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CN107404881B - 用于过继性t细胞疗法的中央记忆t细胞 - Google Patents

用于过继性t细胞疗法的中央记忆t细胞 Download PDF

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CN107404881B CN201580062281.6A CN201580062281A CN107404881B CN 107404881 B CN107404881 B CN 107404881B CN 201580062281 A CN201580062281 A CN 201580062281A CN 107404881 B CN107404881 B CN 107404881B
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Abstract

描述了包括胞外域、跨膜区、共刺激域和胞内信号传导域的嵌合跨膜免疫受体(CAR)，所述胞外域包括IL‑13或其结合白介素‑13Rα2(IL13Rα2)的变体。

Description

用于过继性T细胞疗法的中央记忆T细胞
发明背景
已经研究了基于肿瘤特异性T细胞的免疫疗法，包含使用工程化改造的T细胞的疗法用于抗肿瘤治疗。在一些情况下，用于该疗法的T细胞在体内维持不了足够长时间的活性。在一些情况下，T细胞的肿瘤特异性相对低。因而，本领域需要具有较长期抗肿瘤功能发挥的肿瘤特异性癌症疗法。
利用嵌合抗原受体(CAR)工程化改造的T细胞的过继性T细胞疗法(ACT)可以提供安全且有效的方式来减少MG的复发率，因为CAR T细胞可以被工程化改造以特异识别抗原不同的肿瘤群体(Cartellieri等2010 J Biomed Biotechnol 2010:956304；Ahmed等2010Clin Cancer Res 16:474；Sampson等2014 Clin Cancer Res 20:972；Brown等2013 ClinCancer Res 2012 18:2199；Chow等2013 Mol Ther 21:629)，并且T细胞可以通过脑实质迁移以靶向并杀死浸润性恶性细胞(Hong等2010 Clin Cancer Res 16:4892；Brown等2007 JImmunol 179:3332；Hong等2010 Clin Cancer Res16:4892；Yaghoubi 2009 Nat ClinPRact Oncol 6:53)。临床前研究已经证明靶向IL13Rα2的CAR+ T细胞针对干细胞样和分化型神经胶质瘤细胞显示有效的不依赖主要组织相容性复合体(MHC)的IL13Rα2-特异性细胞溶解活性，并且在体内诱导建立的神经胶质瘤异种移植物的消退(Kahlon等2004 CancerRes 64:9160；Brown等2012 Clin Cancer Res 18:2199)。
发明概述
本文描述的是包含中央记忆T细胞(Tcm)的细胞群。细胞群体包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两种。细胞群中的细胞用于表达嵌合跨膜免疫受体(嵌合抗原受体或“CAR”)，其包含胞外域(例如，结合所选靶标的scFv)，跨膜区和胞内信号传导域，例如，包含来自人CD3复合体的ζ链(CD3ζ)的信号传导域和一个或多个共刺激域，例如4-1BB共刺激域的胞内域。当在T细胞表面上表达时，胞外域使CAR能够将T细胞活性导向表达由胞外域识别的靶标的那些细胞。胞内区中包含串联CD3ζ的共刺激域，如4-1BB(CD137)共刺激域使得T细胞能够接受共刺激信号。
可以工程化改造本文中描述的Tcm细胞，例如患者特异的自体Tcm细胞或同种异体(allogenic)Tcm细胞以表达期望的CAR，并且工程化细胞可以扩增并用于ACT。TCM细胞群体是CD45RO+ CD62L，并包括CD4+和CD8+细胞。
在各种实施方案中：人T细胞群体包含表达嵌合抗原受体的载体；人中央记忆T细胞(Tcm细胞)的群体包含至少10％的CD4+细胞和至少10％的CD8+细胞(例如，至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％的细胞是Tcm细胞；至少15％，20％，25％，30％，35％的Tcm细胞是CD4+，且至少15％，20％，25％，30％，35％的Tcm细胞是CD8+细胞)
还描述的是在患者中治疗癌症的方法，其包含施用通过包含编码嵌合抗原受体的表达盒的载体转导的自体或同种异体人T细胞(例如，包含Tcm细胞的自体或同种异体T细胞，例如，至少20％、30％、40％、50％60％、70％、80％的细胞是Tcm细胞；至少15％、20％、25％、30％、35％的Tcm细胞是CD4+并且至少15％、20％、25％、30％、35％的Tcm细胞是CD8+细胞)。
本文描述了用表达嵌合抗原受体的载体转导的人T细胞群体，其中至少50％的转导的人T细胞是中央记忆T细胞。在各种实施方案中：至少10％的转导的细胞中央记忆T细胞是CD4+；至少10％的转导的中央记忆T细胞是CD8+；至少15％的中央记忆T细胞是CD4+，并且至少15％是CD8+；并且至少50％的转导的人T细胞是CD4+/CD8+/CD62L+。
本文还描述了用表达嵌合抗原受体的载体转导的人T细胞群，其中至少50％的转导的人T细胞是CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-细胞，至少10％的细胞是CD4+，并且至少10％的细胞是CD4+。在各种实施方案中：作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少10％也是CD4+细胞，并且为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少10％也是CD8+细胞；并且为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少15％也是CD4+细胞，并且为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少15％也是CD4+细胞。
还描述了一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者施用包含本文所述的中央记忆T细胞的药物组合物。T细胞可以对于患者是自体的或者对于患者是同种异体的。
