CN107376032A

CN107376032A - 一种膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法

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Publication number: CN107376032A
Application number: CN201710702758.3A
Authority: CN
Inventors: 汪长春; 吴攀; 龙霈华; 徐虹; 陈宏�
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2017-08-16
Filing date: 2017-08-16
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明属于功能材料和生物技术领域，具体为一种膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法。本发明的是一种通过反相悬浮法制备的琼脂糖微球与透明质酸交联形成的凝胶，或者是一种通过反相悬浮法制备的带有荧光基团的琼脂糖微球与透明质酸交联形成的凝胶。通过反相悬浮法制备琼脂糖微球，再在碱性条件下进行交联，交联琼脂糖与透明质酸混合形成凝胶填充剂，并可在琼脂糖微球表面接枝荧光基团，后期动物实验即可实现高效且无创的活体成像，以便观察凝胶填充剂在体内的保留情况。本发明制备时间短，过程简单高效，产品热稳定性好，机械强度高。

Description

一种膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法

技术领域

本发明属于功能材料和生物技术领域，具体涉及一种膀胱输尿管反流注射治疗用填充剂及其制备方法。

背景技术

膀胱输尿管反流(Vesicoureteral reflux, VUR)是最常见的先天性肾脏和尿路畸形之一。VUR患儿具有泌尿系统感染的高风险, 可引起肾盂肾炎和肾疤痕的形成（Pediatrics, 1999, 103(4): 843）, 肾疤痕及其后的慢性肾损伤即反流型肾病（refluxnephropathy, RN）可导致成人期高血压、蛋白尿和进行性肾功能衰竭。研究表示，有5%~10%VUR患儿最终因RN进展为终末期肾病（The Journal of urology, 2003, 169(1):309；Pediatric Nephrology. 2012, 27(4):551）。因此，对儿童VUR，早发现、正确诊断以及进行规范治疗一直是医学界关注研究的热点。

内窥镜下注射治疗VU，R因其操作简单快速，几无术后疼痛，微创美观，仅在门诊手术条件下即能完成，副作用小，而被广泛研究，其原理是利用内镜将各类填充剂注射于输尿管膀胱壁间段的黏膜下层，填充剂能抬高输尿管末端及开口位置，可以达到抗反流的目的。

目前报道过的填充材料有：Teflon（聚四氟乙烯）（Br Med J (Clin Res Ed).1984, 289(6436):7）, 动物蛋白（J. Urology. 2000, 55(5):759）, 聚二甲硅烷颗粒（Urology. 2002, 60(5):894）, 自体软骨细胞（The Journal of urology. 1999, 162(3):1185），聚丙烯酸酯-多元醇共聚物（Journal of pediatric urology. 2011,7(6):654）等。但是由于具有迁移到其他脏器的可能性，不能生物降解，有致敏可能性，会被人体吸收，不能长时间稳定地存在在患处等缺点，上述材料在应用上受到了一定的限制。

目前国内尚未正式批准任何治疗VUR内窥镜下注射用填充药物。本发明通过简单方法制备琼脂糖微球/透明质酸水凝胶，制得可注射的VUR凝胶填充剂。本发明致力于制备国内首个批准的VUR内窥镜下注射用填充剂，这将填补国内目前的空白，为国内VUR患儿带来福音。

发明内容

本发明的目的在于提出一种制备方便、热稳定性好、机械强度高的膀胱输尿管反流注射治疗用荧光填充剂及其制备方法。带有荧光基团的交联琼脂糖微球/明质酸凝胶填充剂的制备方法及其在膀胱输尿管反流等疾病注射治疗的应用。

本发明提出的膀胱输尿管反流注射治疗用荧光填充剂，是一种通过反相悬浮法制备的琼脂糖微球与透明质酸交联形成的凝胶，或者是一种通过反相悬浮法制备的带有荧光基团的琼脂糖微球与透明质酸交联形成的凝胶。后者可使后期动物实验即可进行方便高效且无创的活体成像观察凝胶填充剂在体内的保持情况。

