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CN107406832A - 具有受控铜离子的制备方法 - Google Patents

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CN107406832A
CN107406832A CN201680017702.8A CN201680017702A CN107406832A CN 107406832 A CN107406832 A CN 107406832A CN 201680017702 A CN201680017702 A CN 201680017702A CN 107406832 A CN107406832 A CN 107406832A
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organism
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CN201680017702.8A
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山本圣子
土井广幸
寺岛勇
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Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供了一种细胞培养方法，其包括将含有细胞的种子培养基添加到初始培养基中并开始在初始培养基中培养细胞，其中初始培养基中具有添加到其中的源自生物体的培养基添加剂，且通过在细胞培养开始时初始培养基的铜含量来控制制备的蛋白质中C‑末端酰胺化种类的量。

Description

具有受控铜离子的制备方法
技术领域
本发明涉及源自生物体的培养基添加剂在制备抗体药物中的用途，并且涉及通过利用关于添加剂的铜含量的信息来稳定抗体药物的质量的方法。
背景技术
在培养动物细胞以获得动物细胞产生的天然蛋白质中或在培养用编码所需蛋白质的基因转染的动物细胞以获得所需蛋白质等中，不仅基础营养素(诸如，盐、糖、氨基酸和维生素)而且源自生物体的培养基添加剂通常被添加到用于增殖动物细胞的特定目的的培养基中，从而充分地防止在培养的早期阶段细胞存活比率上的显著下降以维持培养液中活细胞的数量并使其能够延长培养。此外，从制造成本的角度出发，蛋白质制备的产量优选为尽可能的高，为此，有时进行补料分批培养。
同时，谈及通过基因重组制备的蛋白质(诸如，抗体药物)，理论上它们应该具有从基因序列预测的氨基酸序列，但实际上它们可能包括各种非均一的成分。这是由于已知或新的体内(转录后(翻译))修饰或物理化学(非酶)反应(Harris R J.，J ChromatogrA.1995；705：129-134)。这些反应进程的变化将自然导致蛋白质中非均一组分含量的变化。作为活性药物成分制备的蛋白质中的非均一组分的变化优选为尽可能的小。
在抗体药物中含有的非均一成分中，在重链的C-末端处酰胺化的分子种类是已知的(Tsubaki M et al.，Int J Biol Macromol.2013 Jan；52：139-47；WO2005/090405)。虽然对于处于C-末端的抗体药物的酰胺化反应仍未阐明其反应机理，但已知在用于通过培养动物细胞制备抗体药物的培养基中的铜含量与所制备的抗体药物中C-末端酰胺化种类的量呈正相关(Kaschak T.et al.，mAbs，3：6，577-583，2011)。
然而，完全不清楚的是当将源自生物体的培养基添加剂添加到培养基中并且通过培养制备抗体时，添加剂的制备在批次之间铜含量上的差异如此之大，以至于在制备的抗体中C-末端酰胺化种类副产物的含量由于该批次-批次的差异而不同。
现有技术文献
专利文献
专利文件1：WO2005/090405，标题为“Subtypes of humanized antibodyagainstinterleukin-6receptor”。
非专利文献
非专利文件1：Harris R J.“Processing of C-terminal lysineand arginineresidues of proteins isolated from mammalian cell culture”J ChromatogrA.1995；705：129-134。
非专利文件2：Tsubaki M，Terashima I，Kamata K，Koga A“C-terminalmodification of monoclonal antibody drugs：amidated species as a generalproduct-related substance”Int J Biol Macromol.2013 Jan；52：139-47。
非专利文件3：Kaschak T.et al.“Characterization of the basic chargevariants of a human IgG1：effect of copper concentration in cell culturemedia”mAbs，3：6，577-583，2011。
发明内容
技术问题
本发明人首先确定了源自生物体的培养基添加剂的制备涉及批次之间的差异，该批次之间的差异极难控制在有限范围内，并因此导致了在使用该添加剂制备的抗体中C-末端酰胺化种类的质量的变化。由于抗体药物理想地在其非均一性上具有最小的可能变化，本发明人对控制抗体制备中C-末端酰胺化种类的量的变化的方法进行了深入研究。
因此，本发明的目的是提供一种方法以通过在培养基中培养动物细胞来控制制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量，其中源自生物体的培养基添加剂已添加到所述培养基中。
问题的解决方案
作为解决上述问题的深入研究的结果，本发明人开发了一种新颖的细胞培养方法，其特征在于测量源自生物体的培养基添加剂的各个生产批次的铜含量并且将由所测量的铜含量作为指标而选出的批次适当地添加到培养基中，并且实现了本发明。