还描述了一种用于制备中央记忆T细胞群的方法，其包括：获得来自人受试者的T细胞群；针对表达CD25的细胞，表达CD14的细胞和表达CD45+的细胞消减T细胞群以制备经消减的T细胞群；针对表达CD62L的细胞富集经消减的T细胞群，由此制备中央记忆T细胞群，其中该方法不包括针对表达CD4的细胞消减细胞群的步骤，以及不包括消减表达CD8+细胞的细胞群的步骤。在各种实施方案中：中央记忆T细胞群中至少50％(例如，至少60％，70％，80％，90％或95％)的细胞是CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-细胞，至少10％的细胞是CD4+并且至少10％的细胞是CD4+；在中央记忆T细胞群中至少50％(例如，至少60％，70％，80％，90％或95％)的细胞是CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-，至少15％的细胞是CD4+，并且至少15％的细胞是CD4+；在中央记忆T细胞群中至少50％的细胞是CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-细胞，至少20％(例如，例如，至少30％，40％或50％)的细胞是CD4+并且至少20％(例如，至少30％，40％或50％)的细胞是CD4+。该方法可以进一步包括刺激中央记忆T细胞群(例如通过将中央记忆T细胞群与CD3和/或CD28接触)；可以包括用表达重组蛋白质的载体转导细胞以产生遗传修饰的中央记忆T细胞群；并且可以包括扩充经遗传修饰的中央记忆T细胞群(例如，通过将细胞暴露于IL-2和IL-15中的一种或两种来扩充经遗传修饰的中央记忆T细胞群)。
附图简述
图1是IL13(E13Y)-zetakine CAR(左)的示意性描述，所述IL13(E13Y)-zetakineCAR由所指示的IL13Rα2-特异性人IL-13变体(huIL-13(E13Y))、人IgG4 Fc间隔物(huγ4Fc)、人CD4跨膜(huCD4 tm)，和人CD3ζ链胞质(huCD3ζcyt)部分组成。还描述的是IL13(EQ)BBζCAR，其与IL13(E13Y)-zetakine相同，除了定位在IgG4间隔物的CH2域中红色指示的两个点突变L235E和N297Q，并添加了共刺激4-1BB胞质域(4-1BB cyt)。
图2A-C描述了某些载体可读框。A是2670个核苷酸IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t构建体的cDNA可读框的图表，其中指示了IL13(EQ)BBZ CAR的IL13Rα2-特异性配体IL13(E13Y)、IgG4(EQ)Fc铰链、CD4跨膜、4-1BB胞质信号传导、三甘氨酸接头，和CD3ζ胞质信号传导域，以及T2A核糖体跳跃(skip)和截短的CD19序列。还指示了人GM-CSF受体α和驱动IL13(EQ)BBζCAR和CD19t表面表达的CD19信号序列。B是侧翼为将整合至宿主基因组中的长末端重复(由‘R’指示)的序列的图表。C是IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7质粒图。
图3描述了pHIV7的构建。
图4描述了pHIV7的元件。
图5描述了IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM的产生图解。
图6A-C描述了表面转基因和T细胞标志物表达的流式细胞检测分析的结果。IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM HD006.5和HD187.1被抗IL13-PE和抗CD8-FITC共染色以检测CD8+ CAR+和CD4+(即，CD8阴性)CAR+细胞(A)，或被抗CD19-PE和抗CD4-FITC共染色以检测CD4+CD19t+和CD8+(即，CD4阴性)CAR+细胞(B)。IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM HD006.5和HD187.1被荧光色素缀合的抗CD3、TCR、CD4、CD8、CD62L和CD28(灰色柱状图)或同种型对照(黑色柱状图)染色(C)。在所有情况中，百分比基于高于同种型染色的有活力的淋巴细胞(DAPI阴性)。
图7A-B描述了IL13(EQ)BBZ+ TCM的IL13Rα2-特异性效应器功能的体外功能表征。IL13(EQ)BBZ/CD19t+ TCMHD006.5和HD187.1在使用10:1 E:T比例基于CD19t表达的6-小时51Cr释放测定中用作效应器。将IL13Rα2阳性肿瘤靶标是K562工程化改造的，以表达IL13Rα2(K562-IL13Rα2)和原代神经胶质瘤系PBT030-2，并且IL13Rα2阴性肿瘤靶标对照是K562亲本系(A)。在与IL13Rα2阳性和阴性靶标以10:1 E:T比例过夜共培养后评估IL13(EQ)BBZ/CD19t+ TCMHD006.5和HD187.1的抗原依赖性细胞因子产生。使用Bio-Plex Pro人细胞因子TH1/TH2测定试剂盒测定细胞因子水平并报道了INF-γ(B)。
图8A-C描述了研究结果，其证明在IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM过继性转移后建立的神经胶质瘤肿瘤异种移植物的消退。将EGFP-ffLuc+ PBT030-2肿瘤细胞(1×105)立体定向植入NSG小鼠的右前脑中。在第5天，小鼠接受2x106个IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM(1.1x106CAR+；n＝6)、2x106个模拟TCM(无CAR；n＝6)或PBS(n＝6)。来自各组的代表性小鼠，其显示使用Xenogen Living Image的相对肿瘤负荷(A)。ffLuc流量(光子/秒)的定量显示IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM与模拟转导的TCM和PBS相比诱导肿瘤消退(#p<0.02,*p<0.001,重复测量ANOVA)(B)。Kaplan Meier存活曲线(n＝6/组)，证明利用IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM处理的小鼠的存活显著提高(p＝0.0008；时序检验)(C)。
