CN107406353A

CN107406353A - 苯基乙炔基萘染料和用于它们用途的方法

Info

Publication number: CN107406353A
Application number: CN201680012071.0A
Authority: CN
Inventors: C·F·巴特瑞尔; T·马特雷; H·谢里夫; M·范布伦特
Original assignee: Sony Corp; Sony Pictures Entertainment Inc
Current assignee: Sony Corp; Sony Pictures Entertainment Inc
Priority date: 2015-02-26
Filing date: 2016-02-26
Publication date: 2017-11-28
Also published as: EP3262022A4; WO2016138457A1; US11084932B2; EP3262022A1; US20180237641A1; KR20170125354A; JP6982500B2; JP2018513836A; KR102646956B1

Abstract

公开了可用作荧光或着色染料的化合物。该化合物具有以下结构(I)：包括其盐，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、x和y如本文所定义。还提供了与制备相关的方法和这类化合物的用途。

Description

苯基乙炔基萘染料和用于它们用途的方法

背景

领域

本发明涉及新的包含苯基乙炔基萘基团的荧光或着色染料和它们的制备方法以及在多种分析方法中的用途。

相关技术的描述

持续且扩大需要检测和定量研究和诊断混合物中的作为分析物的化学、生化和生物物质的快速、高度特异性的方法。特别有价值的是用于测量小量核酸、肽、糖、药物、代谢物、微生物、离子和其他有诊断价值的物质的方法。这类物质的实例包括麻醉剂和毒物，施用用于治疗目的的药物，激素，病原微生物和病毒，肽，例如抗体和酶，以及核酸，特别是牵涉于疾病状态的那些。

特定分析物的存在经常可以通过利用表征许多生化和生物体系的高度特异性的方法来确定。常用方法基于例如抗原-抗体体系、核酸杂交技术和蛋白-配体体系。在这些方法中，有诊断价值的复合物的存在通常通过连接至相互作用材料中的一种或多种的可观察的“标记”的存在或不存在来表示。选择的特异性标记方法经常决定用于检测目的分析物的特定体系的有用性和通用性。优选的标记是便宜的，安全的，且能够被有效地连接至各种各样的化学、生化和生物材料，而不显著改变那些材料的重要结合亲和力。所述标记应当给予高度特征性信号，并且应当在自然界中罕见，优选从未发现。所述标记应当经范围长达数月的时间段在水体系中是稳定且可检测的。所述标记的检测是优选快速、灵敏且可重复的，而不需要昂贵、专门的设备或者不需要保护人员的特别预防措施。所述标记的定量优选相对独立于变量如待测定的混合物的温度和组成。

已经开发了各种各样的标记，其各自具有特定的优点和缺点。例如，放射性标记是相当通用的，并且可以在非常低的浓度进行检测。然而，这类标记是昂贵的，危险的，并且它们的使用需要复杂的设备和受过训练的人员。因此，对于非放射性标记特别是通过分光光度、自旋共振和发光技术可观察的标记和反应性材料如产生这类分子的酶，存在广泛的兴趣。

使用荧光光谱学可检测的标记是特别感兴趣的，因为本领域中已知大量这类标记。此外，文献中充满了经衍生化以允许它们附接至其他分子的荧光标记的合成，并且许多这类荧光标记是商业可得的。

花青染料已被广泛用于标记生物分子包括抗体、DNA探针、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、脂质、生化类似物、肽和药物，以及用于各种应用包括DNA测序、DNA微阵列、western印迹、流式细胞术分析和蛋白微阵列，仅举几例。科学家喜欢在生物应用中使用花青染料，因为除其他原因外花青染料1)是生物相容；2)具有高的摩尔吸光系数(约10⁵M^-1cm^-1)；3)容易修饰以匹配宽范围的期望的激发和检测波长(例如约500至约900nm)；4)能够掺入水溶性基团和连接基团；5)且具有有利的荧光特性。具体而言，Cy2共轭物(具有492nm左右的最大吸附/激发和510nm左右的发射，在可见光谱的绿色区域中)，由于对pH变化的降低灵敏度而通常用作FITC的替代物。然而，Cy2的低荧光量子产率、短荧光寿命、光漂白的倾向和差化学稳定性已经限制了其在化学和生命科学中的使用。

因此本领域需要在没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下允许目视或荧光检测生物分子的水溶性染料和生物标记物。理想地，这类染料和生物标记物应当强烈显色或发荧光并且应当以多种颜色和荧光波长可获得。本发明满足这种需要并且进一步提供相关优点。

发明概述

简言之，本发明通常涉及可用作能够目视检测生物分子和其他分析物的水溶性荧光染料或着色染料和探针的化合物，以及制备它们的试剂。还描述了用于目视检测生物分子以及用于确定生物分子大小的方法。本发明的水溶性荧光染料或着色染料强烈显色和/或发荧光并且可以通过视检或其他手段轻易地观察。在一些实施方案中，可以在没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下观察所述化合物。有利地，所述染料的实施方案具有范围为约400nm至约420nm的最大激发波长和范围为约520nm至约540nm的最大发射波长。例如，在某些实施方案中，所述染料具有在约410nm处的最大激发波长和在约553nm处的最大发射波长。因此，所述染料对于各种分析方法中的使用是理想的。通过适宜地选择如本文所述的染料可以获得具有多种颜色的目视可检测生物分子。

因此，在一个实施方案中，提供了具有以下结构(I)的化合物。

或其盐，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、x和y如本文中所定义。

在另一个实施方案中，提供用于对样品进行染色的方法，所述方法包括以足够在所述样品以适宜波长照亮时产生光学响应的量向所述样品添加如本文所述的代表性化合物。

仍然在其他实施方案中，本公开提供用于目视检测生物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供本文所述的代表性化合物；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

所公开的其他方法包括用于目视检测生物分子的方法，所述方法包括：

(a)将任一种所公开的化合物与一种或多种生物分子混合；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

其他实施方案涉及组合物，所述组合物包含任一种公开的化合物和一种或多种生物分子。还提供了这类组合物在检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。

本发明的这些方面和其他方面会在参考以下详述后而显而易见。

附图说明

在附图中，相同的参考数字表示相似的要素。在图中要素的尺寸和相对位置不必要按照比例绘制并且这些要素的一些被可以扩大并且放置以改善附图的可读性。进一步地，所绘制的要素的特定形状不旨在传达关于特定要素的实际形状的任何信息，并且为了便于在图中的识别而被单独选择。

图1描述了示例性化合物的UV光谱。示例性的化合物显示了在约410nm处的最大激发波长和在约533nm处的最大发射波长。

发明详述

在以下说明书中，阐述某些具体细节，旨在提供对本发明多个实施方案的透彻理解。但是，本领域技术人员将理解本发明可以在没有这些细节的情况下实施。

除非上下文另有需要，否则在本说明书和权利要求通篇范围内，词“包含”及其变例，如，“包含了”和“包含着”将解释成是开放、包括性意义，即，理解为“包括但不限于”。

本说明书通篇范围内对“一个实施方案“或“某个实施方案”的谈及意指在本发明的至少一个实施方案中包含与某实施方案联系所描述的具体特点、结构或特征。因此，短语“在一个实施方案中”或“在某个实施方案中”在本说明书通篇范围内多个位置的出现并不必然地全都指相同的实施方案。另外，具体特点、结构或特征可以在一个或多个实施方案中按任何适合的方式组合。

“氨基”是指-NH₂基团

“羧基”是指-CO₂H基团

“氰基”是指-CN基团

“甲酰基”是指-C(＝O)H基团

“羟”或“羟基”是指-OH基团

“亚氨基”是指＝NH基团

“硝基”是指-NO₂基团

“氧代”是指＝O取代基

“巯基”是指-SH基团

“硫代”是指＝S基团

“烷基”是指仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链基团，所述烃链基团是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或叁键)。在一些实施方案中，烷基具有1个至12个碳原子(C₁-C₁₂烷基)、优选地1个至8个碳原子(C₁-C₈烷基)或1个至6个碳原子(C₁-C₆烷基)，并且通过单键与分子的其余部分连接，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔-丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非在本说明书中另外声明，否则烷基可以是任选取代的。

