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CN107427589A - 酶‑聚合物缀合物的非水溶液和相关方法 - Google Patents

酶‑聚合物缀合物的非水溶液和相关方法 Download PDF

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CN107427589A
CN107427589A CN201680021192.1A CN201680021192A CN107427589A CN 107427589 A CN107427589 A CN 107427589A CN 201680021192 A CN201680021192 A CN 201680021192A CN 107427589 A CN107427589 A CN 107427589A
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conjugate
polymer
polymer conjugate
reaction
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CN201680021192.1A
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A·J·拉塞尔
H·穆拉塔
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Carnegie Mellon University
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Abstract

一种酶‑聚合物缀合物，其显示在非水溶剂中的增加的活性和分子溶解，使得能够在非水溶液中酶介导催化。本说明书中描述的发明涉及酶‑聚合物缀合物、含有酶‑聚合物缀合物的有机溶液、在有机溶剂中溶解酶‑聚合物缀合物的方法、和例如在催化应用中使用酶‑聚合物缀合物的方法。本说明书中描述的发明解决酶在包含例如有机溶剂或离子液体的非水溶液中的不溶性和活性降低的问题。

Description

酶-聚合物缀合物的非水溶液和相关方法
背景技术
作为天然的纳米催化剂，酶能够在温和条件下在水性环境中以高底物特异性催化多种反应。然而，主要由于弱底物结合和溶剂对酶的结构影响，有机介质中的酶活性通常比水性条件中的酶活性低几个数量级。在非极性有机介质中，因为非极性溶剂和蛋白质之间的溶剂化作用有利于结构化的球形状态，一些酶保持结构稳定。然而，这些溶剂中的活性大幅降低，这是因为酶不具有催化所需的迁移性。在更极性的有机溶剂例如乙腈中，水分子从酶拉开，这有利于变性的蛋白质状态。甚至在修饰后，酶在有机介质中通常作为聚集体存在，这使得只有聚集体表面的酶催化反应。
发明内容
本说明书所描述的发明涉及酶-聚合物缀合物(conjugate)、含有酶-聚合物缀合物的有机溶液、在有机溶剂中溶解酶-聚合物缀合物的方法、和例如在催化应用中使用酶-聚合物缀合物的方法。本说明书所描述的发明解决酶在含有例如有机溶剂或离子液体等的非水溶液(non-aqueous solution)中的不溶性和活性降低的问题。
在一个实例中，非水溶液含有有机溶剂或离子液体、和在有机溶剂或离子液体中分子溶解(molecularly dissolved)的酶-聚合物缀合物，其中所述有机溶剂或离子液体含有作为共溶剂的不多于50体积％的水。酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，其中在非水溶液中分子溶解(molecularly dissolved)的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径(hydrodynamic diameter)小于在非变性pH下在水中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。
在另一个实例中，催化反应的方法包括将酶-聚合物缀合物溶解在有机溶剂或离子液体中从而形成酶-聚合物缀合物在有机溶剂或离子液体中的分子溶液(molecularsolution)，其中酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，其中在分子溶液中的溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。所述方法可进一步包括进行由有机溶剂或离子液体中的酶-聚合物缀合物催化的反应。
在另一个实例中，催化反应的方法包括向容器提供含有有机溶剂或离子液体的分子加溶(molecularly solubilized)的酶-聚合物缀合物的非水溶液，其中所述有机溶剂或离子液体含有作为共溶剂的不多于50体积％的水。所述分子加溶的酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，在溶液中分子加溶的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中测量的分子加溶的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。所述方法可进一步包括向容器提供至少一种反应物，并进行由酶-聚合物缀合物催化的反应。
应理解，本说明书所述的发明不必限于在本发明内容中总结的实例。
附图说明
本说明书所述的各种特征和特性可通过参考所附的图来更好地理解，其中：
图1A和1B是含有生长自酶-引发剂缀合物的聚合物链的酶-聚合物缀合物的"接枝自(grafting from)"合成的示意图；图1A示出生成酶-引发剂缀合物的反应；图1B示出共价键合至图1A的酶-引发剂缀合物的单体的原子转移自由基聚合(atom transfer radicalpolymerization,ATRP)，其生成酶-聚合物缀合物。
图2A和2B为含有共价键合至酯酶的聚合物链的酶-聚合物缀合物的"接枝自"合成的示意图，其中所述聚合物链生长自酯酶-引发剂缀合物；图2A示出生成酯酶-引发剂缀合物的反应；图2B示出共价键合至图2A的酯酶-引发剂缀合物的单体的ATRP，其生成酶-聚合物缀合物，即，酯酶-聚合物缀合物。
图3A和3B为示出酶-聚合物缀合物的流体动力学直径(Dh)与溶剂条件的相关性的条形图；图3A为示出酶-聚合物缀合物在具有增加的水含量和固定的丙醇浓度(500mM)的乙腈中的流体动力学直径的图；图3B为示出图3A的酶-聚合物缀合物在具有增加的丙醇含量和固定的水浓度(1000mM)的乙腈中的流体动力学直径的图。
图4为示出乙腈中酶-聚合物缀合物浓度对浊度(500nm下的吸光度)的影响的散点图。
图5为N-乙酰基L-苯丙氨酸硫代苯酯(APTE)和1-丙醇的、酶-聚合物缀合物催化的酯交换和水解的化学反应的示意图。
图6为酶-聚合物缀合物用于催化APTE至N-乙酰基L-苯丙氨酸丙酯(APPE)的酯交换的示意图。
图7A和7B为用于通过曲线拟合测定米-曼氏参数(Michaelis-Mentenparameters)的APTE浓度对初始反应速率的图；图7A为示出固定的丙醇浓度500mM下米-曼氏参数与水浓度的相关性的APTE浓度对初始速率的图；图7B为示出固定的水浓度1000mM下米-曼氏参数与丙醇浓度的相关性的APTE浓度对初始速率的图。
图8A为在具有固定的丙醇浓度500mM的乙腈溶液中水浓度相对于初始反应速率以及酯交换速率与水解速率之比的图；图8B为在具有固定的水浓度1000mM的乙腈溶液中丙醇浓度相对于初始反应速率以及酯交换速率与水解速率之比的图。
根据本说明书考虑本发明的以下具体实施方式，读者将理解前述特征和特性等。
具体实施方式
本发明提供用作有机溶剂中催化剂的分子溶解的酶-聚合物缀合物。
