CN107406834B

CN107406834B - 具有糖蛋白h融合体的重靶向疱疹病毒

Info

Publication number: CN107406834B
Application number: CN201680009622.8A
Authority: CN
Inventors: 马里亚·加布里埃拉·坎帕代利; 瓦伦蒂娜·加塔
Original assignee: Universita di Bologna
Current assignee: Universita di Bologna
Priority date: 2015-02-11
Filing date: 2016-02-11
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2036-02-11
Also published as: CN107406834A; WO2016128497A1; PT3256570T; EP3256570A1; JP2018512115A; RU2017127024A; AU2016217906A1; US20180002723A1; ES2874584T3; PL3256570T3; RU2732120C2; HUE054563T2; DK3256570T3; RU2017127024A3; CA2974868C; JP6751721B2; EP3256570B1; US10421979B2; AU2016217906B2; CA2974868A1

Abstract

本发明涉及疾病治疗领域。更具体地，其涉及具有与糖蛋白H融合的异源多肽的重靶向疱疹病毒，其中所述多肽靶向患病细胞。其还涉及包含本发明疱疹病毒的基因组的核酸、包含所述核酸的载体以及包含所述核酸和所述载体的细胞。其还涉及使用本发明的疱疹病毒来杀伤细胞并且涉及用于体外培养疱疹病毒的方法。

Description

具有糖蛋白H融合体的重靶向疱疹病毒

技术领域

本发明涉及疾病治疗的领域。更具体地，本发明涉及具有与糖蛋白H融合的异源多肽的重靶向疱疹病毒，其中所述多肽靶向特定细胞，特别是患病细胞。本发明还涉及包含本发明疱疹病毒的基因组的核酸、包含所述核酸的载体以及包含所述核酸或所述载体的细胞。本发明还涉及使用本发明的疱疹病毒来杀伤细胞并且涉及用于体外培养疱疹病毒的方法。

实现本发明的工作已经接受来自欧洲研究委员会(European Research Council)的欧盟第七框架计划(European Union’s Seventh Framework programme)(FP7/2007-2013)/ERC授权协议n°340060的资金。

背景技术

尽管在过去数十年内，大量发现已被转化为治疗或治愈手段并且使得人的健康和生命质量得到改善，但是不能被治疗并且更加不能被治愈的疾病和病理的负担仍然保持升高。其中突出的为多种形式的癌症，特别是转移性癌症形式，其用化学放射治疗或生物药物或者其组合进行治疗，但是成功非常有限。

在过去20年内，已进行大量努力以使用单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)作为溶瘤剂(o-HSV)来治疗癌症和转移。实例为遗传改造的HSV，其携带一些病毒基因的缺失以使病毒减毒并且赋予一定程度的癌症特异性。以被命名为HSV1716的病毒为例的这些病毒携带γ₁34.5基因的一个或两个拷贝的缺失，其产物与通过激活PKR(蛋白激酶R(protein kinase R))而施加的宿主防御形成对比。携带γ₁34.5基因缺失的HSV通过非癌细胞引发针对其的先天应答使得阻止病毒复制的事实而获得其部分癌症特异性；相比之下，一些癌细胞在先天应答中表现出缺陷并且因此允许Δγ₁34.5HSV复制，由此杀伤癌细胞。这些o-HSV的缺点是：癌细胞是异质的，并且Δγ₁34.5HSV仅能杀伤PKR应答缺陷的癌细胞部分。出于安全性原因并且为了实现提高的癌症特异性，在一些情况下，Δγ₁34.5HSV已经被改造以携带另外的缺失，实例为缺失编码核糖核苷酸还原酶的大亚基的UL39基因、缺失ICP 47缺失等。这些另外的缺失使得o-HSV进一步减毒。

为了克服由减毒引起的有限溶瘤效果，携带γ₁34.5基因缺失或缺失组合的o-HSV已被进一步修饰以编码趋化因子或细胞因子。两个相关的实例为T-VEC和M032。最初命名为Onco-Vex并且后来重命名为T-Vec的o-HSV编码GM-CSF，其有利于单核细胞和树突细胞的募集和成熟，并且因此增强所治疗患者对其自身肿瘤的应答。效果为所治疗患者通过免疫系统以清除肿瘤的增强。在III期临床试验中，其改善携带转移性黑素瘤的患者的结果。第二个实例为M032，其为被改造以编码IL12的序列的Δγ₁34.5HSV。这种病毒被预测有利于Th1应答。招募用于在1期试验中用M032进行治疗的患有胶质母细胞瘤的患者是开放的。经减毒病毒的主要限制是双重的：(i)其整体复制降低，这表现为体内和在产生足够大病毒贮存液以产生有效接种物方面的障碍；以及(ii)由于其能够进入正常细胞并被正常细胞隔离而具有受限的癌症特异性。这两个限制预期对治疗的临床效力不利。

克服这些限制的一种方法是将对癌细胞表现出高度特异性向性并且另外地未减毒的o-HSV遗传改造。这种方法被限定为对癌症特异性受体的HSV向性的重靶向。HSV通过其包膜与细胞膜的融合进入细胞；这些为质膜或限制内吞小泡的膜。在后一种情况下，在病毒附着到细胞表面之后，细胞将病毒摄取到内吞小泡中，并且随后病毒体包膜与内吞小泡的膜融合。病毒体包膜是HSV颗粒的最外部结构；其由携带许多病毒编码的糖蛋白的膜组成，所述糖蛋白以级联方式激活而促进HSV包膜与细胞膜融合。这些糖蛋白为gC和gB，其介导HSV颗粒与细胞表面硫酸类肝素(heparan sulphate)的第一附着。在此之后，gD与至少两种独立的可选择细胞表面受体相互作用，所述两种受体命名为连接蛋白1(Nectin1)和HVEM或HVEA。连接蛋白1或HVEM在gD上的结合位点不同。gD与两种可选择受体之一的相互作用诱导gD的构象改变，这被认为以级联方式激活下游的糖蛋白gH/gL(其形成异二聚体)和gB。gB实施病毒体包膜与细胞膜的融合。

HSV对癌症特异性受体的重靶向需要对gD进行遗传修饰，使得其具有编码特异性配体的异源序列。在用编码嵌合gD-配体糖蛋白的重组病毒感染之后，形成在其包膜中携带嵌合gD-配体糖蛋白替代wt-gD的子代病毒体。配体与所选癌细胞或癌症组上特异性表达的分子相互作用并且使得重组o-HSV能够进入所选癌细胞中。已经成功地用于HSV重靶向的配体实例的为IL13α、uPaR、针对HER2的单链抗体以及针对EGFR的单链抗体。

之前的研究已经公开了命名为R-LM113和R-LM249的两种重组体的构建，其二者都重靶向HER2癌症受体。为了实现高度癌症特异性，通过缺失gD分子的特定部分来消除gD与其天然受体连接蛋白1和HVEM的相互作用。R-LM113携带与AA 6-38对应的成熟gD序列的缺失。R-LM249携带与AA 61-218对应的成熟gD的核心区域的缺失。在两种病毒中，均用编码由曲妥珠单抗(针对HER2的单克隆抗体)衍生的单链抗体(single chain antibody，sc-Fv)的序列替换缺失的序列。

已试图用gC通过对除gD之外的糖蛋白进行修饰来重靶向。插入的配体为EPO和IL13。携带gC-EPO嵌合体的病毒附着到表达EPO受体的细胞上；然而，这种附着不导致感染性进入；相反，病毒被降解，这可能是因为其被摄入并且最终在溶酶体中；总之，此策略未产生活的重靶向病毒。gC-IL13嵌合体存在于在gD基因中携带第二IL13拷贝的病毒中。病毒被重靶向。由于所有活的重靶向HSV都在gD中携带重靶向配体，因此不能从这些研究中推断出gC-IL13是否有助于对IL13α2受体的重靶向。

据发明人所知，通过对HSV gB进行遗传修饰的重靶向尚未被描述。

据发明人所知，通过对gH/gL进行遗传修饰的重靶向尚未被描述或者甚至尚未尝试过。

与本发明相关的是之前Cairns等(Journal of Virology，2003年6月，第77卷，第12期，第6731-6742页)的发现，其总结在下文中。为了试图了解gL在异二聚体gH/gL中的作用，在命名为伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，PrV)的疱疹病毒中引入gL基因的缺失，伪狂犬病病毒是与人HSV具有高同源性的猪疱疹病毒。ΔgL PrV无法生存，因为其不能感染，因此不能复制。这种病毒的连续盲目传代产生命名为PrV-ΔgLPass的自发突变体，其携带由与gH的N-端融合的gD序列构成的嵌合糖蛋白。随后还用对应的HSV基因改造了基本上类似的嵌合体。其携带编码gD的信号肽和融合在成熟gH之N-端的成熟gD的胞外域(aa1-308)的序列。其中gH部分缺失的实施例不产生任何功能分子。其中gD的整个胞外域与gH的N-端融合的gD-gH糖蛋白(在Cairns等(同上)中命名为嵌合体22)的特性与本文相关。需要注意的是，在wt病毒中，受体结合的gD对gH/gL施加的活化必需通过分子间信号传导而发生。发明人将其称为反式信号传导，如与在本文中称为顺式信号传导的分子内发生的信号传导相对。本发明发明人的一个令人惊讶的发现是gH的激活可顺式发生。构建体R-VG803和R-VG809就是这种情况，其中sc-Fv激活自身嵌合体中的gH部分。将Cairns等(同上)的嵌合体22用于互补测定中。特别地，嵌合体22补救gD^-/-gH^+/+病毒或gH^-/-gD⁺病毒的感染。对于双缺失gD^-/-gH^-/-病毒的互补没有进行测试。之前的报道和本发明发现之间具有两个关键区别。第一，在互补测定(Cairns等，同上)中，gH^-/-gD⁺病毒中的wt-gD可反式激活为gD-gH嵌合体一部分的gH部分。相反地，为嵌合体一部分的gD部分可反式激活存在于gD^-/-gH⁺病毒体中的wt-gH。在任一情况下，激活均只能反式发生，如Cairns等(同上)总结的。gD-gH嵌合体的顺式激活的证据未提供，并且技术人员不认为其是可能的。第二，不考虑激活机理，在互补系统中，gH激活由具有gH结合位点的gD介导而不是由异源配体介导。这些结果未确立或表明，本文中命名为配体的异源序列(除病毒序列之外的序列)可被引入在gH的N-端，更不用说引入在gH N-端的异源配体是否可以起使HSV向性重靶向能够结合改造配体的细胞受体的功能。