本发明总结如下。
(1)一种细胞培养方法，其包括将含有细胞的种子培养基添加到初始培养基中并开始在所述初始培养基中培养所述细胞，其中所述初始培养基中添加有源自生物体的培养基添加剂，且在细胞培养开始时所述初始培养基的铜含量不超过0.02ppm。
(2)根据(1)所述的方法，其中在细胞培养开始时所述初始培养基的所述铜含量不超过0.015ppm。
(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中铜含量不超过1ppm的源自生物体的培养基添加剂已被添加到所述初始培养基。
(4)根据(3)所述的方法，其中铜含量不超过1ppm的源自生物体的培养基添加剂已被添加到将要添加到所述初始培养基中的所述种子培养基。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中所述培养方法为分批培养、补料分批培养、连续培养、分批培养或半分批培养。
(6)根据(1)至(4)中任一项所述的方法，其中所述培养方法为补料分批培养。
(7)根据(6)所述的方法，其中铜含量不超过3ppm的源自生物体的培养基添加剂已被添加到将要添加到所述初始培养基中的补料分批培养基。
(8)根据(6)或(7)所述的方法，其中源自所述补料分批培养基的所述铜离子在培养结束时在所述培养基中以不超过0.08ppm存在。
(9)根据(6)至(8)中任一项所述的方法，其中在培养结束时在所述培养基中铜离子以不超过0.1ppm存在。
(10)根据(1)至(9)中任一项所述的方法，其中所述源自生物体的培养基添加剂是动物源性或植物源性的培养基添加剂。
(11)根据(1)至(9)中任一项所述的方法，其中所述源自生物体的培养基添加剂是鱼源性的培养基添加剂。
(12)根据(1)至(9)中任一项所述的方法，其中所述源自生物体的培养基添加剂是鱼肉水解产物。
(13)根据(1)至(12)中任一项所述的方法，其中将要添加到所述培养基的所述源自生物体的培养基添加剂已预先测量所述铜含量。
(14)根据(1)至(13)中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
(15)根据(14)所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
(16)根据(15)所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
(17)根据(1)至(16)中任一项所述的方法，其中，所述细胞已用编码所需蛋白质的基因转染。
(18)根据(17)所述的方法，其中所述所需蛋白质是抗体。
(19)根据(18)所述的方法，其中所述抗体是托珠单抗。
(20)一种使用初始培养基的细胞培养方法，其中已将具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂添加到所述初始培养基。
(21)根据(20)所述的方法，其中所述培养方法为分批培养、补料分批培养、连续培养、分批培养或半分批培养。
(22)根据(20)所述的方法，其中所述培养方法为补料分批培养。
(23)一种细胞培养方法，其包括以下步骤：
1)预先测量将要添加到培养基中的源自生物体的培养基添加剂中的铜含量；和
2)选择铜含量不超过1ppm的测量的添加剂并将其添加到初始培养基中。
(24)一种补料分批细胞培养方法，其包括以下步骤：
1)预先测量将要添加到培养基中的源自生物体的培养基添加剂中的铜含量；
2)选择铜含量不超过1ppm的测量的添加剂并将其添加到种子培养基或初始培养基中。
3)从所述测量的添加剂中选择铜含量不超过3ppm的添加剂并将其添加到补料分批培养基中。
(25)一种制备蛋白质的方法，其使用根据(1)至(24)中任一项所述的培养方法。
(26)一种制备含有所需蛋白质的药物组合物的方法，其包括以下步骤：
1)通过根据(25)所述的制备方法制备所述所需的蛋白质；和
2)通过将步骤1)中制备的所述所需蛋白质与药学上可接受的载体和添加剂混合并且配制来制备所述药物组合物。
(27)一种通过使用根据(1)至(24)中任一项所述的培养方法来抑制所需蛋白质中C-末端酰胺化种类的产生的方法。
(28)根据(27)所述的方法，其中所述所需蛋白质是抗体。
发明的有利效果
根据本发明，预先测量添加到用于补料分批培养的种子培养基、初始培养基或补料分批培养基中的源自生物体的培养基添加剂的铜含量，据此将各添加剂添加到适当的培养基中，从而可以控制制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量的变化。
附图的简要说明
图1显示了非均一组分峰(Sub-1峰)的含量(％)与各水解产物批次的铜含量(ppm)之间的相关性，所述非均一组分峰含有通过离子交换色谱法发现的抗体蛋白的C-末端脯氨酰胺种类，所述抗体蛋白产生于培养基中培养的CHO细胞，其中已添加了15g/L的多批次商业鲣鱼(bonito)水解产物。
图2显示了在向培养基中添加铜时制备的抗体蛋白中Sub-1峰的含量(％)的增加，水平轴上的Cu的值(ppm)表示添加的铜的总含量。
图3显示了通过培养获得的抗体蛋白中的Sub-1峰的含量(％)的平均值，对于种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的每一者所述培养使用了高铜含量或低铜含量的鲣鱼水解产物。
图4显示了通过多元回归分析获得的回归表达式，其中在培养基中由CHO细胞产生的抗体蛋白中的Sub-1峰含量(％)为客观变量，并且添加到种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的鲣鱼水解产物中的铜含量为解释变量，其中通过补料分批培养来培养CHO细胞，所述补料分批培养使用了以3g/L添加鲣鱼水解产物的种子培养基、以15g/L添加鲣鱼水解产物的初始培养基和以75g/L添加鲣鱼水解产物的补料分批培养基。由于在分析中种子培养基中的铜含量与Sub-1峰的含量之间没有观察到统计学上的显著差异，所以在不使用种子培养基中的铜含量的情况下计算图4中的回归表达式。