图9A-C描述了比较IL13(EQ)BBZ TCM和IL13-zetakine CTL克隆的抗肿瘤效果的研究结果。将EGFP-ffLuc+ PBT030-2TSs(1×105)立体定向植入NSG小鼠的右前脑中。在第8天，小鼠接受1.6x106个模拟TCM(无CAR)、1.0×106CAR+ IL13(EQ)BBζTCM(1.6×106全部T细胞；63％CAR)、1.0x106IL13-zetakine CD8+ CTL cl.2D7(克隆CAR+)，或没有处理(n＝6/组)。来自各组的代表性小鼠使用Xenogen Living Image显示相对肿瘤负荷(A)。ffLuc流量(光子/秒)的自然对数随时间的线性回归线，P-值通过时间相互的比较用于组(P-valuesare for group by time interaction comparisons)(B)。Kaplan Meier存活分析(n＝6/组)证明与IL13-zetakine CD8+ CTL cl.2D7相比，利用IL13(EQ)BBζTCM处理的小鼠的存活显著提高(p＝0.02；时序检验)(C)。
图10A-C描述了比较IL13(EQ)BBζTCM和IL13-zetakine CTL克隆的抗肿瘤效果的研究结果。将EGFP-ffLuc+ PBT030-2TSs(1×105)立体定向植入NSG小鼠的右前脑中。在第8天，小鼠接受1.3x106模拟TCM(无CAR；n＝6)、1.0、0.3或0.1x106CAR+ IL13(EQ)BBζTCM(78％CAR+；n＝6-7)、1.0、0.3或0.1x106个IL13-zetakine CD8+ CTL cl.2D7(克隆CAR+；n＝6-7)，或无处理(n＝5)。来自各组的代表性小鼠的Xenogen成像显示相对肿瘤负荷(A)。ffLuc流量(光子/秒)的自然对数的线性回归线显示与第一代IL13-zetakine CTL cl.2D7、模拟TCM和仅肿瘤相比，IL13(EQ)BBζTCM实现卓越的肿瘤消退(B)。肿瘤注射后第27天的平均流量/组证明0.1x106个IL13(EQ)BBζTCM剂量胜过高10倍剂量的1.0x106个IL13-zetakine CD8+ CTL cl.2D7(p＝0.043；Welch两样品t-检验)(C)。
图11描述了研究结果，其证明与IL13-zetakine CTL克隆相比IL13(EQ)BBζTcm展示提高的持续性。CD3免疫组织化学在T细胞输注后7天在肿瘤位点上评估T细胞持续性。检测IL13(EQ)BBζTcm的显著数量的T细胞(上图)。相反，检测到极少的有活力的CD3+ IL13-zetakine T细胞(下图)。
图12A-D描述了比较用于大的建立肿瘤的CAR+ T细胞递送途径(i.c.相对于i.v.)的实验结果。将EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TSs(1×105)植入NSG小鼠的右前脑中。在第19天和第26天，利用5x106个CAR+ IL13(EQ)BBζ+ Tcm(11.8x106总细胞；n＝4)，或模拟Tcm(11.8x106细胞；n＝4)通过尾静脉i.v.注射小鼠。或者，在第19、22、26和29天，利用1x106个CAR+ IL13(EQ)BBζ+ Tcm(2.4x106个总细胞；n＝4)，或模拟Tcm(2.4x106个细胞；n＝5)i.c.注射小鼠。随时间的平均ffLuc流量(光子/秒)显示i.c.递送的IL13(EQ)BBζTcm介导第19天肿瘤的肿瘤消退。通过比较，i.v.递送的T细胞与未处理的或模拟Tcm对照相比不显示肿瘤负荷的减少(A)。Kaplan Meier存活曲线证明与利用i.v.施用的CAR+ Tcm处理的小鼠相比利用IL13(EQ)BBZ Tcm i.c.处理的小鼠的存活提高(p＝0.0003时序检验)(B)。利用IL13(EQ)BBZ+ Tcm i.v.(C)相对于i.c.(D)处理的小鼠的代表性H&E和CD3 IHC。仅在i.c.处理组中检测到CD3+ T细胞，对于i.v.处理的小鼠，在肿瘤或周围脑实质中没有检测到CD3+细胞。
图13A-B描述了研究结果，其显示颅内、瘤内(i.c.t.)或心室内(i.c.v.)注射的CAR+ T细胞可以运输到对面半球上的肿瘤中。将EGFP-ffLuc+ PBT030-2 TSs(1×105)立体定向植入NSG小鼠的右前脑和左前脑中。在第6天，利用1.0x106IL13(EQ)BBζ+ Tcm(1.6x106总细胞；63％CAR；n＝4)在右边肿瘤位点i.c.注射小鼠。多病灶神经胶质瘤实验模型的示意图(A)。CD3 IHC显示T细胞浸润右边和左边肿瘤位点二者(B)。
图14描述了IL13(EQ)BBζ/CD19t+的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)。
图15描述了IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζT2A-CD19t_epHIV7；pF02630](SEQ IDNO:12)与CD19Rop_epHIV7(pJ01683)(SEQ ID NO:13)的序列比较。
发明详述
下文描述了包含CD4+细胞和CD8+细胞的TCM细胞群(“TCM CD4+/CD8+”细胞群)。可以用抗CD3/CD28活化TCM CD4+/CD8+细胞群的细胞，并用例如指导CAR表达的SIN慢病毒载体转导以产生遗传修饰的细胞。可以用IL-2/IL-15在体外扩增活化/经遗传修饰的细胞，然后使用或冷冻保存并在以后使用。描述了使用TCM CD4+/CD8+细胞群体以表达靶向IL13Rα2的CAR的实例。
以下实例中使用的CAR称为IL13(EQ)BBζ。该CAR包含多个重要特征，包含：具有氨基酸改变的IL13α2配体，所述氨基酸改变提高与IL13α2结合的特异性；CD137(4-1BB)的域与CD3ζ串联以提供有益的共刺激；和IgG4 Fc区，其在CH2区内的两个位点上以减少被Fc受体(FcR)结合的方式被突变(L235E；N297Q)。可以使用载体产生本文所述的CAR，在所述载体中CAR可读框后接T2A核糖体跳跃序列和截短的CD19(CD19t)，其缺少胞质信号传导尾部(在第323位氨基酸上被截短)。在该排列中，CD19t的共表达提供惰性的非免疫原性表面标志物，其允许精确测定基因修饰的细胞，并使得能够阳性选择基因修饰的细胞，以及有效的细胞运输和/或在过继性转移后体内治疗性T细胞成像。CD19t的共表达提供用于使用临床可得的抗体和/或免疫毒素试剂在体内免疫靶向转导细胞以选择性删除治疗细胞，并由此作为自杀开关起作用的标志物。
神经胶质瘤表达IL13受体，特别是高亲和力IL13受体。然而，不像IL13受体，神经胶质瘤细胞过表达独特的IL13Rα2链，其能够不依赖对IL4Rβ或γc44的需要而结合IL13。与其同系物IL4相似，IL13在CNS外具有多效(pleotropic)的免疫调节活性。IL13和IL4均刺激B淋巴细胞产生IgE并抑制巨噬细胞产生促炎症细胞因子。