“亚烷基”或“亚烷基链”指仅由碳和氢组成的使分子的其余部分与取代基连接的直链或支链二价烃链，所述二价烃链是饱和或不饱和的(即，含有一个或多个双键和/或叁键)并且具有1个至12个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正-亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正-亚丁烯基、亚丙炔基、正-亚丁炔基等。亚烷基链通过单键或双键与分子的其余部分连接并通过单键或双键与取代基连接。亚烷基链与分子其余部分及与取代基的连接点可以是经过链内部的一个碳或任何两个碳。“杂亚烷基”是指其中至少一个碳-碳键已经被碳杂原子(例如N、S或O)键替代的亚烷基。杂原子可以在杂亚烷基中的任何位置，包括末端位置使得杂原子将杂亚烷基与分子的剩余部分连接。除非在本说明书中另外声明，否则亚烷基链是任选取代的。

“氨基亚烷基”是指包含一种或多种氨基取代基的所定义的亚烷基。除非在说明书中另有明确说明，氨基亚烷基是任选取代的。

“烷氧基”指式-OR_a的基团，其中R_a是如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。“羟基烷氧基”为包含至少一个羟基取代基的烷氧基。“氨基烷氧基”为包含至少一个氨基取代基的烷氧基。除非在说明书中另有明确说明，烷氧基、羟基烷氧基和/或氨基烷氧基是任选取代的。

“烷基氨基”是指式-NHR_a或-NR_aR_a的基团，其中每一个R_a独立地为如上文定义的含有1个至12个碳原子的烷基。除非在说明书中另有明确说明，烷基氨基是任选取代的。

“烷基羰基”是指如上所定义的烷基，其通过羰基(C＝O)连接连接到分子的剩余部分。除非在说明书中另有明确说明，烷基羰基是任选取代的。

“烷基羰基氧基”是指式RC(＝O)O-的基团，其中R为如上所定义的烷基。除非在说明书中另有明确说明，烷基羰基氧基是任选取代的。

“烷基醚基”指如上文定义的任何烷基，其中至少一个碳-碳键用碳-氧键替换。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。烷基醚基包含至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个碳氧键(即，“聚烷基醚基”)。例如，在烷基醚的含义内部包括聚乙二醇(PEG)，其是聚烷基醚基。“羟基聚烷基醚基”是指包含一个或多个羟基取代基的聚烷基醚基。“氨基聚烷基醚基”是指包含一种或多种氨基取代基的聚烷基醚基。除非在说明书中另有明确说明，否则烷基醚、聚烷基醚、羟基聚烷基醚和/或氨基聚烷基醚的基团是任选取代的。

“亚烷基醚基”是指如上所定义的亚烷基，其中至少一个碳-碳键被碳-氧键替代。碳-氧键可以在末端上(如在烷氧基中)或碳氧键可以是内部的(即，C-O-C)。亚烷基醚基包含至少一个碳氧键，但是可以包括多于一个碳氧键(即，“聚亚烷基醚基”)。PEG连接基团是聚亚烷基醚基的实例。“羟基聚亚烷基醚基”是指包含至少一个羟基取代基的聚亚烷基醚基。“氨基聚亚烷基醚基”是指包含至少一个氨基(包括烷基氨基、芳基氨基和芳烷基氨基)取代基的聚亚烷基醚基。除非在说明书中另有明确说明，亚烷基醚、聚亚烷基醚、羟基聚亚烷基醚和氨基聚亚烷基醚的基团是任选取代的。

“芳基”是指包含6至18个碳原子和至少一个碳环芳环的碳环状环体系基团。出于本发明的目的，芳基可以是单环状、双环状、三环状或四环状环体系，其可以包括稠合或桥环体系。芳基包括但不限于衍生自苯并苊(aceanthrylene)、苊烯、荧蒽(acephenanthrylene)、蒽、薁、苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯、芘、和三亚苯的芳基。除非在本说明书中另外声明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(如“芳烷基”中)意在包括任选取代的芳基。

“芳基氨基”是指式-NR_aR_b的基团，其中R_a为如上所定义的芳基，和R_b为H、如上所述含有1-12个碳原子的烷基，或如上所定义的芳基。除非在说明书中另有明确说明，芳基氨基是任选取代的。

“芳氧基”是指式-OR_a的基团，其中R_a是如上所定义的芳基，例如苯氧基等。除非在说明书中另有明确说明，芳氧基可以是任选取代的。

“芳基羰基”是指如上所定义的芳基，其通过羰基(C＝O)连接连接至分子的剩余部分。除非在说明书中另有明确说明，芳基羰基基团是任选取代的。

“芳基羰基氧基”是指式RC(＝O)O-的基团，其中R为如上所定义的芳基。除非在说明书中另有明确说明，芳基羰基氧基基团是任选取代的。

“芳烷基”是指式-R_b-R_c的基团，其中R_b是如上文定义的亚烷基链并且R_c是如上文定义的一种或多种芳基，例如，苄基、二苯甲基等。除非在说明书中另有明确说明，芳烷基可以是任选取代的。

芳烷基氨基”是指式-NR_aR_b的基团，其中R_a为如上所定义的芳烷基，和R_b为H、如上所定义的含有1-12个碳原子的烷基、如上所定义的芳基或如上所定义的芳烷基。除非在说明书中另有明确说明，芳基氨基基团是任选取代的。

“碳环状环”是其中每一个环原子是碳的环。碳环状环可以是饱和或不饱和的，包括芳族环。除非在说明书中另有明确说明，否则碳环基是任选取代的。

“环烷基”指稳定非芳族单环状或多环状碳环状环，所述非芳族单环状或多环状碳环状环可以包括稠合或桥环体系，具有3个至15个碳原子，优选地具有3个至10个碳原子，并且是饱和或不饱和的以及通过单键与分子的其余部分连接。单环状环烷基例如包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环状环烷基例如包括金刚烷基、降冰片基、萘烷基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非在本说明书中另外声明，否则环烷基是任选取代的。

“多环的”指具有多于一个环的任何分子。这些环可以稠合、为螺环状或由一个或多个原子分隔(例如，通过非环连接基连接)。

“螺环”指其中两个环共有单个碳原子的多环分子。

“稠合的”是指稠合到本发明的化合物中的存在的环结构的本文所描述的任何环结构。当稠合的环是杂环基或杂芳基时，在存在的环结构上的任何碳原子(其变成稠合杂环基环或稠合杂芳基环的部分)可以被氮原子替代。

“卤”或“卤素”是指溴、氯、氟或碘。

“杂环基”或“杂环状环”是指稳定的三元至十八元芳环基(杂芳基)或非芳环基，其中至少一个环原子为选自氮、氧和硫的杂原子，并且剩余的环原子选自碳、氮、氧和硫。除非在说明书中另有明确说明，杂环基可以单环状、双环状、三环状或四环状环体系，所述环体系可以包括稠合或桥环体系；并且杂环基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季化；和杂环基可以是部分或完全饱和的。这类杂环基的实例包括但不限于二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、唑啉基、哌啶、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、硫吗啉基、1-氧代-硫代吗啉基和1,1-二氧代-硫代吗啉基。除非在本说明书中另外声明，否则杂环基是任选取代的。

“杂芳基”是指包含1个至13碳原子、1个至6个选自氮、氧和硫的杂原子和至少一个芳环的5元至14元环体系。出于本发明的目的，杂芳基可以单环状、双环状、三环状或四环状环体系，所述环体系可以包括稠合或桥环体系；并且杂芳基中的氮、碳或硫原子可以任选地氧化；氮原子可以任选地季化。实例包括但不限于吖庚因基、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二唑基、苯并呋喃基、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环己烯基、1,4-苯并二烷基、苯并萘并呋喃基、苯并唑基、苯并二唑基、苯并二氧杂环己烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并噻吩)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌啉基、二苯并呋喃基、二苯并噻吩基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、吲哚啉基，异吲哚啉基、异喹啉基、吲嗪基、异唑基、萘啶基、二唑基、2-氧代吖庚因基、唑基、环氧乙烷基、1-氧化吡啶基、1-氧化嘧啶基、1-氧化吡嗪基，1-氧基哒嗪基，1-苯基-1H-吡咯基，吩嗪基，吩噻嗪基、吩嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和噻吩基(即噻吩基)。除非在说明书中另有特别说明，杂芳基是任选取代的。