在本说明书中描述和说明了本发明的各个实施方案或方面，从而提供对所公开的组合物、系统和方法的结构、功能、操作、制造和应用的总体理解。应理解，本说明书中描述和说明的各个实施方案或方面是非限制的和非穷举的。因此，本发明不受本说明书所公开的各个非限制的和非穷举的方面或实施方案的描述的限制。相反，本发明仅由权利要求所限定。结合各个方面或实施方案说明和/或描述的特征和特性可以与其它方面或实施方案的特征和特性组合。这些修改和变化旨在包括在本说明书的范围内。这样，权利要求可修改为叙述本说明书明确地或固有地描述的，或者由本说明书明确地或固有地支持的特征或特性。在本说明书中公开和描述的各个方面或实施方案可包括以下、由以下组成、或主要由以下组成、或特征在于：本文所不同地描述的特征和特性。
除非另有说明，本文所标明的任何专利、出版物或其他公开材料全部引入本说明书以作参考，但是仅在所引用材料不与本说明书中明确地阐述的现有定义、陈述或其他公开材料冲突的范围内。这样，在必要的范围内，本说明书中阐述的明确公开(expressdisclosure)取代通过引入本文以作参考的任何冲突材料。所述通过引入本说明书以作参考的但与本文阐述的现有定义、陈述或其他公开材料相冲突的任何材料或其部分仅在所引用材料和现有公开材料之间不产生冲突的范围内引用。申请人保留修改本说明书从而明确地叙述通过引入本文以作参考的任何主题或其部分的权利。
贯穿本说明书的对“各个方面”或“各个实施方案”等的引用指的是可包括在方面或实施方案中的特定特征或特性。因此，在本说明书中使用短语“在各个方面”等并不必要指通常的方面或实施方案，并可指不同的方面和/或实施方案。此外，所述特定特征或特性可以以任何合适的方式组合在一个或多个方面或实施方案中。因此，结合各个方面或实施方案说明或描述的特定特征或特性可全部或部分地与一个或多个其他方面或实施方案的特征或特性组合而不受限制。这些修改和变化旨在包括在本说明书的范围内。
在本说明书中，除另有说明之外，所有数值参数应理解为在所有情况下以术语“约”为前缀和修饰，其中数值参数具有用于确定参数的数值的基础测量技术的固有变化性特性。至少并非试图将等同原则的适用范围限制在权利要求书的范围内，本说明书所描述的各数值参数至少应根据报告的有效数字的数量和通过应用普通的舍入技术来解释。
并且，本说明书中描述的任何数值范围都旨在包括所述范围内所包含的相同数值精度的所有子范围。例如，范围“1.0至10.0”旨在包括在所述最小值1.0和所述最大值10.0之间(包括所述最小值和最大值)的所有子范围，即，具有等于或大于1.0的最小值和等于或小于10.0的最大值，例如2.4至7.6等。本说明书所述的任何最大数值限制旨在包括其中所包含的所有更低的数值限制，且本说明书所述的任何最小数值限制旨在包括其中所包含的所有更高的数值限制。相应地，申请人保留修改本说明书包括权利要求从而明确地描述包含在本文明确地描述的范围内的任何子范围的权利。所有这样的范围旨在在本说明书中固有地描述，使得明确地描述任何这样的子范围的修改将符合所适用的公开要求。
除非另有说明，本说明书所使用的语法冠词“一个/种(one,a,an)”和“所述(the)”旨在包括“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。因此，在本说明书中使用冠词以指所述冠词的一个/种或多于一个/种(即，指“至少一个”)语法对象。作为实例，“组分”指的是一种或多种组分，且因此可能考虑并可在所述实施方案的实施(implementation)中采用或使用多于一种组分。此外，单数名词的使用包括复数，复数名词的使用包括单数，除非所述使用的上下文另有要求。
除非另有说明，本文所使用的关于本文所述的酶-聚合物缀合物的组合物、和取代基、基团、和部分等使用的术语“键合(bound,)、结合(bind,binding)”、“相连(associatedwith)”、和“连接(attachment,attached to)”等，意为共价或非共价键合，包括但不限于两个以上的化合物、取代基、分子、离子或原子之间的分子间吸引力，其可涉及或可不涉及分享或供给电子。非共价相互作用可包括离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力(色散吸引力(dispersion attractions)、偶极-偶极和偶极诱导的偶极相互作用)、插层(intercalation)、熵力和化学极性。
本文所使用的术语“聚合物长度”指的是作为并入聚合物链的单体残基的平均数的结果的聚合体长度。“单体”是可以化学和共价键合至其它分子从而形成聚合物的分子。
本文所使用的术语“非水的”指的是包括含有不多于50体积％的水的溶剂系统的溶液。
本文所使用的术语“酶-引发剂”指的是一种酶，其含有在原子转移自由基聚合(ATRP)、自由基聚合、或可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合中可操作的共价表面键合引发剂。
本文所使用的术语“催化剂”指的是可引起化学反应速率变化而自身不在反应中消耗的物质(通过使用催化剂的反应速率改变称为催化)。
本文所使用的术语“酶”指的是由天然或转基因活细胞或蛋白质工程产生的并介导和促进生命或其他化学反应的化学过程而其自身不改变或破坏的任何一组催化蛋白质。与其作为生物催化剂的作用一致，酶对其作用的分子(称为“底物”)显示出相当大的选择性。本文所使用的术语“活性位点”和“酶活性位点”指的是底物结合和催化发生的酶的特定区域(也称为“结合位点”)。
本文所使用的术语“抑制剂”指的是通常在称为“抑制”的过程中通过在酶的活性位点内结合而降低化学反应速率的物质。在酶催化反应中，抑制剂通常通过与酶结合而起作用，在所述情况下，所述抑制剂可称为“酶抑制剂”。
本文所使用的术语“烷基”指的是直链或支链烃。烷基基团的实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、叔丁基和正戊基。类似地，术语“烯基”或“炔基”指的是分别含有一个或多个C＝C双键或一个或多个C≡C三键的直链或支链烃。
本文所使用的术语“游离酶”、“游离脂肪酶”、“游离金属蛋白酶”、“游离枯草杆菌酶”或“游离酯酶”等指的是未由聚合物、自由基、或其组合等所改性的天然型酶。
本文所使用的术语“官能团”指的是负责这些分子的特征化学反应的分子内的特定原子或键的组。本文所使用的术语“磷酰基官能团”指的是磷酸的衍生物。
本文所使用的术语“溶剂”指的是溶解溶质来产生溶液的物质。溶剂可为纯物质或混合物。本文所使用的术语“溶液”指的是由两种以上的物质组成的均匀混合物。本文所使用的术语“溶质”指的是溶解在溶剂中的物质。
本文所使用的术语“混合物”指的是化学物质如元素和化合物的机械共混或混合而无化学变化的产物，使得各成分物质保持其自身的化学性质和组成。
本文所使用的术语“可溶”指的是固体、液体或气体化学溶质溶解在固体、液体或气体溶剂中从而形成溶质在溶剂中的溶液的性质。本文所使用的术语“饱和度”和“饱和浓度”指的是溶质在溶剂中的溶解度的程度，其中加入更多的溶质不增加溶液的浓度并开始析出过量的溶质。
本文所使用的术语“分子可溶的(molecularly soluble)”、“分子加溶的”、“分子溶液”、“分子溶解的”和“分子加溶”指的是酶-聚合物缀合物溶解在溶剂中，使得缀合物单独溶剂化，且溶剂中测量的各溶剂化的缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中测量的缀合物的流体动力学直径的两倍。这些术语排除缀合物的胶体悬浮液、乳状液或溶解的或悬浮的聚集体。
本文所使用的溶液中溶质的术语“浓度”指的是相比于存在的溶剂的量，溶解在溶剂中的溶质的量的量度。
本文所使用的术语“无水”指的是不含水的物质(例如缺乏其水合水的蛋白质、酶或酶-聚合物缀合物)。本文所使用的术语“水合水”或“结晶水”指的是在折叠蛋白质内部、折叠酶内部或酶-聚合物缀合物内部存在的水分子。
本文所使用的术语“酯交换”指的是酯的有机基团R"与醇的有机基团R'交换的过程。酯交换反应可以通过加入酶或其它合适的酶-聚合物缀合物、酸或碱的形式的催化剂而催化。酯交换反应可包括甘油醇解、相互酯化或酯-酯互换。本文所使用的“相互酯化”指的是在酯和醇之间交换酰基基团。“可逆酯交换反应”指的是在催化剂存在下油或脂肪与一元醇反应的反应。