使用利用放射标记的IL13的放射自显影技术的详细研究已经证明在所研究的几乎所有恶性神经胶质瘤组织上大量的IL13结合。该结合在肿瘤切片和单细胞分析中是高度同质的。然而，对IL13Rα2 mRNA特异的分子探针分析不检测神经胶质瘤特异性受体通过正常脑元件的表达，并且利用放射标记的IL13的放射自显影技术也不能检测正常CNS中的特异性IL13结合。这些研究提示共有的IL13Rα1/IL4β/γc受体在正常的CNS中不可被检测地表达。因而，IL13Rα2是神经胶质瘤非常特异的细胞表面靶标并且是被设计用于治疗神经胶质瘤的CAR的合适靶标。
然而，基于IL13的治疗分子与广泛表达的IL13Rα1/IL4β/γc受体复合体结合具有向CNS外的正常组织介导不想要的毒性的潜力，并因此限制这些试剂的全身施用。IL13α螺旋A第13位氨基酸上酪氨酸对天然谷氨酸的氨基酸取代选择性地降低了IL13对IL13Rα1/IL4β/γc受体的亲和力。然而，该突变体(称为IL13(E13Y))与IL13Rα2的结合相对于野生型IL13是增加的。因此，该最低限度改变的IL13类似物同时增加了IL13对神经胶质瘤细胞的特异性和亲和力。因而，本文所述的CAR包含在第13位氨基酸(根据Debinski等1999 ClinCancer Res 5:3143s的编号)上含有突变(E变成Y或E变成一些其他氨基酸如K或R或L或V)的IL13。然而，也可以使用具有天然序列的IL13，并且可以特别可用于下述情况，其中有待如通过直接注射到肿瘤块中局部施用所述修饰的T细胞。
可以通过本领域已知的任何手段产生本文所述的CAR，尽管优选使用重组DNA技术产生它。可以通过本领域已知的便利分子克隆的标准技术(基因组文库筛选、PCR、引物-辅助的连接、定点诱变等)制备编码嵌合受体的几个区域的核酸并将其装配成完整的编码序列。将所得的编码区优选插入表达载体中并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选T淋巴细胞细胞系，并最优选自体T淋巴细胞细胞系。
实施例
实施例1：IL13Rα2-特异性CAR的构建和结构
在下文描述了有用的IL13Rα2-特异性CAR的结构。密码子优化的CAR序列含有在单个位点上突变(E13Y)以减少与IL13Rα1的可能结合的膜栓系IL-13配体、含有极大减少Fc受体介导的识别模型的两个突变(L235E；N297Q)的IgG4 Fc间隔物、CD4跨膜域、共刺激4-1BB胞质信号传导域，和CD3ζ胞质信号传导域。T2A核糖体跳跃序列将该IL13(EQ)BBζCAR序列与CD19t分隔开，所述CD19t是惰性的非免疫原性细胞表面检测/选择标志物。该T2A连接导致IL13(EQ)BBζ和CD19t从单个转录本协同表达。图1A是编码IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t构建体的2670个核苷酸的可读框的示意图。在该图中，IL13(EQ)BBZ CAR的IL13Rα2-特异性配体IL13(E13Y)、IgG4(EQ)Fc、CD4跨膜、4-1BB胞质信号传导、三甘氨酸接头，和CD3ζ胞质信号传导域，以及T2A核糖体跳跃和截短的CD19序列均被指出。也指出了驱动IL13(EQ)BBZ CAR和CD19t表面表达的人GM-CSF受体α和CD19信号序列。因此，IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t构建体包含IL13Rα2特异性的铰链优化的共刺激嵌合免疫受体序列(命名为IL13(EQ)BBZ)、核糖体跳跃T2A序列，和CD19t序列。
通过融合人GM-CSF受体α前导肽与IL13(E13Y)配体5L235E/N297Q-修饰的IgG4 Fc铰链(其中双突变干扰FcR识别)、CD4跨膜、4-1BB胞质信号传导域，和CD3ζ胞质信号传导域序列来产生IL13(EQ)BBZ序列。在密码子优化后从头合成该序列。从消化含T2A的质粒获得T2A序列。从横跨含CD19的质粒的前导肽序列与跨膜组分(即，碱基对1-972)获得CD19t序列。将所有三个片段，1)IL13(EQ)BBZ,2)T2A，和3)CD19t克隆到epHIV7慢病毒载体的多克隆位点中。当转染到适当的细胞中时，载体整合图1B中示意描述的序列到宿主细胞基因组中。图1C提供9515个碱基对的IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7质粒自身的示意图。
如图2中示意所示，IL13(EQ)BBZ CAR与先前描述的IL13Rα2-特异性CAR(称作IL13(E13Y)-zetakine)在几个重要方面不同(Brown等2012 Clinical Cancer Research 18:2199)。IL13(E13Y)-zetakine由所示的IL13Rα2-特异性人IL-13突变蛋白(huIL-13(E13Y))、人IgG4Fc间隔物(huγ4Fc)、人CD4跨膜(huCD4tm)，和人CD3ζ链胞质(huCD3ζcyt)部分组成。相反，IL13(EQ)BBζ)具有两个点突变L235E和N297Q，其定位在IgG4间隔物的CH2域中，和共刺激4-1BB胞质域(4-1BB cyt)。
实施例2：用于表达IL13Rα2-特异性CAR的epHIV7的构建和结构
pHIV7质粒是这样的亲代质粒，在City of Hope(COH)的T cell TherapeuticsResearch Laboratory(TCTRL)中从所述亲代质粒衍生临床载体IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7。从pHIV7载体产生用于表达CAR的epHIV7载体。重要的是，该载体使用人EF1启动子以驱动CAR的表达。载体的5'和3'序列都来源于如先前来源于HXBc2前病毒的pv653RSN。聚嘌呤区DNA瓣(flap)序列(cPPT)来源于来自NIH AIDS Reagent Repository的HIV-1菌株pNL4-3。先前描述了土拨鼠(woodchuck)转录后调节元件(WPRE)序列。