发明人已表明，这确实可以实现并且可以对gH进行修饰以使疱疹病毒重靶向。

发明概述

在第一方面，本发明涉及重组感染性疱疹病毒，其包含与成熟糖蛋白H(gH)或截短gH的N-端融合或者插入到gH中的异源多肽配体。

在第二方面，本发明涉及第一方面的重组感染性疱疹病毒，其用于治疗疾病。

在第三方面，本发明涉及核酸，其包含第一方面的重组感染性疱疹病毒或者至少其与成熟gH或截短gH的N-端融合或者插入到gH中的异源多肽配体的基因组。

在第四方面，本发明涉及载体，其包含第三方面的核酸。

在第五方面，本发明涉及细胞，其包含第一方面的重组感染性疱疹病毒、第三方面的核酸或第四方面的载体。

在第六方面，本发明涉及第一方面的重组感染性疱疹病毒，其用于医药用途。

在第七方面，本发明涉及使用第一方面的重组感染性疱疹病毒来杀伤细胞的方法。

在第八方面，本发明涉及用于在细胞中培养第一方面的重组感染性疱疹病毒的体外方法。

在本发明的一个优选实施方案中，重组感染性疱疹病毒具有带有氨基酸缺失的糖蛋白D(gD)，所述氨基酸缺失使得疱疹病毒从细胞表面上可及的被未经修饰gD靶向的分子或其部分脱靶(de-target)。此外或可替选地，gD包含与成熟gD或截短gD的N-端融合或者插入到gD中的异源多肽配体。

附图说明

图1：重组体R-VG803、R-VG811、R-VG809、R-VG805和R-VG807的基因组排布。HSV-1基因组表示为被内部重复(Internal repeat，IR)框入的线。Lox-P框入的BAC序列插入在基因间区域UL3-UL4中。m-Cherry红色荧光标记插入在基因间区域UL37-UL38中。R-VG803携带在gH的AA 23-24之间插入被Ser-Gly接头框入的scFv-HER2。R-VG811携带在gH的AA 23-48之间插入被Ser-Gly接头框入的scFv-HER2。R-VG809在其他方面与R-VG803相同。另外，其携带从成熟gD缺失AA 6-38。R-VG805在其他方面与R-VG809相同；另外，其携带从成熟gD插入scFv-EGFR替换AA 6-38。R-VG807在其他方面与R-VG809相同；另外，其携带从成熟gD插入scFv-HER2替换AA 6-38。

图2：R-VG803和R-VG809表达嵌合scFv-gH糖蛋白。对用R-VG803、R-VG809或R-LM5感染的Vero细胞的裂解物进行PAGE。通过免疫印迹检测gH。左侧的数字表示130K和95K MW标记的迁移位置。

图3：R-VG803感染表达HER2作为唯一受体的细胞(J-HER2细胞)以及对天然gD受体呈阳性的细胞，并且子代病毒在J-HER2细胞中细胞间播散。J细胞不表达wt-HSV的受体。J-HER2、J-连接蛋白1、J-HVEM只表达指定受体。(A)将指定细胞用R-VG803感染(1PFU/细胞，如在J-HER2细胞中滴定的)，并用红色荧光显微术监测。(B)将J-HER2细胞用R-VG803感染(0.01PFU/细胞)，维持在含有MAb 52S的培养基中，并每天监测红色荧光。斑块尺寸的增大表示细胞间播散。

图4：J-HER2中R-VG803进入途径(A至B)以及SK-OV-3细胞中R-VG803和R-VG809进入途径(C)的表征。(A，B)曲妥珠单抗抑制J-HER2细胞的R-VG803感染。在存在曲妥珠单抗(trastuz)(28μg/ml)或对照IgG下用R-VG803感染J-HER2细胞。通过荧光显微术(A)或流式细胞术(B)监测感染。(C)曲妥珠单抗和HD1 MAb对用R-VG803或R-VG809感染SK-OV-3细胞的影响。以一式三份，将R-VG803与HD1(终浓度1μg/ml)预孵育，并随后允许感染SK-OV-3细胞。当指示时，将细胞用曲妥珠单抗(终浓度28μg/ml)预处理。24小时后通过流式细胞术(BDAccuri C6)量化感染程度，并表示为相对于用未经处理病毒感染的细胞的百分比。每个值代表一式三份的平均值。

图5：R-VG809感染表达HER2作为唯一受体的细胞(J-HER2、CHO-HER2)以及SK-OV-3细胞，但是不能感染对HER2表达呈阴性而对天然gD受体呈阳性的J-HVEM、J-连接蛋白以及人和动物细胞。将细胞以3PFU/细胞感染并在24小时后监测感染。

图6：R-VG805感染J-HER2、J-EGFR、CHO-EGFR、U251-EGFR-vIII细胞，但是不能感染J-连接蛋白1和J-HVEM细胞以及受体阴性wt-CHO-KI细胞。

图7：J-HER2、SK-OV-3以及J-连接蛋白1和J-HVEM细胞的R-VG811感染(A)，以及病毒感染程度的确定(B至D)。(A)R-VG811感染J-HER2、SK-OV-3以及J-连接蛋白1和J-HVEM细胞。(B)在将R-VG811或R-VG803DNA-BAC转染在J-HER2或SK-OV-3细胞中之后获得的受感染细胞的量的比较。(C至D)通过m-cherry检测量化转染有DNA_BAC的细胞中的感染。

图8：J-HER2或SK-OV-3细胞中与R-LM113、R-LM249和R-LM5相比的R-VG803和R-VG809的复制曲线。(A)J-HER2中R-VG803和R-LM113的生长曲线，(B)J-HER2中R-VG803、R-VG809和R-LM5的生长曲线。(C)SK-OV-3细胞中的R-VG803、R-VG809、R-LM113、R-LM249和R-LM5。以0.1PFU/细胞(A，C)或0.01PFU/细胞(B)病毒感染细胞，在相同细胞系中滴定，在指定时间收获。子代病毒在J-HER2(A，B)或SK-OV-3(C)细胞中滴定。结果为至少两个独立实验的平均值。

图9：与R-LM113、R-LM249和R-LM5的杀伤能力相比的R-VG803和R-VG809对SK-OV-3细胞的杀伤能力。结果示为在一式三份单层中如通过AlamarBlue测定的经指定病毒以2PFU/细胞感染的SK-OV-3细胞的生存力。数值代表一式三份的平均值。

发明详述

在下面详细描述本发明之前，应当理解本发明不限于本文中描述的具体方法、方案和试剂，因为这些可变。还应当理解本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限定。除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，Leuenberger，H.G.W， Nagel，B.和

，H.编辑(1995)，Helvetica Chimica Acta，CH-4010Basel，Switzerland)中所述进行定义。

在本说明书的正文通篇引用了数篇文件。本文中不管是在上文还是下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)均在此通过引用整体并入。本文中没有内容应被解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这些公开内容。

在下文，将描述本发明的要素。这些要素随具体实施方案而列出，然而，应当理解，其可以以任何方式和任意数量组合以产生另外的实施方案。不同描述的实例和优选实施方案不应解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。这种描述应当理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另外指出，否则本申请中所有所述要素的任意排列和组合应当被认为通过本申请的说明书公开。

在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式应被理解为意指包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但是不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。除非内容另外明确指出，否则本说明书和所附权利要求书中使用的没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。

在第一方面，本发明涉及重组感染性疱疹病毒，其包含与成熟糖蛋白H(gH)或截短gH的N-端融合或者插入到gH中(在本文中还称为经修饰gH)的异源多肽配体。

本文中使用的术语“重组”疱疹病毒指已经被遗传改造以表达异源蛋白质的疱疹病毒。产生重组疱疹病毒的方法在本领域中是公知的，参见例如Sandri-Goldin等，AlphaHerpesviruses：Molecular and Cellular Biology，Caister Academic Press，2006。

本文中使用的术语“感染性”疱疹病毒指能够进入靶细胞并且能够产生由病毒基因组编码的蛋白质(包括其中包含的异源蛋白质)的疱疹病毒。在一个优选含义中，疱疹病毒还能够在所进入的靶细胞中产生子代病毒。

本文中使用的术语“疱疹病毒”指双链DNA病毒的疱疹病毒科的成员，其引起潜伏性或裂解性感染。疱疹病毒全部都共有共同的结构：所有疱疹病毒均由包装在称为衣壳的二十面体蛋白质笼内编码100至200个基因的相对大的双链线性DNA基因组构成，所述衣壳自身包裹在含有病毒蛋白和病毒mRNA二者称为被膜的蛋白质层以及称为包膜的脂质双层膜内。这整个颗粒也被称为病毒体。

本文中关于疱疹病毒使用的术语“异源”多肽指不是疱疹病毒天然的多肽。至少其对于所使用的特定疱疹病毒毒株不是天然的，但是在一个优选含义中，其对于任何其他疱疹病毒也不是天然的。该术语还不包括从疱疹病毒获得的经遗传改造的蛋白质，即在该术语的限定含义内，这样的经遗传改造疱疹病毒蛋白不是异源多肽。在一个具体实施方案中，异源多肽配体不是疱疹病毒糖蛋白D(gD)或其特异性结合gD的细胞配体的片段。

本文中使用的术语“融合的”或“融合”指两个不同的多肽直接地或者经由一个或更多个肽接头间接地通过肽键连接。在涉及gH的一个优选实施方案中，异源多肽配体与成熟gH或截短成熟gH的N-端融合。在涉及gD的一个优选实施方案中，异源多肽配体与成熟gD或截短成熟gD的N-端融合。

肽接头的长度为1至30个氨基酸，优选5至15个氨基酸，更优选8至12个氨基酸，并且可由任意氨基酸组成。优选地，其包含氨基酸Gly和/或Ser，更优选地其包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个选自Gly和Ser的氨基酸。最优选地，其由氨基酸Gly和/或Ser组成。基于Gly和Ser的接头是优选的，因为其提供柔性、良好溶解度以及针对蛋白水解的抗性。

本文中使用的术语“成熟”糖蛋白指缺乏N-端信号肽的糖蛋白。对于gH，其优选地指根据SEQ ID NO：1之gH的缺乏1至18位氨基酸的gH或同源gH的对应区域。对于gD，其优选地指根据SEQ ID NO：4之gD的缺乏1至25位氨基酸的gD或同源gD的对应区域。

本文中使用的术语“截短”糖蛋白指缺乏N-端部分的疱疹病毒糖蛋白，优选成熟疱疹病毒糖蛋白。在一个具体实施方案中，gH被截短直至(即，截短包括)根据SEQ ID NO：1的gH的18至88位氨基酸中的任一个(即18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87或88)，特别是23、24、48、50或88位氨基酸(直至18位氨基酸的截短产生成熟gH)。在另一个具体实施方案中，gD被截短直至(即截短包括)根据SEQ ID NO：4的gD的25至64位氨基酸中的任一个(即，25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64)，特别是64位氨基酸(直至25位氨基酸的截短产生成熟gD)。

