葡萄糖、至少96％葡萄糖、至少96.1％葡萄糖、至少96.2％葡萄糖、至少96.3％葡萄糖、至少96.4％葡萄糖、至少96.5％葡萄糖、以及至少97％葡萄糖。

7.如1-6中任一项所述的方法，该方法进一步包括将该高葡萄糖浆发酵为终产物。

8.如7所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

9.如7或8所述的方法，其中该终产物是醇。

10.如9所述的方法，其中该终产物是乙醇。

11.如1-10中任一项所述的方法，其中该淀粉底物是约5％至99％、15％至50％、或40％-99％干固体(DS)。

12.如1-11中任一项所述的方法，其中每种葡糖淀粉酶的剂量是在约0.01至约10葡糖淀粉酶单位(GAU)/克干固体淀粉(dss)的范围内。

13.如1-12中任一项所述的方法，其中该淀粉底物选自以下各项：小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高粱、麸、木薯、蜀黍、粟、马铃薯、甘薯、树薯、及其任意组合。

14.如1-13中任一项所述的方法，其中该淀粉底物包括液化淀粉、凝胶化淀粉、或颗粒状淀粉。

15.如1-14中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该淀粉底物中添加己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、水解酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、或其组合。

16.如15中所述的方法，其中进一步添加支链淀粉酶。

17.一种用于糖化和发酵淀粉底物以产生终产物的方法，该方法包括将该淀粉底物与以下项接触：与Fv-GA(SEQ ID NO:1)具有至少85％同一性的葡糖淀粉酶，以及与Tr-GA变体CS4(SEQ ID NO:9)具有至少85％同一性的葡糖淀粉酶。

在方法17的一些实施例中，第一个列出的葡糖淀粉酶与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列具有90％、95％、98％、或99％同一性。在方法17的一些实施例中，第二个列出的葡糖淀粉酶与Tr-GA变体CS4(SEQ ID NO:9)的序列具有90％、95％、98％、或99％同一性。

18.如17所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

19.如17或18所述的方法，其中该终产物是醇。

20.如17-19中任一项所述的方法，其中该终产物是乙醇。

21.如20所述的方法，其中经糖化和发酵的淀粉底物导致降低的DP4+水平和增加的乙醇终浓度。

22.如21中所述的方法，其中该降低的DP4+水平低于在相同的糖化和发酵条件下分别使用相同总葡糖淀粉酶剂量的Fv-GA或Tr-GA变体CS4会达到的水平。

23.如21中所述的方法，其中该增加的乙醇终浓度高于在相同糖化和发酵条件下分别使用相同总葡糖淀粉酶剂量的Fv-GA或Tr-GA变体CS4会达到的浓度。

24.一种用于糖化和发酵淀粉底物以产生生物化学终产物的方法，该方法包括在适合用于生物化学发酵的条件下，使该淀粉底物与具有与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的至少85％同一性的葡糖淀粉酶接触，并且与具有与Hg-GA(SEQ ID NO:5)的至少85％同一性的葡糖淀粉酶接触。

在方法24的一些实施例中，第一个列出的葡糖淀粉酶与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列具有90％、95％、98％、或99％同一性。在方法24的一些实施例中，第二个列出的葡糖淀粉酶与Hg-GA(SEQ ID NO:5)的序列具有90％、95％、98％、或99％同一性。

25.如权利要求24所述的方法，其中该终产物是选自下组的生物化学品，该组由以下各项组成：氨基酸、有机酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一钠、葡糖酸、葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙、葡萄糖酸钾、葡萄糖酸-δ-内酯、异抗坏血酸钠、ω-3脂肪酸、丁醇、赖氨酸、衣康酸、1,3-丙二醇、生物柴油、以及异戊二烯。

26.一种生产发酵饮料的方法，其中该方法包括以下步骤：使醪液和/或麦芽汁与葡糖淀粉酶接触，该葡糖淀粉酶与Fv-GA(SEQ ID NO:1)具有至少85％同一性，并且使该淀粉底物与至少一种另外的葡糖淀粉酶接触。

在方法26的一些实施例中，第一个列出的葡糖淀粉酶与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列具有90％、95％、98％、或99％同一性。

附图说明

图1示出了针对Afu-GA(80μg/g ds)、Fv-GA(80μg/g ds)、和Afu-GA+Fv-GA(40μg/gds+40μg/g ds)共混物，在48hr的结尾处的％葡萄糖。

图2是基于表6中数据的图，示出了糖化48hr后，Afu-GA和Fv-GA的葡糖淀粉酶比率对最终％葡萄糖的影响。

图3示出了在两种不同的pH条件下，孵育48hr时的％葡萄糖。

图4基于表7中的数据，示出了针对OPTIMAX^TM4060VHP以及与葡糖淀粉酶Afu-GA或Fv-GA另外共混，在72hr处的％葡萄糖。

图5示出了针对CS4+Fv-GA共混物、单独的CS4GA、和单独的Fv-GA，在54hr处的％w/v DP4+。

图6示出了针对CS4+Fv-GA共混物、CS4GA、和Fv-GA，在54hr处的％w/v乙醇。

发明详述

现将仅通过参考的方式使用以下定义和实例，详细地描述本发明。在此引用的所有专利和出版物，包括在此类专利和出版物中披露的所有序列,都通过引用清楚地结合在此。

除非在此另外定义，否则在此所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton,等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology,3rd Ed.[微生物学和分子生物学词典，第3版]，John Wiley andSons,Ltd.[约翰威利父子公司]，纽约(2007)，以及Hale&Marham,The Harper CollinsDictionary of Biology[哈珀柯林斯生物学词典]，Harper Perennial[哈珀永久出版社]，纽约(1991)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的通用词典。虽然相似或等效于在此描述的那些方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但描述优选的方法和材料。数值范围包括限定范围的数值在内。除非另有说明，核酸以5'至3'取向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基取向从左向右书写。有关本领域的定义和术语，从业人员特别地参照Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(FourthEdition)[分子克隆：实验指南(第四版)]，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012[冷泉港实验室出版社2012]，以及Ausubel FM等人，1993。应当理解的是，本发明不限于本文所述的具体方法、方案、和试剂，因为这些可以变化。

本文提供的标题并不是对本发明的不同方面或实施例的限制，可以通过作为一个整体参考本说明书来获得这些方面与实施例。因此，通过作为一个整体参考本说明书更完整地定义下文直接定义的术语。

为了描述和披露可能用于与本发明有关的组合物和方法的目的，本文引用的所有出版物清楚地通过引用结合在此。

I.定义

术语“氨基酸序列”与术语“多肽”“蛋白质”和“肽”同义，并且可互换地使用。当此类氨基酸序列显示出活性时，它们可以被称为“酶”。使用针对氨基酸残基的常规单字母或三字母密码，采用标准氨基-至-羧基端取向(即N→C)表示的氨基酸序列。

术语“核酸”涵盖能够编码多肽的DNA、RNA、异源双链体、以及合成分子。核酸可以是单链的或双链的，并且可以具有化学修饰。术语“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用。由于遗传密码是简并的，可以使用多于一个密码子来编码具体的氨基酸，并且本发明的组合物和方法涵盖编码具体氨基酸序列的核苷酸序列。由此，本发明考虑了编码GA或其氨基酸变体的每种可能的变体核苷酸序列，鉴于该遗传密码的简并，所有可能的变体核苷酸序列都是可能的。除非另有说明，核酸序列以5′-至-3′取向呈现。

在本文中被称为“非天然存在的”的核酸和氨基酸序列是指没有在自然界中发现的那些，即是人类操纵和/或合成的产物。

如本文所用的“葡糖淀粉酶”或“GA”或“GA酶”或“GA多肽”被定义为淀粉葡糖苷酶类的酶(EC 3.2.1.3、葡糖淀粉酶、α-1,4-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是催化从淀粉和相关的寡糖和多糖的非还原性末端释放D-葡萄糖的外切作用酶。这些酶还能够水解α-1,6和α-1,3键，尽管α-1,6和α-1,3键通常以比α-1,4键的水解远远更慢的速率水解。

如本文所用的酶、蛋白质、多肽、核酸、或多核苷酸的“变体”是指该变体衍生自亲本多肽或亲本核酸(例如，天然的、野生型的、或其他定义的亲本多肽或核酸)，与其亲本相比，该变体包括至少一个修饰或改变。因此，与亲本相比，变体可以具有几个突变，其中“几个”是指从1至10个突变。例如，与SEQ ID NO:1相比，具有从1至10个氨基酸取代的变体可以被称为具有几个取代的Fv-GA变体。改变/修饰可以包括针对在一个或多个位点处的不同的氨基酸/核酸残基，在亲本中的氨基酸/核酸残基的取代，在一个或多个位点处的在亲本中的一个氨基酸/核酸残基(或一系列的氨基酸/核酸残基)的缺失，在一个或多个位点处的在亲本中的一个氨基酸/核酸残基(或一系列的氨基酸/核酸残基)的插入，氨基-和/或羧基-端氨基酸序列或5’和或3’核酸序列的的截短，及其任意组合。根据本发明的一些方面所述的变体Fv-GA酶保持淀粉水解活性，但可以在一些特定方面具有改变的特性，例如，改进的特性。例如，对于一种或多种底物(例如，DP1(例如，葡萄糖)、DP3(例如，麦芽三糖，潘糖)、DP4(例如，麦芽四糖)、和/或支链淀粉)或其组合，变体Fv-GA酶可以具有改变的最适pH、改进的热稳定性、改进的水解。在某些实施例中，变体Fv-GA酶包含与SEQ ID NO:1具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，或其酶促活性片段。同样地，设想变体An-GA、变体Afu-GA、变体Hg-GA、Tr-GA变体CS4的变体、以及Tr-GA的变体与它们各自的SEQ ID NO具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性，或是其酶促活性片段。

“组合的变体”是包括两个或更多个突变，例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个取代、缺失、和/或插入的变体。

如本文所用的，“亲本”或“亲本的”多核苷酸、多肽、或酶序列(例如，“亲本Fv-GA酶”)，或其等价物，是指用作用于设计变体多核苷酸、多肽、或酶的起始点或模板的多核苷酸、多肽、或酶序列。进一步注意到，词语“亲本”和“亲本的”是在上下文中可互换地使用。如本文所用的“亲本Fv-GA酶”是指处于其成熟形式的多肽，该多肽包括与SEQ ID NO:4具有至少60％同一性的氨基酸序列，包括具有淀粉水解活性的与SEQ ID NO:1(提供来自轮枝镰孢菌的成熟形式的野生型GA的氨基酸序列)具有至少60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％同一性的氨基酸序列，或其等位基因变体或片段。

术语“野生型”是指天然存在的多肽或核酸序列，即不包括人造变异的多肽或核酸序列。

术语“异源性”当关于核酸的部分使用时表明该核酸包含在自然界中未正常发现彼此间的相同关系的两个或更多个子序列。例如，该核酸典型地是重组产生的，具有两个或更多个序列，这些序列例如来自不相关基因，排列成产生一种新的功能性核酸，例如来自一个来源的启动子和来自另一个来源的编码区。相似地，异源多肽将通常是指在自然界中未发现彼此间的相同关系的两个或多个子序列(例如融合多肽)。

术语“重组”当关于例如一种细胞、或核酸、多肽或载体使用时表明该细胞、核酸、多肽或载体已经通过引入异源核酸或多肽或天然的核酸或多肽的改变进行修饰，或者表明该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，例如，这些重组细胞表达在细胞的天然形式(非重组体)内未发现的基因，或表达以其他方式异常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。“重组”组合物需要由人来操纵，并且因此排除了自然的产物。

如本文所使用的，术语“分离的”或“纯化的”是指从天然产生的环境中去除的核酸或多核苷酸。通常，在分离或纯化的核酸或多肽样品中，与其天然产生的环境相比，感兴趣的一种或多种核酸或多肽以增加的绝对浓度或相对浓度存在。在一些情况下，分离或纯化的核酸或多核苷酸是合成产生的。

当描述组合物中的组分或材料(例如，多肽或多核苷酸)时，术语“富集”是指与从此生成富集组合物的起始组合物相比，该组合物中的组分或材料以相对增加的浓度存在。例如，与来自宿主生物体的初始发酵产物相比，富集的GA组合物(或样品)是其中GA的相对浓度或绝对浓度增加的GA组合物(或样品)。

如本文所使用的，术语“启动子”是指起着引导下游基因转录功能的核酸序列。通常启动子将适合于正在表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)一起有必要用于表达给定的基因。通常，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。“组成型”启动子是一种在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是指在环境调节或发育调节下具有活性的启动子。在本发明中有用的诱导型启动子的实例是里氏木霉(红褐肉座菌)cbh1启动子，在基因库(Genbank)中以登录号D86235保藏。在另一方面，该启动子是来自红褐肉座菌的cbh II或木聚糖酶启动子。适合的启动子的实例包括来自以下各项的启动子：泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg,J.H.等人(1984)Mol.Cell.Biol[分子和细胞生物学].4,2306-2315；Boel,E.等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3,1581-1585)；米黑毛霉羧基蛋白酶基因；红褐肉座菌葡糖淀粉酶I基因(Shoemaker,S.P.等人(1984)欧洲专利申请号EPO0137280A1)；构巢曲霉trpC基因(Yelton,M.等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]81,1470-1474；Mullaney,E.J.等人(1985)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]199,37-45)；构巢曲霉alcA基因(Lockington,R.A.等人(1986)Gene[基因]33,137-149)；构巢曲霉tpiA基因(McKnight,G.L.等人(1986)Cell[细胞]46,143-147)；构巢曲霉amdS基因(Hynes,M.J.等人(1983)Mol.Cell Biol.[分子和细胞生物学]3,1430-1439)；红褐肉座菌xln1基因；红褐肉座菌cbh2基因；红褐肉座菌eg1基因；红褐肉座菌eg2基因；红褐肉座菌eg3基因，以及高等真核生物的启动子，如SV40早期启动子(Barclay,S.L.和E.Meller(1983)Molecular and Cellular Biology[分子和细胞生物学]3,2117-2130)。

当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系时，该核酸与另一个核酸序列“可操作地连接”。例如，如果编码分泌前导序列(即信号肽)的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白质，那么编码分泌前导序列(即信号肽)的该DNA可操作地连接至多肽的DNA；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读相中。然而，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制位点处连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则按照常规实践使用这些合成的寡核苷酸衔接子或接头。术语“可操作地连接的”启动子是指核酸表达控制序列(如启动子、或大量转录因子结合位点)和第二核酸序列之间的功能性连接，其中表达控制序列指导与第二序列相应的核酸序列的转录。