本发明提出的交联琼脂糖微球/透明质酸凝胶的制备方法，具体步骤为：

（1）以琼脂糖粉末和去离子水为原料配制成琼脂糖水溶液；

（2）利用反相悬浮法将步骤（1）的琼脂糖水溶液制备成琼脂糖微球；

（3）在步骤（2）制备的体系中加入交联剂和碱，进行交联反应，形成交联琼脂糖微球；

（4）将步骤（3）制备的体系通过多次分离洗涤，得到具有一定粒径分布的交联琼脂糖微球；

（5）步骤（4）得到的交联琼脂糖微球与透明质酸配制成凝胶，作为注射用填充剂；或者将步骤（4）得到的交联琼脂糖微球接枝荧光分子，然后再与透明质酸配制成凝胶，作为注射用填充剂，以满足后期活体成像观察体内保留情况的需要。

本发明步骤（1）中，琼脂糖水溶液的浓度为1-10%（w/w）。

本发明步骤（2）中，所述反相悬浮法，采用正辛烷为液相，使用Span-80作为乳化剂，在高速机械搅拌、50-85℃温度下，加入琼脂糖水溶液，经反应得到琼脂糖微球。

本发明步骤（3）中，所述交联反应在150-1000rpm的搅拌速度下进行，交联反应温度为35-80℃，反应时间为0.5-6h。所述交联剂选自环氧氯丙烷、1,3-二溴-2-丙醇等，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠、碳酸钠中的一种，或者多种。

本发明步骤（4）中，所述分离洗涤用溶液为乙醇、20%乙醇-水溶液以及去离子水；分离可以采用离心分离（离心转速1000-5000rpm, 1-10min），也可采用静置分离(静置时间0.5-5h)；然后用分样筛(65-190目)过滤洗涤，得到一定粒径（80-250微米）分布的交联琼脂糖微球。

本发明步骤（5）中，所述接枝的荧光分子可为异硫氰酸荧光素（异构体I）、吲哚菁绿、罗丹明的一种；交联琼脂糖微球直接与透明质酸配制成凝胶，其浓度为1-100 mg/ml，交联琼脂糖微球接枝荧光分子后再与透明质酸配制成的凝胶，其浓度为1-50 mg/ml。

将上述交联琼脂糖微球透明质酸凝胶注射在老鼠皮下，观察保留情况。

本发明提出的交联琼脂糖微球透明质酸凝胶的制备方法，所述交联琼脂糖微球是通过反相悬浮法将琼脂糖在碱性条件下交联制备得到，通过在交联琼脂糖表面接枝荧光基团，可高效且无创地观察凝胶在体内的保留情况。

本发明具体操作流程如下：

（1）称取0.5-3g琼脂糖粉末与50g去离子水中，在90-100℃条件下加热，磁力或机械搅拌10-30mins至琼脂糖全部溶解，形成浓度为1-10%（w/w）的琼脂糖水溶液；该琼脂糖水溶液粘度较大；

（2）（用移液枪或者移液管）移取50ml正辛烷，加入0.1-5g乳化剂Span-80，高速机械搅拌，搅拌速度500-1500rpm, 在搅拌过程中，同时升温到50-85℃，将步骤（1）得到的琼脂糖水溶液（粘度较大）倒入高速搅拌的正辛烷中，高继续速搅拌0.5-2h；

（3）将步骤（2）得到的反应体系温度调至35-80℃，加入0.1-2M 碱性溶液 2ml，交联剂0.1-4g，搅拌速度150-1000rpm，交联反应0.5-6h；

（4）停止加热，静置后溶液分层，下层为琼脂糖微球；将上层液体倒出，下层固体依次用乙醇、20%乙醇-水溶液和去离子水洗涤分离数次，洗涤分离可以采用离心分离（1000-5000rpm, 1-10min）的形式，也可采用静置分离(0.5-5h)，后用分样筛(65-190目)过滤洗涤得到一定粒径分布的交联琼脂糖微球，产物保存在20%的乙醇-水溶液或者去离子水中备用；