本文中使用的术语“糖蛋白H”或“gH”指在疱疹病毒感染力中起作用的110KDa病毒体包膜糖蛋白。特别地，其与疱疹病毒糖蛋白L形成异二聚体。在本文中，其由根据SEQ IDNO：1的HSV-1gH表示(包含信号序列的gH前体或全长gH；成熟gH缺乏该信号序列，即SEQ IDNO：1的残基1至18)。然而，gH同源物见于疱疹病毒科的所有成员中，并且因此同源序列可变化(有关优选同源物，还参见下文)。因此，本发明也包括HSV-1gH同源物。在一个优选实施方案中，这样的HSV-1gH同源物具有与根据SEQ ID NO：1的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其优选地作为野生型(即未经修饰)保留与疱疹病毒糖蛋白L形成异二聚体的能力。在至少人和猴疱疹病毒中，gH是保守的。三种gH蛋白的细胞外部分的晶体结构是已知的：一种来自α疱疹病毒HSV-2gH(Chowdary等，Nat Struct Mol Biol 2010 17：882-888)；一种来自猪PrV(Backovic等，PNAS 2012 107(52)22635-22640)，其也是一种α疱疹病毒；以及一种来埃巴病毒(Epstein-Barr virus)(Matsuura等，PNAS，2010 107(52)22641-22646)，其是一种γ疱疹病毒。其基本上类似，例如在所有晶体结构中都存在结构类似结构域的组构。

术语“gD”或“糖蛋白D”指疱疹病毒的病毒体包膜的在HSV进入细胞中起必要作用的组分。在疱疹病毒糖蛋白gC和gB与硫酸类肝素蛋白聚糖初始相互作用之后，gD与细胞分子(即，HVEM和连接蛋白-1)结合。在本文中，其由根据SEQ ID NO：4的HSV-1gD表示(包含信号序列的gD前体或全长gD；成熟gD缺乏该信号序列，即SEQ ID NO：4的残基1至25)。然而，同源gD(有关优选同源物，还参见下文)见于疱疹病毒科的其他成员中，并且因此同源序列可变化。因此，本发明还包括HSV-1gD同源物。在一个优选实施方案中，这样的HSV-1gD同源物具有与根据SEQ ID NO：4的序列具有至少70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，并且其作为野生型(即未经修饰)保留与HVEM和连接蛋白-1结合或者更一般地与细胞受体结合使得gD同源物能够以级联方式促进病毒包膜与细胞膜融合的能力。

在一个优选实施方案中，疱疹病毒选自：单纯疱疹病毒1(Herpes Simplex Virus1，HSV-1)、单纯疱疹病毒2(Herpes Simplex Virus 2，HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus)(人疱疹病毒3(human herpesvirus 3，HHV-3))、猪α疱疹病毒伪狂犬病病毒(PRV)、黑猩猩α1疱疹病毒(Chimpanzee alpha1 herpesvirus，ChHV)、狒狒疱疹病毒2(Papiine herpesvirus 2，HVP2)、猕猴疱疹病毒2(Cercopithecine herpesvirus2，CeHV2)、恒河猴疱疹病毒1(Macacine herpesvirus 1，MHV1)、松鼠猴疱疹病毒1(Saimiriine herpesvirus 1，HVS1)、金丝猴疱疹病毒3(callitrichine herpesvirus 3，CalHV3)、松鼠猴疱疹病毒2(Saimiriine herpesvirus 2，HVS2)、牛疱疹病毒1(Bovineherpesvirus 1，BoHV-1)、牛疱疹病毒5(Bovine Herpesvirus 5，BoHV-5)、马疱疹病毒1(Equine herpesvirus 1，EHV-1)、马疱疹病毒2(Equine herpesvirus 2，EHV-2)、马疱疹病毒5(Equine herpesvirus 5，EHV-5)、犬疱疹病毒1(Canine herpesvirus 1，CHV)、猫疱疹病毒1(Feline herpesvirus 1，FHV-1)、鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)、果蝠α疱疹病毒1(Fruit bat alphaherpesvirus 1，FBAHV1)、牛疱疹病毒2(Bovine herpesvirus2，BoHV-2)、兔疱疹病毒4(Leporid herpesvirus 4，LHV-4)、马疱疹病毒3(Equineherpesvirus 3，EHV-3)、马疱疹病毒4(Equine herpesvirus 4，EHV-4)、马疱疹病毒8(Equine herpesvirus 8，EHV-8)、马疱疹病毒9(Equid herpesvirus 9，EHV-9)、猕猴疱疹病毒9(Cercopithecine herpesvirus 9，CeHV-9)、猪疱疹病毒1(Suid herpesvirus 1，SuHV-1)、马雷克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)、马雷克病病毒血清型2(Marek’sdisease virus serotype 2，MDV2)、隼鸟疱疹病毒1型(Falconid herpesvirus type 1，FaHV-1)、禽疱疹病毒3(Gallid herpesvirus 3，GaHV-3)、禽疱疹病毒2(Gallidherpesvirus 2，GaHV-2)、肺-眼-气管疾病相关疱疹病毒(Lung-eye-trachea disease-associated herpesvirus，LETV)、禽疱疹病毒1(Gallid herpesvirus 1，GaHV-1)、鹦鹉疱疹病毒1(Psittacid herpesvirus 1，PsHV-1)、人疱疹病毒8(Human herpesvirus 8，HHV-8)、人疱疹病毒4(Human herpesvirus 4，HHV-4)、海龟疱疹病毒5(Chelonid herpesvirus5，ChHV5)、蛛猴疱疹病毒3(Ateline herpesvirus 3，AtHV3)或吐绶鸡疱疹病毒1(Meleagrid herpesvirus 1，MeHV-1)。这些病毒全部都具有至少与HSV-1/-2的gH具有明显同源性的gH。在一个更优选的实施方案中，疱疹病毒是HSV-1或HSV-2。

本文中使用的术语“插入的”或“插入”指一个多肽并入另一多肽中，其中并入的多肽直接地或者经由一个或更多个肽接头，更特别地根据插入物经由N-端和/或C-末端肽接头通过肽键与宿主多肽连接。虽然肽配体与成熟gH/gD的融合分别也可以视为插入根据SEQID NO 1/4的gH/gD前体中，但是由于病毒体携带成熟的糖蛋白，因此本文中将这样的插入称为N-端融合。因此，术语“插入”优选地指插入成熟的糖蛋白，特别是gH和gD中。

在一个优选实施方案中，异源多肽配体插入在gH的N-端区域中，所述N-端区域起始于根据SEQ ID NO：1的gH的19至23位氨基酸中任一个(优选19位)并且终止于48至88位氨基酸中任一个(优选88位)，优选地起始于19位氨基酸并且终止于88位氨基酸、起始于61位氨基酸并且终止于65位氨基酸、起始于69位氨基酸并且终止于72位氨基酸、或者起始于74位氨基酸并且终止于80位氨基酸、或者起始于116位氨基酸并且终止于136位氨基酸，或者为同源gH的对应区域。范围61至65、69至72和74至80被认为是特别有用的，因为其表示gHH1A结构域的暴露环区并且因此表示保留gH H1A结构域的结构完整性的插入点。在一个更优选的实施方案中，异源多肽配体插入在gH的N-端区域中，所述N-端区域起始于根据SEQID NO：1的gH的19位氨基酸并且终止于50位氨基酸或者为同源gH的对应区域。在一个甚至更优选的实施方案中，异源多肽配体插入在gH的N-端区域中，所述N-端区域起始于根据SEQID NO：1的gH的19位氨基酸并且终止于48位氨基酸或者为同源gH的对应区域。在另一个更优选的实施方案中，异源多肽配体插入在gH的N-端区域中，所述N-端区域起始于根据SEQID NO：1的gH的23位氨基酸并且终止于48位氨基酸或者为同源gH的对应区域。在所有的这些实施方案中，限定区域的起始和终止的氨基酸包括在该区域中，即插入可以通过起始或终止氨基酸的N-端或C-末端。在插入SEQ ID NO：1之残基19的N-端的特殊情况下，插入还可以视为与成熟gH的N-端融合。因此，为了清楚地区别术语“插入”和“融合”，该特殊情况优选地从可能的插入排除并且落入所述与成熟gH的N-端融合的情况下。

此外，在所有这些实施方案中，所述区域可以通过插入而被替换。在插入替换包含SEQ ID NO：1之残基19的区域的特殊情况下，插入还可以视为与截短成熟gH的N-端融合。因此，为了清楚地区别术语“插入”和“融合”，该特殊情况优选地从可能的插入排除并且落入所述与截短成熟gH的N-端融合的情况下。

在最优选的实施方案中，配体插入在根据SEQ ID NO：1的gH的23位氨基酸和24位氨基酸之间或同源gH的对应区域(在此情况下与所述23至24位氨基酸对应)。

在一个具体实施方案中，如上所述的N-端区域的一个或更多个gH氨基酸缺失。在一个相关实施方案中，如上所述，gH是截短的。

术语“同源gH的对应区域”指当使用Smith-Waterman算法和以下比对参数时与根据SEQ ID NO：1之HSV-1gH的给定区(优选如上限定的插入区)对齐的gH区域：MATRIX：BLOSUM62，GAP OPEN：10，GAP EXTEND：0.5。在使用上述算法和参数HSV-1gH之给定区的仅一个或更多个部分与同源gH的序列对齐的情况下，术语“同源gH的对应区域”指与HSV-1gH的给定区的该一个或更多个部分对齐的区域。换言之，在此情况下，同源gH中插入配体或被配体替换的区域仅包含与HSV-1gH之给定区的该一个或更多个部分对齐的氨基酸。此外，在相同情况下，术语“同源gH的对应区域”可以指以对应侧翼序列为侧翼的区域，其中对应侧翼序列为同源gH的使用上述算法和参数与在HSV-1gH之上述给定区(优选如上限定的插入区)侧翼的序列对齐的序列。HSV-1gH的这些侧翼序列的长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个氨基酸(在gH的N-端，即根据SEQ ID NO：1之19至23位氨基酸残基中任一个的N-端的侧翼序列可较短，即如所述，但长度为最多18、19、20、21或22个氨基酸残基)，并且使用上述算法和参数与同源gH的序列对齐。

同源gH优选地为以下的gH：单纯疱疹病毒2(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(人疱疹病毒3，HHV-3)、猪α疱疹病毒伪狂犬病病毒(PRV)、黑猩猩α1疱疹病毒(ChHV)、狒狒疱疹病毒2(HVP2)、猕猴疱疹病毒2(CeHV2)、恒河猴疱疹病毒1(MHV1)、果蝠α疱疹病毒1(FBAHV1)、松鼠猴疱疹病毒1(HVS1)、金丝猴疱疹病毒3(CalHV3)、松鼠猴疱疹病毒2(HVS2)、牛疱疹病毒1(BoHV-1)、牛疱疹病毒5(BoHV-5)、马疱疹病毒1(EHV-1)、马疱疹病毒2(EHV-2)、马疱疹病毒5(EHV-5)、犬疱疹病毒1(CHV)、猫疱疹病毒1(FHV-1)、猕猴疱疹病毒9(CeHV-9)、鸭肠炎病毒(DEV，AnHV-1)、牛疱疹病毒2(BoHV-2)、兔疱疹病毒4(LHV-4)、马疱疹病毒3(EHV-3)、马疱疹病毒4(EHV-4)、马疱疹病毒8(EHV-8)、马疱疹病毒9(EHV-9)、马雷克病病毒(MDV)、马雷克病病毒血清型2(MDV2)、禽疱疹病毒3(GaHV-3)、禽疱疹病毒2(GaHV-2)、肺-眼-气管疾病相关疱疹病毒(LETV)、禽疱疹病毒1(GaHV-1)、鹦鹉疱疹病毒1(PsHV-1)、人疱疹病毒8(HHV-8)、人疱疹病毒4(HHV-4)、隼鸟疱疹病毒1型(FaHV-1)、海龟疱疹病毒5(ChHV5)、蛛猴疱疹病毒3(AtHV3)或吐绶鸡疱疹病毒1(MeHV-1)。相对于HSV-1的gH序列，这些疱疹病毒和HSV-1具有高度保守的gH序列。更优选地，同源gH是单纯疱疹病毒2(HSV-2)、黑猩猩α1疱疹病毒(ChHV)、狒狒疱疹病毒2(HVP2)、猕猴疱疹病毒2(CeHV2)、恒河猴疱疹病毒1(MHV1)、果蝠α疱疹病毒1(FBAHV1)、牛疱疹病毒2(BoHV-2)或兔疱疹病毒4(LHV-4)的gH。最优选地，同源gH是单纯疱疹病毒2(HSV-2)的gH。