术语“信号序列”、“信号肽”、“分泌序列”、“分泌肽”、“分泌信号序列”、“分泌信号肽”等表示一个肽序列(该肽序列作为更大多肽的组分，通过其中合成该更大多肽的细胞的分泌途径引导该更大多肽)，连同编码此类肽的核酸。通常，更大多肽(或蛋白质)通常被切割以在通过分泌途径转运期间去除分泌肽/信号肽，其中多肽的经切割形式(即，没有信号肽/分泌肽的形式)通常在本文中被称为多肽的“成熟形式”。例如，SEQ ID NO:2为来自轮枝镰孢菌(Fv-GA)的GA的氨基酸序列提供信号肽(即，全长Fv-GA)。

如本文所使用的，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中整合并表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核和真核表达载体是可商购的。适合的表达载体的选择是在本领域技术人员的知识范围内。

因此，“表达盒”或“表达载体”是重组或合成产生的具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件的核酸构建体。重组表达盒可以整合在质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。典型地，表达载体的重组表达盒部分包括，除了其他序列之外，待转录的核酸序列和启动子。

如本文所使用的，术语“质粒”是指当存在于许多细菌和一些真核生物中时，形成染色体外自复制遗传元件的环状双链(ds)DNA构建体。质粒可以用于许多不同目的中的任一种，例如作为克隆载体、繁殖载体、表达载体等。

如本文所使用的，术语“可选择标记”是指由此编码的核苷酸序列或多肽，其能够在细胞中表达，并且其中在细胞中选择性标记的表达赋予与不表达可选择标记的细胞中相区分的能力。在某些实施例中，可选择标记允许表达该可选择标记的细胞在相应的选择剂存在下或在相应的选择性生长条件下生长。在其他实施例中，可选择标记允许表达该可选择标记的细胞通过物理特征(例如通过在荧光、免疫反应性等中的差异)从不表达该可选择标记的细胞中鉴定和/或分离。

通常，编码Fv-GA或变体Fv-GA的核酸分子将在中等至高严格条件下与在此提供为SEQ ID NO:2(天然Fv-GA基因)的野生型序列杂交。然而，在一些情况下，采用拥有基本上不同的密码子使用的Fv-GA编码核苷酸序列，而由Fv-GA编码核苷酸序列编码的酶具有与天然酶相同或基本上相同的氨基酸序列。例如，根据由宿主利用的特定密码子的频率(通常称为“密码子优化”)，可以将该编码序列修饰，以便于促进在具体原核或真核表达系统中Fv-GA的更快表达。例如，Te'o,等人(2000)，描述了用于在丝状真菌中表达的基因的优化。有时，此类核酸序列被称为“简并的”或“简并序列”。

如果两个序列在中至高严格杂交和洗涤条件下彼此特异性杂交，则认为核酸序列可与参考核酸序列“选择性杂交”。杂交条件是基于核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)。例如，典型地“最大严格”在约Tm-5℃(探针的Tm以下5℃)下发生；“高严格”在Tm以下约5℃-10℃下发生；“中等”或“中等严格”在探针的Tm以下约10℃-20℃下发生；并且“低严格”在Tm以下约20℃-25℃发生。功能上，最大严格条件可用于鉴定与杂交探针具有严格同一性或接近严格同一性的序列；而高严格条件用于鉴定与该探针具有约80％或更多序列同一性的序列。

中等和高严格杂交条件在本领域中是熟知的(参见，例如Sambrook,等人，1989，第9和11章，以及在Ausubel,F.M.,等人，1993，清楚地通过引用结合在此)。高严格条件的实例包括以下杂交：在约42℃下，在50％甲酰胺、5X SSC、5X登哈特溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中进行，随后在室温下在2X SSC和0.5％SDS中洗涤两次，并在42℃下在另外的0.1X SSC和0.5％SDS下再洗涤两次。

如本文所使用的，关于细胞的术语“转化的”、“稳定转化的”、和“转基因的”是指细胞具有整合到其基因组中的或作为通过多代维持的附加体质粒的非天然(异源的)核酸序列。

如在此所用，术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。该过程通常包括转录和翻译二者。

在将核酸序列插入细胞的上下文中，术语“引入的”表示“转染”、“转化”或“转导”，并且包括关于将核酸序列并入真核或原核细胞中，其中可以将该核酸序列并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或进行瞬时表达(例如，转染的mRNA)。

术语“宿主细胞”是指包含载体并支持表达构建体的复制、和/或转录以及翻译(表达)的细胞。用于在本发明中使用的宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母的、植物的、昆虫的、两栖动物的、或哺乳动物的细胞)。在某些实施例中，宿主细胞是丝状真菌。

当第一多肽中的氨基酸位置(或残基)被认为与在第二个相关多肽中的氨基酸位置“等同”时，这意味着第一多肽的氨基酸位置对应于在第二相关多肽中通过(i)一级序列比对(参见以下序列比对和序列同一性的描述)；(ii)结构序列同源性；或(iii)相似的功能特性中的一个或多个指出的位置。因此，第一GA酶(或其变体)中的氨基酸位置可以被鉴定为与在第二种GA酶(或甚至多种不同的GA酶)中的氨基酸位置是“等同”(或“同源”)的。

一级序列比对：可以使用一级氨基酸序列比对方法来确定等同的氨基酸位置，其中的许多方法是在本领域中已知的。例如，通过比对两种或更多种不同GA酶的一级氨基酸序列，可能将来自一种GA酶的氨基酸位置编号指定为等同于另一种比对的GA酶的位置编号。以这种方式，可以使用源自一种GA酶(例如，在SEQ ID NO:1中表示的Fv-GA酶)的氨基酸序列的编号系统来鉴定在其他GA酶中等同的(或同源的)氨基酸残基。

结构序列同源性：除了使用一级序列比对方法确定“等同的”氨基酸位置之外，还可以通过在二级和/或三级结构水平下确定同源性来定义“等同的”氨基酸位置。例如，对于葡糖淀粉酶，已经通过x射线晶体学确定其三级结构，可以将等同的残基定义为以下那些：其中葡糖淀粉酶的具体氨基酸残基的两个或更多个主链原子的原子的坐标在与Fv-GA比对(N对N，CA对CA，C对C，O对O)后为0.13nm内，优选为0.1nm内。在最佳模型已经被定向和定位，以将所讨论的葡糖淀粉酶的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠给予Fv-GA之后，实现比对。最好的模型是给予最高可用分辨率的晶体学模型。在两个或更多个不同模型具有相等分辨率的情况下，在使用以下等式，模型具有针对实验衍射数据的最低R因子时，使用该模型。

相似的功能特性：在功能上相似于第二相关多肽(例如，第一葡糖淀粉酶和Fv-GA)的具体残基的第一多肽中的等同氨基酸残基被定义为在第一多肽中的那些氨基酸，其采用构象使得它们以定义的方式改变、修饰、或有助于多肽结构、底物结合、或催化，并且归因于第二相关多肽的特定残基。当已经通过x射线晶体学获得第一多肽的三级结构时，功能上相似于第二多肽的第一多肽的氨基酸残基占据相似的位置至一种程度，在该程度下尽管给定残基的主链原子基于占据的同源位置可能不能满足等同标准，但是残基的至少两个侧链原子的原子坐标位于该第二多肽的相应侧链原子的0.13nm处。

相对于变体酶(例如，GA变体)，术语“改进的特性”或“改进的性能”等在本文中被定义为与其各自的亲本酶相比，与变体酶相关的特征或活性是改进的。改进的特性包括但不限于，改进的热稳定性、或改变的温度依赖性活性谱、在所需pH或pH范围内的改进的活性或稳定性、改进的底物特异性、改进的产物特异性、以及在化学品或淀粉转化工艺步骤中的其他组分等的存在下的改进的稳定性。可以使用一种或多种具体的测定来确定改进的性能，这些测定包括但不限于：(a)表达、(b)对DP2底物的水解活性、(c)对DP7底物的水解活性、(d)对潘糖底物的水解活性、(e)对支链淀粉底物的水解活性、(f)对颗粒状玉米淀粉(CS)的水解活性、(g)热稳定性、(h)葡萄糖抑制、(i)逆转活性、以及(j)对支链淀粉底物的水解活性。

相对于变体蛋白(例如，GA变体)，术语“改进的热稳定性”在本文中被定义为在相对于亲本酶的升高的温度下孵育一段时间之后，显示保留更大部分酶活性的变体酶。这样一种变体相对于亲本可以显示或未能显示改变的热活性谱。例如，相对于亲本，在升高的温度下孵育后，变体可以具有改进的重折叠能力。

“改进的产物特异性”是指与亲本酶相比，显示改变的产物谱的变体酶，其中与亲本相比，在给定的应用中，该变体的改变的产物谱是改进的。“产物谱”在本文中被定义为由感兴趣的酶产生的反应产物的化学组成。

“改进的底物特异性”是指以与亲本酶不同的方式靶向水解的特定底物(或底物的类别)的变体酶，使得该变体在给定的应用中与亲本相比具有改进的性能。

“改进的化学稳定性”是指在相同条件下，在降低亲本酶酶活性的一种或多种化学品的存在下，在孵育一段时间后，变体酶显示酶活性的保留。与亲本酶相比，具有改进的化学稳定性的变体在此类化学品的存在下能够更好地催化反应。

关于酶的“pH范围”是指在其下酶显示催化活性的pH值的范围。

关于酶的术语“pH稳定”和“pH稳定性”涉及在一个宽范围内的pH值下，酶保持预定时间段(例如，15min.、30min.、1小时)的活性的能力。

如本文所使用的，“淀粉”是指由植物的复合多糖碳水化物组成的任何材料，该复合多糖碳水化物由具有化学式(C₆H₁₀O₅)_x(其中“X”可以是任何数目)的直链淀粉和支链淀粉组成。特别地，该术语是指任何基于植物的材料，包括但不限于谷物、草、块茎、和根，并且更具体地是小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高粱、麸、木薯、粟、马铃薯、甘薯、和树薯。“颗粒状淀粉”是指未经受糊化的未煮过的(生的)淀粉，其中“淀粉糊化”是指溶解淀粉分子以形成粘性悬浮液。

“聚合度(DP)”是指给定的糖中脱水吡喃葡萄糖单元的数目(n)。DP1的实例是单糖，例如葡萄糖和果糖。DP2的实例是二糖，例如麦芽糖和蔗糖。DP7表示具有七个脱水吡喃葡萄糖单元的聚合物。

如本文所使用的，“淀粉的水解”等是指通过添加水分子来裂解糖苷键。因此，具有“淀粉水解活性”的酶通过添加水分子来催化糖苷键的裂解。

如本文所使用的，“可发酵糖”是指能够在发酵条件下代谢的糖。典型地，这些糖是指葡萄糖、麦芽糖、和麦芽三糖(DP1、DP2、和DP3)。

如本文所使用的，“总含糖量”是指在淀粉组合物中存在的总含糖量。

“百分比序列同一性”或语法等价物意指使用比对算法，具体序列与在指定参考序列中的氨基酸残基具有至少一定百分比的氨基酸残基同一性。适合用于确定序列相似性的算法的实例是BLAST算法，其描述于Altschul,等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215:403-410(1990)中。用于进行BLAST分析的软件通过美国国家生物技术信息中心(theNational Center for Biotechnology Information)(<www(dot)ncbi(dot)nlm(dot)nih(dot)gov>)公开地可获得。这种算法涉及首先通过鉴定查询序列中具有长度W的短字而鉴定高得分序列对(HSP)，这些短字当与数据库序列中具有相同长度的字比对时匹配抑或满足一些正值阈值得分T。这些初始相邻字命中用作起始点以找到包含它们的更长HSP。按沿着进行比较的两个序列中每个序列的两个方向对字命中进行延伸，直到累积比对得分可以增加。当累计比对得分从其最大获得值以数量X降低时，当累计得分为零或低于零时，或当达到任一序列末端时，字命中的延伸就停止。BLAST算法参数W、T、以及X确定了该比对的灵敏度与速度。该BLAST程序使用字长(W)为11、BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff&Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89:10915(1989))比对(B)为50、期望值(E)为10、M’5、N’-4、以及两条链的比较作为默认值。

然后该BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin&Altschul,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90:5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个量度是最小总和概率(P(N))，它提供了由此将偶然发生在两个核苷酸序列或氨基酸序列之间的匹配的概率的一个指示。例如，如果在测试氨基酸序列与蛋白酶氨基酸序列的比较中的最小总和概率是小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为氨基酸序列与蛋白酶相似。

还可以采用比对算法来鉴定在第一氨基酸序列(例如，Fv-GA)中的氨基酸残基(或残基)，其对应于在第二氨基酸序列(例如，来自其他物种的同源的GA酶，例如，里氏木霉GA)中的氨基酸残基(或残基)。

当出现两个序列之间的百分比序列同一性或相应的氨基酸残基的问题时，使用具有默认参数的CLUSTAL W算法的比对将居于支配地位。参见Thompson等人(1994)NucleicAcids Res.[核酸研究]22:4673-4680。CLUSTAL W算法的默认参数为：

II.分子生物学

本发明的实施例提供了在感兴趣的宿主细胞(例如丝状真菌)中，在启动子功能性的控制下，来自葡糖淀粉酶-编码核酸的所希望的葡糖淀粉酶(或葡糖淀粉酶的组合)的表达。因此，本发明依赖于在重组遗传学领域的许多常规技术。披露了适合的重组遗传学方法的实例的基本文献在上文中注明。

本发明考虑了在本领域中已知的可以将突变引入亲本核酸/多肽的任何方法。

本发明涉及变体GA酶的表达、纯化、和/或分离以及用途。这些酶可以通过重组方法，利用一些在本领域中已知的葡糖淀粉酶基因中的任一者(例如，轮枝镰孢菌葡糖淀粉酶基因，包括SEQ ID NO:2)来制备。可以采用用于引入突变的任何方便的方法，包括定点诱变。如上所述，突变(或变异)包括将对应于在表达的GA变体中的一个或多个氨基酸变化的取代、添加、缺失、或截短。再次，定点诱变和在DNA水平上在表达的蛋白质中掺入氨基酸变化的其他方法可以在许多参考文献中找到，例如Green和Sambrook等人，2012和Ausubel，等人。