本文所使用的"酶-聚合物缀合物"指的是已共价修饰以从催化活性构象的酶的表面所存在的官能团接枝聚合物的酶。如果适用，本文所述的酶-聚合物缀合物可以是盐的形式。盐例如可在阴离子和本发明的蛋白质-聚合物缀合物的带正电荷的基团(例如在低于其pKa的pH下的氨基基团)之间形成。合适的阴离子包括氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甲烷磺酸盐、三氟乙酸盐、和乙酸盐。相同地，盐还可在阳离子和本发明的蛋白质-聚合物缀合物上的带负电荷的基团(例如羧酸根)之间形成。合适的阳离子包括钠离子、钾离子、镁离子、钙离子、和铵阳离子例如四甲基铵离子。此外，酶-聚合物缀合物可具有一个或多个双键、或一个或多个不对称中心。这样的缀合物可作为外消旋体、外消旋体混合物、单一对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合物、和顺-或反-或E-或Z-双键异构体形式存在。
本文所使用的术语“非变性”pH指的是包含pH值的液体，在该pH值下所述液体有利于使酶的催化活性构象。
本文所使用的术语“挠性(flexibility)”是指使聚合物、单体、或共聚物等弯曲而不断裂聚合物链中的共价键的物理能力。
本文所使用的术语“酶活性”指的是存在的活性酶的量的量度，且其等于相对于单位时间的底物转化的摩尔数。
本文所使用的术语“比活性”指的是相对于每毫克总蛋白的酶的活性的量度，例如以μΜ/min-mg表示。比活性也是在特定底物浓度下酶合成能力(enzyme processivity)的量度。
如上所述，酶在有机溶剂中显示差的溶解度和活性。因此，存在对酶在有机溶剂中分子溶解的需要，这提供了在有机介质中分子溶解的酶活性以及底物与酶的紧密结合的显著增加。
虽然在水性环境中较有效，但酶能够在基本无水的有机介质中催化反应，尽管不处于分子溶解的状态。然而，由于低效底物结合、溶解度不足、通过亲水性无水溶剂失活，有机溶剂中的酶活性受限制。将ATRP用于合成在有机溶剂例如乙腈中分子可溶和有催化活性的酶-聚合物缀合物。
由于在有机溶剂中活性和溶解度增加，酶-聚合物缀合物例如可用于各种应用。检查了基于聚合物的蛋白质工程化酶对水介质中各种应激因素(stressors)(pH、温度、蛋白酶降解)的活性和稳定性响应。具体地，ATRP制备的酶-聚合物缀合物在有机溶剂例如乙腈中分子可溶。
图1A和1B示出使用聚合物系蛋白质工程(PBPE)聚合方法、ATRP、和“接枝自”或“生长自(grown from)”方法合成的酶-聚合物缀合物的合成示意图。为了提供允许更高的接枝链密度、更好的接枝位点控制和可预测性的合成酶-聚合物缀合物的替代方法，开发了蛋白质表面引发的“接枝自”技术，其中引发剂首先与酶共价键合(参见图1A)，然后是使用蛋白质作为酶-引发剂缀合物(参见图1B)的聚合物合成从而生成酶-聚合物缀合物。
在“接枝自”或“生长自”方法中，可以使用宽范围的单体来形成与酶共价键合的聚合物，酶上的接枝聚合物的分子量可控制为窄分子量分布。因此，使用“接枝自”或“生长自”方法生成的缀合物可潜在地合理地设计，这允许聚合物和酶之间的结构-功能关系来预测共价键合的酶-聚合物缀合物的功能性。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物的聚合物组分例如聚(2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(pDMAEMA)可用于评估“接枝自”刺激响应的酶-聚合物缀合物可以如何用环境变量例如溶剂组成来控制。还可使用除pDMAEMA之外的聚合物，包括从可自由基聚合的单体生成的聚合物，其实例包括但不限于聚(寡聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(pOEGMA)、聚(二甲基丙烯酰胺)(pDMAA)、或液体聚合物、或其任意组合。
本发明促进了对酶机理以及酶-聚合物相互作用，特别是涉及在有机溶剂中催化的那些的理解。就本发明人所知，先前未描述任何酶在乙腈中的分子溶解。此外，至今，先前未描述酯酶在有机溶剂或离子液体中的分子溶解。
在各个方面中，本发明描述了含有有机溶剂或离子液体的非水溶液和在有机溶剂或离子液体中分子溶解的酶-聚合物缀合物，其中所述有机溶剂或离子液体含有作为共溶剂的不大于50体积％的水。酶-聚合物缀合物包括生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链。在非水溶液中的分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。
在各个方面中，用于分子溶解酶-聚合物缀合物的有机溶剂可包括无水有机溶剂或离子液体。在一些方面，有机溶剂可含有作为共溶剂的高达50体积％、高达45体积％、高达40体积％、高达35体积％、高达30体积％、高达25体积％、高达20体积％、高达15体积％、高达10体积％、高达5体积％、高达1体积％、或高达0.5％的水。在各个方面中，有机溶剂或离子液体可包括极性或亲水性溶剂，例如乙腈、氯仿、四氢呋喃、1,4-二噁烷、醚、己烷、甲苯、或丙酮，或其任意组合。
酶-聚合物缀合物的工程化结构可包括生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链。能够在有机溶剂或离子液体中分子溶解的酶-聚合物缀合物可含有共价键合至酶的一种聚合物或多种聚合物，所述酶例如来自酯酶组的酶，其包括金属蛋白酶、枯草杆菌酶(subtilase)、或脂肪酶，或其任意组合。虽然CT是本文所使用作为本发明的实例的一种酯酶，但可使用其他蛋白质酶，包括但不限于脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、枯草杆菌酶、金属蛋白酶、胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、胰蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、嗜热菌蛋白酶、或CT，或其任意组合。乙酰胆碱酯酶的可选名称是本领域普通技术人员公知的。例如，乙酰胆碱酯酶的可选名称包括RBC胆碱酯酶，红细胞胆碱酯酶，血清胆碱酯酶，乙酰胆碱乙酰基水解酶，乙酰基水解酶，和由一种(或多种)AChE基因、AChE、AChET、AChEH、和AChER编码的乙酰胆碱酯酶的形式。丁酰胆碱酯酶的可选名称也是本领域普通技术人员公知的。例如，丁酰胆碱酯酶的可选名称包括BChE、BuChE、假胆碱酯酶、血浆胆碱酯酶、或酰基胆碱酰基水解酶。酶-聚合物缀合物的实例在国际公开第WO 2015/051326 A1号中进一步描述，其内容通过引入本说明书以作参考。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物组合物可含有显示聚合物长度从最低至少2个单体重复至约1000个单体重复的范围内的至少一种聚合物。例如，聚合物长度范围可为从最低至少5个单体重复至约750个单体重复，从最低至少25个单体重复至约500个单体重复，从最低至少100个单体重复至约250个单体重复，或任何其中包含的范围，例如，从最小10个单体重复至约900个单体重复。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物组合物可含有共聚物，其含有多于一种单体重复单元。在各个方面中，酶-聚合物缀合物可含有是含有至少两种不同单体的共聚物的至少一种聚合物，其中至少一种单体包含选自由以下组成的组的成员：醛肟、酮肟、粘膜粘附(muco-adhesion)单体、聚乙二醇、双吡啶鎓肟、Ν,Ν-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸酯、Ν,Ν-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、羧基丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、季铵单体、磺基甜菜碱(sulfobetain)甲基丙烯酸酯、寡聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯、2-PAM单体、4-PAM单体、和可点击(Clickable)叠氮化物单体等，和其组合。