“羟基烷基”指包含至少一个羟基取代基的烷基。一个或多个-OH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则羟基烷基可以是任选取代的。

“羟基亚烷基”是指包含至少一个羟基取代基的亚烷基。一个或多个-OH取代基可以是在伯、仲或叔碳原子上。除非在说明书中另有明确说明，羟基亚烷基是任选取代的。

“羟基烷基醚基”指包含至少一个羟基取代基的烷基醚基。一个或多个-OH取代基可以在伯、仲或叔碳原子上。除非在本说明书中另外声明，否则羟基烷基醚基是任选取代的。

“磷酸酯基”是指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a为O^-或OR_c；和R_b为O^-、OR_c，另一个磷酸酯(如在二磷酸酯和三磷酯中)硫代磷酸酯、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚或硫代磷酰烷基醚的基团，其中R_c为反离子(例如，H+、Na+等)。

“磷酰基”是指二价-OP(＝O)(R_a)O-基团，其中R_a为O^-或OR_c；其中R_c为抗衡离子(例如H+、Na+等)。

“磷酰烷基”是指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a为O^-或OR_c；和R_b为-氧烷基，其中R_c为抗衡离子(例如H+、Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，磷酰烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在磷酰烷基中烷基基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基或磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代，其取代基是任选取代的。

“磷酰亚烷基”是指二价-OP(＝O)(R_a)R_b-基团，其中R_a为O^-或OR_c；和R_b为-氧亚烷基，其中R_c为抗衡离子(例如H+、Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，磷酰亚烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在磷酰烷基中的亚烷基基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基或磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代，其取代基是任选取代的。

“磷酰烷基醚基”是指-OP(＝O)(R_a)R_b基团，其中R_a为O^-或OR_c；和R_b为-氧烷基醚(包括聚烷基醚，例如聚氧乙烯醚等)，其中R_c为抗衡离子(例如H+、Na+等)。除非在说明书中另有明确说明，磷酰烷基醚基团是任选取代的。例如，在某些实施方案中，在磷酰烷基醚基团中的烷基醚基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、磷酰基、硫代磷酰基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代，其取代基是任选被取代的。

“亚磷酰胺基”是指-OP(OR^a)(NR^b ₂)基团，其中R^a为烷基和每一个R^b独立地为H或烷基。除非在说明书中另有明确说明，亚磷酰胺基团是任选取代的。

“活化磷”是指包含能够与亲核体反应(例如，在磷原子处与亲核体反应)的磷的任何部分。例如，磷酰亚胺基和包含P-卤素键的部分被包括于激活的含磷部分的定义内。除非在本说明书中另外声明，否则活化的含磷基团是任选取代的。

“硫代磷酸酯基”是指-R_dP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a和R_d各自独立地为O或S；R_b为O^-、S^-、OR_e或SR_e；R_c为O^-、OR_e、S^-、SR_e、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基；其中R_e为抗衡离子(例如H+、Na+等)和条件是：R_a为S；或R_b为S^-或SR_e；或R_c为S^-或SR_e；或Rd为S，或其组合。

“硫代磷酰基”是指二价-R_dP(＝R_a)(R_b)R_c-基团，其中R_a、R_c和R_d各自独立地为O或S；R_b为O^-、S^-、OR_e或SR_e；其中R_e为抗衡离子(例如H⁺、Na+等)并且条件是：R_a为S；或R_b为S^-或SR_e；或R_c为S；或Rd为S，或其组合。

“硫代磷酰烷基”是指-R_dP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a和R_d各自独立地为O或S，R_b为O^-、S^-、OR_e或SR_e；和R_c为-O烷基或-S烷基，其中R_e为抗衡离子(例如H+、Na+等)和条件是：R_a为S；或R_b为S^-或SR_e；或Rc为-S烷基；或R_d为S，或其组合。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酰烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，硫代磷酰烷基中的烷基基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代，其取代基任选被取代。

“硫代磷酰亚烷基”是指二价-R_dP(＝R_a)(R_b)R_c-基团，其中R_a和R_d各自独立地为O或S，R_b为O^-、S^-、OR_e或SR_e；和R_c为-氧亚烷基或-硫亚烷基，其中R_e为抗衡离子(例如H+、Na+等)和条件是：R_a为S；或R_b为S^-或SR_e；或Rc为-硫亚烷基；或R_d为S，或其组合。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酰亚烷基是任选取代的。例如，在某些实施方案中，硫代磷酰亚烷基中的亚烷基基团任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代。其取代基是任选取代的。

“硫代磷酰烷基醚基”是指-R_dP(＝R_a)(R_b)R_c基团，其中R_a和R_d各自独立地为O或S，R_b为O^-、S^-、OR_e或SR_e；和R_c为-O烷基醚基或-S烷基醚基，其中R_e为抗衡离子(例如H+、Na+等)和条件是：R_a为S；或R_b为S^-或SR_d；或R_c为-S烷基醚基；或R_d为S，或其组合。除非在说明书中另有明确说明，硫代磷酰烷基醚基团任选被取代。例如，在某些实施方案中，在硫代磷酰烷基中的烷基醚任选被一个或多个羟基、氨基、巯基、磷酸酯基、磷酰基、硫代磷酰基、硫代磷酸酯基、磷酰烷基、硫代磷酰烷基、磷酰烷基醚基或硫代磷酰烷基醚基取代，其取代基是任选取代的。

在本文中所使用的术语“取代的”是指上述任一基团(例如，烷基、亚烷基、氨基亚烷基、烷氧基、烷基氨基、烷基羰基、烷基羰基氧基、烷基醚基、聚烷基醚基、羟基聚烷基醚基、氨基聚烷基醚基、亚烷基醚基、聚亚烷基醚基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、芳基、芳基氨基、芳基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、芳烷基、芳烷基氨基、碳环状环、环烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、羟基烷基、羟基亚烷基、羟基烷基醚基、磷酰烷基、磷酰亚烷基、磷酰烷基醚基、亚磷酰胺基、活化磷、硫代磷酰烷基、硫代磷酰亚烷基和/或硫代磷酰烷基醚基)其中至少一个氢原子由与非氢原子形成的键替换，所述非氢原子例如是，但不限于卤原子如F、Cl、Br和I；多种基团如羟基、烷氧基和酯基中的氧原子；多种基团如硫醇基、硫代烷基、砜基团、磺酰基和亚砜基团中的硫原子；多种基团如胺基、酰胺基、烷基胺基、二烷基胺基、芳基胺基、烷基芳基胺基、二芳基胺基、N-氧基、酰亚胺基和烯胺基中的氮原子；多种基团如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和多种其他基团中的其他杂原子。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与杂原子(如氧代、羰基、羧基和酯基中的氧；和多种基团如亚胺、肟、腙和腈中的氮)形成的更高级键替换(例如，双键或叁键)。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子由-NR_gR_h、-NR_gC(＝O)R_h、-NR_gC(＝O)NR_gR_h、-NR_gC(＝O)OR_h、-NR_gSO₂R_h、-OC(＝O)NR_gR_h、-OR_g、-SR_g、-SOR_g、-SO₂R_g、-OSO₂R_g、-SO₂OR_g、＝NSO₂R_g，和-SO₂NR_gR_h替换的上述任一基团。“取代的”还意指其中一个或多个氢原子被-C(＝O)R_g、-C(＝O)OR_g、-C(＝O)NR_gR_h、-CH₂SO₂R_g、-CH₂SO₂NR_gR_h替代的任何上述基团。在前述中，R_g和R_h是相同的或不同的，并且独立地为氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基。“取代的”还意指上述任一基团，其中一个或多个氢原子由与氨基、氰基、羟基、亚胺基、硝基、氧代、硫酮基、卤素、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基、卤代烷基、杂环基、N-杂环基、杂环基烷基、杂芳基、N-杂芳基和/或杂芳基烷基形成的键替换。此外，前述取代基的每一者也可以任选由一个或多个上述取代基取代。

“荧光”指能够吸收特定频率的光并发射不同频率的光的分子。荧光是本领域普通技术人员熟知的。

“着色的”指吸收有色光谱(即，红色、黄色、蓝色等)内光的分子。

“连接基”指至少一个原子(如碳、氧、氮、硫、磷及其组合)的连续链，所述连续链将分子的一部分连接至相同分子的另一个部分或连接至不同分子、部分或固体载体(例如，微粒子)。连接基可以经共价键或其他方式如离子相互作用或氢键相互作用连接分子。连接基包括线性连接基、环状连接基和其组合。在一些实施方案中，连接基为亚烷基或杂亚烷基。