实施方案描述
在下面的页面中，详细描述了实现本发明的实施方案。
本发明涉及一种培养方法以及使用该培养方法通过细胞制备蛋白质的蛋白质制备方法，所述培养方法的特征在于将具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂添加到用于细胞培养的培养基中。
细胞培养的方法通常分为分批培养、连续培养和补料分批培养。
在分批培养中，将少量种子培养液添加到培养基中，并且在不用新鲜培养基补充培养基或不排出培养液的情况下增殖细胞。
在连续培养中，在培养期间连续添加和排出培养基。灌注培养也包括在连续培养中。
补料分批培养是分批培养与连续培养的混合，并且也称为半分批培养；如在连续培养中在培养期间连续或连贯添加培养基，但不进行培养液的连续排出。在补料分批培养中添加的培养基(以下称为“补料分批培养基”)不需要与培养中已使用的培养基(以下称为“初始培养基”)相同，且可添加不同培养基或者可仅添加指定的成分。
在本发明中，可以采用分批培养、连续培养和补料分批培养中的任一种，优选补料分批培养。
根据通过细胞培养制备所需蛋白质的常规程序，将含有细胞的种子培养基以指定量添加到初始培养基中，并培养细胞。此外，为了增加所需蛋白质的产量，在培养期间添加补料分批培养基。
种子培养基是指这样的培养基：在其中产生所需蛋白质的细胞(即，工作细胞库)被广泛培养直到获得必需的细胞计数以转移到培养基(初始培养基)中用以最终制备所需蛋白质。初始培养基通常是指这样的培养基：在其中培养细胞以制备所需蛋白质且其用于培养细胞的第一阶段中。补料分批培养基通常是这样的培养基：其添加到进行初始培养的培养基中。补料分批培养基可以以两份或更多份分开的部分添加。或者，其可连续地或间歇地添加。
在本发明中，将细胞在种子培养基中传代培养，然后将指定量的含有细胞的种子培养基添加到初始培养基中，在其中培养细胞以产生所需蛋白质。任选地，补料分批培养基可一次或多次添加到进行培养的培养基中。此处，种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的至少一者添加有源自生物体的培养基添加剂，且优选的是已将源自生物体的培养基添加剂添加到所有的培养基中。
在本发明的一个实施方案中，将源自生物体的培养基添加剂添加到所有种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中。在本发明的另一个实施方案中，源自生物体的培养基添加剂可仅添加到初始培养基中。在本发明的另一个实施方案中，源自不同生物物种的培养基添加剂可添加到种子培养基和初始培养基中。
为了给出示例性培养方法，在初始培养基中开始细胞培养，并进一步将补料分批培养基至少一次添加到进行细胞培养的培养基中，其中将具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂添加到初始培养基和补料分批培养基中的至少一者。
可以采用的另一种示例性培养方法的特征在于，在已添加有具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂的培养基中开始细胞培养，并进一步将具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂至少一次添加到进行细胞培养的培养基中。该培养方法是补料分批培养的一个实施方案(涉及仅添加指定的成分)。
虽然添加到初始培养基的种子培养基的量与初始培养基的量之间的比率没有特别限制，但是相对于作为整体的初始培养基的体积，种子培养基的体积比的范围通常为0.1至1，优选为0.2至0.6，且更优选为0.3至0.5。虽然初始培养基的量与补料分批培养基的量(即，在进行一次培养中添加到初始培养基中的补料分批培养基的总量)之间的比率也没有特别限制，但是相对于作为整体的初始培养基的体积，补料分批培养基的体积比的范围通常为0.01至10，优选为0.1至1的范围内，且更优选为0.2至0.3。补料分批培养基可连续地或连贯地添加。当补料分批培养基连贯添加时，添加量没有特别限制，且补料分批培养基可一次添加或者以两份或更多份分开的部分添加。
本发明的显著特征在于，预先测定添加到种子培养基、初始培养基和/或补料分批培养基中的源自生物体的培养基添加剂的铜含量。添加到种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的各个生源自生物体的培养基添加剂可来自相同的生产批次或不同的生产批次。如果需要，来自不同生产批次的源自生物体的培养基添加剂可以混合使用。由于在制备培养基之前测量了源自生物体的培养基添加剂中的铜含量，因此添加到培养基中的各自批次的源自生物体的培养基添加剂所用的方式(例如，在种子培养基中、初始培养基、补料分批培养基中或者混合使用)可以在培养基制备之前根据测量的铜含量来确定。
在下文中，添加到种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的各自的源自生物体的培养基添加剂有时被称为用于种子培养基的源自生物体的培养基添加剂、用于初始培养基的源自生物体的培养基添加剂和用于补料分批培养基的源自生物体的培养基添加剂。
本发明人研究了添加到种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的各自的源自生物体的培养基添加剂中的铜含量与制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量是如何相关的。结果是，源自生物体的培养基添加剂中的铜含量在添加到初始培养基中时比在添加到种子培养基和补料分批培养基中时对制备的蛋白质中的C-末端酰胺化种类的量产生了更大的影响。因此，为了控制待制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量的变化，理想的是用于初始培养基的源自生物体的培养基添加剂的铜含量应以比用于种子培养基或补料分批培养基的源自生物体的培养基添加剂的铜含量更小的程度变化。初始培养基中源自生物体的培养基添加剂中的铜含量不高于指定浓度也是理想的。