此外，酶-聚合物缀合物的共聚物可含有至少两种不同的单体，其中至少一种单体可包含与共聚物的至少一种不同单体不同的拓扑结构。更具体地，所述至少一种单体的不同的拓扑结构可包括嵌段、无规、星形、末端官能或链内官能共聚物拓扑结构。例如，共聚物的至少一种单体可包括二嵌段拓扑结构的至少一种单体。共聚物、用于二嵌段形成的单体、含有末端官能团的单体、或链内官能共聚物可利用在以下中描述的材料和方法合成：Matyjaszewski等人的美国专利第5,789,487号、Matyjaszewski等人的美国专利第6,624,263号、Jakubowski等人的美国专利申请公布第2009/0171024号、以及Matyjaszewski,K,和Davis,T.P.,编辑的Handbook of Radical Polymerization,John Wiley and Sons,Inc.,Hoboken,New Jersey(2002)，将其各自引入本说明书以作参考。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物可包括各自共价键合的并因此缀合至酶的多个聚合物，各聚合物含有多个单体单元，其中至少一种所述单体单元含有肟官能团，其中各聚合物的多个单体单元含有肟官能团。在各个方面中，所述多个聚合物的各聚合物的多个单体单元可含有肟官能团。在各个方面中，所述多个聚合物可包括共聚物，其中各共聚物可含有至少两种不同的单体，其中至少一种单体包含选自由以下组成的组的成员：醛肟、酮肟、粘膜粘附单体、聚乙二醇、双吡啶鎓肟、N,N-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸酯、N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、羧基丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、季铵单体、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、寡聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯、2-PAM单体、4-PAM单体、和可点击叠氮化物单体等，和其组合。
当酶-聚合物缀合物包含共聚物，所述共聚物可包含由以下组成的组的成员：统计共聚物(statistical co-polymer)、无规共聚物、交替共聚物、嵌段共聚物、二嵌段共聚物、三嵌段共聚物、接枝共聚物、或多嵌段共聚物等，或其组合。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物可包含多个聚合物，各聚合物共价缀合至酶，各聚合物可含有多个单体单元，其中至少一个所述单体单元含有肟官能团，多个聚合物包含多个共聚物和多个均聚物。另外，所述多个共聚物的各共聚物可含有至少两种不同单体，其中至少一种单体含有选自由以下组成的组的成员：醛肟、酮肟、粘膜粘附单体、聚乙二醇、双吡啶鎓肟、Ν,Ν-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸酯、N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、羧基丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、季铵单体、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、寡聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯、2-PAM单体、4-PAM单体、和可点击叠氮化物单体等，和其组合。此外，所述多个均聚物的各均聚物包含选自由以下组成的组的成员：醛肟、酮肟、粘膜粘附单体、聚乙二醇、双吡啶鎓肟、Ν,Ν-二甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸酯、Ν,Ν-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯、羧基丙烯酰胺、2-羟乙基甲基丙烯酸酯、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺、季铵单体、磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯、寡聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯、2-PAM单体、4-PAM单体、和可点击叠氮化物单体等，和其组合。
在各个方面中，非水溶液中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍(非水溶液中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径是在非变性pH下在水中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的不到两倍)。例如，一方面，乙腈中分子溶解的酶-聚合物缀合物(酯酶-pDMAEMA)的流体动力学直径小于在高于pH 8和低于低临界溶液温度下在水中测量的酶-聚合物缀合物(酯酶-pDMAEMA)的流体动力学直径的两倍。
在各个方面中，分子溶解的酶-聚合物缀合物包含能够催化显示出至少3.7min-1的kcat的反应的酶-聚合物缀合物。在一些方面中，分子溶解的酶-聚合物缀合物包含能够催化显示出至少4min-1、至少5min-1、至少6min-1、至少7min-1、至少8min-1、至少9min-1、至少10min-1、至少15min-1、至少16min-1、至少18min-1、至少20min-1、至少21min-1、或至少25min-1的kcat的反应的酶-聚合物缀合物。
在各个方面中，本发明包括催化反应的方法，其包括将酶-聚合物缀合物溶解在有机溶剂或离子液体中从而形成酶-聚合物缀合物在有机溶剂或离子液体中的分子溶液，其中酶-聚合物缀合物包含生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链。在分子溶液中溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。所述方法进一步包括在有机溶剂或离子液体中进行酶-聚合物缀合物催化的反应。
在各个方面中，酯酶用于酶-聚合物缀合物的合成，然而，可使用的其他酶包括但不限于胆碱酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、枯草杆菌酶、枯草杆菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、脂肪酶、三酰甘油脂肪酶、金属蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、或胰蛋白酶，或其任意组合。在各个方面中，酶-聚合物缀合物可包含酯酶-聚合物缀合物(其包含胰凝乳蛋白酶-pDMAEMA(CT-pDMAEMA)缀合物)、金属蛋白酶-pOEGMA缀合物、嗜热菌蛋白酶-pOEGMA缀合物、枯草杆菌蛋白酶-离子液体聚合物缀合物、枯草杆菌酶-离子液体聚合物缀合物、或脂肪酶-pDMAA缀合物，或其任意组合。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物在有机溶剂或离子液体中分子溶解。例如，酶-聚合物缀合物可溶解在有机溶剂或离子液体中，所述有机溶剂或离子液体可包含无水有机溶剂、极性或亲水性溶剂、或形成非水溶液的溶剂，包括例如乙腈、氯仿、四氢呋喃、1,4-二噁烷、醚、己烷、甲苯、或丙酮，或其任意组合。
在各个方面中，用于催化化学反应的分子溶液可含有高达50体积％的水。在一些方面中，用于催化化学反应的分子溶液可含有高达2000mM的水。例如，在一些方面中，分子溶液可含有500mM、750mM、1000mM、1250mM、1500mM、2000mM、或大于2000mM、高达最大值50体积％的量的水。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物催化的化学反应可包括例如酯交换反应、水解反应、对映选择性(enantioselective)反应、氧化还原反应、缩合反应、聚酯合成反应、或肽合成反应，或其任意组合。例如，一方面，酯酶-聚合物缀合物例如CT-pDMAEMA可用于催化N-乙酰基L-苯丙氨酸硫代苯酯(APTE)与1-丙醇在乙腈(AN)中的酯交换，参见图5。