出于本发明的目的，术语“生物分子”指多种生物材料的任一者，所述生物材料包括核酸、糖、氨基酸、多肽、糖蛋白、激素、适配体及其混合物。更具体地，该术语意在包括而不限于RNA、DNA、寡核苷酸、修饰或衍生化的核苷酸、酶、受体、朊病毒、受体配体(包括激素)、抗体、抗原和毒素，以及细菌、病毒、血细胞和组织细胞。如本文进一步描述，通过以下方式制备本发明的目视可检测生物分子(即，与生物分子连接的结构(I)的化合物)：使生物分子与具有“M”基团的化合物接触，所述“M”基团能够借助生物分子上的任何可用原子或官能团如氨基、羟基、羧基或巯基，使该生物分子与化合物连接。

术语“可视的”和“目视可检测的”在本文中用来指没有事先光照或化学激活或酶促激活情况下通过视检可观察的物质。这类目视可检测的物质在范围从约300nm至约900nm的光谱区吸收并发光。优选地，这类物质强烈着色，优选地具有至少约40,000、更优选地至少约50,000、仍然更优选地至少约60,000、仍更优选地至少约70,000和最优选地至少约80,000M^-1cm^-1的摩尔消光系数。可以通过用肉眼观察，或借助基于光学的检测装置，包括而不限于，吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪，检测到本发明的生物分子。目视可检测的物质不限于在可见光谱发射和/或吸收光的那些。“目视可检测的”物质的范围内还包括在紫外(UV))区(约10nm至约400nm)、红外(IR)区(约700nm至约1mm)发射和/或吸收光的物质和在其他电磁波谱区发射和/或吸收的物质。

为了本发明的目的，术语“光稳定的可视染料”指如上文所定义那样目视可检测并且当暴露于光时没有显著改变或分解的化学部分。优选地，在暴露于光至少1小时后，光稳定的可视染料不显示明显的漂白作用或分解。更优选地，在暴露于光至少12小时、仍然更优选地至少24小时、然而仍更优选地至少1周和最优选地至少1个月后，可视染料稳定。适用于本发明化合物和方法中的光稳定可视染料的非限制性例子包含偶氮染料、硫靛蓝染料、喹吖啶酮颜料、二嗪、酞菁、芘酮、二酮吡咯并吡咯、喹酞酮和truarycarbonium。

本发明实施方案的目视可检测生物分子可用于广泛类型的生物化学应用和生物医学应用，其中需要确定特定生物分子的存在、位置或量。在另一个方面，因此，本发明提供一种用于目视检测生物分子的方法，包含：(a)向生物体系提供包含与生物分子连接的结构(I)的化合物的目视可检测生物分子；并且(b)通过其可视特性检测生物分子。

出于本发明的目的，短语“通过其可视特性检测生物分子”意指在没有光照或化学激活或酶促激活的情况下用肉眼或借助基于光学的检测装置观察生物分子，所述检测装置包括而不限于吸收分光光度计、透射光学显微镜、数码照相机和扫描仪。光密度计可以用来对存在的目视可检测生物分子的量定量。例如，可以通过测量相对光学密度确定两份样品中生物分子的相对量。如果已知染料分子/生物分子的化学计量并已知染料分子的消光系数，则也可以从光学密度的量值确定生物分子的绝对浓度。如本文所用，术语“生物体系”是用来指除目视可检测生物分子之外还包含一种或多种生物分子的任何溶液或混合物。这类生物体系的非限制性例子包括细胞、细胞提取物、组织样品、电泳凝胶、分析混合物和杂交反应混合物。

“微颗粒”是指可用于与本发明化合物连接的众多小粒子的任一个，包括但不限于玻璃珠、磁珠、聚合物珠、非聚合物珠等。在某些实施方案中，微粒子包含聚苯乙烯，例如聚苯乙烯珠。

本文公开的发明的实施方案还意在涵盖通过一个或多个原子由具有不同原子质量或质量数的原子替换而进行同位素标记的全部的结构(I)化合物。可以掺入所公开化合物的同位素的例子分别包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁵O、¹⁷O、¹⁸O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F、³⁶Cl、¹²³I、和¹²⁵I。

同位素标记的结构(I)化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与下文和以下实施例中所述的那些相似的方法，使用适宜的同位素标记试剂而非先前所用的非标记试剂来制备。

“稳定化合物”和“稳定结构”意指这样的化合物，所述化合物充分稳健以承受从反应混合物分离至有用纯度和配制成有效治疗剂。

“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或环境可能出现或可能不出现，并且这种描述包括其中所述事件或环境出现的情况及其中它不出现的情况。例如，“任选取代的烷基”意指烷基可以是取代的或可以是未取代的并且该描述包括取代的烷基和没有取代的烷基。

“盐”包括酸加成盐和碱加成盐。

“酸加成盐”指与无机酸和与有机酸形成的那些盐，所述无机酸例如是但不限于氢氯酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸例如是但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、延胡索酸、乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、黏酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟-2-萘酸、尼克酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对-甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸等。

“碱加成盐”指从添加无机碱或有机碱至游离酸所制备的那些盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环状胺和碱性离子交换树脂，如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙基胺、三丙基胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇、2-二甲氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、哈胺、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺、苄星、乙二胺、氨基葡萄糖、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂等。特别优选的有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

通常，结晶产生本发明化合物的溶剂化物。本发明包括所描述化合物的全部溶剂化物。如本文所用，术语“溶剂化物”指包含一个或多个分子的本发明化合物与一个或多个分子的溶剂的聚集物。溶剂可以是水，在这种情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本发明的化合物可以作为水合物存在，包括一水合物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等以及相应的溶剂化形式。本发明的化合物可以是真溶剂化物，而在其他情况下，本发明的化合物可以仅保留外来水或另一种溶剂或是水外加一些外来溶剂的混合物。

本发明的化合物(例如结构(I)的化合物)或其盐、互变异构体或溶剂化物可以含有一个或多个非对称中心并且因此可以产生可以根据绝对立体化学定义相对于氨基酸而定义为(R)-或(S)-或定义为(D)-或(L)-的对映异构体、非对映异构体及其他立体异构形式。本发明意在包括全部这类可能的异构体以及其消旋形式和光学纯形式。光学活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术例如色谱和分级结晶拆分。用于制备/分离各种对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体中手性合成或例如使用手性高压液相色谱(HPLC)拆分消旋物(或盐或衍生物的消旋物)。当本文所述的化合物含有烯属双键或其他几何非对称性中心时并且除非另外说明指定，否则该化合物意在包括E和Z几何异构体。同样，还意在包括全部互变异构形式。

“立体异构体”指由不可互换的借助相同键结合、但具有不同三维结构的相同原子组成的化合物。本发明构思了多种立体异构体及其混合物并且包括“对映异构体”，所述对映异构体是指其分子彼此是不可叠加镜像的两种立体异构体。

“互变异构体”指质子从分子的一个原子位移至同一分子的另一个原子。本发明包括任何所述化合物的互变异构体。化合物的多种互变异构形式可由本领域普通技术人员容易地衍生。

使用ACD/命名9.07版软件程序和/或ChemDraw第11.0版软件命名程序(CambridgeSoft)，本文所用的化学命名方案和结构简图是I.U.P.A.C.命名系统的修改形式。还使用本领域普通技术人员熟悉的通用名。

“键合”是指一个分子或原子与另一个原子或分子相联系的方法。键合包括离子键合、共价键合、螯合、缔合络合、氢键合等。能够使与分析物分子或固体载体键合的基团为能够通过任何以上方法与分析物分子或固体载体相联系的基团。在一个实施方案中，基团通过共价键合于分析物分子或固体载体键合(即，能够与分析物分子或固体载体形成共价键的基团)。

如上所指出，在本发明的一个实施方案中，提供了在多种分析方法中可用作荧光和/或着色染料的化合物。在一些实施方案中，该化合物具有以下结构(I)：

或其盐，其中：

R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-SO₃ ^-、-SO₃烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；或R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的一个与R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的另一个连接形成碳环状环或杂环状环，和剩余R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-OSO₂ ^-、-OSO₂烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；