在另一个实施方案中，异源多肽配体插入在gH的H1A结构域的N-端。插入在N-端在此方面并非意指在N-端侧邻近H1A结构域，而是在H1A结构域的N-端侧的任何位置。gH的H1A结构域为gH的H1结构域的子结构域。H1结构域从根据SEQ ID NO：1的gH蛋白的49位氨基酸延伸至327位氨基酸，并且H1A结构域从根据SEQ ID NO：1的gH蛋白的49位氨基酸延伸至115位氨基酸(Chowdary等，2010)。许多gH蛋白确实具有H1A结构域，其可以通过与SEQ ID NO：1进行序列比对或者通过H1结构域中的结构相似性(如来自水痘带状疱疹病毒(人疱疹病毒3)的gH的情况)来鉴定。不是每种疱疹病毒都可具有带有与根据SEQ ID NO：1之gH蛋白的1至48位氨基酸对应的区域的gH。然而，每种成熟gH都具有在H1A结构域的N-端的至少一些，例如1、2或3个氨基酸。一个实例为EBV，其中在成熟肽中在H1A结构域之前只有1个残基(假定H1A结构域起始于在X射线结构中可见的第一个残基，即对于EBA，起始于gH前体的第19位)。在其中该在前区域非常短，例如10个或更少、5个或更少或者3个或更少氨基酸的gH的情况下，设想插入物在这些残基之后(即，C-末端)，以及设想任选地，这些残基在插入物之后，即在插入物和H1A结构域之间重复。

在本发明第一方面的一个实施方案中，疱疹病毒具有相对于野生型病毒的毒力降低的毒力或者具有在患病细胞相对于未患病细胞中不同的复制能力。术语“野生型病毒的毒力”指野生型疱疹病毒，即非重组疱疹病毒具有的感染细胞，特别是进入细胞的能力。在一个具体实施方案中，降低的毒力是结合与野生型病毒结合的靶细胞表面受体的能力降低或甚至消除。这样的靶细胞表面受体包括例如与gD结合的HVEM(本领域中使用的同义词：HveA和TNFRSF14)和连接蛋白-1(本领域中使用的同义词：HveC和PVRL1)、与gB和gC结合的硫酸类肝素蛋白聚糖、髓鞘相关糖蛋白MAG(Myelin-associated glycoprotein)、配对免疫球蛋白样2型受体α(paired immunoglobin-like type 2receptor alpha，PILRα)、与gB结合的DC-SIGN和非肌肉肌球蛋白重链9MYH9/NMHC-IIA、以及与gH-gL结合的ITGB3/αvβ3整联蛋白、与gH结合的avβ6-整联蛋白和avβ8-整联蛋白(Gianni T，Salvioli S，ChesnokovaLS，Hutt-Fletcher LM，Campadelli-Fiume G. PLoS Pathog.2013；9(12)：e1003806)。降低或消除的结合可以例如通过缺失或改变参与与靶细胞表面受体相互作用的病毒糖蛋白(例如，gD、gB或gC)或其部分来实现。

术语“复制能力”指疱疹病毒在受感染的细胞中在给定时间内自我复制的倍数。优选地，当在患病细胞相对于未患病细胞中复制能力不同时，复制能力在患病细胞中高于未患病细胞中(即，对于患病细胞提高)，或者在未患病细胞中低于患病细胞中(即，对于未患病细胞降低)。

在一个优选实施方案中，重组感染性疱疹病毒包含对gD的细胞配体具有降低的或不具有特异性结合的经改变gD，或者其缺乏gD。

在一个更优选的实施方案中，疱疹病毒具有带有氨基酸缺失的gD，所述氨基酸缺失起始于根据SEQ ID NO：4的gD的26至33位氨基酸残基中任一个并且终止于31至63位氨基酸残基中任一个(优选地起始于残基31并且终止于残基63)和/或起始于65至86位氨基酸残基中任一个并且终止于235至243位氨基酸残基中任一个(优选地起始于86位残基并且终止于243位残基)，或者为同源gD的对应区域。对于缺乏N-端25个氨基酸的信号肽的成熟gD，这意指氨基酸缺失分别起始于成熟gD的1至8位氨基酸残基中任一个并且终止于6至38位氨基酸残基中任一个(优选地起始于6位残基并且终止于38位残基)和/或起始于40至61位氨基酸残基中任一个并且终止于210至218位氨基酸残基中任一个(优选地起始于61位残基并且终止于218位残基)。在本文中，起始和终止残基包含在缺失中。术语“同源gD的对应区域”指当使用Smith-Waterman算法和以下比对参数时与根据SEQ ID NO：4之HSV-1gD的给定区(优选上述缺失)对齐的gD区域：MATRIX：BLOSUM62，GAP OPEN：10，GAP EXTEND：0.5。在使用上述算法和参数HSV-1gD之给定区的仅一个部分或更多个部分与同源gD的序列对齐的情况下，术语“同源gD的对应区域”指与HSV-1gD之给定区的该一个或更多个部分对齐的区域。换言之，在此情况下，同源gD中的缺失仅包含与HSV-1gD之给定区的该一个或更多个部分对齐的氨基酸。此外，在相同情况下，术语“同源gD的对应区域”可以指以对应侧翼序列为侧翼的区域，其中对应侧翼序列为同源gD的使用上述算法和参数与在HSV-1gD之上述给定区(优选上述缺失)侧翼的序列对齐的序列。HSV-1gD的这些侧翼序列的长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个氨基酸(在gD的N-端，即根据SEQ ID NO：4之26至33位氨基酸残基中任一个的N-端的侧翼序列可较短，即如所述，但长度为最多25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸残基)，并且使用上述算法和参数与同源gD的序列对齐。同源gD优选地是HSV-2的gD、黑猩猩α1疱疹病毒(ChHV)的gD、恒河猴疱疹病毒1(MHV1)的gD、狒狒疱疹病毒2(HVP2)的gD、猕猴疱疹病毒1(CeHV1)的gD、猕猴疱疹病毒2(CeHV2)的gD、松鼠猴疱疹病毒1(HVS1)的gD、牛疱疹病毒1(BoHV-1)的gD、牛疱疹病毒5(BoHV-5)的gD、马疱疹病毒1(EHV-1)的gD、马疱疹病毒3(EHV-3)的gD、马疱疹病毒4(EHV-4)的gD、马疱疹病毒8(EHV-8)的gD、马疱疹病毒9(EHV-9)的gD、犬疱疹病毒1(CHV)的gD、猫疱疹病毒1(FHV-1)的gD、鸭肠炎病毒(DEV)的gD、麋鹿疱疹病毒(Elk herpesvirus，ElkHV)的gD、驯鹿疱疹病毒(Rangiferine herpesvirus，RanHV)的gD；鹿疱疹病毒1(Cervid herpesvirus 1，CerHV-1)、兔疱疹病毒4(LHV-4)、鹿疱疹病毒2(Cervid herpesvirus 2，CerHV-2)的gD；山羊疱疹病毒1(Caprine herpesvirus 1，CapHV-1)的gD、非洲羚羊疱疹病毒1(Bubaline herpesvirus 1，BuHV1)的gD、果蝠α疱疹病毒1(FBAHV1)的gD；袋鼠疱疹病毒1(Macropodid herpesvirus 1，MaHV-1)、隼鸟疱疹病毒1(FaHV-1)的gD；袋鼠疱疹病毒1(MaHV-2)的gD；猪伪狂犬病病毒(PrV)、海豹疱疹病毒-1(Phocid herpesvirus-1，PhHV-1)、马雷克病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(TurkeyHerpesvirus，HVT)、吐绶鸡疱疹病毒1(MeHV-1)的gD；禽疱疹病毒1(GaHV-1)的gD、禽疱疹病毒2(GaHV-2)的gD或兀鹰疱疹病毒(Vulture herpesvirus，VHV)的gD。更优选地，同源gD是HSV-2的gD、黑猩猩α1疱疹病毒(ChHV)的gD、狒狒疱疹病毒2(HVP2)的gD、恒河猴疱疹病毒1(MHV1)的gD、猕猴疱疹病毒1(CeHV1)的gD、果蝠α疱疹病毒1(FBAHV1)的gD、猕猴疱疹病毒2(CeHV2)的gD、袋鼠疱疹病毒1(MaHV-2)的gD或松鼠猴疱疹病毒1(HVS1)的gD。最优选地，同源gD是HSV-2的gD。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，异源多肽配体与在功能上等同于gD的N-端并且存在于功能等同于HSV gD的蛋白质中的结构域融合，所述结构域例如人疱疹病毒4(EBV)的gp42、恒河猴疱疹病毒的BZLF2、金丝猴疱疹病毒3的ORF44或猪嗜淋巴疱疹病毒1(Porcine lymphotropic herpesvirus 1)的BZLF2。

疱疹病毒还可以被减毒，例如通过缺失或改变病毒基因γ₁34.5、UL39和/或ICP47来减毒。术语“经减毒的”指毒性弱化或减小的疱疹病毒。优选的是条件性减毒，其中通过根据本发明的重靶向，减毒仅影响不被疱疹病毒靶向的未患病细胞。因此，只有疱疹病毒重靶向的患病细胞(例如癌细胞)受疱疹病毒的全毒力影响。条件性减毒可以例如通过用排他性地在癌细胞中表达的人基因启动子(例如存活蛋白(survivin)启动子)替换γ₁34.5、UL39和/或ICP47基因的启动子区来实现。用于条件性减毒的另外修饰可以包括用排他性地在患病细胞(例如癌细胞)中表达的基因启动子区(例如存活蛋白启动子)替换负责IE基因转录的调控区，例如ICP-4启动子区。此变化产生能够在癌细胞中复制但不能在正常细胞中复制的复制条件性HSV。病毒的另外修饰可以包括向必需HSV基因(例如ICP4)的3’非翻译区中插入在正常细胞中丰富但在肿瘤细胞中不丰富的响应于微RNA(MicroRNA，miR)的序列元件。结果也是仅在正常细胞中不具有复制能力的病毒。