在各个方面中，酶-聚合物缀合物催化的化学反应显示出至少3.7min-1的kcat。在一些方面，酶-聚合物缀合物催化的化学反应显示出至少4min-1、至少5min-1、至少6min-1、至少7min-1、至少8min-1、至少9min-1、至少10min-1、至少15min-1、至少16min-1、至少18min-1、至少20min-1、至少21min-1、或至少25min-1的kcat。
在各个方面中，本发明包括催化反应的方法，其包括向容器提供含有有机溶剂或离子液体的分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液，其中所述有机溶剂或离子液体含有不多于50体积％的水作为共溶剂。分子加溶的酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，且分子加溶的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中测量的分子加溶的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。所述方法进一步包括向容器提供至少一种反应物，并进行酶-聚合物缀合物催化的反应。
在各个方面中，分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液可包括在有机溶剂或离子液体中分子溶解的酶-聚合物缀合物。例如，有机溶剂或离子液体可包括无水有机溶剂、或形成非水溶液的溶剂，包括例如乙腈、氯仿、四氢呋喃、1,4-二噁烷、醚、己烷、甲苯、或丙酮，或其任意组合。在各个方面中，溶剂可包括极性或亲水性溶剂。
在各个方面中，分子加溶的酶-聚合物缀合物可含有使用接枝自方法合成的酶-聚合物缀合物。例如，分子加溶的酶-聚合物缀合物可含有酯酶-聚合物缀合物(其包括CT-pDMAEMA缀合物)、嗜热菌蛋白酶-pOEGMA缀合物、金属蛋白酶-pOEGMA缀合物、枯草杆菌酶-离子液体聚合物缀合物、枯草杆菌蛋白酶-离子液体聚合物缀合物、或脂肪酶-pDMAA缀合物，或其任意组合。
在各个方面中，由分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液催化的反应可包括例如酯交换反应、水解反应、对映选择性反应、氧化还原反应、缩合反应、聚酯合成反应或肽合成反应，或其任意组合。
在各个方面中，由分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液催化的反应显示出至少3.7min-1的kcat。在一些方面，由分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液催化的反应显示出至少4min-1、至少5min-1、至少6min-1、至少7min-1、至少8min-1、至少9min-1、至少10min-1、至少15min-1、至少16min-1、至少18min-1、至少20min-1、至少21min-1、或至少25min-1的kcat。
在各个方面中，由分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液催化的反应显示出小于约22mM的KM值。在一些方面，由分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液催化的反应显示出小于约20mM、小于约17mM、小于约15mM、小于约12mM、或小于约10mM的KM值。
实施例
材料
在本发明的一个方面使用的材料包括来自牛胰的α-胰凝乳蛋白酶(CT)(II型)、2-溴-2-甲基丙酰基溴化物、β-丙氨酸、N-羟基琥珀酰亚胺、Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺、溴化亚铜(I)、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(HMTETA)、2-(二甲基氨基)乙基甲基丙烯酸酯(DMAEMA，使用前通过碱性氧化铝柱)、N-琥珀酰基-L-Ala-L-Ala-L-Pro-L-Phe-对硝基苯胺(nitroanilide)(Suc-AAPF-pNA)、二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)溶液、硫酸铜(II)溶液、二氯甲烷、乙酸乙酯、2-丙醇、二乙醚、和正己烷购自SigmaAldrich，不进一步纯化而使用。渗析管(分子量截留(cut off)，25、15、和1kDa(Spectra/Por,SpectrumLaboratories Inc.))购自Fisher Scientific。N-乙酰基-L-苯丙氨酸(AP)、苯硫酚(thiophenol)、氯甲酸异丁酯4,4’-二硫代二吡啶(DTDP)、三乙胺、二甲基亚砜(DMSO)和1-丙醇购自Sigma Aldrich。乙腈、二氯甲烷和乙醇购自Fisher Scientific。乙腈和1-丙醇通过在氢化钙下蒸馏而干燥，并在活性分子筛(Sigma Aldrich)上保存。DMSO通过在氢化钙下真空蒸馏而干燥，并在活性分子筛上保存。
方法
NHS-官能化的ATRP引发剂的合成过程
如下合成N-2-溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸N'-氧代琥珀酰亚胺酯。在0℃下将2-溴-2-甲基丙酰基溴化物(12.4mL,100mmol)和二氯甲烷(50mL)的混合物缓慢加入β-丙氨酸(8.9g,100mmol)和碳酸氢钠(21g,250mmol)在去离子水中的溶液(200mL)，然后将混合物在室温下搅拌2h。水相用二氯甲烷(100mL×3)洗涤，并在0℃用1.0N HC1水溶液调节至pH 2。产物用乙酸乙酯(150mL×6)提取。用MgSO4干燥有机相，并蒸发从而除去溶剂。N-2-溴-甲基丙酰基-β-丙氨酸通过重结晶从二乙醚和正己烷的混合物(1/9体积比)中分离。在0℃下将Ν,Ν'-二异丙基碳二亚胺(2.8g,22mmol)缓慢加入N-2-溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸(4.8g,20mmol)、和N-羟基琥珀酰亚胺(2.5g,22mmol)在二氯甲烷中的溶液(200mL)。将混合物在室温下搅拌4h。在滤出析出的尿素后，蒸发溶液从而除去溶剂。N-2-溴-2-甲基丙酰基-β-丙氨酸N'-氧代琥珀酰亚胺酯(1)通过重结晶从2-丙醇中纯化。通过1H NMR和IR确认化学结构。
1H NMR光谱用氧化氘(D2O),DMSO-d6和CDC13在分光光度计(300MHz,BrukerAvance)上记录。常规FT-IR光谱用Nicolet Avatar 360 FT-IR分光光度计(Thermo)获得。使用有温度控制的比色皿托架(cell holder)的UV-vis分光光度计(Lambda 2,PerkinElmer)获得UV-vis光谱，用于酶活性测定。用Laboratory Devices Mel-Temp测量熔点(mp)。通过凝胶渗透色谱(GPC)，在有数据处理器、装有三个柱(Waters UltrahydrogelLinier,500和250)的Water 2695系列上，使用含0.2体积％三氟乙酸(pH 2.5)的100mM磷酸钠缓冲液作为洗脱剂，在流速0.5mL/min下，用折光率(RI)检测器检测，估计数均和重均分子量(Mn和Mw)以及多分散指数(Mw/Mn)。聚乙二醇标准用于校准。
基质辅助的激光解吸离子化时间飞行(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight)
用Perseptive Biosystems Voyager Elite MALDI-TOF分光光度计估计ATRP CT-引发剂缀合物的分子量。