通过在本领域中已知的多种方法来制备编码亲本GA的氨基酸序列变体的DNA。这些方法包括但不限于，通过编码该亲本GA酶的更早制备的DNA的定点(或寡核苷酸介导的)诱变、PCR诱变、和盒式诱变的制备方法。

定点诱变是一种可以在制备取代变体中采用的方法。该技术是在本领域中熟知的(参见，例如，Carter等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]13:4431-4443(1985)，以及Kunkel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82:488(1987))。简言之，在进行DNA的定点诱变时，通过首先将编码所需突变的寡核苷酸与这种起始DNA的单链杂交来改变起始DNA。杂交后，使用DNA聚合酶合成整个第二链，使用杂交的寡核苷酸作为引物，并使用起始DNA的单链作为模板。因此，将编码所需突变的寡核苷酸掺入所得的双链DNA中。

PCR诱变还适用于制造亲本GA的氨基酸序列变体。参见Higuchi，在PCR Protocols[PCR方案]，177-183页(Academic Press[学术出版社]，1990)；以及Vallette等人，Nuc.Acids Res.[核酸研究]17:723-733(1989)。简言之，当在PCR中使用少量模板DNA作为起始材料时，可以使用与在模板DNA中相应区域在序列上略有不同的引物，以产生相对大量的特定DNA片段，该DNA片段仅在引物与模板不同的位置处不同于模板序列。

用于制备变体、盒式诱变的另一个方法是基于由Wells等人，Gene[基因]34:315-323(1985)描述的技术。该起始材料是包含将发生突变的起始多肽DNA的质粒(或其他载体)。在将发生突变的起始DNA中鉴定出一种或多种密码子。在一个或多个鉴定的突变位点的每一侧必须有独特的限制性内切核酸酶位点。如果不存在这样的限制位点，则可以使用上述寡核苷酸介导的诱变方法产生它们，从而将它们引入起始多肽DNA中的适当位置处。在这些位点处切割质粒DNA，以使其线性化。使用标准程序合成编码限制位点之间但包含所希望的一个或多个突变的DNA的序列的双链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的两条链单独合成，并且然后使用标准技术杂交在一起。该双链寡核苷酸被称为盒。该盒被设计为具有与线性化质粒的末端相容的5'和3'末端，使得其可以直接连接到质粒上。该质粒现在包含突变的DNA序列。

可替代地或另外地，可以确定编码所需葡糖淀粉酶的所需氨基酸序列，并且可以合成产生编码这种氨基酸序列变体的核酸序列。

如此制备的一种或多种所希望的葡糖淀粉酶可以进行进一步地修饰，这通常取决于葡糖淀粉酶的预期用途。这些修饰可以涉及氨基酸序列的进一步改变，与一种或多种异源多肽和/或共价修饰的融合。

III.GA和变体GA多肽以及编码它们的核酸

葡糖淀粉酶(GA)通过许多细菌、真菌、酵母、和植物的株系而产生。许多真菌的葡糖淀粉酶是从以下细胞中分泌的，例如来自曲霉属(Svensson等人，CarlsbergRes.Commun.[嘉士伯研究通讯]48:529-544(1983)；Boel等人，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3:1097-1102(1984)；Hayashida等人，Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学]53:923-929(1989)；美国专利号5,024,941；美国专利号4,794,175和WO 88/09795)；踝节菌属(美国专利号4,247,637；美国专利号6,255,084；以及美国专利号6,620,924)；根霉属(Ashikari等人，Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学]50:957-964(1986)；Ashikari等人，App.Microbio.Biotech.[应用微生物与生物技术]32:129-133(1989)和美国专利号4,863,864)；腐质霉属(WO 05/052148和美国专利号4,618,579)；以及毛霉菌属(Houghton-Larsen等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]62:210-217(2003))的菌株。编码这些酶的许多基因已被克隆，并在酵母、真菌、和/或细菌细胞中表达。

商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，并且已经用于需要水解淀粉的多种应用(例如，用于从淀粉产生葡萄糖和其他单糖)中。葡糖淀粉酶用于生产高果糖玉米甜味剂，该甜味剂占美国甜味剂市场的50％以上。通常，葡糖淀粉酶可以，并且通常是与淀粉水解过程中的α-淀粉酶一起使用，从而将淀粉水解成糊精，以及之后的葡萄糖。该葡萄糖可以被直接使用；通过其他酶(例如，葡萄糖异构酶)转化为果糖；结晶；或用于发酵以产生许多终产物(例如，乙醇、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸中间物、谷氨酸、甘油、1,3-丙二醇、以及乳酸)。

葡糖淀粉酶可以由多达三个不同的结构域组成，在所有葡糖淀粉酶中，结构保守的大约450个残基的催化结构域，通常之后是由连接到大约100个残基的淀粉结合结构域(SBD)(也称为碳水化合物结合结构域，或CBD)的30个至80个之间的残基组成的接头区。具有所有三个区域完整的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的结构确定为1.8埃分辨率。参见WO2009/048488和WO 2009/048487，通过引用结合在此。使用确定的坐标，将该结构与先前确定的来自泡盛曲霉菌株X100的葡糖淀粉酶的催化结构域的坐标进行比对(Aleshin,A.E.,Hoffman,C.,Firsov,L.M.,和Honzatko,R.B.Refined crystal structures ofglucoamylase from Aspergillus awamori var.X100.[来自泡盛曲霉变种X100的葡糖淀粉酶的提纯的晶体结构]J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]238:575-591(1994))。这两种葡糖淀粉酶的催化结构域的结构非常紧密地重叠，并且可能基于这种结构叠加来鉴定等同的残基。进一步认为所有的葡糖淀粉酶共享基本结构。

鉴于葡糖淀粉酶的熟知的结构和功能关系，具有改变特性的葡糖淀粉酶变体已被成功地制得和表征。与亲本葡糖淀粉酶相比，某些变体显示改进的特性。改进的特性的实例包括增加的热稳定性和增加的比活性。用于制造和表征具有改变特性的里氏木霉GA变体的方法已经在WO 2009/067218中进行了描述(通过引用结合在此)。

在本文中描述了GA酶蛋白(氨基酸)和核苷酸序列，包括：

轮枝镰孢菌GA(Fv-GA)蛋白质序列(SEQ ID NO:1)

轮枝镰孢菌GA(Fv-GA)DNA核苷酸序列(SEQ ID NO:2)

烟曲霉GA(Afu-GA)蛋白质序列(SEQ ID NO:3)

烟曲霉GA(Afu-GA)核苷酸序列(SEQ ID NO:4)

灰腐质霉GA(Hg-GA)蛋白质序列(SEQ ID NO:5)

灰腐质霉GA(Hg-GA)核苷酸序列(SEQ ID NO:6)

黑曲霉GA(An-GA)蛋白质序列(SEQ ID NO:7)

黑曲霉GA(An-GA)核苷酸序列(SEQ ID NO:8)

里氏木霉GA(Tr-GA)变体CS4成熟蛋白质序列(SEQ ID NO:9)

里氏木霉GA(Tr-GA)成熟蛋白质序列(SEQ ID NO:10)

里氏木霉GA(Tr-GA)亲本蛋白质序列(SEQ ID NO:11)

里氏木霉GA(Tr-GA)核苷酸序列(SEQ ID NO:12)

还在本文中描述了变体GA酶。如在本文中所述的，关于亲本GA酶，这些变体GA酶具有一个或多个突变，其中该亲本GA酶与SEQ ID NO:4具有至少60％(即，60％或更大)的氨基酸序列同一性，包括与SEQ ID NO:4具有至少61％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、高达并包括100％氨基酸序列同一性。变体GA酶(即，具有一个或多个突变)可以与SEQ ID NO:4具有至少60％(即，60％或更大)氨基酸序列同一性，包括与SEQ ID NO:4具有至少61％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。在某些实施例中，该亲本GA选自以下各项：木霉属菌株(例如，里氏木霉、长柄木霉、短孢钩状木霉、棘孢木霉、康长木霉、桔绿木霉、拟康氏木霉、以及哈茨木霉)；曲霉属菌株(例如棘孢曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、白曲霉、泡盛曲霉、棒曲霉、土曲霉、烟曲霉、以及米曲霉)；踝节菌属菌株(例如，埃默森踝节菌、嗜热踝节菌、和杜邦提踝节菌(T.duponti))；栓菌属菌株(例如，瓣环栓菌)；肉座菌属菌株(例如胶状肉座菌(H.gelatinosa)、东方肉座菌(H.orientalis)、维萨肉座菌(H.vinosa)、红褐肉座菌、施维尼兹肉座菌(H.Schweinitzii)、以及橙黄肉座菌(H.citrina))；镰孢菌属菌株(例如，尖孢镰孢菌，和粉红镰孢菌)；腐质霉属菌株(例如，灰腐质霉、特异腐质霉、和绵毛状腐质菌)；酵母菌属菌株(例如，扣囊复膜酵母)；嗜热色串孢；安德瑞柄孢壳菌(Podospora anderina)；或它们各自的无性型、有性型或全型对应形式。

在一些情况下，该亲本GA是轮枝镰孢菌GA(Fv-GA)。另外，该变体GA酶具有淀粉水解活性(或是具有淀粉水解活性的变体GA片段)，其中在某些实施例中，与该亲本GA(如在本文中详细描述的)相比，该变体GA具有改进的特性。

本发明的一些方面提供了亲本GA酶的变体，其中该变体具有淀粉水解活性，与SEQID NO:1具有至少60％(例如，至少80％)序列同一性，并且相比该亲本GA酶具有至少一种改进的特性，该特性选自：(a)表达、(b)对DP2底物的水解活性、(c)对DP7底物的水解活性、(d)对潘糖底物的水解活性、(e)对支链淀粉底物的水解活性、(f)对颗粒状玉米淀粉(CS)的水解活性、(g)热稳定性、(h)葡萄糖抑制、(i)逆转活性、以及(j)对支链淀粉底物的水解活性。

在某些实施例中，相比该亲本GA酶，GA变体具有至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少8个、至少9个、或更多个改进的特性(选自上述列表)。在某些实施例中，变体GA酶包括在Fv-GA(如在SEQ ID NO:1中表示)中的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸突变。由于根据本发明方面所述的某些亲本GA酶可能不具有与野生型Fv-GA相同的氨基酸，所以与上述残基相对应的氨基酸位置还可以由位置号单独指定。

可以通过使用“序列比较算法”来确定用来确定同源性的氨基酸序列的比对。可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如，通过Smith&Waterman的局部同源性算法，Adv.Appl.Math.[应用数学进展]2:482(1981)，通过Needleman&Wunsch的同源性比对算法，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443(1970)，通过Pearson&Lipman的相似性捜索方法,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]85:2444(1988)，通过这些算法的计算机执行(在Wisconsin Genetics Software Package[威斯康辛遗传软件包]中的GAP、BESTFIT、FAST、以及TFASTA，Genetics Computer Group[遗传学计算机组包]，575Science[科学]Dr.，麦迪逊，威斯康星州)，通过由Chemical Computing Group[化学计算组]，蒙特利尔，加拿大进行的目视检查或MOE。还参见在上述定义部分中提供的“百分比序列同一性”的描述。

IV.重组GA的表达

本发明的方面包括多种方法和组合物，这些方法和组合物涉及编码GA酶和GA酶变体的世代核酸，包含此类核酸的宿主细胞，通过此类宿主细胞的GA或GA变体的产生，以及这些GA变体的分离、纯化、和/或用途。

因此，本发明的实施例提供已经用包含所需GA或GA变体-编码核酸序列的表达载体转导、转化、或转染的宿主细胞。例如，丝状真菌细胞或酵母细胞用具有启动子或生物活性启动子片段或一个或多个(例如，一系列)在宿主细胞系中起作用的增强子的表达载体转染，这些启动子或启动子片段或增强子可操作地连接到编码所需GA或GA变体的DNA片段，使得所需GA或GA变体在细胞系中表达。

A.核酸构建体/表达载体。

可以将编码所需GA或GA变体的天然的或合成的多核苷酸片段掺入异源核酸构建体或载体中，这些异源核酸构建体或载体能够引入感兴趣的宿主细胞(例如，丝状真菌细胞或酵母细胞)中，并且在其中复制。在此披露的载体和方法对于在宿主细胞中用于表达所需GA或GA变体是适合的。可以使用任何载体，只要该载体满足在其引入的一种或多种宿主细胞中的所期望的复制/表达特征(此类特征通常由使用者定义)。本领域技术人员已知许多适合的载体和启动子，其中的一些是可商购的。还在Sambrook等人，1989，Ausubel FM等人，1989，和Strathern等人,1981中描述了克隆和表达载体，其中的每一个清楚地通过引用结合在此。对于真菌的适当的表达载体在van den Hondel,C.A.M.J.J.等人(1991)在：Bennett,J.W.And和Lasure,L.L.(编辑)More Gene Manipulations in Fungi[在真菌中更多的基因操纵]Academic Press[学术出版社]396-428中进行了描述。可以通过多种程序将适当的DNA序列插入质粒或载体(本文统称为“载体”)。通常，通过标准程序将该DNA序列插入适当的一个或多个限制性内切核酸酶位点。此类程序和相关的亚克隆程序被认为是在本领域技术人员的知识范围内的。

包含用于所需GA或GA变体的编码序列的重组宿主细胞可以通过将包含所需GA或GA变体编码序列的异源核酸构建体引入所需宿主细胞(例如，如下文进一步详细描述)中来产生。例如，可以根据熟知的重组技术将所希望的GA或GA变体编码序列插入适合的载体中，并用于转化能够GA表达的丝状真菌。如上所述，由于遗传密码的固有简并性，编码基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其他核酸序列可用于克隆和表达所希望的GA或GA变体。因此，应当理解，在编码区中的此类取代属于由本发明所涵盖的序列变体之内。

本发明还包括重组核酸构建体，其包含如上所述的一个或多个所希望的GA或GA变体编码核酸序列。这些构建体包括载体(例如质粒或病毒载体)，向该载体中以正向或反向插入本发明的序列。

异源核酸构建体可以包括用于所希望的GA或GA变体的编码序列：(i)处于分离形式；(ii)与另外的编码序列，例如融合多肽或信号肽编码序列组合，其中所希望的GA或GA变体编码序列是主要的编码序列；(iii)与非编码序列，例如内含子和控制元件，例如启动子和终止子元件或5'和/或3'非翻译区组合，有效地用于在适合的宿主中表达编码序列；和/或(iv)在载体或宿主环境中，其中所希望的GA或GA变体编码序列是异源基因。