术语“IE基因”指即早期基因(immediate early gene)，其为响应于细胞刺激而瞬时且快速地激活的基因。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，疱疹病毒包含与成熟gD或截短gD的N-端融合或者插入到gD(本文中也称为经修饰gD)中的异源多肽配体。在一个优选实施方案中，插入到gD中的异源多肽配体插入在根据SEQ ID NO：4之gD的26至243位氨基酸(成熟gD的1至218位氨基酸)中任一个的C-末端，或者替换根据SEQ ID NO：4的gD的以下氨基酸序列或同源gD的对应区域，所述氨基酸序列起始于26至33位氨基酸残基中任一个并且终止于31至63位氨基酸残基中任一个(优选地起始于31位残基并且终止于63位残基)和/或起始于65至86位氨基酸残基中任一个并且终止于235至243位氨基酸残基中任一个(优选地起始于86位残基并且终止于243位残基)。同样地，术语“同源gD的对应区域”指当使用Smith-Waterman算法和以下比对参数时与根据SEQ ID NO：4之HSV-1gD的给定区(优选上述待替换的氨基酸序列)对齐的gD区域：MATRIX：BLOSUM62，GAP OPEN：10，GAP EXTEND：0.5。在使用上述算法和参数，且HSV-1gD之给定区的仅一个部分或更多个部分与同源gD的序列对齐的情况下，术语“同源gD的对应区域”指与HSV-1gD之给定区的该一个或更多个部分对齐的区域。换言之，在此情况下，同源gD中待替换的序列仅包含与HSV-1gD之给定区的该一个或更多个部分对齐的氨基酸。此外，在相同情况下，术语“同源gD的对应区域”可以指以对应侧翼序列为侧翼的区域，其中对应侧翼序列为同源gD的使用上述算法和参数与在HSV-1gD之上述给定区(优选上述待替换的氨基酸序列)侧翼的序列对齐的序列。HSV-1gD的这些侧翼序列的长度为至少5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50个氨基酸(在gD的N-端，即根据SEQ ID NO：4之氨基酸残基26至33中任一个的N-端的侧翼序列可较短，即如所述，但长度为最多25、26、27、28、29、30、31或32个氨基酸残基)，并且使用上述算法和参数与同源gD的序列对齐。同源gD如上文针对gD缺失所述的。

在本发明第一方面的一个优选实施方案中，与gH和/或gD融合或者插入到gH和/或gD中的异源多肽配体与细胞表面上可及的靶分子或其部分结合。优选地，其与细胞表面上可及的分子或其部分特异性结合。本文中使用的术语“特异性结合”指确定所述分子在蛋白质并且特别是细胞的异质群体中，例如在生物体，优选人体中的存在的结合反应。因此，指定配体与其特定靶分子结合，并且不与细胞上存在的其他分子或者不与生物体中配体可接触的其他分子以显著量结合。一般来说，“特异性结合”靶分子的配体对该靶分子的平衡亲和常数为大于约10⁵(例如，10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹和10¹²或更大)摩尔/升。一般来说，和与gD融合或插入到gD中的多肽配体相比，与gH融合或插入到gH中的异源多肽配体可以与细胞表面上可及的不同或相同分子或者其部分结合。与相同分子结合被认为提高与一种分子结合的程度，而与不同分子结合则赋予双重特异性，并且使得：1)在一种分子不再存在于细胞表面的情况下，例如在突变肿瘤细胞的情况下维持细胞特异性；2)应对肿瘤异质性：肿瘤是异质的并且通常肿瘤特异性分子不是在所有肿瘤细胞中都表达；因此双重靶向允许病毒使用第一或第二靶向受体进入细胞，从而增加可被感染的肿瘤细胞的数量。

在一个实施方案中，异源多肽配体选自抗体、抗体衍生物和抗体模拟物。抗体、抗体衍生物或抗体模拟物可以是单特异性的(即对细胞表面上可及的一种靶分子或其部分具有特异性)或多特异性的(即对相同或不同细胞的表面上可及的多于一种靶分子或其部分具有特异性)，例如是双特异性或三特异性的(参见，例如Castoldi等，Oncogene.2013年12月12日；32(50)：5593-601；Castoldi等，Protein Eng Des Sel.2012年10月；25(10)：551-9)。对相同细胞的表面上可及的多于一种靶分子或其部分同时靶向提高病毒的特异性。同时靶向不同细胞的表面上可及的多于一种靶分子或其部分如上所述允许处理肿瘤异质性。

本文中使用的术语“抗体衍生物”指包含至少一个抗体可变结构域而不具有抗体(例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY或IgW)的整体结构，但是仍然能够与靶分子结合的分子。所述衍生物可以是但不限于功能性(例如靶标结合，特别是特异性靶标结合)抗体片段，例如Fab、Fab2、scFv、Fv或其部分；或者免疫球蛋白的其他衍生物或组合，例如纳米抗体(nanobody)、双链抗体(diabody)、微型抗体(minibody)、骆驼单结构域抗体、单结构域或Fab片段、可变区的重链和轻链的结构域(例如Fd、VL(包括Vλ和Vκ)、VH、VHH)，以及由通过至少两个结构环连接的免疫球蛋白结构域的两条β链组成的微型结构域(mini-domain)。优选地，衍生物是单价的。更优选地，衍生物是单链抗体，最优选地，其具有结构VL-肽接头-VH或VH--肽接头-VL。

本文中使用的术语“抗体模拟物”指类似于抗体可特异性结合抗原但是在结构上与抗体不相关的有机化合物。其通常是摩尔质量为约3至20kDa的人工肽或蛋白质。抗体模拟物的非限制性实例为亲和体(affibody)、affilin、affimer、affitin、anticalin、avimer、DARPin、fynomer、Kunitz结构域肽、单抗体、蛋白A的Z结构域、γB晶状体蛋白(Gamma Bcrystalline)、泛素、胱抑素、来自嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus αcidocαldαrius)的Sac7D、脂质运载蛋白(lipocalin)、膜受体的A结构域、锚蛋白重复基序、Fyn的SH3结构域、蛋白酶抑制剂的Kunits结构域、纤连蛋白的第10III型结构域、合成的异二价或异多价配体(Josan等，Bioconjug Chem.2011 22(7)：1270-1278；Xu等，PNAS 2012 109(52)21295-21300；Shallal等，Bioconjug Chem.2014 25(2)393-405)或者合成的肽配体，例如来自(随机)肽文库的合成肽配体。合成的肽配体具有用于结合特定靶分子的非天然存在氨基酸序列。在本发明上下文中的肽配体通常为少于约50个氨基酸残基并且优选少于约40个氨基酸残基的受限制(即，具有一些结构元素，例如存在起始β转角或β折叠片的氨基酸，或者例如通过存在二硫键键合的Cys残基而环化)或不受限制(线性)的氨基酸序列。在少于约40个氨基酸残基的肽配体中，优选的是约10至约30个氨基酸残基的肽配体。

在一个实施方案中，细胞是患病细胞。特别地，其可以是肿瘤细胞、慢性感染细胞或衰老细胞。

在肿瘤细胞的情况下，潜在的疾病是肿瘤，其优选地选自：肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS、肿瘤、乳腺癌、未知原发癌、卡斯尔曼病(Castleman Disease)、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因家族肉瘤(Ewing Family Of Tumor)、眼癌、胆囊癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor，GIST)、妊娠性滋养层病(Gestational Trophoblastic Disease)、霍奇金病(Hodgkin Disease)、卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤-成体软组织癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldnstrom Macroglobulinemia)和维尔姆斯瘤(Wilms Tumor)。

优选的肿瘤疾病是HER-2阳性癌症(如乳腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、头颈癌、骨肉瘤和多形性胶质母细胞瘤)、EGFR阳性癌症(如头颈癌、多形性胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌和胰腺癌)、EGFR-vIII阳性癌症(如多形性胶质母细胞瘤)、PSMA阳性癌症(如前列腺癌)、CD20+阳性淋巴瘤和EBV相关性肿瘤。

在慢性感染细胞的情况下，潜在的疾病是慢性感染性疾病，例如肺结核、疟疾、慢性病毒性肝炎(HBV、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus)和HCV)、获得性免疫缺陷综合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS；由HIV(Human Immunodeficiency Virus，人免疫缺陷病毒)引起)或EBV相关性病症：系统性自身免疫病(系统性红斑狼疮(SystemicLupus Erithematosus)、类风湿性关节炎和舍格伦综合征(Sjogren Syndrome))和多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)。

在衰老细胞的情况下，潜在的疾病是衰老相关性疾病，例如(i)以过早老化为特征的称为早衰综合征(Progeroid syndrome)的罕见遗传疾病：维尔纳综合征(Wernersyndrome，WS)、布卢姆综合症(Bloom syndrome，BS)、罗-汤综合症(Rothmund-Thomsonsyndrome，RTS)、科凯恩综合征(Cockayne syndrome，CS)、着色性干皮病(Xerodermapigmentosum，XP)、毛发低硫营养不良(Trichothiodystrophy)或哈-吉早老综合征(Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome，HGPS)；或者(ii)常见的年龄相关性病症：肥胖、2型糖尿病、肌肉减少症(sarcopenia)、骨关节炎、特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病、白内障、神经变性疾病或癌症治疗相关性病症。

在一个实施方案中，关于细胞表面上可及的靶分子或其部分，靶分子是蛋白质、糖脂或糖苷。优选地，所述蛋白质是细胞受体。在肿瘤细胞的情况下，优选地细胞表面蛋白是癌症相关抗原，例如HER2、EGFR、EGFRvIII、EGFR3(ERBB3)、MET、FAP、PSMA、CXCR4、ITGB3、CEA、CAIX、黏蛋白(Mucin)、叶酸结合蛋白(Folate-binding protein)、GD2、VEGFR1、VEGFR2、CD20、CD30、CD33、CD52、CTLA4、CD55、整联蛋白αVβ3、整联蛋白α5β1、IGF1R、EPHA3、RANKL、TRAILR1、TRAILR2、IL13Rα、UPAR、生腱蛋白(Tenascin)、PD-1、PD-L1、肿瘤相关糖蛋白72、神经节苷脂GM2、A33、Lewis Y抗原或MUC1。在衰老细胞的情况下，靶分子是由衰老细胞表达的任何表面蛋白，例如CXCR2或IL-1受体。

在一个实施方案中，患病细胞的表面上可及的靶分子或其部分不是所述细胞的表面上天然可及的，即在相同类型和/或组织的未患病(即健康)细胞的表面上是不可及的，并且优选地在相同生物体的任何其他细胞的表面上是不可及的。在关于慢性感染疾病的一个相关实施方案中，靶分子是来源于感染细胞的病原体(例如，病毒、细菌或寄生物)的分子，并且其在受感染细胞的表面上表达(例如来自HBV的HBsAg、来自HIV的gp120、来自HCV的E1和E2、来自EBV的LMP1和LMP2)。在另一个实施方案中，与gD融合或插入到gD中的异源多肽配体不与细胞表面上可及的任何分子或其部分结合，但破坏与天然HSV受体的结合。如所述，在该实施方案中，与gD融合或插入到gD中的配体具有消除gD与其天然受体结合之能力的目的。通过与病毒的不同糖蛋白(特别是gH)融合或插入到其中实现对靶细胞的靶向。