动态光散射(DLS)
在Malvern Zetasizer nano-ZS上收集DLS数据。将样品溶液的浓度保持在0.24mg/mL。在各有机溶剂(即，乙腈、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、和丙酮)中测量天然CT的流体动力学直径，参见表1。CT-pDMAEMA缀合物的流体动力学直径在各有机溶剂(即，乙腈、二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、和丙酮)中测量5次(5轮次/测量)，参见表1。
酯酶-引发剂缀合物的制备
在0℃下将CT(1.0g，含有0.56mmol胺基团)溶解在100mM磷酸钠缓冲液(pH 8.0)中。在加入NHS-官能化的TRP引发剂(619mg,1.85mmol)后，将混合物在冰箱中搅拌3h，并将CT-引发剂缀合物在冰箱中在去离子水中使用15kDa分子量截留渗析管渗析分离24h，然后冻干。
酯酶-pDMAEMA缀合物的制备
图2A和2B示出酯酶-聚合物缀合物的合成的示意图，其使用基于聚合物的蛋白质工程化(PBPE)聚合方法、ATRP和"接枝自"方法合成。使用酯酶表面引发"接枝自"技术，其中引发剂首先共价键合至酯酶(参见图2A)，然后为使用酯酶-引发剂缀合物的控制的自由基聚合物合成(参见图2B)。
将DMAEMA(169μL,1.0mmol用于样品缀合物1(C1)；337μL,2.0mmol用于C2；675μL,4.0mmol用于C3；1.35mL,8.0mmol用于C4)和CT-引发剂缀合物(100mg,0.046mmol引发剂基团)在去离子水中的溶液(30mL)密封并在冰浴中吹氩50min。然后在吹氩气下将HMTETA(55μL,0.2mmol)和Cu(I)Br(29mg,0.2mmol)在去离子水中的脱氧催化剂溶液(10mL)加入缀合反应器。将混合物密封并在4℃下搅拌18h从而避免DMAEMA的自聚合。将CT-pDMAEMA缀合物在冰箱中使用25kDa分子量截留渗析管在去离子水中渗析分离24h，然后冻干。
接枝的pDMAEMA从缀合物的裂解
将CT-pDMAEMA缀合物(10-20mg)和6N HC1水溶液(2至3mL)置于水解管中。在3个冷冻-抽吸-融化(freeze-pump-thaw)循环后，在真空中在110℃下进行水解24h。将裂解的聚合物使用1kDa分子量截留渗析管在去离子水中渗析分离，然后冻干。通过GPC测量裂解的聚合物的分子量。
制备的缀合物的分子量的测定
从来自缀合物的裂解的pDMAEMA的估计分子量计算制备的CT-pDMAEMA缀合物的分子量。也进行二辛可宁酸蛋白质分析(Bicinchoninic Acid Protein Assay,BCA)和吸收分析从而测定缀合物的分子量。
如上所述在水性条件下使用引发剂和ATRP，用相对窄的分子量分布合成致密(dense)CT-pDMAEMA缀合物。在低于pH 8下相比于天然CT，CT-pDMAEMA缀合物具有更高的相对酶活性。实际上，在pH 5下缀合物具有比天然酶高十倍的酶活性。达到了13个潜在位点中12个修饰的CT酶的近饱和缀合。这些结果表明高密度聚合物缀合是可实现的，且使用响应聚合物(responsive polymer)的缀合物可影响酶性能。
酯酶-聚合物缀合物、CT-pDMAEMA的溶解度
为了得到具有增加在有机溶剂中的溶剂化的最大潜能的最稳定的酶-聚合物缀合物，我们检查了所制备的最大CT-pDMAEMA缀合物在乙腈中的溶解度和活性。该缀合物由各自平均摩尔质量为23.1kDa的12个pDMAEMA聚合物链围绕的CT核构成。缀合物在水介质中的流体动力学直径(Dh)为约34nm，生物缀合物的总摩尔质量为305kDa。
在检查CT-pDMAEMA缀合物在无水环境中的活性之前，测定了聚合物缀合对缀合物在乙腈中以及在二氯甲烷、氯仿、四氢呋喃、和丙酮中的溶解度的影响。
使用动态光散射(DLS)在乙腈/水/丙醇混合物中测量合成的CT-pDMAEMA缀合物的流体动力学直径值Dh。图3A和3B分别示出合成的CT-pDMAEMA缀合物在乙腈/水和乙腈/丙醇中的测量的流体动力学直径值Dh。图3A示出CT-pDMAEMA的流体动力学直径(Dh)在固定的丙醇浓度(500mM)下与水含量的相关性。图3B示出CT-pDMAEMA的流体动力学直径(Dh)在固定的水浓度(1000mM)下与丙醇含量的相关性。将CT-pDMAEMA缀合物以浓度0.24mg/mL溶解在乙腈中，并在25℃下使用动态光散射测定Dh。对于各有机介质条件，CT-pDMAEMA Dh与水性条件中的相等，表明CT-pDMAEMA以分子级(molecular scale)容易地溶解在基本无水的乙腈中。
如表1所示，在与针对酶-聚合物缀合物所描述的相同条件下的天然CT的流体动力学直径研究，由于天然酶不溶于乙腈，CT-pDMAEMA如所期望的形成聚集体。还发现CT-pDMAEMA缀合物在二氯甲烷中分子溶解，并比天然CT在氯仿、四氢呋喃、或丙酮中更可溶(参见表1)。有趣的是，当在恒定水含量(1000mM)下丙醇的浓度增加时，CT-pDMAEMA缀合物的尺寸增加，表明聚合物链更加延长。
图4示出在乙腈中酶-聚合物缀合物浓度对浊度(在500nm下的吸光度)的影响。如图4和表1所示，在各CT-pDMAEMA缀合物浓度下，浊度值比所观察的天然CT在0.02mg/mL下的浊度值低。所观察的CT-pDMAEMA缀合物的浊度测量表明pDMAEMA与CT的共价缀合极大地增加了CT在乙腈中的溶解度。例如，如图4所示，甚至在比天然CT高约10倍的浓度下，CT-pDMAEMA缀合物在乙腈中仍不形成聚集体。
表1：CT和CT-pDM AEMA在有机介质中的溶解度
通过测量有机介质中的CT颗粒悬浮液的浊度和数均流体动力学直径(Dh)来测定天然CT(0.02mg/mL)和CT-pDMAEMA(0.24mg缀合物/mL，0.02mg酶/mL)的对比溶解度(comparative solubility)。
CT-pDMAEMA缀合物在催化作用中的动力学
在无水乙腈中检测CT聚合物缀合物催化的酯交换和APTE的水解的动力学。为了检测有机介质中"生长自"CT-pDMAEMA缀合物的ATRP的行为，合成了CT的硫酯(thioester)底物APTE。
APTE和N-乙酰基L-苯丙氨酸丙酯(APPE)的合成
从N-乙酰基-L-苯丙氨酸和苯硫酚合成了酯交换底物APTE。在0℃下将氯甲酸异丁酯(1.3mL,9.7mmol)缓慢加入N-乙酰基-L-苯丙氨酸(2.0g,9.7mmol)和三乙胺(1.5mL,9.8mmol)在二氯甲烷中的溶液(100mL)中，并将反应溶液在室温下搅拌30min。将苯硫酚(1.0mL,9.6mmol)在二氯甲烷(10mL)中的混合物加入反应混合物中。搅拌30min后，用0.1ΝHC1水溶液(50mL×2)、饱和NaHCO3水溶液(50mL×2)和饱和NaCl水溶液(50mL×2)洗涤混合物。有机相经无水MgSO4干燥并蒸发从而移除二氯甲烷。通过乙醇和水(2：1体积比)的重结晶来分离APTE；产量2.5g(86％)，mp 136-138℃(lit.134-136℃)。1H NMR(300MHz,CDC13)δ2.02(s,3H,乙酰基),3.19(d,2H,J＝6.6Hz,CH2 β),5.13(td,1H,J＝6.6和8.4Hz,CHα),5.92(宽峰d,1H,J＝8.4Hz,酰胺质子),7.19-7.45(m,10H,苯基)ppm。
根据以上提及的步骤从N-乙酰基-L-苯丙氨酸和1-丙醇合成APPE。通过使用氯仿作为洗脱剂的硅胶上的柱色谱(70-230目,Sigma Aldrich)来分离获得的APPE。合成的APPE用作HPLC研究的校准标准。1H NMR(300MHz,CDC13)δ0.94(t,3H,J＝7.5Hz,OCH2CH2CH3),1.65(m,2Η,OCH2CH2CH3),2.01(s,3H,乙酰基),3.15(d,2H,J＝6.9Hz,CH2 β),4.09(t,2Η,J＝6.9Hz,OCH2CH2CH3),4.90(m,1H,CHα),5.93(宽峰d,1Η,J＝7.8Hz,酰胺质子),和7.11-7.34(m,5H,苯基)ppm.