在本发明的一个方面，采用异源核酸构建体将所希望的GA或GA变体编码核酸序列在体外转移到宿主细胞中，例如转移到已建立的丝状真菌系和酵母系中。可以通过产生具有GA或GA变体的稳定表达的宿主细胞，来实现所希望的GA或GA变体的长期产生。因此，在实践本发明时可以使用有效产生稳定转化体的任何方法。

适合的载体典型地配备有可选择标记-编码核酸序列、插入位点、以及适合的控制元件(例如，启动子和终止序列)。载体可以包括调节序列，包括例如非编码序列，例如内含子和控制元件，即启动子和终止子元件或5'和/或3'非翻译区，有效地用于在宿主细胞(和/或在载体或宿主细胞环境中，其中修饰的可溶性蛋白质抗原编码序列正常不被表达)中表达编码序列，它们可操作地连接至该编码序列。本领域技术人员已知许多适合的载体和启动子，其中的许多是可商购，和/或在Sambrook，等人，(同上)中描述。

适合的启动子的实例包括组成型启动子和诱导型启动子二者，两种启动子的实例包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、包含如描述的在tet-开或tet-关系统(ClonTech和BASF)中tet应答元件(TRE)的启动子、β肌动蛋白启动子、以及可通过添加某些金属盐上调的金属硫蛋白启动子。启动子序列是由用于表达目的的具体宿主细胞识别的DNA序列。该启动子序列可操作地连接到编码GA或变体GA多肽的DNA序列。这种连接包括将启动子相对于在表达载体中编码GA或变体GA多肽的DNA序列的起始密码子而定位，使得该启动子可以驱动GA或GA变体编码序列的转录/翻译。启动子序列包含介导GA或变体GA多肽的表达的转录和翻译控制序列。实例包括来自黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶、或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脉孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌cbh1、cbh2、egl1、egl2、或其他纤维素酶编码基因的启动子。

适当的可选择标记的选择将取决于宿主细胞，并且针对不同宿主的适当的标记是本领域熟知的。典型的可选择标记基因包括来自构巢曲霉或红褐肉座菌的argB、来自构巢曲霉的amdS、来自粗糙脉孢菌或红褐肉座菌的pyr4、来自黑曲霉或构巢曲霉的pyrG。适合的可选择标记的另外的实例包括但不限于，trpc、trp1、oliC31、niaD、或leu2，这些可选择标记包括在异源核酸构建体中，用于转化突变菌株，例如trp-、pyr-、leu-等。

此类可选择标记赋予转化体利用通常不被丝状真菌代谢的代谢物的能力。例如，来自红褐肉座菌的amdS基因，其编码酶乙酰胺酶，允许转化体细胞靠作为氮源的乙酰胺生长。可选择标记(例如pyrG)可恢复营养缺陷突变菌株在选择性基本培养基上生长的能力，或可选择标记(例如，olic31)可赋予转化体在抑制药物或抗生素的存在下生长的能力。

使用本领域通常使用的方法，将可选择标记编码序列克隆到任何适合的质粒中。适合的质粒的实例包括pUC18、pBR322、pRAX、和pUC100。pRAX质粒包含来自构巢曲霉的AMA1序列，该序列使得在黑曲霉中复制成为可能。

除非另有说明，本发明的实践将采用在本领域技术范围内的分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术在文献中进行了充分地解释。参见，例如，Sambrook等人，1989；Freshney，1987；Ausubel等人，1993；以及Coligan等人，1991。

B.用于GA酶生产的宿主细胞和培养条件

在编码GA或GA变体的DNA序列已经克隆到DNA构建体中后，将DNA用于转化微生物。出于表达根据本发明所述的GA或变体GA的目的，待转化的微生物可以选自多种宿主细胞。提供下面的部分作为宿主细胞/微生物的实例，并不意味着限制在实践本发明的方面时可以采用的宿主细胞的范围。

(i)丝状真菌

本发明的方面包括丝状真菌，将该丝状真菌相对于相应的未转化的亲本丝状真菌，以有效产生所希望的GA或GA变体产生或表达的方式被修饰、选择、和培养。

可以针对所希望的葡糖淀粉酶表达进行处理和/或修饰的亲本丝状真菌的物种的实例包括但不限于，木霉属、青霉属物种、腐质霉属物种(包括特异腐质霉)；曲霉属物种(包括黑曲霉)、金孢子菌属物种、毁丝霉属物种、镰孢菌属物种、肉座菌属物种、以及裸胞壳属物种。

将表达所希望的GA或GA变体的细胞在典型地用于培养亲本真菌系的条件下进行培养。通常，将细胞在包含生理盐和营养素的标准培养基中培养，例如描述于Pourquie,J.等人，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation[纤维素降解的生物化学和遗传学]，编辑，Aubert,J.P.等人，Academic Press[学术出版社]，71-86页，1988，以及Ilmen,M.等人，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:1298-1306,1997中。标准培养条件是在本领域中已知的，例如，将培养物在28℃下在振荡培养器或发酵罐中孵育，直到达到所希望的GA变体表达的所希望的水平。

针对给定丝状真菌的培养条件可以例如在科学文献中和/或从真菌来源(例如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC))中找到。在真菌生长已经建立之后，将细胞暴露于有效引起或允许所希望的GA或GA变体表达的条件下。

在其中所希望的GA或GA变体编码序列处于诱导型启动子控制下的情况下，将诱导剂(例如糖、金属盐、或抗生素)以有效诱导所希望的GA或GA变体表达的浓度添加到培养基中。

在一个实施例中，该菌株是黑曲霉菌株，其是用于获得过量表达蛋白质的有用菌株。例如已知黑曲霉变体泡盛曲霉dgr246分泌渐增量的分泌的纤维素酶(Goedegebuur等人，Curr.Genet[现代遗传学](2002)41:89-98)。黑曲霉变体泡盛曲霉的其他菌株(例如GCDAP3、GCDAP4、和GAP3-4)是已知的(Ward等人，1993,Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]39:738-743)。

在另一个实施例中，该菌株是里氏木霉菌株，它是用于获得过量表达蛋白质的有用菌株。例如，由Sheir-Neiss,等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物与生物技术]20:46-53(1984)描述，已知RL-P37分泌渐增量的纤维素酶酶。RL-P37的功能性等价物包括里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC号56765)和菌株QM9414(ATCC号26921)。预期这些菌株还将在过量表达GA或变体GA中是有用的。

在不存在潜在有害的天然葡糖淀粉酶活性下，希望获得GA或GA变体的情况下，在引入包含编码所希望的GA或GA变体的DNA片段的DNA构建体或质粒之前，获得具有一个或多个葡糖淀粉酶基因缺失的宿主细胞菌株是有用的。可以按任何方便的方式制备此类菌株，例如通过在美国专利号5,246,853和WO 92/06209中披露的方法，其披露内容通过引用结合在此。通过在缺失一个或多个葡糖淀粉酶基因(例如宿主细胞的内源性葡糖淀粉酶基因)的宿主微生物中表达所希望的GA或GA变体，如果需要，将鉴定和随后的纯化程序简化。

可以通过在本领域中已知的方法将待删除或破坏的所需基因的形式插入质粒来完成基因缺失。然后在所需基因编码区内部，在一个或多个适当的限制酶位点处切割缺失质粒，并且将基因编码序列或其一部分置换为可选择标记。来自待缺失或破坏的基因的基因座的侧翼DNA序列(例如约0.5kb至约2.0kb)可以保留在可选择标记基因的任一侧上。适当的缺失质粒将通常具有存在于其中的独特的限制性酶位点，以使包含缺失基因(包括侧翼DNA序列)和可选择标记基因的片段能够作为单个线性片段被去除。

在某些实施例中，编码所希望的GA或GA变体的DNA的多于一个拷贝可以存在于宿主菌株中，以促进GA或GA变体的过量表达。例如，宿主细胞可以具有整合到基因组中的所希望的GA或GA变体的多个拷贝，或者可替代地，包括能够在宿主生物中自主复制的质粒载体。

(ii)酵母

本发明还考虑酵母作为用于所希望的一种或多种GA生产的宿主细胞的用途。编码水解酶的若干其他基因已经在酵母酿酒酵母的不同菌株中进行了表达。这些包括编码来自里氏木霉的两种内切葡聚糖酶(Penttila等人，1987)、两种纤维二糖水解酶(Penttila等人，1988)、和一种β-葡糖苷酶(Cummings和Fowler,1996)、一种来自出芽短梗霉菌的木聚糖酶(Li和Ljungdahl,1996)、一种来自小麦的α-淀粉酶(Rothstein等人，1987)、等的序列。

(iii)其他

进一步预期，在一些实施例中，可以采用除丝状真菌细胞或酵母细胞以外的宿主细胞中的表达系统，包括昆虫细胞或细菌细胞表达系统。某些细菌宿主细胞可以例如是也是产乙醇生物体(例如工程化的运动发酵单胞菌)的细菌宿主细胞，它不仅能够表达感兴趣的一种或多种酶/变体，而且还能够代谢某些单体和其他可发酵糖，将它们转化为乙醇。宿主细胞的选择可以由在本文所描述的GA或GA变体的使用者的希望来确定，并且因此在这方面预期没有限制。

C.将所希望的GA-编码核酸序列引入的宿主细胞中。

本发明进一步提供已被遗传修饰从而包含外源提供的所希望的GA或GA变体编码核酸序列的细胞和细胞组合物。亲本细胞或细胞系可以用克隆载体或表达载体进行遗传修饰(例如转导、转化、或转染)。如上进一步的描述，该载体可以是例如处于质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式。

本发明的转化的方法可以导致转化载体的全部或一部分稳定整合到宿主细胞的基因组中。然而，还考虑了导致维持自主复制的染色体外转化载体的转化。

可以使用用于将外源核苷酸序列引入宿主细胞的任何熟知的程序。这些包括使用磷酸钙转染、聚凝胺、原生质体融合、电穿孔、基因枪法、脂质体、显微注射、原生质载体、病毒载体，以及用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA、或其他外源遗传材料引入宿主细胞的任何其他熟知方法(参见例如Sambrook等人，同上)。实质上，所使用的具体基因工程程序应该能够成功地将多核苷酸(例如，表达载体)引入到能够表达所希望的GA或GA变体的宿主细胞中。

可以使用许多标准转染方法以产生表达大量异源多肽的里氏木霉细胞系。一些用于将DNA构建体引入木霉属的菌株的公开的方法包括：Lorito,Hayes,DiPietro和Harman,1993,Curr.Genet.[现代遗传学]24:349-356；Goldman,VanMontagu和Herrera-Estrella,1990,Curr.Genet.[现代遗传学]17:169-174；Penttila,Nevalainen,Ratto,Salminen和Knowles,1987,Gene[基因]6:155-164；对于曲霉属：Yelton,Hamer和Timberlake,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474；对于镰孢菌属：Bajar,Podila和Kolattukudy,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]88:8202-8212；对于链霉菌属：Hopwood等人，1985,The John Innes Foundation[约翰英纳斯基金会]，诺维奇，英国，以及对于芽孢杆菌属：Brigidi,DeRossi,Bertarini,Riccardi和Matteuzzi,1990,FEMS Microbiol.Lett.[FEMS微生物学快报]55:135-138。对于曲霉属物种适合的转化过程的实例可以在Campbell等人，Improved transformation efficiencyof A.niger using homologous niaD gene for nitrate reductase[使用针对硝酸还原酶的同源niaD基因的黑曲霉的改进转化效率].Curr.Genet[现代遗传学].16:53-56；1989中发现。

此外，包含所希望的葡糖淀粉酶编码核酸序列的异源核酸构建体可以在体外转录，并且将所得的RNA通过熟知的方法(例如通过注射)引入到宿主细胞中。

D.针对GA核酸编码序列和/或蛋白质表达的分析。

为了通过已经用所希望的GA变体编码核酸构建体转化的细胞系评估所希望的GA变体的表达，测定可以在蛋白质水平、RNA水平上进行，或通过使用具体用于葡糖淀粉酶活性和/或生产的功能性生物测定。

通常，用于分析所希望的GA变体表达的测定包括但不限于，RNA印迹法、斑点印迹(DNA或RNA分析)、RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)、或原位杂交(使用适当标记的探针(基于核酸编码序列))和常规的DNA印迹法以及放射自显影。

此外，可以直接在样品中测量所希望的GA变体的产生和/或表达，例如通过针对葡糖淀粉酶活性、表达、和/或产生的测定。这样的测定在例如在Becker等人，Biochem J.[生物化学杂志](2001)356:19-30，以及Mitsuishi等人，FEBS[欧洲生物化学学会联盟通讯](1990)275:135-138中进行了描述，其各自清楚地通过引用结合在此。GA水解分离的可溶性和不溶性底物的能力可以使用在Srisodsuk等人，J.Biotech.[生物技术杂志](1997)57:49-57，以及Nidetzky和Claeyssens,Biotech.Bioeng.[生物技术与生物工程](1994)44:961-966中描述的测定来测量。用于测定葡糖淀粉酶的有用的底物包括可溶性淀粉、支链淀粉、DP7、对硝基苯基葡萄糖苷。此外，可以通过免疫学方法，如ELISA、竞争性免疫测定、放射性免疫测定、蛋白质印迹、间接免疫荧光测定等来评价蛋白质表达。这些测定中的某些可以使用设计用于检测GA酶的可商购试剂和/或试剂盒进行。此类免疫测定可以用于定性和/或定量评价所希望的GA或GA变体的表达。这些方法的细节对于本领域技术人员是已知的，并且用于实践此类方法的许多试剂是可商购的。在某些实施例中，可以采用对于所希望的GA或变体GA酶而不是其亲本GA具有特异性的免疫试剂，例如，对GA或GA变体的GA取代或融合配偶体(例如，N或C端标签序列，如六-组氨酸标签或FLAG标签)具有特异性的抗体。因此，本发明的方面包括使用所希望的GA或GA变体的纯化形式来产生用于在不同免疫测定中使用的对表达的多肽具有特异性的单克隆抗体抑或多克隆抗体。(参见，例如，Hu等人，1991)。