在另一个实施方案中，与gH或gD融合或者插入到gH或gD中的异源多肽配体与细胞表面上可及的异源分子或其部分结合。本文中关于细胞所使用的术语“异源分子”指不是细胞天然的分子。特别地，其不是和/或不能由细胞天然(即非重组)产生。优选地，在多肽的情况下，其不由细胞的天然(即，未经重组改造的)基因组编码。在该实施方案中，通过gH或gD与细胞表面上可及的异源分子或其部分结合而靶向的细胞可以用于病毒的生长，即增殖。增殖的方式对该细胞是特异性的，并且gH或gD与异源分子或其部分的结合不靶向其他细胞(例如，需使用这种疱疹病毒治疗的患者的细胞)。

在本发明第一方面的另一个实施方案中，重组感染性疱疹病毒包含异源可检测标志物，优选在表达盒中的异源可检测标志物。本文中使用的术语“可检测标志物”指本领域中通常使用的标志物和标签，例如，例如磷酸酶和过氧化物酶的酶标志物、例如NaI同向转运体的膜转运蛋白、PET或SPEC放射示踪剂、或者荧光标志物。荧光标志物包括例如GFP和GFP变体，例如具有不同荧光谱的突变体GFP；RFP(例如mCherry RFP)和RFP变体，例如具有不同荧光谱的突变体GFP胆红素诱导型荧光蛋白UnaG、dsRed、eqFP611、Dronpa、TagRFP、KFP、EosFP、Dendra和IrisFP。对于肿瘤可视化，膜转运蛋白NaI同向转运体是特别适合的。

优选地，可检测标志物插入到不干扰病毒感染细胞或不干扰病毒在细胞中倍增或不干扰病毒增殖的区域中。特别地，所述区域不中断任何重叠或任何转录单元(有义或反义)。优选地，可检测标志物插入到疱疹病毒基因组的基因间序列，更优选UL37和UL38、UL3和UL4、或US1和US2之间的基因间序列中。

在第一方面的另一个实施方案中，重组感染性疱疹病毒包含表达以下一种或更多种的一个或更多个表达盒：

i)一种或更多种治疗性蛋白质，例如具有促炎或抗炎活性的免疫调节剂(包括细胞因子，优选刺激免疫应答的细胞因子，例如GM-CSF或IL12)；抗体、其衍生物或抗体模拟物，例如针对检查点抑制剂(例如PDL1、PD1、CTLA4)的抗体、其衍生物或抗体模拟物；或者能够修饰疾病微环境(例如胶原酶)，特别是肿瘤微环境的蛋白质；

ii)一种或更多种异源或自体抗原、表位/新表位或表位/新表位串；或者

iii)一种或更多种前药转化酶，例如伐昔洛韦(valacyclovir)和人巨细胞病毒的蛋白激酶、CYP2B1、胞嘧啶脱氨酶、嘌呤脱氧核苷磷酸化酶、羧酸酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、对氧磷酶、基质金属蛋白酶、碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、伐昔洛韦酶(valacyclovirase)、纤溶酶、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶或β-半乳糖苷酶(来自Yang等，Acta Pharmaceutica Sinica B 20111(3)143-159的实例)。

在第一方面的一个具体实施方案中，重组感染性疱疹病毒具有带有根据SEQ IDNO：2(如实施例的构建体R-VG803、R-VG805和R-VG809中的gH；scFv-HER2在野生型gH的aa23-24之间)或SEQ ID NO：3(如实施例的构建体R-VG811中的gH；scFv-HER2替换野生型gH的aa 24-47)的氨基酸序列的经修饰gH，二者都缺乏信号序列(分别为SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3的残基1至18)，或者所述经修饰gH的具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体；并且任选地具有带有根据SEQ ID NO：5(如实施例的构建体R-LM113中的gD，scFv HER2替换野生型gD的aa 31至63)、SEQ ID NO：6(如实施例的构建体R-LM249中的gD，scFv HER2替换野生型gD的aa 86-243)、SEQ ID NO：7(如实施例的构建体R-VG805中的gD，scFv EGFR替换野生型gD的aa 31至63)、SEQ ID NO：8(如实施例的构建体R-VG807中的gD，scFv-HER2替换野生型gD的aa 31至63)或SEQ ID NO：9(如实施例的构建体R-VG809中的gD，缺失野生型gD的aa 31至63)的氨基酸序列的经修饰gD，全部都缺乏信号序列(SEQ ID NO 5至9的残基1至25)，或者所述经修饰gD的具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体。除根据SEQ ID NO：9的gD之外，术语“功能性的”在此方面意指gH和/或gD分别能够介导在其表面上携带HER2和/或EGFR的细胞的感染。关于根据SEQ ID NO：9的gD，其意指具有缺失和无插入的gD不能够介导，特别是通过HVEM或连接蛋白-1来介导任何细胞的感染。

在第一方面的另一个具体实施方案中，重组感染性疱疹病毒具有带有根据SEQ IDNO：2或3的氨基酸序列的经修饰gH，其中所述gH包含如上限定的任何异源肽配体以替换scFv-HER2(特别是不为scFv-HER2)，或者所述经修饰gH的具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的功能性变体；并且任选地具有带有根据SEQ ID NO：5至9中任一个的氨基酸序列的经修饰gD，其中SEQ ID NO：5至9的gD包含如上限定的任何异源肽配体替换这些序列中限定的那些(分别为scFv-HER2和scFv-EGFR；任何方式，特别是不是这些中限定的异源肽配体)。除根据SEQ ID NO：9的gD之外，术语“功能性的”在此方面意指gH和/或gD能够介导感染在其表面上携带与gH/gD中包含的异源肽配体结合的分子的细胞。关于根据SEQ ID NO：9的gD，其意指具有缺失和无插入的gD不能够介导，特别是通过HVEM或连接蛋白-1来介导任何细胞的感染。

在一个优选实施方案中，所述疾病是肿瘤疾病、慢性感染性疾病或衰老相关性疾病。

肿瘤疾病优选地选自：肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS、肿瘤、乳腺癌、未知原发癌、卡斯尔曼病、宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、尤因家族肉瘤、眼癌、胆囊癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠间质肿瘤(GIST)、妊娠性滋养层病、霍奇金病、卡波西肉瘤、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、皮肤淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤-成体软组织癌、皮肤癌、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯瘤。

慢性感染性疾病优选地选自：肺结核、疟疾、慢性病毒性肝炎(HBV、丁型肝炎病毒和HCV)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS，由HIV人免疫缺陷病毒引起)和EBV相关性病症，例如系统性自身免疫病(系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和舍格伦综合征)或多发性硬化(MS)。

衰老相关性疾病优选地选自：(i)以过早老化为特征的称为早衰综合征的罕见遗传疾病：维尔纳综合征(WS)、布卢姆综合症(BS)、罗-汤综合症(RTS)、科凯恩综合征(CS)、着色性干皮病(XP)、毛发低硫营养不良或哈-吉早老综合征(HGPS)；以及(ii)常见的年龄相关性病症：肥胖、2型糖尿病、肌肉减少症、骨关节炎、特发性肺纤维化和慢性阻塞性肺病、白内障、神经变性疾病或癌症治疗相关性病症。

在第三方面，本发明涉及核酸，其包含第一方面的重组感染性疱疹病毒或者至少其与成熟gH或截短gH的N-端融合或者插入到gH中的异源多肽配体，任选地还有其与成熟gD或截短gD的N-端融合或者插入到gD中的异源多肽配体的基因组。应理解，核酸，特别是基因组，优选地不将经修饰gH和任选地经修饰gD编码为成熟蛋白质，而是编码为包含信号序列(SEQ ID NO：1的残基1至18和SEQ ID NO：4的残基1至25)的前体。代表性实例是根据SEQ IDNO 2、3和5至9的gH和gD。

在第四方面，本发明涉及载体，其包含第三方面的核酸。合适的载体在本领域中是已知的并且包括例如质粒、黏粒、人工染色体(例如细菌的、酵母的或人的)、噬菌体、病毒载体(例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)(特别是杆状病毒载体)或纳米改造物质(例如混合有机硅(ormosil))。

在一个实施方案中，载体是经修饰的，特别是通过缺失、插入和/或突变一个或更多个核酸残基而修饰的，使得其毒力减弱，优选地在病毒载体的情况下，或者使得其条件性地在患病细胞中复制但在未患病细胞中不复制。例如，包括用排他性地在癌细胞中表达的人基因启动子(例如存活蛋白启动子)替换γ₁34.5基因的启动子区，这将在非癌细胞中产生经减毒的表型而在癌细胞中产生未减毒的表型。另外的修饰可包括用排他性地在癌细胞中表达的基因启动子(例如存活蛋白启动子)替换负责IE基因转录的调控区(例如ICP-4启动子区)。此变化将产生能够在癌细胞中复制但不能在正常细胞中复制的复制条件性HSV。用于病毒子代增殖的细胞培养物细胞将提供高水平的特异性启动子活化蛋白以允许产生高病毒产率。

在第五方面，本发明涉及细胞，其包含第一方面的重组感染性疱疹病毒、第三方面的核酸或第四方面的载体。优选地，所述细胞是细胞培养物细胞。合适的细胞培养物和培养技术在本领域中是公知的，参见例如Peterson等，Comp Immunol Microbiol InfectDis.1988；11(2)：93-8。

在第六方面，本发明涉及第一方面的重组感染性疱疹病毒，其用作药物。

在第七方面，本发明涉及使用第一方面的重组感染性疱疹病毒来杀伤细胞的方法。在一个实施方案中，可以杀伤在细胞培养物中的在表面上携带靶分子的细胞，例如以测试第一方面重组感染性疱疹病毒的裂解效力。在另一个实施方案中，细胞是从患者获得的患病细胞，例如从癌症患者获得的肿瘤细胞，并任选地增殖。这种细胞被第一方面的重组感染性疱疹病毒感染并由此被杀伤。成功地杀伤从患者获得的细胞指示第一方面的重组感染性疱疹病毒在患者中的体内细胞特异性，即指示治疗成功。在另一个实施方案中，还可以从同一患者或从未患该患者所患疾病的对象获得未患病细胞(在表面上不携带靶分子的细胞)作为对照，作为未患病细胞是否容易遭受重组感染性疱疹病毒感染的指示。在另一个实施方案中，在从患者分离细胞群(例如白细胞分离术)之后，杀伤包含未患病细胞和患病细胞(例如癌细胞，例如白血病细胞)的细胞群(例如组织，例如血液)中所包含的患病细胞。这是为了获得不含患病细胞的细胞群，例如不含患病细胞(例如白血病细胞)的血液，特别是为了用于将细胞群稍后移植到患者中，优选地移植到细胞群所从中分离的同一患者中。在例如血液和白血病的情况下，这种方法提供了不含肿瘤细胞的血液的再输注。