在图3中示意描述了pHIV7的构建。简言之，如下将pv653RSN亚克隆至pBluescript中，所述pv653RSN含有来自gag-pol的653bp加上5’和3’长末端重复(LTRs)与居间SL3-新霉素磷酸转移酶基因(Neo)：在步骤1中，从5’LTR到rev-响应元件(RRE)的序列构成了p5’HIV-1 51，然后通过去除TATA盒上游的序列修饰5'LTR，并首先连接CMV增强子，然后连接SV40复制起始区(p5'HIV-2)。在步骤2中，将3'LTR克隆到pBluescript中以制备p3’HIV-1，在3'LTR增强子/启动子中进行400-bp缺失以去除HIV U3中的顺式调节元件并形成p3'HIV-2。在步骤3中，连接从p5'HIV-3和p3'HIV-2分离的片段以制备pHIV-3。在步骤4中，通过去除额外的上游HIV序列进一步修饰p3'HIV-2来产生p3’HIV-3，并将含有WPRE的600-bp BamHI-SalI片段添加到p3’HIV-3来制备p3'HIV-4。在步骤5中，通过PCR在大小上减少pHIV-3RRE并将其连接到来自pHIV-3的5’片段(未显示)和p3’HIV-4中，以制备pHIV-6。在步骤6中，从pNL4-3扩增含有来自HIV-1pNL4-3(55)的cPPT DNA瓣序列的190-bp BglII-BamHI片段并置于pHIV6中的RRE与WPRE序列之间来制备pHIV-7。该亲代质粒pHIV7-GFP(GFP，绿色荧光蛋白)用于使用四质粒系统包装亲代载体。
将病毒基因组有效包装到载体中需要包装信号psiψ。RRE和WPRE增强RNA转录本转运和转基因的表达。已经证明瓣序列与WPRE组合增强哺乳动物细胞中慢病毒载体的转导效率。
将产生病毒载体所需的辅助功能分到三个独立质粒中以减少通过重组产生能够复制的慢病毒的可能性：1)pCgp编码病毒载体装配所需的gag/pol蛋白；2)pCMV-Rev2编码Rev蛋白，其作用于RRE序列上以辅助病毒基因组转运用于有效的包装；和3)pCMV-G编码水疱-口炎病毒(vesiculo-stomatitis virus,VSV)的糖蛋白，其为病毒载体的传染性所需。
在pHIV7编码的载体基因组与辅助质粒之间存在最小的DNA序列同源性。同源区域包含大概600个核苷酸的包装信号区，其定位在pCgp辅助质粒的gag/pol序列中；所有三个辅助质粒中的CMV启动子序列；和辅助质粒pCgp中的RRE序列。非常可能的是由于这些区域中的同源性可产生能够复制的重组病毒，因为其需要多个重组事件。此外，任何所得的重组子均可能会丢失功能性LTR和tat序列，其为慢病毒复制所需。
CMV启动子被EF1α-HTLV启动子(EF1p)替换，并将新的质粒命名为epHIV7(图4)。EF1p具有563bp并使用NruI和NheI将其引入到epHIV7中，在切掉CMV启动子后。
已经从该系统去除了慢病毒基因组，不包含gag/pol和rev，其为野生型病毒的病原性所必需并且为靶细胞的有效感染所需。此外，IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7载体构建体不含有完整的3’LTR启动子，所以靶定细胞中所得的表达的和反向转录的DNA前病毒基因组将具有无活性的LTR。由于该设计，没有HIV-I来源的序列从前病毒转录并且仅治疗序列将从其各自启动子表达。预期SIN载体中LTR启动子活性的去除显著减少了宿主基因无意激活的可能性(56)。表4概述了IL13(EQ)BBZ-T2ACD19t_epHIV7中存在的多个调节元件。
Figure GDA0001397820770000101
Figure GDA0001397820770000111
实施例3：产生载体用于转导患者T细胞
对于每个质粒(IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7；pCgp；pCMV-G；和pCMV-Rev2)，产生种子库，其用于接种发酵罐以产生足够量的质粒DNA。测试质粒DNA的身份(identity)、无菌性(sterility)和内毒素，之后在生成慢病毒载体中使用它。
简言之，从293T工作细胞(WCB)扩增细胞，所述293T工作细胞已经被测试以验证无菌性和病毒污染的缺乏。融化来自293T WCB的293T细胞的小瓶。培养细胞并扩增直至存在足够数量的细胞以平铺适当数量的10层细胞工厂(cell factories,CF)用于载体产生和细胞培养(cell train)维持。可以使用细胞的单培养(single train)用于生产。
在高达10个CF的分批中产生慢病毒载体。可以在同一周产生两个分批，导致产生大概20L的慢病毒上清液/周。在下游加工期间集中从所有分批产生的材料，以产生一批产物。将293T细胞平铺在293T培养基(具有10％FBS的DMEM)中的CF中。将工厂放置在37℃温育箱中并水平放平以在CF的所有层上获得平均细胞分布。两天后，利用上述四个慢病毒质粒，使用CaPO4方法转染细胞，其包含Tris:EDTA、2M CaCl2、2XHBS和四个DNA质粒的混合物。转染后第3天，收集、纯化并浓缩含有分泌的慢病毒载体的上清液。从CF去除上清液后，从各CF收集生产终末期细胞。从各工厂胰蛋白酶处理(trypsinize)细胞并通过离心收集。将细胞重悬浮在冰冻的培养基中并冷藏保存。这些细胞稍后用于能够复制的慢病毒(RCL)测试。
为了纯化并配制载体，通过膜过滤澄清粗上清液以去除细胞碎片。通过内切核酸酶消化
Figure GDA0001397820770000121
降解宿主细胞DNA和残留的质粒DNA。使用0.45μm过滤器澄清病毒上清液的细胞碎片。将澄清的上清液收集到预先称重的容器中，向所述容器中加入
Figure GDA0001397820770000122
(终浓度50U/mL)。残留的质粒DNA和宿主基因组DNA的内切核酸酶消化在37℃进行6小时。内切核酸酶处理的上清液的初始切向流超滤(TFF)浓缩用于从粗上清液中去除残留的低分子量组分，同时将病毒浓缩约20倍。澄清的内切核酸酶处理的病毒上清液通过具有500kD的NMWCO的中空纤维药筒以这样的流速循环，设计所述流速以维持约4,000/秒或更低的剪切速率，同时使流通率最大。在浓缩过程中开始透析过滤核酸酶处理的上清液以维持药筒性能。在PBS中使用4％的乳糖作为透析过滤缓冲液建立80％的渗透置换率。使病毒上清液达到靶体积，代表20倍浓度的粗上清液，并且透析过滤以100％的渗透置换率持续4份额外的交换体积。
通过使用高速离心技术完成病毒产物的进一步浓缩。使用Sorvall RC-26plus离心机在6℃下以6000RPM(6,088RCF)沉淀慢病毒的各分批16-20小时。然后利用PBS中4％的乳糖在50mL体积中重构来自各分批的病毒沉淀。在该缓冲液中重构的沉淀代表用于病毒制备的最终制剂。完整的载体浓缩过程导致大概200倍体积减少。完成所有分批后，接着将材料放置在-80℃中，同时测试来自各分批的样品的无菌性。验证样品无菌性后，将分批在37℃频繁搅拌快速溶解。然后收集材料并手工平分到病毒载体组(suite)中的II类A/B3型生物安全箱中。使用无菌USP六级，外部螺纹的O-环冷冻管中1mL浓缩慢病毒的填充构造。COH的应用技术开发中心(Center for Applied Technology Development)(CATD)的质量系统(Quality Systems)(QS)根据关于CBG的政策和标准操作规程(Policies and StandardOperating Procedures for the CBG)并顺应目前的良好制造实践(Good ManufacturingPractices)(cGMPs)释放所有材料。