R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地为H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的一个或多个与相同环上的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的另外一个或多个(例如一个或两个)连接形成单或稠合双环碳环或杂环和剩余的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；

R³在每次出现时独立地为选自聚烷基醚基、聚亚烷基醚基、羟基烷氧基、羟基烷基、羟基亚烷基、氨基亚烷基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚基、羟基聚亚烷基醚基、氨基聚烷基醚基、氨基聚亚烷基醚基、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、膦酰基、硫代膦酰基、膦酰烷基、膦酰亚烷基、膦酰烷基醚基、硫代膦酰烷基、硫代膦酰亚烷基、硫代膦酰烷基醚基、亚磷酰胺基和活化磷的单价或二价官能团；

M为不存在、H或能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或M为分析物分子或固体载体；和

L¹和L²在每次出现时独立地为任选的连接基；

x和y各自独立地为0-4的整数，和x和y的总和为2或更大；

z为1-10的整数；和

条件是R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的至少一个为-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

在一些实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的至少一个为-L¹-(R³)_z-L²-M。在其他实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f至少一个为-L¹-(R³)_z-L²-M。仍然在更多的实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的至少一个为-L¹-(R³)_z-L²-M。

在某些实施方案中，结构(I)的化合物包含两个乙炔基苯基基团，和x和y的总和为2。在这些实施方案的一些中x为0和y为2。

在一些更具体的实施方案中，该化合物具有以下结构(Ia)：

在其它更具体的实施方案中，该化合物具有以下结构(Ib):

在一些实施方案中，R^1a为-L¹-(R³)_z-L²-M。在其它实施方案中，R^1d、R^1e或R^1f之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。仍然在不同的实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。仍在其它实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的两个为-L¹-(R³)_z-L²-M。

在一些更多的实施方案中，R^1a和R^1b二者均为-L¹-(R³)_z-L²-M。在其它实施方案中，R^1a或R^1b之一为-L¹-(R³)_z-L²-M和R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。在一些其它实施方案中，R^1a或R^1b之一为-L¹-(R³)_z-L²-M和R^1d、R^1e或R^1f之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。

在一些其它实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的至少一个为氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基或杂环基。例如，在某些实施方案中，R^2c或R^2h或二者为氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基或杂环基。在这些实施方案的一些中，烷基氨基为二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基或乙基异丙基氨基。在这些实施方案的其它中，芳基氨基为二苯基氨基。在仍然更多的这些实施方案中，杂环基为N-吡咯烷基或N-吡咯基。

在一些实施方案中，R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地为H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

在其它实施方案中，一个或多个R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j与相同环上另一个或多个(例如，一个或两个)R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j连接形成单或稠合双环碳环或杂环状环和剩余的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地为H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。例如，在一些实施方案中，该化合物具有以下结构之一：

在任何前述实施方案中，R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为卤素、烷氧基或芳基氧基。例如，在一些实施方案中，R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个卤素。在其它实施方案中，R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为烷氧基。仍然在其它实施方案中，R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为芳基氧基。

在其它任何前述实施方案中，R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为H。例如，在一些实施方案中，R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ和R^2j的每一个为H。

在一些其它任何前述实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-SO₃ ^-、-SO₃烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

例如，在一些实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为C₁-C₆烷氧基、芳基氧基或C₁-C₆烷基羰基氧基。在这些实施方案的一些中，C₁-C₆烷氧基为甲氧基。

在其它前述实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为氨基、烷基氨基、芳基氨基或芳烷基氨基。在这些实施方案的一些中，烷基氨基为二甲基氨基。

在其它实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为卤素或硝基。

仍在其它实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为-SO₃ ^-或-SO₃烷基。

在一些更多的实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为C₁-C₆烷基或芳基。在这些实施方案的一些中，C₁-C₆烷基为甲基或乙基。

在其它任何前述的实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或的至少一个为烷基羰基或芳基羰基。

在任何前述结构(I)的化合物的更多的实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的一个与R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的另一个连接形成碳环状环或杂环状环和剩余的R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-OSO₂ ^-、-OSO₂烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

在其它任何前述实施方案中，该化合物具有以下结构的一个：

在一些实施方案中，L¹存在。例如，在某些实施方案中，L¹为C₁-C₆亚烷基。在某些其它实施方案中，L¹为C₁-C₆杂亚烷基。

在一些实施方案中，L²存在。例如，在某些实施方案中，L²为C₁-C₆亚烷基。在某些其它实施方案中，L²为C₁-C₆杂亚烷基。在其它实施方案中，L²包含环状连接基团。

在任何前述化合物的某些实施方案中，R³选自聚烷基醚基、磷酸酯基、磷酰基和磷酰烷基。例如，在一些实施方案中，R³选自：

其中n为1-6的整数和m为2-10的整数。

仍然在其它实施方案中，-(R³)_z-L²-M具有以下结构之一：

在一些不同的实施方案中，R³为亚磷酰胺和M不存在。

在其它实施方案中，M不存在或为H。

仍然在其它实施方案中，M为能够与分析物分子或固体载体结合的基团。在某些实施方案中，M提供了将结构(I)的化合物连接至分析物分子或固体载体的方法(例如通过共价键)。例如，在一些实施方案中，M为能够与分析物分子或固体载体形成共价键的反应性基团。在这方面，不限制M基团的类型和M基团与结构(I)化合物的剩余部分的连接性。在某些实施方案中，M为在水性条件下不容易水解的基团，但足够具有反应性与在分析物分子或固体载体上的相应基团(例如胺)形成键。

结构(I)的化合物的某些实施方案包含通常在生物共轭领域采用的M基团。例如，在一些实施方案中，M为亲核反应性基团，亲电子反应性基团或环加成反应性基团。在一些更具体的实施方案中，M为巯基、二硫基、活化酯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、炔基、烯基、二烯基、亲二烯基、酰卤基、磺酰卤基、膦、α-卤代酰亚胺基、生物素、氨基或马来酰亚胺基。在一些实施方案中，活化酯基为N-琥珀酰亚胺酯基、亚氨酸酯基或聚氟苯基酯基。在其它实施方案中，炔基是烷基叠氮基或酰基叠氮基。

示例性的M基团在以下表I中提供。

表1.示例性的M基团

在一些实施方案中，有利地采用结构(I)的化合物，其中M为-SH，因为-SH可以容易地共轭到许多分析物分子和/或固体载体(例如通过与分析物分子或固体载体上的自由的巯基形成二硫键)。然而，为了结构(I)化合物的长期稳定性的目的，以二硫化物的二聚体的形式储存化合物可能是需要的。因此，一些实施方案提供了这种二硫化物二聚体。例如，在一些实施方案中，R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的至少一个为-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I,其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物.

二聚体可以在R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的任一个和R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的另一个之间形成。为了易于解释说明，但不限制，以下阐明了示例性的二聚体(I’)(其中该二聚体在两个R^1a基团之间形成)：

其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R³、L¹、L²、x、y和z各自独立地如任何前述实施方案所定义。

该二聚体还如下(I’)阐明：

在多种不同的实施方案中，该二聚体具有以下结构(Ia’)：

在其它实施方案中，该二聚体具有以下结构(Ib’)：

结构(I)的两个化合物，即-L¹(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-之间的二硫化物连接基可以具有多种不同的结构。在一些实施方案中，-L¹(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-具有以下结构之一：

仍然在其它实施方案中，M为分析物分子或固体载体。例如，在一些实施方案中，分析物分子为生物分子。在一些实施方案中，生物分子为核酸、氨基酸或其聚合物。在其它实施方案中，生物分子为核酸、肽、碳水化合物、脂质、酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体、抗原或朊病毒。

在不同的实施方案中，分析物分子为药物、维生素或小分子。

通常选择结构(I)的化合物的结构以优化激发和/或发射波长。因此，在多种不同的实施方案中，结构(I)的化合物具有约390nm至约430nm范围的最大波长，例如约400nm至约420nm。在其它实施方案中，结构(I)的化合物具有约510nm至约550nm范围的最大发射波长，例如由约520nm至约540nm。例如，在某些实施方案中，染料在约410nm处具有最大激发波长和在约533nm处具有最大发射波长。