酯交换和水解
图5示出通过CT-pDMAEMA催化的APTE与1-丙醇在乙腈(AN)中的酯交换所生成的APPE的化学反应，以及随后的用来量化产物形成的苯硫酚与DTDP的反应的示意图。图6示出酯酶-pDMAEMA缀合物在图5的化学反应中的催化活性的图示。
回到图5，CT-pDMAEMA缀合物还催化APTE的水解，得到N-乙酰基苯丙氨酸(AP)。作为酯交换和水解反应两者的结果，释放苯硫酚，然后用使用DTDP的比色分析来检测和量化。
通过比色方法测量酯交换和水解活性
APTE通过CT-pDMAEMA的酯交换和水解的比色分析在DTDP试剂的存在下进行。通过将APTE(在干燥的乙腈中的0-500μL 200mM，0-100mM)加入干燥乙腈(0-500μL)中来制备底物溶液。然后将底物溶液(500μL)加入在干燥乙腈中的500μL CT-pDMAEMA(0.22mg/mL(0.018mg CT/mL)[E]0＝0.7M)、DTDP(0.22mg/mL,[DTDP]0＝0.98mM)、干燥的1-丙醇(0-414μL/mL,[ProOH]0＝0-5000mM)和水(10-30μL/mL,[水]＝500-1500mM)的溶液中。30℃下APTE的酯交换和水解的初始速率通过使用UV-vis分光光度计记录324nm(ξ324＝11980M-1cm-1)下吸收的增加来监测。
米-曼氏参数(Vmax,kcat,KM)通过对底物浓度的非线性曲线使用Enzfitter软件测定(如图7A和7B所示)。更具体地，图7A和7B提供如通过APTE对初始速率图的米-曼氏曲线拟合所计算的米-曼氏参数(Vmax,kcat,KM)。图7A所示的曲线表明在固定的丙醇浓度500mM下米-曼氏参数与水浓度的相关性。在图7A中，空心方形表示1500mM水，空心菱形表示1250mM水，空心圆形表示1000mM水，空心三角形表示750mM水，星号表示500mM水。图7B所示曲线表明在固定的水浓度1000mM下米-曼氏参数与丙醇浓度的相关性。在图7B中，空心三角形表示5000mM丙醇，空心方形表示2500mM丙醇，空心菱形表示1000mM丙醇，空心圆形表示500mM丙醇，星号表示0mM丙醇。
具体地，研究了水和丙醇浓度两者对反应速率(kcat)和底物亲和性(KM)的影响。对于在有机溶剂中悬浮的天然酶，相比于观察到的CT-pDMAEMA催化反应的反应速率(kcat)和底物亲和性(KM)的结果，kcat通常下降超过3个数量级，KM增加至少3个数量级。因为苯硫酚是酯交换和水解反应的副产物，将DTDP用于量化产物形成。因此，观察到的所得表观kcat和KM值对应于反应中底物消耗的总速率。
本发明人注意到出乎意料的结果，并很惊讶地观察到乙腈可溶的CT-pDMAEMA缀合物的水样(water-like)KM值。因为未观察到饱和，未精确测定有机溶剂中天然酶的KM值，因此结果是出乎意料和令人惊讶的。针对APTE与乙腈可溶的CT-pDMAEMA缀合物的亲和性的非常低的KM值也对增加水浓度不敏感。因此，CT-pDMAEMA催化的APTE降解的总转换数(totalturnover number)(kcat)随水含量增加而增加(参见表2)。
表2.水和丙醇浓度对CT-pDMAEMA催化的APTE的酯交换和水解的表观米-曼氏参数的影响。
使用DTDP计算表2米-曼氏参数从而量化在30℃下乙腈中不同丙醇浓度下随时间变化的产物形成。底物(APTE)浓度在0-100mM变化。DTDP与水解和酯交换产物两者反应；因此，这些值描述了合并的速率。
天然CT活性
天然CT活性在有1000mM丙醇和1000mM水的干燥乙腈中测量。使用的底物(APTE)浓度为20mM。初始速率使用量热法在30℃下测量5分钟。在与CT-pDMAEMA相等的酶浓度下，天然CT不具有可检测的活性。
如表3所示，即使当增加水含量时，在相等酶浓度下天然CT也不显示酯交换活性。
表3.乙腈中相对CT活性的测定
1未检测到产物形成。
当将天然CT浓度增加10倍(从0.02mg/mL至0.2mg/mL)，天然CT活性(1.3±0.1μΜ/min·mg CT)仍比CT-pDMAEMA活性(170±20μΜ/min·mg CT)低2个数量级。当水含量增加，CT-pDMAEMA活性的增加可能是由于更多的结构挠性。此前，在有机溶剂中水浓度增加的离子溶液中测量不溶性CT的酯交换和水解活性，酶显示出钟形活性曲线。出乎意料地，本发明人发现当水浓度增加，酶-聚合物缀合物简单地增加在乙腈中的活性(表2)。使用“接枝自”ATRP生成从而围绕酶的致密的pDMAEMA壳可保护CT免于在足够高的水浓度下变性。CT-pDMAEMA活性和APTE底物亲和性两者随丙醇浓度增加而减小(参见表2)。作为丙醇与连接至酶表面的聚合物链的直接相互作用的结果，酶活性合理地(plausibly)减小。关于丙醇对溶解在乙腈中的这些蛋白质-聚合物缀合物尺寸的影响的观察支持该发现。
使用RP-HPLC测量酯交换和水解活性
水和丙醇浓度对CT-pDMAEMA催化的酯交换和水解的单个速率的影响使用反相高压液相色谱(RP-HPLC)测定。
将APTE(60mg,20mM)加入在螺纹盖玻璃瓶中的具有不同量的干燥1-丙醇(0-5000mM)和水(500-1500mM)的CT-pDMAEMA(2.2mg,0.7μΜCT)在干燥的乙腈中的溶液(10mL)中，并在30℃下温浴。每隔1至2h移去等分试样，并通过与AP和APPE的校准比较来由线性渐进(linear progress)测定初始速率。
APPE(酯交换反应)和AP(水解反应)产物形成的初始速率分别量化。反应的初始速率使用500-1500mM水和500-5000mM丙醇以恒定底物(APTE)浓度20mM来量化(参见图7A和7B)。
图8A示出固定的丙醇浓度500mM下，CT-pDMAEMA催化的酯交换和水解初始速率与水含量的相关性。图8B相似地示出固定的水浓度1000mM下，CT-pDMAEMA催化的酯交换和水解初始速率与丙醇含量的相关性。在图8A和8B中，酯交换速率由空心圆形表示，水解速率由空心三角表示，酯交换速率/水解速率之比由实心方形表示。30℃下乙腈中CT-pDMAEMA(0.7μΜ)催化的酯交换和水解的速率通过使用RP-HPLC测量的随时间变化的产物形成来计算。