为了保证慢病毒载体制剂的纯度，对它测试残留宿主DNA污染物，以及残留的宿主和质粒DNA的转移。在其他测试中，通过RT-PCR评估载体身份以保证存在正确的载体。对于旨在用于该研究的载体，满足所有的释放标准。
实施例4：适合在ACT中使用的TCM CD4+/CD8+细胞群的制备
在图8中描述了用于TCM CD4+/CD8+细胞群的制造策略的概要(用于IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM的制造方案)。具体地，将从知情的研究参与者获得的单采血液成分术(apheresis)产物进行ficoll处理(ficolled)、洗涤并温育过夜。然后使用GMP级别的抗CD14、抗CD25和抗CD45RA试剂(Miltenyi Biotec)和CliniMACSTM分离设备消减细胞的单核细胞、调节性T细胞和幼稚T细胞群。消减后，在CliniMACSTM分离设备上使用DREG56-生物素(COH临床级别)和抗生物素微珠(Miltenyi Biotec)为CD62L+ TCM细胞富集阴性级分细胞。该细胞未消减CD4+细胞或CD8+细胞。
富集后，在完整的X-Vivo15加50IU/mL IL-2和0.5ng/mL IL-15中配制TCM CD4+/CD8+细胞并将其转移到Teflon细胞培养袋中，其中利用Dynal ClinExTMVivo CD3/CD28珠刺激它们。刺激后高达5天，利用表达CAR的期望的载体(例如，IL13(EQ)BBZ-T2A-CD19t_epHIV7慢病毒载体)以例如1.0-0.3的多重性感染(MOI)转导细胞。在添加如细胞扩增所需的完整X-Vivo15和IL-2以及IL-15细胞因子的情况下将培养物维持高达42天(保持细胞密度在3x105-2x106个活细胞/mL之间，并且在培养的每周一、周三和周五维持细胞因子补给)。细胞通常在这些条件下在21天内扩增至大概109个细胞。在培养期结束时，收集细胞，洗涤两次并配制在临床级别的冷藏保存培养基(Cryostore CS5,BioLife Solutions)中。
在T细胞输注当天里，将冷藏保存的和释放的产物融化、洗涤并配制用于再次输注。从液氮存储取出含有释放的细胞产物的冷藏保存管、融化、冷却并利用PBS/2％人血清白蛋白(HSA)洗涤缓冲液进行洗涤。离心后，去除上清液并将细胞重悬于无防腐剂的生理盐水(PFNS)/2％HSA输注稀释液中。取出样品用于质量控制测试。
使用上述制造平台在从健康供体获得的细胞上进行两次量化运行。为各临床前量化运行产物分配人供体(HD)编号-HD006.5和HD187.1。重要的是，如表5中所示，这些量化运行在28天内扩充>80倍并且扩增的细胞表达IL13(EQ)BBγ/CD19t转基因。
表5：来自临床前量化运行产物的表达数据的概括
Figure GDA0001397820770000141
实施例5：IL13(EQ)BBγ/CD19t+TCM中表面转基因和T细胞标志物表达的流式细胞术分析
在实施例4中描述的两份临床前量化运行产物用于如下所述的临床前研究。图6A-C描述了表面转基因和T细胞标志物表达的流式细胞术分析结果。IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCMHD006.5和HD187.1与抗IL13-PE和抗CD8-FITC共染色以检测CD8+ CAR+和CD4+(即，CD8阴性)CAR+细胞(图6A)，或与抗CD19-PE和抗CD4-FITC共染色以检测CD4+ CD19t+和CD8+(即，CD4阴性)CAR+细胞(图6B)。利用荧光色素缀合的抗CD3、TCR、CD4、CD8、CD62L和CD28(灰色柱状图)或同种型对照(黑色柱状图)染色IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5和HD187.1。(图6C)。在图6A-C的各图中，所指示的百分比基于活的淋巴细胞(DAPI阴性)染色的上述同种型。
实施例6：IL13(EQ)BBγ/CD19t+TCM的效应器活性
评估IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM的效应器活性并在图7A-B中描述该分析结果。简言之，IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM HD006.5和HD187.1在基于CD19t表达的使用10E:1T比例的6小时51Cr-释放测定中用作效应器。将IL13Rα2阳性肿瘤靶标是K562工程化改造的，以表达IL13Rα2(K562-IL13Rα2)和原代神经胶质瘤系PBT030-2，并且IL13Rα2-阴性肿瘤靶标对照是K562亲本系(图7A)。如上所述与相同的IL13Rα2-阳性和阴性靶标以10E:1T比例过夜共培养后评估IL13(EQ)BBγ/CD19t+HD006.5和HD187.1的抗原依赖性细胞因子产生。使用Bio-Plex Pro Human Cytokine TH1/TH2测定试剂盒测定细胞因子水平并描述INF-γ水平(图7B)。
实施例7：IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM的体内抗肿瘤活性
下述研究证明在体内小鼠模型中IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM展示抗肿瘤效果。尤其是，我们已经评估了IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM针对IL13Rα2+原代低传代成胶质细胞瘤肿瘤球系PBT030-2的抗肿瘤潜能，已经改造了所述原代低传代成胶质细胞瘤肿瘤球系PBT030-2以表达EGFP和萤火虫萤光素酶(ffLuc)报告基因二者(PBT030-2EGFP:ffLuc)(6)。来自患者成胶质细胞瘤样本的一组原代系(PBT)在无血清培养基中生长为肿瘤球(TS)。这些扩增的TS系展示干细胞样特征，包含干细胞标志物的表达、多谱系分化和在免疫受损的小鼠(NSG)中以低细胞数目起始原位肿瘤的能力。PBT030-2EGFP:ffLuc TS起始的异种移植模型(0.1x106细胞；5天移植物移入)先前已经用于评估NSG小鼠中表达IL13Rα2-特异性CAR的T细胞的体内抗肿瘤活性，由此显示2周期间三次注射2x106细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)降低肿瘤生长。然而，在那些实验中，大多数PBT030-2肿瘤最终复发。通过比较，单次注射IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM(1.1x106CAR+ TCM；2x106总TCM)展示针对PBT030-2 EGFP:ffLuc TS-起始的肿瘤(0.1x106细胞；5天移植物移入)的强的抗肿瘤活性，如图8A-C中所示。与利用PBS或模拟转导的TCM(无CAR)处理的NSG小鼠相比，IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM显著减少ffLuc流量(>18天，p<0.001)并显著提高存活(p＝0.0008)。