在一些更具体的实施方案中，结构(I)的化合物具有以下结构之一：

或其盐，其中M是能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或M为分析物分子或固体载体，例如微颗粒，其经由任选的连接基共价连接。在一些前述实施方案中，M为-SH。

在多种其它实施方案中，提供了包含任何所公开的化合物和一种或多种生物分子的组合物。在一些实施方案中，还提供了如以下更详细描述的这种组合物在用于探测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。

应当理解，如以上所述的结构(I)的化合物的任何实施方案和本文对于如上所述的在结构(I)的化合物中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、R³、L¹、L²、M、x、y或z变量所述的任何具体选择可以独立地与其它实施方案和/或结构(I)的化合物的变量组合以形成以上并未具体说明的本发明的实施方案。此外，在一个具体实施方案和/或权利要求中针对任何特定R、L、M、x、y或z基团列出一系列选择的情况下，可以理解，每种独立选择可以从该具体实施方案和/或权利要求删除并且剩余的一系列选择将视为处于本发明的范围内。

可以理解，在本说明书中，允许所述式的取代基和/或变量的组合，只要这类组合产生稳定的化合物。

本领域技术人员还将领会，在本文所述的方法中，中间化合物的官能团可能需要通过合适的保护基保护。这类官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基包括叔丁氧羰基、苯甲氧基羰基等。巯基的合适保护基包括-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可以根据本领域技术人员已知和如本文所述的标准技术添加或移除保护基。保护基的用途是在Green,T.W.and P.G.M.Wutz,Protective Groups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley中详述。如本领域技术人员将领会，保护基也可以是聚合物树脂如Wang树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基氯脂。

此外，以游离碱或酸形式存在的本发明的所有化合物(例如结构(I)的化合物)可以通过本领域技术人员已知的方法使用适当的无机或有机碱或酸转化为它们的盐。本发明的化合物的盐可以通过标准技术转化成它们的游离碱或酸。

以下反应方案阐明了制备本发明化合物(即结构(I)的化合物)的示例性方法：

或其盐，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e、R^1f、R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ、R^2j、x和y如本文所限定。

可以理解，本领域技术人员可能通过相似的方法或通过组合本领域技术人员已知其他方法，能够制备这些化合物。还应当理解，通过使用适宜的起始组分并根据需要修改合成的参数，本领域技术人员将能够以如下文描述的相似方式制备下文没有具体描述的其他的结构(I)化合物。通常而言，起始组分可以从多种来源如Sigma Aldrich、LancasterSynthesis,Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等获得或根据本领域技术人员已知的来源(参见，例如，Advanced Organic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版(Wiley,December 2000))合成或如本发明中所述那样制备。

反应方案I

反应方案I阐明了用于制备结构(I)示例性化合物的示例性方法。参考反应方案1，结构A和B的化合物可以购买或通过本领域普通技术人员已知的方法制备。

用强碱(例如正丁基锂)处理2当量的A，随后与B反应产生结构C的化合物。结构C的化合物可以进一步通过与9-BBN和合适的前体的反应官能化以连接基团L¹以制备结构D的化合物。随后化合物D用希望的R³基团官能化。通用反应方案I阐明了在R³位置包含亚磷酰胺基的结构(I)的化合物(化合物E)，其它具有不同R³基团的结构(I)的化合物经由类似的方式制备。

虽然通用反应方案I描绘了结构(I)的对称(即相同的苯基)化合物的制备，但是对于本领域普通技术人员来说，结构(I)的其它非对称化合物可以通过类似的方法制备(例如，不同取代的苯基的逐步反应)是显而易见的。还应当注意到通用反应方案I阐明了其中L¹为亚烷基连接基的结构(I)的化合物，但其他具有不同连接基团或无连接基团的式(I)的化合物经由类似的方法制备。

进一步地，通过上述方法获得的结构(I)的化合物可以进一步改性以获得不同的结构(I)的化合物。例如，在某些实施方案中，亚磷酰胺基E进一步使用普通技术(例如类似于固相DNA合成的技术)官能化以获得包含多种不同R³基团的结构(I)的化合物。反应性基团(M)使用本领域已知并且更详细地描述于实施例中的技术连接至R³基团。

分析物分子(例如生物分子)可以通过许多普通方法的任何一种经由任选的L²连接基连接。例如，结构(I)化合物的实施方案包括能够与分析物分子上的官能团形成共价键的M基团作为用于连接分析物分子的手段。在某些实施方案中，M基团包括但不限于活化磷化合物(例如亚磷酰胺基)、活化酯基、胺基、醇基等。制备这类化合物并且将其与分析物分子反应以形成共价键的方法是领域熟知的。

在一些实施方案中，结构(I)的化合物包含连接到寡核苷酸的共价键。这些键可以通过在结构(I)的化合物中包括亚磷酰胺基团并且在标准DNA合成条件下将其与低聚物(或亚磷酰胺单体)反应形成。DNA合成方法是本领域熟知的。简言之。两个醇分别使用二甲氧基三苯甲基(DMT)基团和2-氰乙基-N,N-二异丙基氨基亚磷酰胺基官能化。亚磷酰胺基团通常在活化剂例如四唑的存在下偶合至醇基团，随后用碘氧化磷原子。二甲氧基三苯甲基基团可以用酸移除(例如氯乙酸)以露出游离醇，其可以与亚磷酰胺基团反应。2-氰乙基基团可以在低聚之后通过使用氨水处理而移除。

用于低聚方法中的亚磷酰胺的制备也是本领域熟知的。例如，伯醇可以通过与DMT-Cl的反应作为DMT基团保护。仲醇随后通过与合适的试剂例如2-氰乙基-N，N-二异丙基氯亚磷酰胺的反应官能化为亚磷酰胺。制备亚磷酰胺和它们低聚的方法是本领域熟知的并且在实施例中更详细地描述。

仍然在其它实施方案中，该化合物可用于多种不同的分析方法。例如在某些实施方案中，本公开内容提供了将样品染色的方法，该方法包括以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加结构(I)的化合物。

在前述方法的其它实施方案中，M为分析物分子例如生物分子。例如，在一些实施方案中，该生物分子为核酸、氨基酸或其聚合物(例如多核苷酸或多肽)。仍然在更多的实施方案中，生物分子为酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体或朊病毒。

还在前述方法的其它实施方案中，M为微粒子。例如，在一些实施方案中，微粒子为聚合物珠或非聚合物珠。

在甚至更多的实施方案中，所述光学响应是荧光响应。

在其他实施方案中，所述样品包含细胞，并且一些实施方案进一步包含通过流式细胞术观察所述细胞。

在仍然更多的实施方案中，该方法进一步包含区分所述荧光响应与具有可检出不同光学特性的第二荧光团的荧光响应。

在其他实施方案中，本公开提供一种用于目视检测分析物分子的方法，包含：

(a)提供结构(I)的化合物，其中M为分析物分子；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

例如，在一些实施方案中，生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物(例如，多核苷酸或多肽)。在仍然更多的实施方案中，分析物分子是酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适配体或朊病毒。

在其他实施方案中，提供一种用于目视检测生物分子的方法，所述方法包含：

(a)将任一种前述化合物与一种或多种生物分子混合；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

例如，在一些实施方案中，与一种或多种生物分子混合的化合物将为式(I)的化合物，其中M为反应性基团，和在进一步的实施方案中，反应性基团形成共价键或其它与生物分子相关的强联系。

如以上所指出，结构(I)的化合物的某些实施方案包含分析物分子(例如生物分子)或与其连接(共轭)的配体。连接例如可以通过共价连接、离子连接、dated bonding、氢键连接和其它形式的分子连接。

许多类型的分析物分子适用于共轭于结构(I)的化合物。例如，本发明有用的共轭底物包括但不限于包含连接其上的分析物分子的结构(I)的化合物(本文也称为“共轭的底物”)，分析物分子选自抗原、小分子、类固醇、维生素、药物、半抗原、代谢物、毒素、环境污染物、氨基酸、肽、蛋白质、光敏剂、核苷酸、寡核苷酸、核酸、碳水化合物、脂质、离子络合部分和非生物聚合物。在一个示例性的实施方案，共轭的底物是天然或合成的氨基酸、天然或合成的肽或蛋白质或离子络合部分。示例性肽包括但不限于蛋白酶底物、蛋白激酶底物、磷酸酶底物、神经肽、细胞因子和毒素。示例性的蛋白质共轭物包括酶、抗体、凝集素、糖蛋白、组蛋白、铝、脂蛋白、抗生物素蛋白、链霉亲和素、蛋白质A、蛋白质G、酪蛋白、藻胆蛋白、其他荧光蛋白、激素、毒素、生长因子等。