本发明的一个示例性实施方案是通过培养来制备蛋白质的方法，所述培养使用种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的一种或这些培养基中的两种或多种，其中向种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的任一者中添加具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂，所述铜含量不高于大约3ppm。本发明的优选示例性实施方案是一种通过培养来制备蛋白质的方法，所述培养使用种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的一种或这些培养基中的两种或多种，其中向至少初始培养基中添加具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂，所述铜含量不高于1ppm，优选不高于0.8ppm，且更优选不高于0.7ppm。
简而言之，理想的是对于初始培养基，源自生物体的培养基添加剂的铜含量不高于1ppm，优选不高于0.8ppm，更优选不高于0.7ppm。
对于种子培养基，源自生物体的培养基添加剂的铜含量也理想的是不高于1ppm，优选不高于0.8ppm，更优选不高于0.7ppm。
对于补料分批培养基的源自生物体的培养基添加剂，其铜含量理想地不高于3ppm。
为了测量铜含量，可以使用本领域技术人员已知的任何方法。例如，可以通过使用高频电感耦合等离子体作为光源的发射光谱光度分析来进行测量。
在本发明的方法中，理想的是除了将要添加的源自生物体的培养基添加剂以外的培养基成分的铜含量的变化小于将要添加的源自生物体的培养基添加剂的铜含量的变化。或者，理想的是除了将要添加的源自生物体的培养基添加剂以外的培养基成分比将要添加的源自生物体的培养基添加剂具有更少的铜含量。
当将要添加源自两种或多种生物体的培养基添加剂时，可以使用源自已知具有一个或多个低铜含量的一个或多个生物体的一个或多个培养基添加剂，而不必费力测量铜含量。
根据本发明，测量将要添加到培养基中的至少一种源自生物体的培养基添加剂的铜含量，这使得控制待制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量成为可能。
本发明的另一个示例性实施方案是一种培养方法，其中在初始培养基中开始细胞培养，并进一步将补料分批培养基至少一次添加到进行细胞培养的培养基中，其中已将具有测定的铜含量的源自生物体的培养基添加剂分别添加到初始培养基和补料分批培养基中，以便在细胞培养开始或培养结束时培养基中铜离子的量被调节至不高于指定浓度。例如，在细胞培养开始时，初始培养基的铜含量优选为不高于0.02ppm，更优选为不高于0.015ppm；在培养结束时，培养基优选含有不高于0.1ppm的铜离子；源自补料分批培养基的铜离子的量优选不高于0.08ppm。
用于本发明的源自生物体的培养基添加剂可例举为源自许多动物和植物以及微生物(包括酵母)的培养基添加剂；具体实例包括源自哺乳动物(诸如，牛、猪和绵羊)的培养基添加剂，源自鱼类(诸如鲣鱼、沙丁鱼(sardine)和鳕鱼(cod))的培养基添加剂，源自植物(诸如，小麦、大豆和水稻)的培养基添加剂，以及源自微生物(诸如，酵母)的培养基添加剂；优选的是源自鱼类或植物的添加剂，且特别优选的是来自鲣鱼、小麦、大豆和酵母的添加剂。
在优选的实施方案中，源自动物或植物的酶分解产物可用作本发明中的源自生物体的培养基添加剂。酶分解产物可以通过以下方法获得：所述方法包括将动物或植物组织酶水解为起始原料，并通过离心、过滤等纯化得到的分解产物。常见的使用形式是喷雾干燥的粉末。例如，对于将鱼类用作起始原料的酶分解产物；分解产物可通过标题为“用于动物细胞培养基的添加剂以及用其制备蛋白质的方法”的日本专利号3822137所描述的方法制备。
可用于本发明的源自动物或植物的酶分解产物可具体例举为源自哺乳动物(诸如，牛、猪和绵羊)的那些，源自鱼类(诸如鲣鱼、沙丁鱼和鳕鱼)的那些，以及源自植物(诸如，小麦、大豆和水稻)的那些；优选的是源自鱼类或植物的那些，且特别优选的是来自鲣鱼、小麦和大豆的那些。
此外，从后述的实施例可明显看出，本发明中使用的鱼源性的水解产物在生产批次中铜离子的含量变化很大，所以本发明的培养方法证明是有效的。
在本发明中，适合于各蛋白质制备方法或细胞培养方法的商业的源自生物体的培养基添加剂也可以适当地使用。示例性的商业的源自生物体的培养基添加剂包括源自鲣鱼(例如，由Maruhachi Muramatsu，Inc.制造的Hy-Fish(FL))、小麦、大豆、酵母、哺乳动物(牛、猪、绵羊等)的那些。
将源自生物体的培养基添加剂添加到种子培养基中的合适浓度的范围通常为0.5至30g/L，优选为1至20g/L，更优选为2至10g/L。将源自生物体的培养基添加剂添加到初始培养基中的合适浓度的范围通常为1至30g/L，优选为3至20g/L，更优选为5至15g/L。将源自生物体的培养基添加剂添加到补料分批培养基中的合适浓度的范围通常为5至150g/L，优选为10至120g/L，更优选为20至90g/L。
特别地，当使用鱼源性培养基添加剂时，它们优选以2至5g/L的浓度添加到种子培养基中，优选以5至15g/L的浓度添加到初始培养基中，且优选以30至75g/L的浓度添加到补料分批培养基中。
对于本发明中使用的培养基中的其它成分，可以适当地使用细胞(优选动物细胞)培养基中通常使用的那些。实例包括氨基酸、维生素、脂质因子、能量源、渗透压调节剂、铁源和pH缓冲剂。除了上述列出的成分之外，例如，可以添加微量金属元素、表面活性剂、生长辅因子和核苷。