简言之，将EGFP-ffLuc+ PBT030-2肿瘤细胞(1×105)立体定向植入NSG小鼠的右前脑中。在第5天，小鼠接受2x106个IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM(1.1x106CAR+；n＝6)、2x106个模拟TCM(无CAR；n＝6)或PBS(n＝6)。图8A描述了来自各组的代表性小鼠，使用XenogenLiving Image显示相对肿瘤负荷。ffLuc流量(光子/秒)的定量显示与模拟转导的TCM和PBS相比，IL13(EQ)BBζ/CD19t+ TCM诱导肿瘤消退(#p<0.02，*p<0.001，重复测量ANOVA)(图8B)。如图8C中所示，Kaplan Meier存活曲线(n＝6/组)证明利用IL13(EQ)BBγ/CD19t+ TCM处理的小鼠存活显著提高(p＝0.0008；时序检验)。
实施例8：IL13(EQ)BBζ+ Tcm和非Tcm IL13-zetakine CD8+ CTL克隆在抗肿瘤效果和T细胞持续性中的比较
下述研究比较了IL13(EQ)BBζ+ Tcm与先前产生的IL13Rα2-特异性人CD8+ CTL(IL13-zetakine CD8+ CTL(描述于Brown等2012 Clin Cancer Res 18:2199和Kahlon等2004Cancer Res64:9160)。IL13-zetakine使用CD3ζ刺激域，缺少共刺激域并使用与IL13(EQ)BBζ+相同的IL13变体。
产生了来自患者成胶质细胞瘤样本的一组原代系(PBT)，其在无血清培养基中生长为肿瘤球(TS)(Brown等2012 Clin Cancer Res 18:2199；Brown等2009 Cancer Res69:8886)。这些扩增的TS系展示干细胞样特征，包含干细胞标志物的表达、多谱系分化和在免疫受损的小鼠(NSG)中以低细胞数目起始原位肿瘤的能力。IL13Rα2+原代低传代成胶质细胞瘤TS系PBT030-2用于下文概括的实验，已经改造所述IL13Rα2+原代低传代成胶质细胞瘤TS系PBT030-2以表达EGFP和萤火虫萤光素酶(ffLuc)报告基因二者(PBT030-2 EGFP:ffLuc)(Brown等2012 Clin Cancer Res 18:2199)。
首先，单剂量(1x106CAR T细胞)的IL13(EQ)BBζ+ Tcm产物与针对第8天PBT030-2EGFP:ffuc TS-起始的异种移植物(0.1x106细胞)评估的IL13-zetakine CD8+ CTL克隆进行比较。尽管两个IL13Rα2-特异性CAR T细胞(IL13-zetakine CTL和IL13(EQ)BBζTcm)与未处理的和模拟Tcm(CAR-阴性)对照相比，证明针对建立的PBT030-2肿瘤的抗肿瘤活性(图9A和9B)，IL13(EQ)BBZ+ Tcm与我们的第一代IL13-zetakine CD8+ CTL克隆相比介导显著提高的存活和持久的肿瘤消退，小鼠存活大于150天(图9C)。
为了进一步比较这两个IL13Rα2-CAR T细胞产物的治疗效果，进行针对第8天PBT030-2EGFP:ffuc TS-起始的肿瘤的1.0、0.3和0.1x106CAR T细胞的剂量滴定(图10A-C)。如在6只动物中的3只中通过Xenogen flux所测定，最高剂量(1x106)的IL13-zetakineCD8+ CTL cl.2D7介导抗肿瘤应答(图10C)，但是在较低CAR T细胞剂量没有观察到明显的抗肿瘤应答。通过比较，在大多数小鼠中在所有剂量水平上，包含利用尽可能少的0.1x106CAR T细胞的处理，注射IL13(EQ)BBζ+ Tcm产物介导完整的肿瘤消退。这些数据证明IL13(EQ)BBζ+ Tcm比IL13-zetakine CD8+ CTL克隆在抗肿瘤效果上至少更有效10倍。提高的抗肿瘤效果是由于肿瘤微环境中提高的T细胞持续性。i.c.注射后7天评估CD3+ T细胞揭示了肿瘤微环境中显著数量的IL13(EQ)BBζ+ Tcm，然而存在非常少的第一代IL13-ζCTL(图11)。
实施例9：用于处理大的TS起始PBT肿瘤的CAR T细胞递送途径的比较
下文描述的是这样的研究，其比较在针对侵入性原代PBT系的抗肿瘤活性上静脉内(i.v.)或颅内(i.c.)的递送途径。在初步研究中(数据未显示)，出乎预料到观察到与用于处理小的(第5天)PBT030-2 EGFP:ffLuc肿瘤的PBS相比，i.v.施用的IL13(EQ)BBζ+ Tcm没有提供治疗益处。这与利用i.c.施用的CAR+ T细胞观察到的强治疗效果相反。推理第5天的PBT030-2肿瘤可能已经太小了以致于不能从外周募集治疗性T细胞，对在针对较大的第19天的PBT030-2EGFP:ffLuc肿瘤的i.v.相对于i.c.递送进行比较。对于这些研究，利用两次i.v.输注(5x106CAR+ Tcm；第19天和第26天)或四次i.c.输注(1x106CAR+ Tcm；第19、22、26和29天)IL13(EQ)BBZ+ Tcm，或模拟Tcm(无CAR)处理PBT030-2移入的小鼠。此处没有如通过对i.v.施用的CAR+ T细胞Xenogen成像或Kaplan-Meier存活分析所监测到的治疗益处(图12A和12B)。相反，对i.c.施用的IL13(EQ)BBζ+ Tcm观察到有效的抗肿瘤活性(图12A-B)。然后，收集来自T细胞注射后7天的一组小鼠的脑并通过IHC评估CD3+人T细胞。令人惊讶的是，对于利用模拟Tcm或IL13(EQ)BBζTcm i.v.处理的小鼠，在肿瘤或其中人T细胞通常存在的其他小鼠脑区域(即，柔脑膜)中没有可检测的CD3+人T细胞(图12C)，提示肿瘤向性的缺乏。这与在i.c.处理的小鼠中检测到显著数量的T细胞相反(图12D)。