V.用于GA或GA变体多肽的富集、分离、和/或纯化的方法

通常，在宿主细胞培养物中产生的所希望的GA或GA变体多肽被分泌到培养基(产生包含GA或GA变体的培养上清液)中，并且可以被富集、纯化、或分离，例如通过从细胞培养基中去除不需要的组分。然而，在一些情况下，可以按需要从细胞裂解物/匀浆中回收的细胞形式(例如，细胞质、周质、或与细胞相关的其他形式)产生所希望的GA或GA变体多肽。从细胞或细胞上清液中收获所希望的GA或GA变体多肽，在细胞或细胞上清液中，所希望的GA或GA变体多肽是使用由本领域技术人员常规采用的技术而产生的。实例包括但不限于，过滤(例如，超过滤或微过滤)、离心、密度梯度分馏法(例如，密度梯度超速离心)、亲和色谱法(Tilbeurgh等人，1984)、离子交换色谱法(Goyal等人，1991；Fliess等人，1983；Bhikhabhai等人，1984；Ellouz等人，1987)(包括离子交换)，使用具有高分辨力的材料(Medve等人，1998)、疏水相互作用层析(Tomaz和Queiroz,1999)、以及两相分配(Brumbauer,等人，1999)。

虽然经富集、分离或纯化的GA或GA变体多肽有时是所希望的，但在一些实施例中，表达GA或GA变体多肽的宿主细胞直接用于需要葡糖淀粉酶活性的工艺中。因此，该所希望的GA或GA变体多肽的富集、分离或纯化并不总是为获得GA或GA变体多肽组合物所需的，发现该组合物在需要葡糖淀粉酶活性的或将从葡糖淀粉酶活性受益的所希望的测定或工艺中的用途。在一个这样的实例中，可以将表达GA或GA变体的酵母细胞直接添加到发酵工艺中，使得该酵母细胞直接将GA或变体GA表达到发酵液中，其中其葡糖淀粉酶活性将不可发酵的底物转化为用于酵母细胞的可发酵糖，从而直接转化成所希望的产物(例如转化为乙醇)(参见，例如，Ilmén等人，High level secretion of cellobiohydrolases bySaccharomyces cerevisiae[纤维二糖水解酶由酿酒酵母高水平分泌]Biotechnology forBiofuels[生物燃料的生物技术]2011,4:30)。

VI.组合物

包括如本文所披露的一种或多种GA或变体GA的组合物是预期的。在本文中描述的这些GA和变体GA可用于酶组合物，这些酶组合物包括但不限于，淀粉水解和糖化组合物，清洁剂和洗涤剂组合物(例如衣物洗涤剂、餐具洗涤剂、和硬表面清洁组合物)，醇，和/或生物化学发酵组合物，以及动物饲料组合物。此外，变体葡糖淀粉酶可在烘焙应用中使用，例如面包和蛋糕生产、酿造、保健、纺织、食品、环境废物转化工艺、生物纸浆加工、以及生物质转化应用。

在一些实施例中，包括由本披露内容(涵盖的一种或多种GA或变体GA(例如，在培养基中获得或从培养基中回收和纯化)的酶组合物将与以下酶中的任一种或其组合一起使用，这些酶是：α淀粉酶、蛋白酶、支链淀粉酶、异淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、环糊精糖基转移酶、脂肪酶、转移酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、氧化还原酶、酯酶、角质酶、颗粒状淀粉水解酶、以及其他葡糖淀粉酶。

在一些代表性的组合物中，如在本文中描述的一种或多种GA或变体GA将与α淀粉酶，例如真菌α淀粉酶(例如，来源于木霉属物种)或细菌α淀粉酶(例如，来源于芽孢杆菌属物种)，包括其变体、嵌合体、及杂交体组合。在某些实施例中，该α淀粉酶是酸稳定性α淀粉酶。在某些实施例中，该α淀粉酶是颗粒状淀粉水解酶(GSHE)。预期在如本文所描述的GA或变体GA组合物中使用的可商购α淀粉酶是可获得的(例如，来自美国丹尼斯克公司(DaniscoUS Inc.)或诺维信公司(Novozymes))。

在其他实施例中，如在本文所描述的一种或多种GA或变体GA可以与其他GA(变体抑或天然的)组合。在一些实施例中，本披露的这些GA将与以下各项组合：来源于曲霉属或其变体，例如米曲霉、黑曲霉、白曲霉、和泡盛曲霉的菌株的一种或多种GA；来源于腐质霉属或其变体的菌株的葡糖淀粉酶；来源于踝节菌属或其变体，特别是埃默森踝节菌，柄踝节菌的菌株的葡糖淀粉酶；来源于阿太氏菌属或其变体，特别是齐整阿太氏菌(A.rolfsii)的菌株的葡糖淀粉酶；来源于青霉菌属或其变体，特别是产黄青霉菌；草酸青霉菌；栓菌属、嗜热丝孢菌属、脉孢菌属、平革菌属、灵芝属、新萨托菌属、裂褶菌属、支顶孢属、密瑚菌屬、阿太氏菌属、短柄霉属、棉状菌属、金孢子菌属、Coniochaeta、Disporotrichum、镰孢菌属、赤霉属、褐褶菌属、白桩菇属、亚灰树花菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、侧孢霉属、脉孢菌属、黑层孔属、厚孢孔菌属、青霉菌属、梨囊鞭菌属、根毛霉属、根霉属、裂褶菌属、齿耳菌属、Subulispora、并头状菌属、踝节菌属、嗜热子嚢菌属、嗜热丝孢菌属、梭孢壳菌属、栓菌属、聚颈座腔菌属的菌株的葡糖淀粉酶；以及来源于木霉属或其变体，特别是里氏木霉的菌株的葡糖淀粉酶。

VII.GA和GA变体的实用性

如以上详细所述，GA是在多种需要将淀粉底物水解成可发酵糖(例如葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、等)的应用中使用的非常重要的商业酶。GA在用来生产高果糖玉米甜味剂的工艺中使用，该甜味剂占美国甜味剂市场的50％以上，连同在用于直接生产葡萄糖的工艺中使用。通常，葡糖淀粉酶可以，并且通常是与淀粉水解过程中的α-淀粉酶一起使用，从而将淀粉水解成糊精，以及之后的葡萄糖。该葡萄糖可以被直接使用；通过其他酶(例如，葡萄糖异构酶)转化为果糖；结晶；或用于发酵以产生许多终产物(例如，乙醇、柠檬酸、琥珀酸、抗坏血酸中间物、谷氨酸、甘油、1,3-丙二醇、以及乳酸)。

一种或多种GA或GA变体或其组合还可以有效地直接水解用于糖浆和/或生物化学品(例如醇、有机酸、氨基酸、其他生物化学品和生物材料)的淀粉，其中反应温度低于底物的糊化温度。

此外，一种或多种GA或GA变体或其组合可以在一步酶转化工艺，同时液化和糖化(SLS)中是有用的，从而在高于淀粉糊化温度的条件下，使用液化α-淀粉酶和糖化葡糖淀粉酶从凝胶化淀粉中产生高葡萄糖浆。在所披露的方法中，淀粉在同时液化和糖化期间同时经历糊化、液化、和糖化。相比之下，颗粒状淀粉在“无煮”或直接-淀粉-至-葡萄糖(DSTG)工艺中在孵育期间仍保持晶体结构。因此，与DSTG相比，由于淀粉在其工作温度下立即糊化，SLS显著地降低了淀粉溶解所需的时间。

考虑到GA的商业重要性，可以理解的是，所希望的GA或GA变体-编码核酸、所希望的GA或GA变体多肽、以及包含它们的组合物在多种应用中找到了实用性。在本文中所述的这些GA或GA变体的改进的一种或多种特性可按许多方式被开发利用。例如，在高温(例如，在亲本GA将表现很差的温度下)下，在热应激条件下具有改进性能的GA或GA变体可以用于在进行的工艺中增加淀粉水解活性，从而允许使用者减少采用的GA的总量(与使用的亲本GA相比)。可以开发利用GA或GA变体多肽的其他改进的特性，包括具有改变的pH最佳值、在特定pH下增加的稳定性或活性、针对底物增加的比活性、和/或在感兴趣的宿主细胞中的高水平表达的GA或GA变体。

包含如在本文中描述的所希望的GA或GA变体的淀粉水解组合物在乙醇生产中具有用途。来自这一工艺的乙醇可以进一步用作辛烷值增强剂，或直接用作代替汽油的燃料，这是有利的，因为作为燃料源的乙醇比石油衍生产物更环境友好。已知使用乙醇将改进空气质量，并可能降低局部臭氧水平和减少烟雾。此外，乙醇代替汽油的利用在缓解不可再生能源和石油化工供应突然变化的影响方面会具有战略重要性。

单独的糖化和发酵是将存在于原料(例如玉米)中的淀粉转化为葡萄糖，并随后产乙醇生物体(例如，酵母菌株)将葡萄糖转化成乙醇的工艺。同时糖化和发酵(SSF)是一种将原料中存在的淀粉转化为葡萄糖，并且同时且在同一反应器中，产乙醇生物体将葡萄糖转化成乙醇的工艺。因此，本发明的GA或GA变体在这两种工艺中都具有用途，用于降解含淀粉原料以产生乙醇。

在一些实施方案中，如在本文中描述的GA或GA变体在产乙醇生物体中表达，由此由产乙醇生物体表达的变体GA的酶活性产生葡萄糖，该葡萄糖可被产乙醇生物体转化为乙醇。

如在本文中描述的GA或GA变体在产生用于产生感兴趣的生物化学产物的宿主细胞中具有用途。因此，本披露的方面包括通过获得表达如在本文中描述的GA或GA变体的宿主细胞，并且在用来产生感兴趣的生物化学品的条件下培养这些宿主细胞来生产生物化学品的方法。设想此类条件可以包括，例如pH 3-8的pH条件，以及例如，25℃-95℃的温度条件。该宿主细胞可以包括另外的修饰，以促进所希望的生物化学品的产生，例如以表达同源或异源基因，另外的变体基因，和/或缺失或以其他方式灭活一种或多种内源基因的表达。感兴趣的生物化学品包括但不限于醇(乙醇、甲醇、丁醇等)和其他有机化合物，包括挥发性有机分子(例如异戊二烯)。

应注意，具有降低的热稳定性的GA或GA变体在以下中具有用途，例如在需要在更低温度下中和酶活性，使得可能存在的其他酶不受影响的区域中。

本发明的一个方面涉及根据本发明所述的GA或GA变体多肽在生产发酵饮料(如啤酒)中的用途。因此，本披露的方面包括提供/生产发酵饮料的方法，该方法包括将醪液和/或麦芽汁与如在本文中描述的GA或GA变体多肽接触的步骤。另一方面涉及一种提供发酵饮料的方法，该方法包括以下步骤：(a)制备醪液、(b)将该醪液过滤以获得麦芽汁，以及(c)将该麦芽汁发酵以获得发酵饮料(如啤酒)，其中将GA或GA变体多肽添加至：(i)步骤(a)中的醪液、和/或(ii)步骤(b)中的麦芽汁、和/或(iii)步骤(c)中的麦芽汁。

根据又另一个方面，通过一种方法生产和提供发酵饮料(如啤酒)，该方法包括以下步骤：(1)将醪液和/或麦芽汁与如在本文中描述的GA或GA变体多肽接触；和/或(2)(a)制备醪液，(b)将该醪液过滤以获得麦芽汁，以及(c)将该麦芽汁发酵以获得发酵饮料(如啤酒)，其中将GA或GA变体多肽添加至：(i)步骤(a)的醪液、和/或(ii)步骤(b)的麦芽汁、和/或(iii)步骤(c)的麦芽汁。

本发明的方面还包括使用如上所述的GA或GA变体产生的发酵饮料(如啤酒)。

术语“啤酒”意指包括通过发酵/酿造含淀粉植物材料而产生的任何发酵麦芽汁。通常，啤酒由麦芽或作为含淀粉植物材料的辅料、或麦芽与辅料的任何组合产生。

如本文所使用的，术语“麦芽”被理解为任何发芽的谷类谷粒，如发芽的大麦或小麦。

如本文所使用的，术语“辅料”是指不是麦芽,例如大麦的或小麦的麦芽的任何包含淀粉和/或糖的植物材料。作为辅料的示例，可以提及可用作淀粉来源的材料，例如普通玉米糁、精制玉米糁、制啤酒用研磨酵母、水稻、高粱、精制玉米淀粉、大麦、大麦淀粉、去壳大麦、小麦、小麦淀粉、烘培谷类、谷类片、裸麦、燕麦、玉米(玉蜀黍)、马铃薯、树薯、木薯和糖浆，例如玉米糖浆、甘蔗糖浆、转化糖浆、大麦和/或小麦糖浆等。

如本文所使用的，术语“醪液”是指任何包含淀粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括压碎的大麦麦芽、压碎的大麦)和/或其他辅料或其组合的含水浆液，随后与水混合以分离成麦芽汁和废糟。

如本文所使用的，术语“麦芽汁”是指在淀粉糖化期间，对谷粉进行提取后，未发酵的液体流出物(run-off)。

在另一方面，本发明涉及一种制备/生产发酵饮料(例如啤酒)的方法，该方法包括将本发明的多肽与与麦芽或辅料混合。

根据以上用途和方法(即，其中使用如在本文中描述的GA变体)生产的啤酒的实例包括但不限于以下各项：全麦芽啤酒、依照“纯净法(Reinheitsgebot)”酿造啤酒、爱尔啤酒、印度淡啤酒(IPA)、贮藏啤酒、苦啤酒、低麦芽啤酒(Happoshu)(第二啤酒)、第三啤酒、干啤酒、淡啤酒、低度啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性黑啤酒、麦芽酒、无醇啤酒、无醇麦芽酒等，而且包括替代的谷类和麦芽饮料，例如果味麦芽饮料，如柑橘味，如柠檬、橙、酸橙或浆果味麦芽饮料，酒味麦芽饮料，例如伏特加、朗姆酒或龙舌兰酒味麦芽酒，或咖啡味麦芽饮料，例如咖啡味麦芽酒等。

从上述可见，与其亲本GA酶相比，具有改进特性的GA或GA变体多肽(和编码它们的核酸)在以下中具有用途，用于改进采用纤维二糖水解酶的多种测定和工艺中的任一种。

实例

本发明在以下实例中进一步详细描述，其不意欲以任何方式限制本发明所要求保护的范围。附图旨在被认为是本发明的说明书和描述的组成部分。将在本文中引用的所有参考文献通过将对其中所述的全部内容的引用，特别结合在此。