如图8A所示，随水含量增加，酯交换和水解两者的初始速率增加。相反地，如图8B所示，随丙醇浓度增加，两个反应的活性降低。因为可从各反应分别量化产物形成，因而计算了酯交换与水解之比。在各浓度下，酯交换产物形成速率比水解的更高。然而，在超过1000mM的水浓度下，CT-pDMAEMA催化的水解速率比CT-pDMAEMA催化的酯交换增加得更快。因此，当改变水含量时，我们得出结论为较佳水浓度为1000mM。最后，我们检查了丙醇浓度对酶活性的影响。使用较佳水含量(1000mM)，我们发现丙醇浓度2500mM导致最高的酯交换与水解之比，虽然酯交换的最高活性在1000mM丙醇处。
总而言之，我们合成了在乙腈中显示剧烈增加的活性和分子溶解的酶-聚合物缀合物(例如CT-pDMAEMA缀合物)。虽然其他策略已得到了酶活性，这些方法不享有酶在有机溶剂中分子溶解的优点。酶-聚合物缀合物催化的酯交换和水解的速率与水浓度成正比，与丙醇浓度成反比。另外，酶-聚合物缀合物显示出与APTE的良好的底物结合(KM低至17mM)，并具有比不可溶的天然酶高很多数量级的特定活性(峰值活性330μΜ/min/mg酶)。天然CT在乙腈中在相等的酶和底物浓度下不具有可检测活性。CT-pDMAEMA缀合物具有与天然酶相似的水样KM。活性酶在用于有机合成的有机溶剂中的分子溶解代表针对非水性酶学应用的重要步骤。
应理解，本公开不限于本文所公开的各个方面或实施方案，且旨在涵盖在如权利要求所限定的本发明的精神和范围内的修改。

Claims (16)

1.一种非水溶液，其含有：
有机溶剂或离子液体，其中所述有机溶剂或所述离子液体含有作为共溶剂的不多于50体积％的水；和
在所述有机溶剂或所述离子液体中分子溶解的酶-聚合物缀合物，
其中所述酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，和
其中在所述非水溶液中的所述分子溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中分子溶解的所述酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍。
2.根据权利要求1所述的非水溶液，其中所述酶-聚合物缀合物包括酯酶-聚合物缀合物。
3.根据权利要求1所述的非水溶液，其中所述有机溶剂或所述离子液体含有大于50体积％的乙腈、氯仿、四氢呋喃、1,4-二噁烷、醚、己烷、甲苯、或丙酮，或其任意组合。
4.根据权利要求1所述的非水溶液，其中所述有机溶剂包括无水有机溶剂。
5.根据权利要求1所述的非水溶液，其中所述酶-聚合物缀合物包括：包含胰凝乳蛋白酶CT-pDMAEMA缀合物的酯酶-聚合物缀合物、金属蛋白酶-pOEGMA缀合物、枯草杆菌酶-离子液体聚合物缀合物、或脂肪酶-pDMAA缀合物，或其任意组合。
6.根据权利要求1所述的非水溶液，其中所述分子溶解的酶-聚合物缀合物含有能够催化以下反应的酶：酯交换反应、水解反应、对映选择性反应、氧化还原反应、缩合反应、聚酯合成反应、或肽合成反应、或其任意组合。
7.一种催化反应的方法，其包括：
在有机溶剂或离子液体中溶解酶-聚合物缀合物从而形成所述酶-聚合物缀合物在所述有机溶剂或所述离子液体中的分子溶液，
其中所述酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，和
其中在所述分子溶液中的所述溶解的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中分子溶解的所述酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍；和
在所述有机溶剂或所述离子液体中进行由所述酶-聚合物缀合物催化的反应。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述有机溶剂或所述离子液体包括乙腈、氯仿、四氢呋喃、1,4-二噁烷、醚、己烷、甲苯、或丙酮，或其任意组合。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述有机溶剂包括无水有机溶剂。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述酶-聚合物缀合物包括：包含胰凝乳蛋白酶CT-pDMAEMA缀合物的酯酶-聚合物缀合物、金属蛋白酶-pOEGMA缀合物、枯草杆菌酶-离子液体聚合物缀合物、或脂肪酶-pDMAA缀合物，或其任意组合。
11.根据权利要求7所述的方法，其中所述反应包括酯交换反应、水解反应、对映选择性反应、氧化还原反应、缩合反应、聚酯合成反应、或肽合成反应，或其任意组合。
12.一种催化反应的方法，其包括：
向容器提供含有有机溶剂或离子液体的分子加溶的酶-聚合物缀合物的非水溶液，
其中所述有机溶剂或所述离子液体含有作为共溶剂的不多于50体积％的水，
其中所述分子加溶的酶-聚合物缀合物含有生长自酶-引发剂缀合物的共价键合的聚合物链，和
其中所述溶液中所述分子加溶的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径小于在非变性pH下在水中测量的所述分子加溶的酶-聚合物缀合物的流体动力学直径的两倍；
向容器提供至少一种反应物；和
进行由所述酶-聚合物缀合物催化的反应。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述有机溶剂或所述离子液体包括乙腈、氯仿、四氢呋喃、1,4-二噁烷、醚、己烷、甲苯、或丙酮，或其任意组合。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述有机溶剂包括无水有机溶剂。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述分子加溶的酶-聚合物缀合物包括：包含胰凝乳蛋白酶CT-pDMAEMA缀合物的酯酶-聚合物缀合物、金属蛋白酶-pOEGMA缀合物、枯草杆菌酶-离子液体聚合物缀合物、或脂肪酶-pDMAA缀合物，或其任意组合。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述反应包括酯交换反应、水解反应、对映选择性反应、氧化还原反应、缩合反应、聚酯合成反应、或肽合成反应，或其任意组合。
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