在一个优选实施方案中，包括所述实施方案的第七方面的方法是一种体外方法。

在第八方面，本发明涉及用于在细胞中培养第一方面的重组感染性疱疹病毒的体外方法。用于在细胞中培养疱疹病毒的合适技术和条件在本领域中是公知的，参见例如Peterson等(Comp Immunol Microbiol Infect Dis.1988；11(2)：93-8)。在一个具体实施方案中，第一方面的重组感染性疱疹病毒包含如上文所述的经修饰gH和gD。优选地，在其中培养疱疹病毒的细胞携带与(i)经修饰gH中的配体或(ii)经修饰gD中的配体结合的靶分子。在(i)的情况下，经修饰gD中的配体结合需在患者中体内靶向的细胞，优选患病细胞的分子，经修饰gH中的配体结合需在细胞培养物中靶向的细胞的分子；在(ii)的情况下，经修饰gH中的配体结合需在患者中体内靶向的细胞，优选患病细胞的分子，经修饰gD中的配体结合需在细胞培养物中靶向的细胞的分子。

***

通过以下实施例描述本发明，这些实施例应被解释为仅是举例说明性的而不限制本发明的范围。应注意，在实施例中，关于gH的氨基酸残基引用与根据SEQ ID NO：1的前体蛋白相关，关于gD的氨基酸残基引用与成熟蛋白质(缺乏残基1至25的SEQ ID NO：4)相关。

实施例

实施例1：HSV重组体的构建，所述HSV重组体表达携带针对Her2的单链抗体(scFv)(scFv-HER2)的经遗传修饰gH、不具有或具有HSV基因中的缺失以及携带mCherry作为报告基因。

A)R-VG803：通过HSV-BAC和galK重组改造在HSV gH的aa 23和24之间插入scFv-HER2。

发明人通过在gH的AA 23和24之间插入编码曲妥珠单抗scFv的序列改造了R-VG801。起始基因组是pYEBac102，其携带插入在HSV-1基因组的UL3和UL4之间的LOX-P框入的pBeloBAC序列。改造通过galK重组改造进行。简言之，通过引物

gH6_galK_fATGCG

GTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO：10)和

gH5_galK_r TCGTGGGGGTTATTAT

TTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO：11)扩增与gH具有同源臂的GalK盒。将该盒电穿孔在携带pYEBac102的SW102细菌中。在包含补充有1mg/L D-生物素、0.2％半乳糖、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO₄·7H₂O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(15mM(NH₄)₂SO₄、100mM KH₂PO₄、1.8μgFeSO₄·7H₂O，调节至pH7)的平板上选择携带galK盒的重组克隆。为了排除galK假阳性细菌菌落，还将其在补充有1％半乳糖和12μg/ml氯霉素的McConKey琼脂基质平板上划线，并通过用引物

galK_129_fACAATCTCTGTTTGCCAACGCATTTGG(SEQ ID NO：28)和

galK_417_r CATTGCCGCTGATCACCATGTCCACGC(SEQ ID NO：29)进行菌落PCR来检测。接下来，作为两个单独片段从pSG-ScFvHER2-SG扩增被下述Ser-Gly接头并且被与gH的同源臂框入的曲妥珠单抗scFv盒，所述两个单独片段命名为片段#1和片段#2。pSG-ScFvHER2-SG携带被Ser-Gly接头框入的曲妥珠单抗scFv盒(SEQ ID NO：12)。片段#1使用pSG-ScFvHER2作为模板通过引物

gH23_8SG_scFv4D5_fTCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGCATAGTAGTGGCGGTGGCTCTGGATCCG(SEQ ID NO：13)和

scFv4D5_358_rGGAAACGGTTCGGATCAGCCATCGG(SEQ ID NO：14)扩增。片段#2使用pSG-ScFvHER2作为模板通过

gH24_12SG_scFv4D5r

ATGCGGTCCATGCCCAGGCCATCCAAAAACCATGGGTCTGTCTGCTCAGTACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC(SEQ ID NO：15)和scFv4D5_315_fGGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG(SEQ ID NO：16)扩增。使片段#1和#2退火并延伸以产生被Ser-Gly接头和与gH的同源臂框入的scFv-HER2盒。重组基因组携带被具有序列HSSGGGSG(SEQ ID NO：17)的上游Ser-Gly接头和具有序列SSGGGSGSGGSG(SEQ ID NO：18)的下游Ser-Gly接头框入的针对HER2的scFv。V_L和V_H之间的接头为SDMPMADPNR FRGKNLVFHS(SEQ ID NO：19)。在包含补充有1mg/L D-生物素、0.2％脱氧-2-半乳糖、0.2％甘油、45mg/L L-亮氨酸、1mM MgSO₄·7H₂O和12μg/ml氯霉素的M63培养基(参见上文)的平板上选择携带galk盒切除和所选序列(例如sc-Fv-HER2或mCherry)插入的重组克隆。还通过菌落PCR检测细菌菌落的所选序列的存在。

在R-VG801中，发明人随后在UL37-UL38基因间区域中插入mCherry红色荧光蛋白。mCherry序列在CMV启动子之下。首先，发明人插入通过寡核苷酸

UL37/38_galK_f

CCGCAGGCGTTGCGAGTACCCCGCGTCTTCGCGGGGTGTTATACGGCCACCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO：20)和

UL37/38_galK_r

TCCGGACAATCCCCCGGGCCTGGGTCCGCGAACGGGATGCCGGGACTTAATCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO：21)扩增的galK盒。随后，发明人用通过寡核苷酸

UL37/38_CMV_mcherry_f

CCGCAGGCGTTGCGAGTACCCCGCGTCTTCGCGGGGTGTTATACGGCCACCGATGTACGGGCCAGATATACG(SEQ ID NO：22)和

UL37/38_pA_mcherry_1958_r

TCCGGACAATCCCCCGGGCCTGGGTCCGCGAACGGGATGCCGGGACTTAACCATAGAGCCCACCGCATCC(SEQ ID NO：23)扩增的启动子-mCherry盒替换galK序列。

B)在HSV gH的aa 23和48之间插入scFv-HER2(R-VG811)

首先，发明人通过在gH的AA 23和48之间插入编码曲妥珠单抗scFv的序列改造了R-VG799。操作与上述改造R-VG803的gH中的scFv-HER2相同，但具有以下两个不同之处。第一，通过引物

gH29_galK_f

CGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCGGTCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO：24)和

gH5_galK_r

TCGTGGGGGTTATTATTTTGGGCGTTGCGTGGGGTCAGGTCCACGACTGGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO：25)扩增galK盒。第二，片段#2与用于产生R-VG803的片段#2的不同之处在于，其通过

gH48_12SG_scFv4D5_r

CCGCGCGGTGGTTTTTGGGGGTCGGGGGTGTTTGGCAGCCACAGACGCCCACCGGATCCACCGGAACCAGAGCC(SEQ ID NO：26)和scFv4D5_315_fGGAGATCAAATCGGATATGCCGATGG(SEQ ID NO：27)扩增。mCherry序列按照构建R-VG803详述的插入。

C)R-VG809：从R-VG803的gD缺失AA 6-38

R-VG809与R-VG803相同，并且另外地其携带gD中对应于AA 6-38的序列的缺失。起始物质是R-VG803BAC基因组。为了在gD中产生AA6-38缺失，用引物

gD5_galK_f

TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO：30)和

gD39_galK_r

ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO：31)扩增以与gD的同源臂为侧翼的galK盒。接下来，发明人用合成的双链寡核苷酸

gD_aa5_39_f_r

TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCACATCCAGGCGGGCCTACCGGACCCGTTCCAGCCCCCCAGCCTCCCGAT(SEQ ID NO：32)替换galK序列。

D)R-VG805：插入scFv-EGFR替换R-VG803gD的AA 6-38

用于R-VG805的起始物质是R-VG803BAC基因组。为了在gD中产生AA 6-38缺失，用引物

gD5_galK_f

TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO：33)和

gD39_galK_r

ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO：34)扩增以与gD的同源臂为侧翼的galK盒。接下来，发明人用scFv-EGFR盒替换BAC VG804中的galK序列，所述scFv-EGFR盒从pTNHaa-αEGFR(由Steve Russel博士，MayoClinic，Rochester友情提供)通过引物

BAC_LM611_f

TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGGCCGAGGTGCAACTGCAGCAGTC(SEQ ID NO：35)和

gD39_11SAG_EGFR_r

ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGACTTGCACTAGATGAAGCACTTCCTGCGGAAGATTTGATCTCGAGTTCTGTCCCCG(SEQ ID NO：36)扩增。下游接头具有序列SSAGSASSSAS(SEQ ID NO：37)，不存在上游接头。V_H和V_L之间的接头为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQID NO：38)。

E)R-VG807：插入scFv-HER2替换R-VG803gD的AA 6-38

用于R-VG807的起始物质是R-VG803BAC基因组。为了在gD中产生AA 6-38缺失，用引物

gD5_galK_f

TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGCCTGTTGACAATTAATCATCGGCA(SEQ ID NO：39)和

gD39_galK_r

ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGTCAGCACTGTCCTGCTCCTT(SEQ ID NO：40)扩增以与gD的同源臂为侧翼的galK盒。接下来，发明人用scFv HER2盒替换galK序列，所述scFv HER2盒从pSG-ScFvHER2通过引物

gD5_scFvHER2_f

TTGTCGTCATAGTGGGCCTCCATGGGGTCCGCGGCAAATATGCCTTGGCGTCCGATATCCAGATGACCCAGTCCC(SEQ ID NO：41)和

gD39_11SAG_HER2_r

ATCGGGAGGCTGGGGGGCTGGAACGGGTCCGGTAGGCCCGCCTGGATGTGACTTGCACTAGATGAAGCACTTCCTGCGGAAGAGGAGACGGTGACTAGTGTTCCTTGACC(SEQ ID NO：42)扩增。下游接头具有序列SSAGSASSSAS(SEQ ID NO：43)，不存在上游接头。V_H和V_L之间的接头为SDMPMADPNRFRGKNLVFHS(SEQ ID NO：44)。

为了重构重组病毒，通过Lipofectamine 2000(Life Technologies)将500ng重组BAC DNA转染到SK-OV-3细胞中，通过红色荧光监测病毒生长。通过测序gH并且对于R-VG809、R-VG805和R-VG807还测序gD ORF来验证重组体的结构。在SK-OV-3细胞或J-HER2细胞中产生并滴定病毒贮存液。

实施例2：R-VG803的gH中scFv-HER2插入的验证

用R-VG803(3PFU/细胞)和R-LM5(用于比较)感染Vero细胞，并在感染后72小时收获。对细胞裂解物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜上，并用针对gH的多克隆抗体进行免疫印迹。图2显示，与来自R-LM5的wt-gH相比，来自R-VG803的嵌合scFv-HER2-gH以更慢的电泳迁移率迁移，并且表观M_r为130K。