实例1

I.在糖化期间，酶浓度对黑曲霉-GA(An-GA)和轮枝镰孢菌GA(Fv-GA)的比较的影响

在典型的糖化条件下，进行一系列实验来确定与单独的葡糖淀粉酶(An-GA，Fv-GA)的最终葡萄糖产量相比，葡糖淀粉酶的新颖共混物(An-GA+Fv-GA)是否产生更高的葡萄糖产量。使用33.5％ds玉米淀粉液化物，并且将使用稀酸将该液化物的pH调节至pH 4.4来进行实验。将淀粉液化物置于保持在60℃的水浴中并添加一种或多种酶。只有Fv-GA的所有处理具有0.32SSU的AkAA酸稳定性α淀粉酶，从而与在An-GA商品中存在的酸稳定性α淀粉酶相匹配。将淀粉液化物保持在60℃下持续48hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱。将葡糖淀粉酶剂量以GAU/g DS玉米淀粉和/或μg/g ds给出，并且在表1、2、和3中给出了在不同间隔处的糖谱。

表1示出了在不同剂量下，针对OPTIMAX^TML-400(针对来自杜邦营养生物科学公司(DuPont Industrial Bioscience)的葡糖淀粉酶An-GA的商品名)的糖谱。可以观察到，在不同剂量下，在48hr末尾，An-GA不能达到>95.5％葡萄糖。

表2示出了在不同剂量下，针对Fv-GA的糖谱。可以观察到，在不同剂量下，在48hr末尾，Fv-GA也不能达到>95.5％葡萄糖。

表3示出了在不同共混物比率下，针对An-GA(OPTIMAX^TML-400)+Fv-GA的共混物的糖谱，观察到大于95.5％的在最终的葡萄糖产量上的出人意料的增加。

表1.不同An-GA(OPTIMAX^TM L-400)剂量的糖分布

表2.不同Fv-GA(镰孢菌-GA)剂量的糖分布

表3.不同An-GA(OPTIMAX^TML-400)和Fv-GA(轮枝镰孢菌-GA)剂量共混比率的糖分布

在表1-3中示出的数据支持了一个出人意料的发现，即An-GA+Fv-GA的共混物表现更好，并产生>95.5％葡萄糖，然而单独使用An-GA和Fv-GA没有产生>95.5％葡萄糖。发现的酶共混物对于葡萄糖浆生产者是有益的，因为An-GA+Fv-GA的共混导致更高的葡萄糖产量。

实例2

I.在标准的糖化期间，不同的葡糖淀粉酶(来自里氏木霉(Tr-GA)、灰腐质霉(H-GA)、烟曲霉(Afu-GA)、和轮枝镰孢菌(Fv-GA)的纯化的葡糖淀粉酶)与An-GA对葡萄糖生产的影响

进行实验来确定当与An-GA共混时，不同的葡糖淀粉酶共混物对葡萄糖生产的影响。使用33.5％ds淀粉液化物，并将该液化物的pH调节至pH 4.4进行这些实验。将淀粉液化物置于保持在60℃的水浴中并添加一种或多种酶。将淀粉液化物保持在60℃下持续48hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱(在表4中示出)。

表4示出了对于使用以10μg/g ds剂量(纯化的葡糖淀粉酶蛋白)添加的不同的葡糖淀粉酶与An-GA(OPTIMAX^TML-400)的处理的糖谱。在所有测试的葡糖淀粉酶中，当与An-GA共混时，在48hr处，只有Fv-GA是有效的，导致产生了大于95.5％的更高葡萄糖。

表4.具有不同葡糖淀粉酶的An-GA(OPTIMAX^TM L-400)共混物的糖分布

实例3

I.在标准的糖化期间，不同的葡糖淀粉酶(来自里氏木霉(Tr-GA)、灰腐质霉(H-GA)、黑曲霉(An-GA)、和轮枝镰孢菌(Fv-GA)的纯化的葡糖淀粉酶)与烟曲霉-GA(Afu-GA)对葡萄糖生产的影响

如已经示出的，当与An-GA共混(在实例2中的讨论)时，进行一组实验来确定不同的葡糖淀粉酶是否示出与Afu-GA相似的效果。使用33.5％ds淀粉液化物，并将该液化物的pH调节至pH 4.4进行这些实验。将淀粉液化物置于保持在60℃的水浴中并添加一种或多种酶。只有纯化的酶蛋白用于这些实验，因此所有酶处理均具有0.32SSU的AkAA酸稳定性α淀粉酶，从而与商用An-GA产物相匹配。将淀粉液化物保持在60℃下持续48hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱(在表5中示出)。

表5示出了对于以10μg/g ds的剂量添加的Afu-GA的不同葡糖淀粉酶的糖谱。与在实例2中使用An-GA做出的观察相似，在所有测试的葡糖淀粉酶中，当与Afu-GA共混时，在48hr处，只有Fv-GA是有效的，将葡萄糖增加至大于95.5％。该观察结果示出，当与An-GA或Afu-GA共混时，Fv-GA增强了葡萄糖生产，然而当与An-GA和Afu-GA共混时，其他测试的葡糖淀粉酶没有显著的影响。

表5.具有不同的葡糖淀粉酶的Afu-GA(烟曲霉-GA)共混物的糖分布

实例4

I.Afu-GA和Fv-GA共混物对DP1(％葡萄糖)的影响

在典型的糖化条件下，用Afu-GA、Fv-GA、和Afu-GA+Fv-GA的共混物进行实验以确定对产生的％葡萄糖的影响。使用33.5％ds淀粉液化物，并将该液化物的pH调节至pH 4.4进行这些实验。将淀粉液化物置于保持在60℃的水浴中并添加一种或多种酶。所有的酶处理具有0.32SSU的AkAA酸稳定性α淀粉酶。将淀粉液化物保持在60℃下持续48hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱(在图1中示出)。

图1示出了针对Afu-GA(80μg/g ds)、Fv-GA(80μg/g ds)、和Afu-GA+Fv-GA(40μg/gds+40μg/g ds)共混物，在48hr的结尾处的％葡萄糖。图中的数据示出，与以相等的总葡糖淀粉酶蛋白剂量单独使用Afu-GA和Fv-GA时相比，在48hr处，Afu-GA+Fv-GA的共混物成功地实现最高％葡萄糖。

实例5

I.Afu-GA和Fv-GA的不同的共混比率的影响

在典型的糖化条件下，用不同的共混比率的Afu-GA和Fv-GA进行实验，以确定用于最大葡萄糖生产的葡糖淀粉酶(蛋白质)的最佳比率。使用33.5％ds淀粉液化物，并将该液化物的pH调节至pH 4.4进行这些实验。将淀粉液化物置于保持在60℃的水浴中并添加一种或多种酶。在该组实验中仅使用纯化的酶蛋白，因此所有的酶处理具有0.32SSU的AkAA酸稳定性α淀粉酶，从而与在An-GA商品中存在的酸稳定性α淀粉酶相匹配。将淀粉液化物保持在60℃下持续48hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱(在表6中示出)。

表6示出了对于具有不同蛋白质比率的Afu-GA和Fv-GA的新颖共混物的糖谱。当Afu-GA以80μg/g ds单独使用时，在48hr处没有达到95.5％葡萄糖。但当该Afu-GA与Fv-GA以不同比率(保持总蛋白常数处于80μg/g ds)共混时，所有的共混物在48hr处达到>95.5％葡萄糖。因此与Afu-GA本身相比，处于相等的总葡糖淀粉酶蛋白的Afu-GA+Fv-GA的共混物导致最高水平的葡萄糖生产。

表6.对于处于不同蛋白质比率的Afu-GA和Fv-GA共混物的糖分布

图2是基于表6中数据的图，示出了糖化48hr后，Afu-GA和Fv-GA的葡糖淀粉酶比率对最终％葡萄糖的影响。发现的是，优化葡萄糖产量的理想的共混物是中等水平的蛋白质比率，示出为40+40。虽然所有的共混物在48hr处达到>95.5％葡萄糖，但是出人意料地发现，对于Afu-GA和FV-GA，示出为40+40的中等水平的蛋白质比率在48hr处达到>96％葡萄糖。

实例6

I.在不同pH条件下，Afu-GA和Fv-GA的不同的共混比率的影响

用Afu-GA+Fv-GA的共混物进行一组实验，并且与商品OPTIMAX4060VHP的结果相比较。使用33.5％ds淀粉液化物，并将该液化物的pH调节至pH 4.4和/或5.5进行这些实验。将淀粉液化物置于保持在60℃的水浴中并添加一种或多种酶。用非商业纯化的酶进行的所有酶处理具有0.32SSU的AkAA酸稳定性α淀粉酶，从而与该商品匹配。将淀粉液化物保持在60℃下持续48hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱(在图3中示出)。

图3示出了在两种不同的pH条件下，孵育48hr时的％葡萄糖。该商品，OPTIMAX^TM4060VHP在pH 4.5下表现合理，并且产生>95.5％葡萄糖，但在pH 5.5下表现不佳，并且在48hr处仅达到90.93％葡萄糖。该OPTIMAX^TM 4060VHP包含黑曲霉葡糖淀粉酶、酸稳定性α淀粉酶、和支链淀粉酶，其有助于在pH 4.5下达到95.5％葡萄糖，但是在升高的pH值(例如>5.0)时受损，因为支链淀粉酶在更高pH值下失活。这种失活导致OPTIMAX 4060VHP产物在升高的pH下的性能下降。该Afu-GA+Fv-GA共混物在大范围的pH中(pH 4.5至5.5)保持性能，并始终达到>95.5％葡萄糖。

实例7

I.去分支酶、支链淀粉酶(PU)对Afu-GA和Fv-GA的一系列共混比率的影响。

用商品OPTIMAX^TM4060VHP进行一组实验，因为它已经包包含助其达到95.5％葡萄糖的支链淀粉酶去分支酶。除了标准0.16GAU/g ds剂量的OPTIMAX^TM4060VHP，将两种不同的葡糖淀粉酶(Afu-GA和Fv-GA)共混。将另外的葡糖淀粉酶Afu-GA和Fv-GA以10μg/g ds添加。

表7示出了OPTIMAX^TM4060VHP和处理的糖谱，在这些处理中除了标准的OPTIMAX^TM4060VHP剂量，添加另外的葡糖淀粉酶Afu-GA或Fv-GA。在72hr内，标准剂量的OPTIMAX^TM4060VHP达到95.52％葡萄糖。葡糖淀粉酶Afu-GA的添加在72hr的糖化时间中没有增加％葡萄糖，并且达到与OPTIMAX^TM4060VHP标准剂量相似的95.6％葡萄糖。

表7.OPTIMAX^TM4060VHP和另外共混的葡糖淀粉酶Afu-GA或Fv-GA的糖分布。

图4基于表7中的数据，示出了OPTIMAX^TM4060VHP以及与葡糖淀粉酶Afu-GA或Fv-GA另外共混，在72hr处的％葡萄糖。

当72hr后每个测试条件达到>95％葡萄糖时，OPTIMAX^TM4060VHP+Fv-GA的组合具有将％葡萄糖增加至96.35％的出人意料的改进的影响，该影响相比对于观察到的单独的OPTIMAX^TM4060VHP标准剂量或OPTIMAX^TM4060VHP+Afu-GA处理是显著更高的。

实例8

I.Fv-GA和另外的GA共混物对用于乙醇工艺的玉米中的同时糖化和发酵(SSF)的影响。

从商业燃料醇生产器中获得玉米液化物。该玉米液化物的规格是32.84％ds和pH3.5。用4N氢氧化钠将玉米液化物的pH调节至4.5。将实验SSF工艺分多个重复在250ml锥形瓶中同时进行，每个锥形瓶中使用100g的液化物。将适当量的酶与干燥酵母以及600ppm尿素一起添加到该液化物中。将干燥酵母添加至锥形瓶前，允许该干燥酵母水合约10分钟。这些测试的酶剂量是1)Tr-GA变体CS4(“CS4”)，按25μg g ds，以及Fv-GA，按25μg g ds；2)CS4GA，按50μg g ds，以及3)Fv-GA，按50μg g ds。将这些锥形瓶用橡皮塞覆盖，并在32℃下放置在加压气流培养箱中，以200rpm振荡持续54hr。按规则间隔抽取样品进行乙醇测量。

在表8中提供的乙醇数据示出，对于Fv-GA加CS4GA的共混物，乙醇比率更高，并且最终乙醇浓度在比较的处理中也是最高。与按相等的总蛋白质加载量的单独GA添加相比，以相等的总蛋白质添加的GA的共混物更好。这示出Fv-GA与其他GA的协同效应。

对于DP4+还原，观察到相似的效果，因为在相等的总蛋白添加下，与单独的GA添加相比，Fv-GA加CS4的共混物达到最低的DP4+。

更低的DP4+和更高的乙醇对于商业乙醇生产者来说是显著的，因为该优点解释了底物至所希望的终产物(例如乙醇)的更高转化。

表8对于CS4+Fv-GA共混物、CS4GA、和Fv-GA，％w/v乙醇和％w/v DP4+分布示出对于该GA共混物更低的％w/v DP4+和更高的％w/v乙醇。

图5示出了针对CS4+Fv-GA共混物、单独的CS4GA、和单独的Fv-GA，在54hr处的％w/v DP4+。很明显，更低的％w/v DP4+有利地源自GA共混物。如图5所示，与单独的CS4GA抑或Fv-GA相比，对于GA共混物产生了约0.3％w/v的更低DP4+。在相似条件下，单独的CS4GA将DP4+降低至1.03％w/v，而新颖的GA共混物将DP4+降低至0.74％w/v，这是DP4+的25.2％的降低。在相似的条件下，使用该共混物可以导致DP4+的1.03x的减少。

图6示出了对于CS4+Fv-GA共混物、CS4GA、和Fv-GA，在54hr处的％w/v乙醇，其中对于GA共混物产生了更高的％w/v乙醇。如所示，与单独的CS4GA抑或Fv-GA相比，对于GA共混物，％w/v乙醇是约0.2％更高。在相似条件下，单独的CS4GA达到了14.98％v/v的乙醇含量，而新颖的GA共混物达到了15.26％v/v的乙醇含量，该含量相比单独使用CS4GA时的乙醇产量总体增加了1.86％。在相似条件下，使用共混物可以导致乙醇生产的1.018x的增加。

实例9

I.在pH 7.0和在37℃下的生物化学发酵条件下，Fv-GA和另外的GA共混物对糖化的影响.