具体地说，本发明中使用的培养基可以含有以下成分：氨基酸，诸如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸，优选L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸：维生素，诸如内消旋肌醇(i-inositol)、生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素维生素B12和抗坏血酸，优选生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12和抗坏血酸；脂质因子，诸如氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸和胆固醇，优选氯化胆碱；能量源，诸如葡萄糖、半乳糖、甘露糖和果糖，优选葡萄糖；渗透压调节剂，诸如氯化钠、氯化钾和硝酸钾，优选氯化钠；铁源，诸如EDTA铁、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁和硝酸铁，优选氯化铁、EDTA铁和柠檬酸铁；和pH缓冲剂，诸如碳酸氢钠、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES和MOPS，优选碳酸氢钠。
除了上述列出的成分之外，还可以添加微量金属元素，诸如硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁和硅酸钠，优选硫酸铜、硫酸锌和硫酸镁；表面活性剂，诸如吐温80和Pluronic F68；生长辅因子，诸如重组胰岛素、重组IGF、重组EGF、重组FGF，重组PDGF、重组TGF-α、乙醇胺盐酸盐、亚硒酸钠、视黄酸和腐胺盐酸盐，优选亚硒酸钠、乙醇胺盐酸盐、重组IGF和腐胺盐酸盐；和核苷，诸如脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、腺苷、胞二磷胆碱、鸟苷和尿苷。在上述本发明的优选实施例中，还可以含有抗生素(诸如，链霉素、青霉素G钾和庆大霉素)以及pH指示剂(诸如，酚红)。
在本发明中，添加有源自生物体的培养基添加剂的培养基没有特别限制，且可以使用任何培养基。常见的基础培养基含有铜，其量的范围大约为培养基的添加剂中铜含量的1/100至1/10，并且该量单独不足以影响抗体的均一性。例如，在不含源自生物体的成分的基础培养基中且在后续描述的实施例中使用的铜含量范围为约0.001至约0，01ppm。
用于本发明的培养基可以由商业动物细胞培养基制备，诸如(Dulbecco’sModified Eagle Medium)、D-MEM/F-12 1∶1Mixture(Dulbecco’s Modified EagleMedium：Nutrient Mixture F-12)、RPMI 1640.CHO-S-SFM II(Invitrogen)、CHO-SF(Sigma-Aldrich)、EX-CELL 301(JRH biosciences)、CD-CHO(Invitrogen)、IS CHO-V(Irvine Scientific)和PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich)，其中添加有源自生物体的培养基添加剂。
以以下量适当地含有培养基中的其它成分：氨基酸为0.05-1500mg/mL；维生素为0.001-10mg/mL；脂质因子为0-200mg/mL；能量源为1-20g/mL；渗透压调节剂为0.1-10000mg/mL；铁源为0.1-500mg/mL；pH缓冲剂为1-10000mg/mL；微量金属元素为0.00001-200mg/mL；表面活性剂为0-5000mg/mL；生长辅因子为0.05-10000μg/mL；且核苷为0.001-50mg/mL。对于包括培养的细胞的类型和所需蛋白质的类型等各种因素，可以适当地确定这些量。
培养基的pH随培养的细胞而变化，且合适的值通常在6.8至7.6之间，在大多数情况下为7.0至7.4之间。
本发明的培养方法没有特别限制，且可用于培养各种细胞(例如，细菌、真菌、昆虫、植物、动物细胞等)。例如，可以培养通过基因工程程序将编码所需蛋白质的基因并入其中的COS或CHO细胞，或者可以培养以小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等产生抗体的杂交瘤为代表的融合细胞。本发明的方法也可用于培养动物细胞以获得它们产生的天然蛋白质，并且甚至可以应用于除上述那些之外的培养细胞(诸如，BHK和HeLa细胞)。
在本发明中特别优选的动物细胞是用编码所需蛋白质的基因转染的CHO细胞。所需蛋白质没有特别限制，且可为任何类型，包括抗体(例如，天然抗体，低分子量抗体，嵌合抗体和人抗体)以及具有生理活性的蛋白质(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-SCF)、红细胞生成素、干扰素、白细胞介素(诸如，IL-1和IL-6)、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、凝血因子等等)；抗体是特别优选的。
可以通过本发明的制备方法制备的抗体不仅包括源自动物(诸如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔和猴)的单克隆抗体，还包括人工修饰的基因重组抗体(诸如，嵌合抗体、人源化抗体和双特异性抗体)。抗体的免疫球蛋白没有特别限制，且可为任何类别，诸如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等等)、IgA、IgD、IgE和IgM，当抗体用作药物时优选为IgG和IgM。在本发明中，抗体不需要是全抗体，且可包括抗体片段(诸如，Fv、Fab和F(ab)2)以及低分子量抗体(诸如，单价、二价或更高价的单链Fv(例如，scFv或sc(Fv)2)，其具有通过肽或其它连接体连接在一起的抗体的可变区)。