分析物分子与结构(I)的化合物的剩余部分的连接点可以并且将取决于于实施方案而变化。另外，一些实施方案包括分析物分子和结构(I)化合物剩余部分之间的连接基(L²)，虽然使用连接基是任选的并且不要求在所有实施方案中使用。还可以预见结构(I)的化合物可以包含多于一个分析物分子。例如可以将两个、三个或多于三个分析物分子共轭至化合物(I)的萘基和/或苯基环上。

将染料连接至多种不同类型分析物分子的许多方法是本领域熟知的。例如，将染料共轭至分析物分子的方法描述于R.Haugland,The Handbook:A Guide to FluorescentProbes and Labeling Technologies,第9版,2002,Molecular Probes,Inc.，和其中引用的文件the references cited therein；and Brindley,1992,Bioconjugate Chem.3:2，其全部通过引用并入本文。通过实施例的方式，公开内容的化合物可以包括通过酰胺、酯、醚或硫代醚键经由一个或多个嘌呤或嘧啶碱基连接至DNA或RNA的共价键，或其通过为酯基、硫代酯基、酰胺基、醚基或硫代醚基连接至磷酸酯基或糖类。或者，结构(I)的化合物可以通过化学后改性，例如使用铂试剂，或使用可光活化的分子，例如共轭的补骨脂素连接到核酸上。

本发明的化合物可用于许多应用，包括在U.S.专利Nos.7,172,907；5,268,486；和U.S.专利申请Nos.20040014981；和20070042398中对其它染料描述的那些，其所有通过引用以其实体并入本文。例如，荧光染料，例如本文描述的那些，可以用于使用例如基于荧光检测的那些技术的成像，包括但不限于荧光寿命、各向异性、光诱导电子转移、光漂白恢复和非放射性转移。结构(I)的化合物本身可以用于所有基于荧光的成像，显微镜和光谱技术，包括其变体。另外，它们还可以用于光动力学治疗和多模态成像。示例性荧光检测技术包括涉及检测系统内产生的荧光的技术。这类技术包括但不限于荧光显微镜、荧光激活细胞分选(FACS)、荧光流式细胞术、荧光相关光谱(FCS)、荧光原位杂交(FISH)、多光子成像、弥漫光学断层扫描、细胞和组织中的分子成像、一纳米精度的荧光成像(FIONA)、自由基引发肽测序(FRIP)和膜电位二次视网膜成像(SHRIMP)以及本领域已知的其它方法。

或者，结构(I)的化合物可以用作标记物或标签来跟踪活细胞中的动态行为。在这方面，光漂白后的荧光恢复(FRAP)可与本发明化合物组合使用，以使用高强度激光选择性地破坏感兴趣区域内的荧光分子，然后用低强度的激光在一段时间内监测新的荧光分子进入漂白区域的恢复。FRAP的变体包括但不限于偏光FRAP(pFRAP)、光漂白中的荧光损失(FLIP)和光漂白后的荧光定位(FLAP)。来自FRAP和FRAP的变体的所得信息可以用于检测动力学性质，包括荧光标记分子的扩散系数、流动分数和传输速率。这种基于光漂白技术的方法描述于Braeckmans,K.et al.,Biophysical Journal 85:2240-2252,2003；Braga,J.etal.,Molecular Biology of the Cell 15:4749-4760,2004；Haraguchi,T.,CellStructure and Function 27:333-334,2002；Gordon,G.W.et al.,Biophysical Journal68:766-778,1995，其全部以其实体通过引用并入本文。

其它荧光成像技术基于非放射性能量转移反应，其是供体和受体之间的能量转移的均匀发光测定。可以采用本发明荧光染料的用途这些技术包括但不限于FRET、FET、FP、HTRF、BRET、FLIM、FLI、TR-FRET、FLIE、smFRET和SHREK。这些技术是FRET的所有变体。

本发明化合物可用作生物传感器生物传感器，例如Ca²⁺离子指示剂、pH指示剂、磷酸化指示剂或其它离子的指示剂，例如镁、钠、钾、氯化物和卤化物。例如，生物化学过程经常涉及生物分子的质子化和去质子化，伴随着环境pH值的变化。使用不同pH敏感基团的中位置取代产生各种具有不同pKa的NIR荧光pH传感器。为了有效，中间位置的取代基将在具有荧光团核的延长的π-共轭中以响应不同的环境来实现显著的光谱变化。

所公开的化合物的用途决不限于分析方法。在多种不同的实施方案中，该化合物在多种不同的应用中用作着色剂或染料。在这方面，在萘和/或苯基基团上的取代基不特别限制，只要该化合物保持其理想的颜色和/或吸收和/或发射性能。用于该目的的适当的取代基的选择在本领域技术人员的技能之内。

在一些实施方案中，本文公开的化合物在纺织品、塑料、油漆和/或安全装置(例如反光材料、应急灯、发光棒等)中用作染料或着色剂。本领域技术人员将容易地认识到所公开化合物的其它用途。

提供以下实施例用于解释说明的目的，而不是限制。

实施例

一般方法

在JEOL 400MHz谱仪上获得¹H谱。¹H谱参比TMS。使用具有保持在45℃的2.1mm x50mm Acquity BEH-C18柱的Waters Acquity UHPLC系统进行反相HPLC染料分析。使用MassLynx4.1采集软件，在Waters/Micromass Quattro micro MS/MS(仅以MS模式)系统上进行质谱分析。用于染料上LC/MS的流动相是100mM 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇(HFIP)，8.6mM三乙胺(TEA)，pH 8。使用具有二极管阵列检测器的Agilent Infinity 1260 UHPLC系统和使用Spirit^TMPeptide C18柱(4.6mm x 100mm,5μm粒径)的高性能自动进样器分析亚磷酰胺和前体分子。使用鎓阳离子注入增强电离法¹获得单体中间体的分子量。在Cary Eclipse分光光度计上记录激发和发射谱实验。

除非另有说明，所有反应在氮气气氛下在烘箱干燥的玻璃器皿中进行。市售的DNA合成试剂由Glen Research(Sterling,VA)购买。无水吡啶、甲苯、二氯甲烷、二异丙基乙基胺、三乙胺、乙酸、吡啶和THF购自Aldrich。所有其他化学制品购自Aldrich或TCI并且用作其本身无额外的纯化。

所有寡核苷酸染料使用基于亚磷酰胺偶合的方法的标准草案在ABI 394 DNA合成仪上合成。用于合成寡核苷酸磷酰胺酯的链组装周期如下：(i)脱三苯甲基化，在二氯乙烷中的3％三氯乙酸，1分钟；(ii)偶合，在乙腈中0.1M亚磷酰胺和0.45M四唑，10分钟；(iii)封端，在THF/二甲基吡啶中0.5M的乙酸酐，1/1，v/v 15s；(iv)氧化，在THF/吡啶/水中0.1M的碘，10/10/1，v/v/v,30s。

在周期内中的化学步骤之后是乙腈洗涤和用干燥的氩气冲洗0.2-0.4分钟。由载体的切割以及移除基体和磷酰胺酯保护基团通过在室温下氨水处理一小时来实现。随后通过上述反相HPLC分析寡核苷酸染料。

实施例1

9,10-取代的蒽染料亚磷酰胺单体(3)的合成

根据以上方案制备化合物3。其它结构(I)的化合物由化合物3使用本领域已知的试剂和技术制备。

NMR和质谱性能使用本领域已知的技术测量，包括以上描述的那些。

本说明书提及的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，包括2015年2月26日提交的美国临时专利申请序列No.62/121,394，以其全部通过引用并入本文，程度是不与本说明书不一致。

由前文可以理解，虽然本发明的具体实施方案已经在本文描述用于阐明的目的，在不脱离本发明的精神和范围可以作出多种修改。因此，除了所附权利要求之外，本发明不受限制。

Claims

1.具有以下结构(I)的化合物：

或其盐，其中：

R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-SO₃ ^-、-SO₃烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；或者R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的一个与R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的另一个连接形成碳环状环或杂环状环，和剩余R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-OSO₂ ^-、-OSO₂烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；