用Afu-GA、HGA、TrGA、Fv-GA、以及HGA+Fv-GA的共混物来进行实验，以确定单独使用GA酶和GA共混物对最终的％葡萄糖的影响。使用33.5％ds淀粉液化物，并将该液化物的pH调节至pH 7.0进行这些实验。将淀粉液化物置于保持在37℃的水浴中并添加一种或多种酶。将淀粉液化物保持在37℃下持续72hr，并在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱。

在表9中的数据示出，与其他GA(也以80μg/g ds添加)相比，按80μg/g ds添加的Fv-GA远远更快，并且达到最高的最终％葡萄糖。而且，与按160μg/g ds添加的HGA相比，以80μg/g ds添加的Fv-GA略微更好。

数据还示出，与按320μg/g ds添加的HGA相比，以40μg/g ds添加的Fv-GA和以160μg/g ds添加的HGA的共混物更好(表10)。这示出了Fv-GA和HGA之间的显著和出人意料的协同作用。与甚至以320μg/g ds添加的HGA相比，Fv-GA和HGA(总蛋白添加量为200μg/g ds，具有以40μg/g ds添加的Fv-GA和以160μg/g ds添加的HGA)的共混物达到更低量的DP4+和最高量的％DP1。

表9.在37℃和pH 7.0下的生物化学发酵条件下，在糖化期间，80μg/g ds蛋白质剂量的Afu-GA、Fv-GA、HGA、和TrGA的糖分布

表10.在37℃和pH 7.0下的生物化学发酵条件下，在糖化期间，与更高剂量的HGA相比，更高剂量的Fv-GA+HGA共混物和HGA的糖分布示出Fv-GA加HGA的共混物表现更好。

实例10

I.Fv-GA和另外的GA共混物对直接淀粉至葡萄糖(DSTG)工艺的影响

用Afu-GA、Fv-GA、和Afu-GA+Fv-GA的共混物进行实验来确定酶和酶共混物对最终的％溶解度和％葡萄糖的影响。使用32％ds生树薯淀粉进行实验，并且将树薯淀粉浆液的pH保持在pH 5.2。将这些酶如这样进行添加：1)以80μg/g ds添加Afu-GA 2)以40μg/g ds添加Afu-GA+以40μg/g ds添加Fv-GA，以及3)以80μg/g ds添加Fv-GA。所有的处理还包括10AAU的α-淀粉酶产物SPEZYME(杜邦公司(DuPont))。将该浆液在室温下混合，以共混这些添加的酶。对于每个处理，将35g等分试样以2个重复称重到LABOMAT钢制烧杯中。将金属烧杯安装回LABOMAT，用于在60℃下孵育72hr，并以60rpm顺时针和逆时针恒定混合。在整个孵育过程中抽取样品以分析糖谱。

表11中的数据示出，Fv-GA加Afu-GA的共混物在72hr内达到96.51％的溶解度，并且单独添加Afu-G或Fv-GA分别达到93.05％和94.89％的溶解度。而且，对于Fv-GA和Afu-GA的共混物，％DP1和％DP4+值分别是96.51％和0.71％。这示出与单独添加的Afu-GA或Fv-GA相比，Fv-GA加Afu-GA的共混物出人意料地达到最低量的DP4+和最高量的％DP1。

表11.AfuGA、Fv-GA+Afu-GA共混物、和Fv-GA的糖分布和％溶解度示出，在60℃和pH 5.2下，在木薯淀粉的DSTG期间，与单独添加Afu-GA和Fv-GA相比，Fv-GA加AfuGA的共混物表现更好。

序列表

SEQ ID NO:1

Fv-GA蛋白质序列：

MFTQILYGLTALSALQGQVTASPGGSSLDRFISKEADISIKGVLANIGADGKRAQGAAPGAVVASPSRTDPDYWYTWTRDSALTYKVLVERFIHGDKSLQRKIDEYVSAQAKLQGVTNPSGGPESGGLGEPKFHVNLTAFTGSWGRPQRDGPPLRATALTLYANWLVSHGDRSKAVNKVWPVIEKDLAYTVKFWNRTGYDLWEEVNGSSFFTLSASHRALVEGAALAKKLGKSCSDCATNAPRVLCFMQSFWTGSYIDSNINVNDGRKGLDANSILSSIHTFDPSSKCTDSTFQPCSSRALANHKEVVDSFRSIYGVNKNRGKGKAAAVGRYSEDVYYDGNPWYLATLAAAEQLYAAVYQWNKIGSITVDSVSLPFFSDLVPKVSKGTYRKNSKTYKAIIKAVTSYADGFVAVVQTYTPKDGSLAEQFDKSTGTPKSAVHLTWSYASFVGAAERRTGVVPPAWGESNANKVPAVCEAAPACDTTITFNVKNVDVTSDQKVYIVGGITQLSNWAPADGIALEESTSTKGLWTVKVKIPSDTSFEYKYIKKTSDGTVTWESDPNNSAATGSKCGSSSTINDEWR

SEQ ID NO:2

Fv-GA DNA核苷酸序列：

ATGTTTACTCAGATCTTGTATGGCCTCACGGCCTTATCTGCCCTCCAAGGTCAGGTCACTGCATCACCAGGCGGTTCCAGCCTTGATCGCTTCATTTCCAAAGAGGCCGACATCTCCATCAAGGGCGTGCTTGCCAATATTGGCGCCGATGGCAAGCGAGCCCAAGGCGCTGCACCTGGCGCCGTTGTAGCAAGTCCATCGAGAACAGATCCAGACTGTAAGTCAATATTCTTGATAGTATCGCAAATGGATGACTGAGACGTTTTCTAGACTGGTACACATGGACCCGAGACTCCGCCTTGACATACAAAGTCCTTGTTGAGCGCTTCATTCACGGAGACAAGTCTCTCCAGCGCAAGATCGACGAATATGTCTCTGCCCAAGCCAAGCTCCAGGGCGTCACCAACCCATCTGGCGGCCCCGAGTCAGGCGGCCTTGGGGAACCCAAGTTTCACGTCAACCTCACAGCTTTCACAGGATCCTGGGGTCGTCCTCAACGAGATGGCCCTCCTCTGAGAGCTACTGCATTGACGCTGTACGCCAACTGGCTTGTTTCTCACGGCGACCGCTCCAAGGCCGTCAACAAGGTTTGGCCTGTCATTGAGAAGGATCTTGCATACACCGTCAAGTTCTGGAACAGAACCGGTTACGATCTTTGGGAGGAGGTTAACGGATCTTCGTTCTTCACCCTCTCTGCTTCACATCGTGCTCTGGTTGAGGGAGCTGCTCTTGCTAAGAAGCTTGGCAAGTCTTGCTCCGACTGCGCAACCAACGCCCCCCGTGTTCTCTGCTTCATGCAAAGCTTCTGGACCGGCAGCTACATCGACTCGAACATCAATGTCAACGATGGCCGCAAGGGTCTTGATGCCAACTCCATTCTGTCTTCTATTCACACCTTTGATCCTTCTTCGAAGTGCACAGACTCTACCTTCCAGCCTTGTTCTTCAAGGGCTCTTGCGAACCACAAGGAAGTAGTGGACTCTTTCCGCTCCATCTATGGTGTCAACAAAAACAGAGGTAAAGGTAAAGCTGCTGCTGTCGGTCGATACAGTGAGGATGTGTACTACGACGGTAACCCTTGGTACTTGGCTACTCTTGCTGCTGCCGAGCAACTGTACGCTGCTGTCTATCAATGGAACAAGATCGGTTCCATCACAGTTGATAGTGTGTCGCTCCCCTTTTTCAGTGACCTTGTACCAAAGGTTTCCAAGGGAACCTATCGCAAGAACAGCAAGACATACAAGGCTATTATCAAGGCTGTCACTTCATACGCTGATGGCTTTGTCGCCGTTGTGCAGACCTATACTCCCAAAGATGGCTCCCTCGCAGAGCAGTTCGATAAGTCTACTGGAACTCCCAAGTCAGCTGTTCACCTAACCTGGTCCTACGCCTCCTTTGTCGGTGCTGCCGAGCGTCGTACTGGCGTCGTTCCTCCAGCTTGGGGCGAGAGCAACGCCAACAAGGTGCCTGCTGTTTGCGAAGCAGCTCCAGCCTGCGACACCACCATCACGTTCAATGTGAAGAACGTTGATGTCACGTCGGACCAGAAGGTTTACATTGTTGGCGGGATCACTCAACTTTCCAACTGGGCCCCTGCTGACGGCATTGCGCTTGAGGAATCCACGAGCACCAAGGGCTTGTGGACTGTGAAGGTCAAGATTCCATCTGATACCAGCTTTGAGTATAAGTATATAAAGAAGACGAGTGATGGAACTGTTACATGGGAGAGTGACCCCAATAACAGTGCGGCGACGGGCAGCAAGTGCGGAAGCAGCAGTACCATCAACGATGAGTGGAGGTAA

SEQ ID NO:3

Afu-GA蛋白质序列：

MPRLSYALCALSLGHAAIAAPQLSARATGSLDSWLGTETTVALNGILANIGADGAYAKSAKPGIIIASPSTSEPDYYYTWTRDAALVTKVLVDLFRNGNLGLQKVITEYVNSQAYLQTVSNPSGGLASGGLAEPKYNVDMTAFTGAWGRPQRDGPALRATALIDFGNWLIDNGYSSYAVNNIWPIVRNDLSYVSQYWSQSGFDLWEEVNSMSFFTVAVQHRALVEGSTFAKRVGASCSWCDSQAPQILCYMQSFWTGSYINANTGGGRSGKDANTVLASIHTFDPEAGCDDTTFQPCSPRALANHKVYTDSFRSVYAINSGIPQGAAVSAGRYPEDVYYNGNPWFLTTLAAAEQLYDAIYQWKKIGSISITSTSLAFFKDIYSSAAVGTYASSTSTFTDIINAVKTYADGYVSIVQAHAMNNGSLSEQFDKSSGLSLSARDLTWSYAAFLTANMRRNGVVPAPWGAASANSVPSSCSMGSATGTYSTATATSWPSTLTSGSPGSTTTVGTTTSTTSGTAAETACATPTAVAVTFNEIATTTYGENVYIVGSISELGNWDTSKAVALSASKYTSSNNLWYVSVTLPAGTTFEYKYIRKESDGSIVWESDPNRSYTVPAACGVSTATENDTWQ

SEQ ID NO:4

Afu-GA核苷酸序列：

atgcctcgcctttcctacgcgctctgtgcgctgtctctcgggcatgctgctattgcagctcctcagttatccgctcgtgctaccggcagcttggactcctggttgggtactgagaccaccgttgcgctcaatggtattctggccaacatcggtgccgacggtgcttatgcgaagagcgctaagcctggcataatcattgccagtccgagcaccagcgaaccagactgtgagaaccttcctgaactggccctgtccggcagtcattgacctcggtagactactatacctggacgagagatgctgctctcgtcacgaaagtcctggtcgacctcttccgcaacggcaacctgggtctgcagaaagtcattaccgaatacgtcaactctcaggcgtacttgcagaccgtgtctaatccgtcgggtggtcttgcgagcggaggtctcgcggagcctaagtacaacgtcgacatgacggcctttaccggagcctggggtcgtcctcagcgtgatggtccggctctgcgggccaccgccctcatcgactttggcaactggctgattgtatgttctccatacgagccccaggaagcgttgctgacgtctacaggacaacggctactccagctatgctgtcaacaacatctggcccattgtgcgcaacgacttgtcctacgtttctcagtactggagccagagtggctttggtgagtcccgactctctggaagtttacaacgtgcatcgattactgacaattgagattctacgtgacagatctctgggaagaagtcaactccatgtccttcttcaccgtcgctgtccagcaccgtgccctcgtggagggaagcacgttcgctaaacgggtgggagcgtcgtgctcgtggtgtgactcgcaggccccccagatcctctgctacatgcagagtttctggactggctcgtatatcaacgccaacaccggtggtggccggtccggcaaggatgccaacaccgtcctcgccagcatccataccttcgaccccgaagccggctgcgacgatactactttccagccctgctctcctcgggcccttgccaaccacaaggtgtacaccgattcgttccgctcggtctacgcgatcaactccggcatcccacagggcgctgccgtttccgctggccgctaccccgaggacgtctactacaacggcaacccttggttcctcaccaccctcgccgctgccgagcagctctacgacgctatctaccagtggaagaagatcggttccatcagcatcaccagcacctccctcgccttcttcaaggacatctacagctccgccgcggtcggcacctacgcctctagcacctccaccttcacggacatcatcaacgcggtcaagacctacgcagacggctacgtgagcatcgtccaggcacacgccatgaacaacggctccctttcggagcaattcgacaagtcctctgggctgtccctctccgcccgcgatctgacctggtcctacgccgctttcctcaccgccaacatgcgtcgtaacggcgtggtgcctgccccctggggcgccgcctccgccaactccgtcccctcgtcttgctccatgggctcggccacgggcacctacagcaccgcgacagccacctcctggcccagcacgctgaccagcggctcgccaggcagcaccaccaccgtgggcaccacgaccagtaccacctctggcaccgccgccgagaccgcctgtgcgacccctaccgccgtggccgtcacctttaacgagatcgccaccaccacctacggcgagaatgtttacattgttgggtccatctccgagctcgggaactgggataccagcaaagcagtggccctgagtgcgtccaagtatacctccagcaataacctctggtacgtgtccgtcaccctgccggctggcacgacattcgagtacaagtatatccgcaaggaaagcgatggctcgatcgtgtgggagagtgaccccaaccgctcgtatacggtgccggcagcttgtggagtgtctactgcgaccgagaatgatacttggcagtga