一些动物细胞只需要经培养以制备蛋白质，而另一些细胞则需要用于蛋白质制备的特殊培养方法；在后一种情况下，对于待培养的动物细胞可适当地确定具体方法或条件。例如，对于使用载体(包括编码小鼠-人嵌合抗体的基因)通过基因工程程序转化的CHO细胞，可以在后续描述的条件下在培养基中获得抗体。然后以常规方式(参见例如KOUTAIKOGAKU NYUMON(Introductionto Antibody Engineering)，由Chijin Shokan出版，p.102-104；Affinity Chromatography Principles&Methods，Amersham Pharmacia BiotechInc.，p.56-60)分离和纯化通过培养得到的产物以获得所需蛋白质。
由于培养条件随所用细胞的类型而变化，因此合适的条件可以以适当的方式确定。例如，CHO细胞通常可以在30-39℃(优选约37℃)下在0-40％(优选2-10％)的CO2浓度下在气相气氛中培养1-14天。
各种类型的培养装置可用于培养动物细胞，并且它们包括例如发酵罐式、气升式，培养瓶式、旋转瓶式、微载体式、流化床式、中空纤维式、滚瓶式和填充床式培养装置。
通过根据本发明的方法培养细胞(优选动物细胞)，可以预测制备的蛋白质中C-末端酰胺化种类的量。因此，就产生的C-末端酰胺化种类的量而言，可以控制具有产生C-末端酰胺化种类的可能性的蛋白质。
例如，通过经由本发明的细胞培养方法培养CHO细胞以制备抗体，人源化抗体药物(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)在C-末端酰胺化种类的量上得到控制。
为了给出更具体的实例，本发明的细胞培养方法可应用于从培养的CHO细胞制备人源化抗IL-6受体抗体，从而人源化抗IL-6受体抗体能够以受控量的C-末端脯氨酰胺种类而制备。更具体的实例为用具有源自鱼肉的培养基添加剂(例如鲣鱼水解产物)进行补料分批培养，所述培养基添加剂以指定量添加到各自的目标培养基(种子培养基、初始培养基和补料分批培养基)。在此，理想地选择添加到初始培养基中的源自鱼肉的培养基添加剂的生产批次，以便其铜含量不超过1ppm。虽然铜含量在0至约1.0ppm之间的源自鱼肉的培养基添加剂可用于任何种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中，但是铜含量的浓度在高于1ppm(约1.1ppm)至3.0ppm之间的那些只能用于补料分批培养基。铜含量高于3.0ppm的源自鱼肉的培养基添加剂理想地不用于制备抗体。
如果通过本发明的方法制备的蛋白质具有保证其作为药物的用途的生物活性，则它们可通过与药学上可接受的载体或添加剂混合来进行配制以制备药物组合物。
药学上可接受的载体和添加剂的实例包括：水；缓冲剂；作为药物添加剂可接受的表面活性剂；药学上可接受的有机溶剂以及其它，诸如胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚(丙烯酸钠)、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇和乳糖。
根据上述列表，可以根据具体药物组合物的剂型单独或以适当的组合选择实际的添加剂，但这当然不限于该列表。例如，当药物组合物作为可注射制剂使用时，纯化的蛋白质可溶解于溶剂中(诸如，生理盐水、缓冲溶液或葡萄糖溶液)并可添加抗吸附剂(诸如，吐温80、吐温20、明胶或人血清白蛋白)。或者，可将纯化的蛋白质冷冻干燥以制备在使用前溶解以重建的制剂，并且用于冷冻干燥的示例性赋形剂包括糖醇(诸如，甘露醇)和糖(诸如，葡萄糖)。
实施例
在下面的页面中，通过实施例和参考实施例的方式来具体描述本发明，这些实施例和参考实施例仅为了说明的目的而给出，并不意图限制本发明的范围。
[实施例1]鲣鱼水解产物中的铜含量与通过使用鲣鱼水解产物的分批培养所制备 的抗体中非均一组分的量之间的相关性
以下描述培养基的组成及其制备程序。
种子培养基：向不含源自动物或植物成分的培养基(以粉末形式进料12.3g/L)中加入大豆水解产物(3g/L)和小麦水解产物(1g/L)并溶解以形成溶液，该溶液通过过滤灭菌。
初始培养基：向不含源自动物或植物成分的培养基(以粉末形式进料15.6g/L)中加入鲣鱼水解产物(15g/L)并溶解以形成溶液，该溶液通过过滤灭菌。
此外，测量鲣鱼水解产物的铜含量。
细胞：能够产生人源化PM-1抗体(通用名：托珠单抗(tocilizumab))的CHO细胞，该人源化PM-1抗体是使用WO 92/19759 A实施例中描述的人类延伸因子Iα启动子通过JP H8-99902A的参考实施例2中描述的方法修改而制备的人源化抗IL-6受体抗体；该抗体属于IgG1类。
将初始培养基装入瓶式细胞培养装置中；将种子培养基中培养的上述CHO细胞系以3.5至4.5×105个细胞/mL的不同浓度添加到初始培养基中，并在37℃和5％CO2的条件下开始培养。在50mL培养液中，种子培养基占10mL而初始培养基占40mL。在培养第7天，将培养上清液在蛋白A柱上进行亲和层析以纯化抗体蛋白产物，然后通过阳离子色谱进行分析以测量非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)，其含有C-末端脯氨酰胺种类作为色谱图上的峰面积比。通过使用具有阳离子交换树脂的柱进行阳离子色谱，其中将峰分离并在具有盐浓度梯度的缓冲液中洗脱。使用紫外光及可见光分光光度计来检测峰。
通过使用高频电感耦合等离子体作为光源的发射光谱光度分析对鲣鱼水解产物的铜含量进行测量。
将Sub-1峰的含量(％)相对于培养中使用的源自动物或植物的水解产物(鲣鱼水解产物)的铜含量(ppm)作图，构图如图1所示。
在铜含量和非均一组分的峰之间观察到正相关(R2调整到自由度＝0.58)。
[实施例2]铜添加剂的量与使用鲣鱼水解产物的分批培养所制备的抗体中非均一 组分的量之间的相关性
以下描述培养基的组成及其制备程序。
种子培养基：与实施例1相同。
初始培养基：除了以下均与实施例1相同：含有0.5ppm Cu的鲣鱼水解产物(批次A)单独使用或与硫酸铜混合使用，所述硫酸铜以使鲣鱼水解产物的计算的铜含量相当于3.5、7和10ppm的量添加，并按照实施例1进行培养；含有3.5ppm Cu的鲣鱼水解产物(批次B)单独使用或与硫酸铜混合使用，所述硫酸铜以使鲣鱼水解产物的计算的铜含量相当于7和10ppm的量添加，并按照实施例1进行培养。