实施例3：用在gH中携带scFv-HER2的R-VG803对表达HER2作为唯一受体的J-HER2细胞进行感染测定

先前已经表明在gD中插入scFv-HER2赋予重组病毒R-LM113和R-LM249以通过HER2受体进入细胞的能力。为了提供在gH中插入scFV-HER2赋予R-VG803以通过HER2受体进入细胞的能力的证据，发明人利用表达HER2作为唯一受体的细胞。亲本J细胞不表达gD的受体，因此不能激活gD并且不被wt-HSV感染。J-HER2细胞转基因表达HER2作为唯一受体。作为对照，发明人包括转基因表达连接蛋白1或HVEM作为受体并且被wt-HSV感染的J-连接蛋白和J-HVEM细胞；以及表达人或动物HVEM/连接蛋白1直向同源物的人和动物细胞，即角质形成细胞HaCaT、神经元SK-N-SH、癌症Hela、MDA-MB-231、人成纤维细胞HFF14、仓鼠BHK细胞；以及表达HER2加HVEM/连接蛋白1的卵巢癌SK-OV-3细胞。如图3A示出的，R-VG803感染J-HER2细胞。由于R-VG803编码wt-gD，因此R-VG803对J-连接蛋白1、J-HVEM以及人和动物细胞的感染(图3A)并不令人惊讶。发明人还报道R-VG803可以在J-HER2细胞中进行细胞间播散。以0.01PFU/细胞感染细胞，并每天监测。在第1天，感染涉及单个细胞。在随后的数天内，感染涉及尺寸逐渐变大的细胞簇(图3B)。

为了证明R-VG803进入J-HER2细胞中通过HER2作为细胞受体而发生，并且为了研究gD在R-VG803进入SK-OV-3细胞中的进入途径中的作用，发明人首先确定感染通过HER2受体发生。在scFv-HER2衍生自的曲妥珠单抗(针对HER2的MAb)存在下用R-VG803感染J-HER2细胞。如通过荧光显微术检测的(图4A)和通过荧光激活细胞分选仪(fluorescentactivated cell sorter，FACS)量化的(图4B)，曲妥珠单抗阻断R-VG803对J-HER2细胞的感染。这证实了重靶向R-VG803使用HER2作为进入J-HER2细胞中之入口的结论。R-VG803可以利用HER2作为受体的发现提供可以通过在gH中改造异源配体来改变HSV的向性的证据。此外，gH重靶向HSV R-VG803进入J-HER2细胞中的感染可以在缺乏gD受体的细胞中发生，即在其中gD物理存在于R-VG803病毒体中但是由于其不能被其关联受体激活并且不能将激活传递于gH而在功能上消除的条件下发生。发明人得出R-VG803的感染不需要gD具有功能性受体结合位点的结论。接下来，发明人分析了表达两组受体(HER2和连接蛋白1/HVEM)的SK-OV-3细胞中的受体使用。问题是一种受体相对于另一种受体被优先使用，还是每种受体可替选地使用。在存在针对HER2的MAb(曲妥珠单抗)、MAb HD1或二者的情况下，用R-VG803感染SK-OV-3细胞。对照为R-LM5，其携带wt-gD以及R-VG803、R-LM249和R-LM113中存在的其他基因组修饰，即插入BAC序列和插入GFP标志物。R-LM249是一种通过将scFv-HER2插入在gD的AA 61-218缺失中而重靶向HER2的HSV。R-LM113是一种通过将scFv-HER2插入在成熟gD的AA 6-38缺失中而重靶向HER2的HSV。R-VG809也包括在内(参见实施例4)。图4C显示，针对HER2或HD1的MAb当单独给予时对R-VG803几乎不施加抑制，但是当一起给予时几乎消除感染。因此，R-VG803可以可替选地使用HER2或连接蛋白1/HVEM来感染SK-OV-3细胞。R-VG803对一个或另一个入口的使用取决于细胞展示的受体谱。如所预期的，完全重靶向R-LM249和R-LM113显示出依赖于HER2的进入途径。R-VG809的感染也被曲妥珠单抗单独地或与MAbHD1组合地抑制，得出以下结论：该重组体通过gH重靶向HER2，并且由于成熟gD中缺失AA 6-38而从连接蛋白1/HVEM脱靶。

实施例4：通过在gH中插入scFv-HER2而重靶向HER2并且通过缺失编码AA 6-38的gD序列而从gD受体脱靶的R-VG809重组体的遗传改造

发明人改造了在gH中携带scFv-HER2并且从gD缺失部分受体结合位点的重组体。gD的两种主要受体为连接蛋白1和HVEM。gD中HVEM的结合位点图谱绘制于AA 1-32。连接蛋白1在成熟gD中的结合位点较为广泛，并且包括Ig折叠核心和位于AA 35-38、199-201、214-217、219-221之间的部分。发明人从R-VG803成熟gD中缺失AA 6-38区域，即先前从R-LM113中缺失的相同区域，R-LM113为通过在成熟gD的AA 5和39之间插入scFv-HER2来重靶向HER2的HSV。缺失除去整个HVEM结合位点和一些参与与连接蛋白1相互作用的残基，参与与连接蛋白1相互作用的残基包括Ig折叠核心和位于AA 35-38、199-201、214-217、219-221之间的部分。尽管参与与连接蛋白1相互作用的少数AA缺失，但是R-LM113仍显示从连接蛋白1脱靶并且从HVEM脱靶，重组体从HVEM和连接蛋白1二者脱靶。命名为R-VG809的重组病毒不仅不能感染J-HVEM细胞，而且还不能感染J-连接蛋白1细胞以及人HaCaT、SK-N-SH、MDA-MB-231、HeLA、HFF14细胞、仓鼠BHK细胞。其维持高效地感染J-HER2和SK-OV-3细胞的能力(图5)。R-VG809的向性与R-VG803的向性明显不同(比较图5与图3A)。发明人得出结论，通过HER2重靶向gH的R-VG809感染不需要gD中具有HVEM和连接蛋白1的结合位点，并且因此不需要受体介导的gD激活。总之，R-VG809显示完全重定向的向性，其通过gH重靶向HER2受体并且从gD受体脱靶。图4示出了其进入SK-OV-3细胞中的途径。可以看出，与R-VG803的进入相反，曲妥珠单抗单独地抑制R-VG809进入SK-OV-3细胞中，这指示其完全通过HER2受体。

实施例5：通过在gH中插入scFv-HER2而重靶向HER2并且通过插入scFv-EGFR替换成熟gD的AA 6-38区域而重靶向EGFR的R-VG805的遗传改造。双重重靶向两种不同的选择受体加从gD受体脱靶。

发明人改造了通过在gH中插入scFv-HER2而重靶向HER2并且通过插入scFv-EGFR替换成熟gD的AA 6-38区域而同时重靶向EGFR的HSV重组体。简言之，对R-VG803进行修饰以用针对EGFR的scFv(在本文中命名为scFv-EGFR)替换成熟gD的内源性AA 6-38区域。命名为R-VG805的重组病毒确实通过gH而重靶向HER2，由于在成熟gD中缺失AA 6-38区域而从连接蛋白1和HVEM脱靶，并且由于插入针对EGFR的scFv替换成熟gD的AA 6-38而重靶向EGFR(图6)。发明人注意到，scFV-EFGR的插入使R-VG805重靶向，还重靶向EGFR-vIII，其为携带缺失的EGFR变体(图6)。这种EGFR变体在人胶质母细胞瘤中高度表达。这些结果表明，改造双重重靶向两种不同选择受体的HSV重组体是可能的。

实施例6：通过在gH中插入scFv-HER2并通过插入scFv-HER2替换成熟gD的AA 6-38区域而双重重靶向HER2的R-VG807重组体的遗传改造。双重重靶向相同的选择受体加从gD受体脱靶。

发明人改造了通过在gH中插入scFv-HER2并通过插入scFv-HER2替换成熟gD的AA6-38区域而重靶向HER2的HSV重组体。简言之，对R-VG803进行修饰以用scFv-HER2替换成熟gD的内源性AA 6-38区域。命名为R-VG807的重组病毒双重重靶向HER2，并且由于在成熟gD中缺失AA 6-38区域而从连接蛋白1和HVEM脱靶。

实施例7：scFv-HER2在gH中的插入位点的研究。缺失编码AA 24-47的序列。

发明人研究了scFv-HER2的插入是否可与gH的N-端部分的缺失相结合。缺失的部分是编码gH的AA 24-47的序列。将该序列用scFv-HER2替换。所得重组体命名为R-VG811。图7显示，R-VG811感染J-HER2细胞。因此，scFv-HER2的插入可与gH中至少直至AA 48的缺失相结合。这表示插入位点可以在AA 18的C-末端和AA 19至AA 48中任意AA的N-端。Atanasiu等(MBio.2013年2月26日；4(2).pii：e00046-13.doi：10.1128/mBio.00046-13)提出“gHΔ48/gL基于导致完全调节激活的途径而具有中间结构并且表明融合途径中的关键步骤是通过受体结合的gD将gH/gL转化为激活状态，此激活的gH/gL类似于gHΔ48/gL”。基于Atanasiu在细胞-细胞融合测定中而不是在病毒体-细胞进入中获得的结果，本领域的专家可假设在gH中缺失AA 24-47序列并用scFv-HER2进行其替换可能导致病毒更容易与细胞膜融合，并且因此相对于R-VG803能够增强感染。发明人将R-VG811和R-VG803(用于比较)的DNA-BAC转染在SK-OV-3和J-HER2细胞中，并通过表达mCherry标志物的细胞的量来确定病毒感染/形成程度。图7B至7D比较了在将R-VG811或R-VG803DNA转染在J-HER2或SK-OV-3细胞中之后获得的受感染细胞的量。实验的量化在图7C至7D中示出。整体上，R-VG811的感染性病毒产生的效率低于R-VG803，表明缺失在gH N-端的直至AA 48的AA降低重组体的感染能力。因此，Atanasiu等的结果不能预测携带scFv-HER2插入替换缺失的AA 24-47内源性gH序列的HSV重组体的表现。

实施例8：重组体的复制程度

发明人将R-VG803和R-VG809的复制程度与通过插入在gD中插入scFv-HER2而重靶向HER2的两种重组体R-LM113和R-LM249的复制程度进行比较。在表达HER2作为受体的J-HER2细胞中以及在表达HER2和连接蛋白1/HVEM作为受体的SK-OV-3细胞中测量复制。细胞以0.1PFU/细胞或0.01PFU/ml感染，并在感染后3、24、48小时收获。图8所示的结果显示，R-VG803和R-VG809与R-LM113或R-LM249一样高效地复制，或者在SK-OV-3细胞中甚至更高效地复制。

实施例9：R-VG803和R-VG809杀伤HER2阳性癌细胞的能力

作为R-VG803或R-VG809杀伤细胞的能力的量度，发明人通过AlamarBlue对HER2阳性SK-OV-3细胞进行了细胞毒性测试。包括wt HSV R-LM5以及重靶向R-LM113和R-LM249用于进行比较。图9显示，由R-VG803、R-VG809引起的细胞毒性与由R-LM113或R-LM249引起的细胞毒性非常类似。