R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地为H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的一个或多个与相同环上的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的另外一个或多个连接形成单或稠合双环碳环或杂环和剩余的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物；

R³在每次出现时独立地为选自聚烷基醚、聚亚烷基醚、羟基烷氧基、羟基烷基、羟基亚烷基、氨基亚烷基、氨基烷氧基、羟基聚烷基醚、羟基聚亚烷基醚、氨基聚烷基醚、氨基聚亚烷基醚、磷酸酯基、硫代磷酸酯基、磷酰基、硫代磷酰基、磷酰烷基、磷酰亚烷基、磷酰烷基醚基、硫代磷酰烷基、硫代磷酰亚烷基、硫代磷酰烷基醚基、亚磷酰胺基和活化的磷的单价或二价官能团。

L¹和L²在每次出现时独立地为任选的连接基；

x和y各自独立地为0-4的整数，和x和y的总和为2或更大；

z为1-10的整数；和

2.权利要求1的化合物，其中x和y的总和为2。

3.权利要求1的化合物，其中x为0和y为2。

4.权利要求1的化合物，其中该化合物具有以下结构(Ia)：

5.权利要求4的化合物，其中该化合物具有以下结构(Ia’):

6.权利要求1-5的任一项的化合物，其中R^1a为-L¹-(R³)_z-L²-M。

7.权利要求1-5的任一项的化合物，其中R^1d、R^1e或R^1f之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。

8.权利要求1-5的任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。

9.权利要求1-5的任一项的化合物,其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的两个为-L¹-(R³)_z-L²-M。

10.权利要求1-5的任一项的化合物，其中R^1a和R^1b二者均为-L¹-(R³)_z-L²-M。

11.权利要求1-5的任一项的化合物，其中R^1a或R^1b之一为-L¹-(R³)_z-L²-M和R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。

12.权利要求1-5的任一项的化合物，其中R^1a或R^1b之一为-L¹-(R³)_z-L²-M和R^1d、R^1e或R^1f之一为-L¹-(R³)_z-L²-M。

13.权利要求1-12的任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的至少一个为氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基或杂环基。

14.权利要求13的化合物，其中R^2c或R^2h或二者为氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基或杂环基。

15.权利要求13-14任一项的化合物，其中烷基氨基为二甲基氨基、二乙基氨基、二异丙基氨基或乙基异丙基氨基。

16.权利要求13-14任一项的化合物，其中芳基氨基为二苯基氨基。

17.权利要求13-14任一项的化合物，其中杂环基为N-吡咯烷基或N-吡咯基。

18.权利要求1-12的任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的一个或多个与相同环上的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ或R^2j的另外一个或多个连接形成单或稠合双环碳环或杂环和剩余的R^2a、R^2b、R^2c、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R^2h、R²ⁱ和R^2j各自独立地H、卤素、C₁-C₆烷氧基、芳基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、杂环基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

19.权利要求18的化合物，其中该化合物具有以下结构之一：

20.权利要求1-19任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为卤素、烷氧基或芳基氧基。

21.权利要求1-20任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为卤素。

22.权利要求1-20任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为烷氧基。

23.权利要求1-20任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为芳基氧基。

24.权利要求1-23任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ或R^2j的至少一个为H。

25.权利要求1-19任一项的化合物，其中R^2a、R^2b、R^2d、R^2e、R^2f、R^2g、R²ⁱ和R^2j的每一个为H。

26.权利要求1-25任一项的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-SO₃ ^-、-SO₃烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

27.权利要求26的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为C₁-C₆烷氧基、芳基氧基或C₁-C₆烷基羰基氧基。

28.权利要求27的化合物，其中C₁-C₆烷氧基为甲氧基。

29.权利要求26的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为氨基、烷基氨基、芳基氨基或芳烷基氨基。

30.权利要求29的化合物，其中烷基氨基为二甲基氨基。

31.权利要求26的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为卤素或硝基。

32.权利要求26的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为-SO₃ ^-或-SO₃烷基。

33.权利要求26的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的至少一个为C₁-C₆烷基或芳基。

34.权利要求33的化合物，其中C₁-C₆烷基为甲基或乙基。

35.权利要求26的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或的至少一个为烷基羰基或芳基羰基。

36.权利要求1-25任一项的化合物，其中R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的一个与R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e或R^1f的另一个连接形成碳环状环或杂环状环并且剩余的R^1a、R^1b、R^1c、R^1d、R^1e和R^1f各自独立地为不存在、H、卤素、硝基、C₁-C₆烷基、-OSO₂ ^-、-OSO₂烷基、C₁-C₆烷氧基、芳基、芳基氧基、C₁-C₆烷基羰基、C₁-C₆烷基羰基氧基、芳基羰基、芳基羰基氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、-L¹-(R³)_z-L²-M或-L¹-(R³)_z-L²-S-S-L²-(R³)_z-L¹-I，其中I独立地表示另外的结构(I)的化合物。

37.权利要求1-18任一项的化合物，其中该化合物具有以下结构之一：

38.权利要求1-37任一项的化合物，其中L¹存在。

39.权利要求38的化合物，其中L¹为C₁-C₆亚烷基。

40.权利要求1-39任一项的化合物，其中R³选自聚亚烷基醚基、磷酸酯基、磷酰基和磷酰亚烷基。

41.权利要求40的化合物，其中R³选自：

其中n为1-6的整数和m为2-10的整数。

42.权利要求1-41任一项的化合物，其中-(R³)_z-L²-M具有以下结构之一：

43.权利要求1-39任一项的化合物，其中R³为亚磷酰胺基和M不存在。

44.权利要求1-43任一项的化合物，其中M为不存在或H。

45.权利要求1-42任一项的化合物，其中M为能够与分析物分子或固体载体结合的基团。

46.权利要求45的化合物，其中M为亲核反应性基团，亲电反应性基团或环加成反应性基团。

47.权利要求46的化合物，其中M为巯基、二硫基、活化酯基、异硫氰酸酯基、叠氮基、炔基、烯基、二烯基、亲二烯基、酰卤基、磺酰卤基、膦基、α-卤代酰胺、生物素、氨基或马来酰亚胺基。

48.权利要求47的化合物，其中活化酯基为N-琥珀酰亚胺酯基、亚氨基酯基或聚氟苯基酯基。

49.权利要求47的化合物，其中炔基为烷基叠氮基或酰基叠氮基。

50.权利要求1-42任一项的化合物，其中M为分析物分子或固体载体。

51.权利要求50的化合物，其中分析物分子为生物分子。

52.权利要求51的化合物，其中生物分子是核酸、氨基酸或其聚合物。

53.权利要求51的化合物，其中生物分子为核酸、肽、碳水化合物、脂质、酶、受体、受体配体、抗体、糖蛋白、适体、抗原或朊病毒。

54.权利要求51的化合物，其中分析物分子为药物、维生素或小分子。

55.权利要求1的化合物，其中该化合物具有以下结构之一：

或其盐，其中M为能够与分析物分子或固体载体结合的基团；或M为经由任选的连接基共价连接的分析物分子或固体载体。

56.权利要求55的化合物，其中M为-SH。

57.染色样品的方法，该方法包括以当所述样品在适当的波长下照射时足以产生光学响应的量向所述样品添加权利要求1-56的任一项的化合物。

58.权利要求57的方法，其中所述光学响应为荧光响应。

59.权利要求57-58的任一项的方法，其中所述样品包含细胞。

60.权利要求59的方法，进一步包括通过流式细胞术观察所述细胞。

61.权利要求60的方法，进一步包括将荧光响应与具有可检测的不同光学性质的第二荧光团的荧光响应区分。

62.目视检测分析物分子的方法，所述方法包括：

(a)提供权利要求1-56任一项的化合物，其中M为分析物分子；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

63.目视检测生物分子的方法，所述方法包括：

(a)将权利要求1-56的任一项的化合物与一种或多种生物分子混合；和

(b)通过其可视特性检测化合物。

64.组合物，包含权利要求1-56任一项的化合物和一种或多种生物分子。

65.权利要求64的组合物在用于检测一种或多种生物分子的分析方法中的用途。