初始培养基中铜的最终浓度经计算具有以下值：对于添加含有0.5ppm Cu的鲣鱼水解产物为0.0075ppm Cu；对于添加含有3.5ppm Cu的鲣鱼水解产物为0.0525ppm Cu；对于添加含有7ppm Cu的鲣鱼水解产物为0.105ppm Cu；且对于添加含有10ppm Cu的鲣鱼水解产物为0.15ppm Cu。
细胞：与实施例1相同。
实验方法也与实施例1相同。
结果显示于图2。
CHO细胞在添加有15g/L鲣鱼水解产物批次A(Cu含量＝0.5ppm)的培养基中和在通过向批次A中以使计算的铜含量相当于3.5、7和10ppm的量添加硫酸铜而制备的培养基中培养，CHO细胞也在添加有15g/L鲣鱼水解产物批次B(Cu含量＝3.5ppm)的培养基中和在通过向批次B中以使计算的铜含量相当于7和10ppm的量添加硫酸铜而制备的培养基中培养；通过离子交换色谱法纯化在那些培养基中由细胞产生的抗体蛋白，将含有C-末端脯氨酰胺种类的非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)相对于源自鲣鱼水解产物的Cu含量作图，并相对于该含量和添加的Cu含量之和作图。
如图2所示，非均一组分的峰的量随着铜含量的增加而增加。因此，实施例2也显示了抗体中非均一组分的量随着添加有鲣鱼水解产物的培养基中铜含量的增加而增加。
[实施例3]添加到种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中鲣鱼水解产物中 的铜含量对通过使用鲣鱼水解产物的补料分批培养所制备的抗体中非均一组分的量的影 响
以下描述培养基的组成及其制备程序。
种子培养基：向不含源自动物或植物成分的培养基中加入鲣鱼水解产物(3g/L)并溶解以形成溶液，该溶液通过过滤灭菌。
初始培养基：向不含源自动物或植物成分的培养基中加入鲣鱼水解产物(15g/L)并溶解以形成溶液，该溶液通过过滤灭菌。
补料分批培养基：向不含源自动物或植物成分的培养基中加入鲣鱼水解产物(75g/L)并溶解以形成溶液，该溶液通过过滤灭菌。
在单独的步骤中，测量鲣鱼水解产物的铜含量。
细胞：与实施例1相同。
将种子培养基装入罐式细胞培养装置中；将上述CHO细胞系以3×106个细胞/mL的浓度添加到种子培养基中，并在37℃和20％CO2的条件下开始培养。在培养的第3天，将种子培养液添加到已装入罐式细胞培养装置的初始培养基中，其量使得种子培养液与初始培养基的体积比为1∶2.2，并在37℃和10％CO2的条件下继续培养。从培养的第2天开始，按照细胞密度依赖性添加补料分批培养基。在1L的最终培养液中，种子培养基占250mL，初始培养基占550mL，且补料分批培养基占200mL。在培养第7天，将培养上清液在蛋白A柱上进行亲和层析并进行离子交换色谱法以纯化制备的抗体蛋白，然后通过阳离子色谱进行分析以测量含有C-末端脯氨酰胺种类的非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)。
通过使用高频电感耦合等离子体作为光源的发射光谱光度分析对各鲣鱼水解产物的铜含量进行测量。将含有1.3ppm Cu的鲣鱼水解产物批次指定为高Cu含量批次，而将含有0.6ppm Cu的鲣鱼水解产物批次指定为低Cu含量批次。
将高Cu含量批次(1.3ppm Cu)或低Cu含量批次(0.6ppm Cu)分别以3g/L、15g/L和75g/L的量添加种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中，并且测量所得的8个组合中在培养基中由补料分批培养的CHO细胞所产生的抗体蛋白中Sub-1峰的含量(％)；结果如下表所示。
[表1]
表中最右列中的“铜浓度”是指在添加各自的初始培养基和补料分批培养基之后的最终Cu离子浓度。
图3是这样的图：其显示了培养所获得的Sub-1峰含量(％)的平均值，其中种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中分别添加了高或低Cu含量批次的鲣鱼水解产物。
在添加到种子培养基和补料分批培养基时，鲣鱼水解产物中的Cu含量对Sub-1峰含量产生了很小的影响，而当添加到初始培养基中时，其产生了很大的影响。
从这些结果可以看出，种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的铜含量对含有C-末端脯氨酰胺种类的非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)具有不同的影响。
[实施例4]鲣鱼水解产物中的铜含量与通过使用鲣鱼水解产物的补料分批培养所 制备的抗体中非均一组分的量之间的相关性
以下描述培养基的组成及其制备程序。
种子培养基：与实施例3相同。
初始培养基：与实施例3相同。
补料分批培养基：与实施例3相同。
在分开的步骤中，测量鲣鱼水解产物的铜含量。
细胞：与实施例1相同。
将初始培养基装入瓶式细胞培养装置中；将上述CHO细胞系以1.6至2.5×105个细胞/mL的不同浓度添加到种子培养基中，并在37℃和pH7.00-7.20的条件下开始培养。在培养的第3天，将种子培养液添加到已装入罐式细胞培养装置的初始培养基中，其量使得种子培养液与初始培养基的体积比为1∶2.2，并在37℃和pH 7.00-7.20的条件下继续培养。从培养的第2天开始，按照细胞密度依赖性添加补料分批培养基。在培养第7天，将培养上清液在蛋白A柱上进行亲和层析并进行离子交换色谱法以纯化制备的抗体蛋白，然后通过阳离子色谱进行分析以测量含有C-末端脯氨酰胺种类的非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)。
通过使用高频电感耦合等离子体作为光源的发射光谱光度分析对各鲣鱼水解产物的铜含量进行测量。
在图4中，一个点代表一个生产运行。在每个生产运行中，各自的培养基(种子培养基、初始培养基和补料分批培养基)使用不同的鲣鱼水解产物批次，在制备每种培养基之前测量它们的铜含量。