肿瘤来源的细胞因子，特别是MCP-1/CCL2在将T细胞募集到肿瘤中是重要的。因此，评估PBT030-2肿瘤细胞并发现该系产生与U251T细胞相当的高水平的MCP-1/CCL2(数据未显示)，所述U251T细胞是先前显示吸引静脉内施用的效应器CD8+ T细胞到颅内移入的肿瘤的神经胶质瘤系。恶性神经胶质瘤是高度侵入性肿瘤并且在表现上经常是多病灶的。上述研究确定IL13BBZ TCM可以消除浸润的肿瘤如PBT030-2，并且介导长期持久的抗肿瘤活性。也检查了颅内递送的CAR T细胞运输到多病灶疾病的能力。对于该研究，将PBT030-2EGFP:ffLuc TS植入左半球和右半球(图13A)并仅在右边肿瘤位点上注射CAR+ T细胞。令人鼓舞的是，对于所评估的所有小鼠(n＝3)，我们通过在注射位点(即，右边肿瘤)，以及左半球的肿瘤内在T细胞输注后7天通过CD3 IHC检测T细胞(图13B)。这些发现提供了这样的证据，即CAR+ T细胞能够运输到并浸润远位点上的肿瘤灶。在使用U251T神经胶质瘤细胞系的第二个肿瘤模型中也观察到类似的发现(数据未显示)。
实施例10：IL13(EQ)BBζ/CD19t序列
在图17中描述了IL13(EQ)BBζ/CD19t的完整氨基酸序列。整条序列(SEQ ID NO:1)包含：22个氨基酸的GMCSF信号肽(SEQ ID NO:2)、112个氨基酸的IL-13序列(SEQ ID NO:3；粗体显示的氨基酸取代E13Y)；229个氨基酸的IgG4序列(SEQ ID NO:4；具有粗体显示的氨基酸取代L235E和N297Q)；22个氨基酸的CD4跨膜序列(SEQ ID NO:5)；42个氨基酸的4-1BB序列(SEQ ID NO:6)；3个氨基酸的Gly接头；112个氨基酸的CD3ζ序列(SEQ ID NO:7)；24个氨基酸的T2A序列(SEQ ID NO:8)；和323个氨基酸的CD19t序列(SEQ ID NO:9)。
成熟的嵌合抗原受体序列(SEQ ID NO:10)包含：112个氨基酸的IL-13序列(SEQID NO:3；粗体显示的氨基酸取代E13Y)；229个氨基酸的IgG4序列(SEQ ID NO:4；具有粗体显示的氨基酸取代L235E和N297Q)；22个氨基酸的CD4序列(SEQ ID NO:5)；42个氨基酸的4-1BB序列(SEQ ID NO:6)；3个氨基酸的Gly接头；和112个氨基酸的CD3ζ序列(SEQ ID NO:7)。在该CAR序列(SEQ ID NO:10)中是IL-13/IgG4/CD4t/41-BB序列(SEQ ID NO:11)，其包含112个氨基酸的IL-13序列(SEQ ID NO:3；粗体显示的氨基酸取代E13Y)；229个氨基酸的IgG4序列(SEQ ID NO:4；具有粗体显示的氨基酸取代L235E和N297Q)；22个氨基酸的CD4序列(SEQ ID NO:5)；和42个氨基酸的4-1BB序列(SEQ ID NO:6)。IL13/IgG4/CD4t/4-1BB序列(SEQ ID NO:11)可以通过接头如Gly Gly Gly接头连接到112个氨基酸的CD3ζ序列(SEQ IDNO:7)中。CAR序列(SEQ ID NO:10)前面可以是22个氨基酸的GMCSF信号肽(SEQ ID NO:2)。图18描述了IL13(EQ)41BBζ[IL13{EQ}41BBζT2A-CD19t_epHIV7；pF02630](SEQ ID NO:12)与CD19Rop_epHIV7(pJ01683)(SEQ ID NO:13)的序列比较。
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Claims (12)

1.用表达嵌合抗原受体的载体转导的人T细胞群，其中：
至少50％的经转导的人T细胞是CD45R0+,CD62L+和CD45Ra-，
至少10％的所述细胞是CD4+，
至少10％的所述细胞是CD8+，
作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少10％也是CD4+，并且
作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少10％也是CD8+。
2.权利要求1的人T细胞群，其中作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少15％也是CD4+，并且作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少15％也是CD8+。
3.用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-2中任一项所述的人T细胞群。
4.根据权利要求3使用的组合物，其中所述人T细胞群对于所述患者是自体的，或者其中所述人T细胞群对于所述患者是同种异体的。
5.用于制备中央记忆T细胞群的方法，其包括：获得来自人受试者的T细胞群；
针对表达CD25的细胞，表达CD14的细胞和表达CD45Ra的细胞消减所述T细胞群以制备经消减的T细胞群；
针对表达CD62L的细胞富集经消减的T细胞群，由此制备中央记忆T细胞群，
其中所述方法不包括针对表达CD4+的细胞消减细胞群的步骤，并且不包括消减表达CD8+的细胞的细胞群的步骤，
其中在所述中央记忆T细胞群中至少50％的细胞是CD45R0+,CD62L+和CD45Ra-，
至少10％的所述细胞是CD4+，
至少10％的所述细胞是CD8+，
作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少10％也是CD4+，并且
作为CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-的细胞的至少10％也是CD8+。
6.权利要求5的方法，其中在所述中央记忆T细胞群中至少50％的细胞是CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-，至少15％的细胞是CD4+并且至少15％的细胞是CD8+。
7.权利要求5的方法，其中在所述中央记忆T细胞群中至少50％的细胞是CD45R0+，CD62L+和CD45Ra-，至少20％的细胞是CD4+并且至少20％的细胞是CD8+。
8.权利要求5的方法，其进一步包括刺激所述中央记忆T细胞群。
9.权利要求8的方法，其包括将所述中央记忆T细胞群与CD3和/或CD28接触。
10.权利要求8的方法，其进一步包括用表达重组蛋白的载体转导所述细胞以产生经遗传修饰的中央记忆T细胞群。
11.权利要求10的方法，其进一步包括扩充所述经遗传修饰的中央记忆T细胞群。
12.权利要求11的方法，其中扩充经遗传修饰的中央记忆T细胞群的步骤包括将所述细胞暴露于IL-2和IL-15中的一种或两种。
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