SEQ ID NO:5

Hg-GA蛋白质序列：

MHTFSKLLVLGSAVQSALGRPHGSSRLQERAAVDTFINTEKPIAWNKLLANIGPNGKAAPGAAAGVVIASPSRTDPPYFFTWTPDAALVLTGIIESLGHNYNTTLQTVIQNYVASQAKLQQVSNPSGTFADGSGLGEAKFNVDLTAFTGEWGRPQRDGPPLRAIALIQYAKWLIANGYKSTAKSVVWPVVKNDLAYTAQYWNETGFDLWEEVPGSSFFTIASSHRALTEGAYLAAQLDTECPPCTTVAPQVLCFQQAFWNSKGNYVVSTSTAGEYRSGKDANSILASIHNFDPEAGCDNLTFQPCSERALANHKAYVDSFRNLYAINKGIAQGKAVAVGRYSEDVYYNGNPWYLANFAAAEQLYDAIYVWNKQGSITVTSVSLPFFRDLVSSVSTGTYSKSSSTFTNIVNAVKAYADGFIEVAAKYTPSNGALAEQYDRNTGKPDSAADLTWSYSAFLSAIDRRAGLVPPSWRASVAKSQLPSTCSRIEVAGTYVAATSTSFPSKQTPNPSAAPSPSPYPTACADASEVYVTFNERVSTAWGETIKVVGNVPALGNWDTSKAVTLSASGYKSNDPLWSITVPIKATGSAVQYKYIKVGTNGKITWESDPNRSITLQTASSAGKCAAQTVNDSWR

SEQ ID NO:6

Hg-GA核苷酸序列：

atgcataccttctccaagctcctcgtcctgggctctgccgtccagtctgccctcgggcggcctcacggctcttcgcgtctccaggaacgcgctgccgttgataccttcatcaacaccgagaagcccatcgcatggaacaagctgctcgccaacatcggccctaacggcaaagccgctcccggtgccgccgccggcgttgtgattgccagcccttccaggacggaccctccttgtacgtggtggcatggaatggacccaagagactgttttagatgaaagagagtttctgctaaccgccacacccagacttcttcacctggaccccggatgccgccctggtcctcaccggcatcatcgagtcccttggccacaactacaacaccaccctgcagaccgtcatccagaactacgtcgcgtcgcaggccaagctgcagcaggtctcgaacccctcgggaaccttcgccgacggctcgggtctcggtgaggccaagttcaatgtcgacctcactgccttcactggcgaatggggtcgccctcagagggacggcccgcccctgcgcgccatcgctctcatccagtacgccaagtggctgatcgccaacggctacaagagcacggccaagagcgtcgtctggcccgtcgtcaagaacgatctcgcctacacggcccagtactggaacgagaccggcttcgatctctgggaggaggtccccggcagctcgttctttaccatcgccagctctcacaggggtgagtcatttattgttcagtgttttctcattgaataattaccggaatgccactgacgccaaacagctctgactgagggtgcttacctcgccgctcagctcgacaccgagtgcccgccctgcacgaccgtcgcccctcaggttctgtgcttccagcaggccttctggaactccaagggcaactatgtcgtctcaacagtaagatccctacaccaacaaaaaaaatcgaaaaggaacgttagctgacccttctagtcaacggcgggcgagtatcgctccggcaaggacgccaactcgatcctggcgtccatccacaacttcgaccctgaggccggctgcgacaacctgaccttccagccctgcagcgagcgcgccctggccaaccacaaggcctatgtcgactcgttccgcaacctctacgccatcaacaagggcatcgcccagggcaaggccgttgccgtcggccgctactcggaggatgtctactacaacggcaacccgtggtacctggccaactttgccgccgccgagcagctctacgacgccatctacgtgtggaacaagcagggctccatcaccgtgacctcggtctccctgcccttcttccgcgaccttgtctcgtcggtcagcaccggcacctactccaagagcagctcgaccttcaccaacatcgtcaacgccgtcaaggcctacgccgacggcttcatcgaggtggcggccaagtacaccccgtccaacggcgcgctcgccgagcagtacgaccgcaacacgggcaagcccgactcggccgccgacctgacgtggtcgtactcggccttcctctcggccatcgaccgccgcgcgggtctcgtccccccgagctggcgggccagcgtggccaagagccagctgccgtccacctgctcgcgcatcgaggtcgccggcacctacgtcgccgccacgagcacctcgttcccgtccaagcagaccccgaacccctccgcggcgccctccccgtccccctacccgaccgcctgcgcggacgctagcgaggtgtacgtcaccttcaacgagcgcgtgtcgaccgcgtggggcgagaccatcaaggtggtgggcaacgtgccggcgctggggaactgggacacgtccaaggcggtgaccctgtcggccagcgggtacaagtcgaatgatcccctctggagcatcacggtgcccatcaaggcgacgggctcggccgtgcagtacaagtatatcaaggtcggcaccaacgggaagattacttgggagtcggaccccaacaggagcattaccctgcagacggcgtcgtctgcgggcaagtgcgccgcgcagacggtgaatgattcgtggcgttaa

SEQ ID NO:7

An-GA蛋白质序列：

MSFRSLLALSGLVCTGLANVISKRATWDSWLSNEATVARTAILNNIGADGAWVSGADSGIVVASPSTDNPDYFYTWTRDSGLVLKTLVDLFRNGDTSLLSTIENYISAQAIVQGISNPSGDLSSGAGLGEPKFNVDETAYTGSWGRPQRDGPALRATAMIGFGQWLLDNGYTSTATDIVWPLVRNDLSYVAQYWNQTGYDLWEVNGSSFFTIAVQHRALVEGSAFATAVGSSCSWCDSQAPEILCYLQSFWTGSFILANFDSSRSAKDANTLLLGSIHTFDPEAACDDSTFQPCSPRALANHKEVVDSFRSIYTLNDGLSDSEAVAVGRYPEDTYYNGNPWFLCTLAAAEQLYDALYQWDKQGSLEVTDVSLDFFKALYSDATGTYSSSSSTYSSIVDAVKTFADGFVSIVETHAASNGSMSEQYDKSDGEQLSARDLTWSYAALLTANNRRNVVPSASWGETSASSVPGTCAATSAIGTYSSVTVTSWPSIVATGGTTTTATPTGSGSVTSTSKTTATASKTSTSTSSTSCTTPTAVAVTFDLTATTTYGENIYLVGSISQLGDWETSDGIALSADKYTSSDPLWYVTVTLPAGESFEYKFIRIESDDSVEWESDPNREYTVPQACGTSTATVTDTWR

SEQ ID NO:8

An-GA核苷酸序列：

atgtcgttccgatctctactcgccctgagcggcctcgtctgcacagggttggcaaatgtgatttccaagcgcgcgacctgggattcatggttgagcaacgaagcgaccgtggctcgtactgccatcctgaataacatcggggcggacggtgcttgggtgtcgggcgcggactctggcattgtcgttgctagtcccagcacggataacccggactacttctacacctggactcgcgactctggtctcgtcctcaagaccctcgtcgatctcttccgaaatggagataccagtctcctctccaccattgagaactacatctccgcccaggcaattgtccagggtatcagtaacccctctggtgatctgtccagcggcgctggtctcggtgaacccaagttcaatgtcgatgagactgcctacactggttcttggggacggccgcagcgagatggtccggctctgagagcaactgctatgatcggcttcgggcaatggctgcttgacaatggctacaccagcaccgcaacggacattgtttggcccctcgttaggaacgacctgtcgtatgtggctcaatactggaaccagacaggatatgatctctgggaagtcaatggctcgtctttctttacgattgctgtgcaacaccgcgcccttgtcgaaggtagtgccttcgcgacggccgtcggctcgtcctgctcctggtgtgattctcaggcacccgaaattctctgctacctgcagtccttctggaccggcagcttcattctggccaacttcgatagcagccgttccgccaaggacgcaaacaccctcctgctgggaagcatccacacctttgatcctgaggccgcatgcgacgactccaccttccagccctgctccccgcgcgcgctcgccaaccacaaggaggttgtagactctttccgctcaatctataccctcaacgatggtctcagtgacagcgaggctgttgcggtgggtcggtaccctgaggacacgtactacaacggcaacccgtggttcctgtgcaccttggctgccgcagagcagttgtacgatgctctataccagtgggacaagcaggggtcgttggaggtcacagatgtgtcgctggacttcttcaaggcactgtacagcgatgctactggcacctactcttcgtccagttcgacttatagtagcattgtagatgccgtgaagactttcgccgatggcttcgtctctattgtggaaactcacgccgcaagcaacggctccatgtccgagcaatacgacaagtctgatggcgagcagctttccgctcgcgacctgacctggtcttatgctgctctgctgaccgccaacaaccgtcgtaacgtcgtgccttccgcttcttggggcgagacctctgccagcagcgtgcccggcacctgtgcggccacatctgccattggtacctacagcagtgtgactgtcacctcgtggccgagtatcgtggctactggcggcaccactacgacggctacccccactggatccggcagcgtgacctcgaccagcaagaccaccgcgactgctagcaagaccagcaccagtacgtcatcaacctcctgtaccactcccaccgccgtggctgtgactttcgatctgacagctaccaccacctacggcgagaacatctacctggtcggatcgatctctcagctgggtgactgggaaaccagcgacggcatagctctgagtgctgacaagtacacttccagcgacccgctctggtatgtcactgtgactctgccggctggtgagtcgtttgagtacaagtttatccgcattgagagcgatgactccgtggagtgggagagtgatcccaaccgagaatacaccgttcctcaggcgtgcggaacgtcgaccgcgacggtgactgacacctggcggtag

SEQ ID NO:9

Tr-GA变体CS4成熟蛋白质序列：

SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSAVHLTWSYASFLTAAARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGHTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYRDNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYIIVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS

SEQ ID NO:10

Tr-GA成熟蛋白质序列：

SVDDFISTETPIALNNLLCNVGPDGCRAFGTSAGAVIASPSTIDPDYYYMWTRDSALVFKNLIDRFTETYDAGLQRRIEQYITAQVTLQGLSNPSGSLADGSGLGEPKFELTLKPFTGNWGRPQRDGPALRAIALIGYSKWLINNNYQSTVSNVIWPIVRNDLNYVAQYWNQTGFDLWEEVNGSSFFTVANQHRALVEGATLAATLGQSGSAYSSVAPQVLCFLQRFWVSSGGYVDSNINTNEGRTGKDVNSVLTSIHTFDPNLGCDAGTFQPCSDKALSNLKVVVDSFRSIYGVNKGIPAGAAVAIGRYAEDVYYNGNPWYLATFAAAEQLYDAIYVWKKTGSITVTATSLAFFQELVPGVTAGTYSSSSSTFTNIINAVSTYADGFLSEAAKYVPADGSLAEQFDRNSGTPLSALHLTWSYASFLTATARRAGIVPPSWANSSASTIPSTCSGASVVGSYSRPTATSFPPSQTPKPGVPSGTPYTPLPCATPTSVAVTFHELVSTQFGQTVKVAGNAAALGNWSTSAAVALDAVNYADNHPLWIGTVNLEAGDVVEYKYINVGQDGSVTWESDPNHTYTVPAVACVTQVVKEDTWQS

SEQ ID NO:11

Tr-GA亲本蛋白质序列(632个氨基酸)：

SEQ ID NO:12

Tr-GA核苷酸序列(1899bp)：

Claims

1.一种用于糖化淀粉底物的方法，该方法包括使该淀粉底物与葡糖淀粉酶接触，该葡糖淀粉酶由Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列组成，与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的序列具有至少85％同一性，与Fv-GA(SEQ ID NO:1)的催化结构域具有至少85％同一性，与接头和Fv-GA(SEQID NO:1)的催化结构域具有至少85％同一性，或与具有葡糖淀粉酶活性的Fv-GA(SEQ IDNO:1)的活性片段具有至少85％同一性，并且使该淀粉底物与至少一种另外的葡糖淀粉酶接触。

2.如权利要求1所述的方法，其中该另外的葡糖淀粉酶包括Afu-GA(SEQ ID NO:3)或An-GA(SEQ ID NO:7)。

3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该另外的葡糖淀粉酶是Afu-GA(SEQ IDNO:3)或是与SEQ ID NO:3具有至少85％同一性的葡糖淀粉酶。

4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该另外的葡糖淀粉酶是An-GA(SEQ IDNO:7)或是与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的葡糖淀粉酶。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中糖化该淀粉底物导致高葡萄糖浆。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该高葡萄糖浆包含一定量的选自以下列表的葡萄糖，该列表由以下各项组成：至少95.5％葡萄糖、至少95.6％葡萄糖、至少95.7％葡萄糖、至少95.8％葡萄糖、至少95.9％葡萄糖、至少96％葡萄糖、至少96.1％葡萄糖、至少96.2％葡萄糖、至少96.3％葡萄糖、至少96.4％葡萄糖、至少96.5％葡萄糖、以及至少97％葡萄糖。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，该方法进一步包括将该高葡萄糖浆发酵为终产物。

8.如权利要求7所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

9.如权利要求7或权利要求8所述的方法，其中该终产物是醇。

10.如权利要求9所述的方法，其中该终产物是乙醇。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中该淀粉底物是约5％至99％、15％至50％、或40％-99％干固体(DS)。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中每种葡糖淀粉酶的剂量是在约0.01至约10葡糖淀粉酶单位(GAU)/克干固体淀粉(dss)的范围内。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中该淀粉底物选自以下各项：小麦、大麦、玉米、黑麦、水稻、高粱、麸、木薯、蜀黍、粟、马铃薯、甘薯、树薯、及其任意组合。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中该淀粉底物包括液化淀粉、凝胶化淀粉、或颗粒状淀粉。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，该方法进一步包括向该淀粉底物中添加己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖异构酶、木糖异构酶、磷酸酶、植酸酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、α-淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、脂肪酶、角质酶、海藻糖酶、异淀粉酶、氧化还原酶、酯酶、转移酶、果胶酶、水解酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、或其组合。

16.如权利要求15所述的方法，其中进一步添加支链淀粉酶。

18.如权利要求17所述的方法，其中糖化和发酵作为同时糖化和发酵(SSF)工艺进行。

19.如权利要求17或权利要求18所述的方法，其中该终产物是醇。

20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中该终产物是乙醇。

21.如权利要求20所述的方法，其中经糖化和发酵的淀粉底物导致降低的DP4+水平和增加的乙醇终浓度。

22.如权利要求21所述的方法，其中该降低的DP4+水平低于在相同的糖化和发酵条件下分别使用相同总葡糖淀粉酶剂量的Fv-GA或Tr-GA变体CS4会达到的水平。

23.如权利要求21所述的方法，其中该增加的乙醇终浓度高于在相同糖化和发酵条件下分别使用相同总葡糖淀粉酶剂量的Fv-GA或Tr-GA变体CS4会达到的浓度。