通过多元回归分析获得回归表达式，其中含有C-末端脯氨酰胺种类的非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)为客观变量，而添加到种子培养基、初始培养基和补料分批培养基中的源自动物或植物的水解产物(鲣鱼水解产物)中的铜含量为解释变量。
预测的Sub-1(％)＝2.13+3.83×[添加到初始培养基中的鲣鱼水解产物中的Cu含量(ppm)]+2.78×[添加到补料分批培养基中的鲣鱼水解产物中的Cu含量(ppm)]。
本实施例显示了种子培养基中的铜含量对目标变量没有影响。
如图4所示，添加到初始培养基和补料分批培养基中的鲣鱼水解产物中的铜含量可用于预测含有C-末端脯氨酰胺种类的非均一组分的峰(Sub-1峰)的含量(％)。
应当注意，本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文。
工业适用性
根据本发明，可以控制由于用于制备药物的源自生物体的水解产物中铜的含量变化而导致的蛋白药物的C-末端酰胺化种类的量的变化，从而能够提供质量稳定的蛋白药品。

Claims (28)

1.一种细胞培养方法，其包括将含有细胞的种子培养基添加到初始培养基中并开始在所述初始培养基中培养所述细胞，其中所述初始培养基中具有添加到其中的源自生物体的培养基添加剂，且在细胞培养开始时所述初始培养基的铜含量不超过0.02ppm。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在细胞培养开始时所述初始培养基的所述铜含量不超过0.015ppm。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中铜含量不超过1ppm的源自生物体的培养基添加剂已被添加到所述初始培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其中铜含量不超过1ppm的源自生物体的培养基添加剂已被添加到将要添加到所述初始培养基中的所述种子培养基中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述培养方法为分批培养、补料分批培养、连续培养、分批培养或半分批培养。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述培养方法为补料分批培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其中铜含量不超过3ppm的源自生物体的培养基添加剂已被添加到将要添加到所述初始培养基中的补料分批培养基中。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中源自所述补料分批培养基的铜离子在培养结束时在所述培养基中以不超过0.08ppm存在。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中在培养结束时在所述培养基中铜离子以不超过0.1ppm存在。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述源自生物体的培养基添加剂是动物源性或植物源性的培养基添加剂。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述源自生物体的培养基添加剂是鱼源性的培养基添加剂。
12.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述源自生物体的培养基添加剂是鱼肉水解产物。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中将要添加到所述培养基的所述源自生物体的培养基添加剂已预先测量所述铜含量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中，所述细胞已用编码所需蛋白质的基因转染。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述所需蛋白质是抗体。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述抗体是托珠单抗。
20.一种使用初始培养基的细胞培养方法，其中已将具有测量的铜含量的源自生物体的培养基添加剂添加到所述初始培养基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述培养方法为分批培养、补料分批培养、连续培养、分批培养或半分批培养。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述培养方法为补料分批培养。
23.一种细胞培养方法，其包括以下步骤：
1)预先测量将要添加到培养基中的源自生物体的培养基添加剂中的铜含量；和
2)选择铜含量不超过1ppm的测量的添加剂并将其添加到初始培养基中。
24.一种补料分批细胞培养方法，其包括以下步骤：
1)预先测量将要添加到培养基中的源自生物体的培养基添加剂中的铜含量；
2)选择铜含量不超过1ppm的测量的添加剂并将其添加到种子培养基或初始培养基中；和
3)选择铜含量不超过3ppm的测量的添加剂并将其添加到补料分批培养基中。
25.一种制备蛋白质的方法，其使用根据权利要求1至24中任一项所述的培养方法。
26.一种制备含有所需蛋白质的药物组合物的方法，其包括以下步骤：
1)通过根据权利要求25所述的制备方法制备所述所需的蛋白质；和
2)通过将步骤1)中制备的所述所需蛋白质与药学上可接受的载体和添加剂混合并且配制来制备所述药物组合物。
27.一种通过使用根据权利要求1至24中任一项所述的培养方法来抑制所需蛋白质中C-末端酰胺化种类的产生的方法。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述所需蛋白质是抗体。
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