（5）交联琼脂糖微球接枝荧光分子，取步骤（4）得到的产物1-5g（湿重）于二胺溶液中，磁力搅拌下35-50℃反应0.5-5h，二胺溶液是由0.1-2g二胺加入到50ml 0.1M 碱性溶液中配制而成；反应完成后撤去加热，将反应得到的微球置于分样筛（65-190目）上，用大量去离子水洗涤至滤液呈中性；将1-10 mg荧光素分散在100 ml去离子水中，超声15 -30min使其溶解，加入0.1-2g（湿重）表面接枝己二胺的琼脂糖微球，常温下磁力搅拌反应1-18 h；将反应过后得到的微球置于分样筛（65-190目）上，用大量去离子水洗涤，直至洗涤液无色记得到接枝荧光基团的交联琼脂糖微球；

（6）取步骤（4）或步骤（5）得到的交联琼脂糖微球与透明质酸配成凝胶，浓度分别为1-100 mg/ml和1-50 mg/ml，搅拌过夜，使其形成体系均匀的凝胶。

用注射器注射0.1ml-2ml凝胶在老鼠皮下监测其在体内保存情况；

本发明中，步骤（5）中所述的二胺可为乙二胺，丙二胺，丁二胺，戊二胺，己二胺中的一种；

本发明中，步骤（5）中所述的荧光素可为异硫氰酸荧光素（异构体I），吲哚菁绿，罗丹明的一种；

利用本发明制备方法获得的交联琼脂糖微球，尺寸分布可调控，热稳定性好和机械性能强；

本发明制备得到交联琼脂糖荧光微球，荧光效果好，且皮下注射可通过活体成像方便高效观察其在体内保留情况，无明显伤害性，是一种理想并具有广泛应用的的注射填充材料；

本发明所制备交联琼脂糖微球透明质酸凝胶的具有以下特点：1.反相悬浮法制备过程简单、高效，且具有工业化大规模生产的潜力；2.交联琼脂糖微球，热稳定性好且可通过交联程度进行调控，机械强度高，尺寸可控；3.可接枝荧光分子，可方便后续动物实验简单高效观察，且不具有伤害性；4.凝胶生物相容性好，无细胞毒性，皮下注射无明显不良反应；5.凝胶可在体内保存至少两周及以上。说明所制备的交联琼脂糖微球透明质酸凝胶是一种优异且可广泛应用的理想注射填充材料。

附图说明

图1为实施例1中未经筛分的尺寸约在10-700微米的交联琼脂糖的光学显微镜照片；

图2为实施例4中经筛分后尺寸约在80-250微米交联琼脂糖的光学显微镜照片；

图3为实施例5中经加热过夜后交联琼脂糖的光学显微镜照片，可见微球形态保持较好，在加热过程中稳定性好；

图4为实施例8中表面修饰异硫氰酸荧光素FITC的琼脂糖微球照片；

图5为实施例8中FITC接枝琼脂糖微球的荧光显微镜照片,荧光效果很明显；

图6为实施例10中交联琼脂糖（未接FITC）/透明质酸凝胶注射材料照片；

图7为实施例11中琼脂糖/透明质酸可注射填充材料剪切模量随温度变化的关系，不同的透明质酸（HA）和琼脂糖微球（AG）的配比，显示了体系中透明质酸的比例越高，凝胶粘度越大。凝胶的剪切模量不会因温度升高明显下降，维持较好的粘度，说明用此种方法得到的凝胶较为稳定，有在体内保留较长时间的潜力；

图8为实施例12中老鼠的小动物活体成像照片，左图为注射前，右图为注射后，绿色荧光部分即为注射凝胶位置，成像效果明显。

具体实施方式

实施例 1 ：交联琼脂糖微球的制备

1. 称取3g琼脂糖粉末与50ml去离子水中，95℃条件下加热搅拌至琼脂糖全部溶解，形成6%（w/w）的琼脂糖水溶液，溶解之后溶液粘度较大；

2. 用移液枪移取50ml正辛烷，加入2g乳化剂Span-80，搅拌溶解，然后用机械搅拌装置进行高速搅拌，搅拌速度800rpm，在这一过程中同时升温到65℃；

3. 将溶解完全的琼脂糖水溶液（粘度较大）趁热倒入高速搅拌的正辛烷中，维持65℃，高速搅拌30min；

4. 将反应体系温度降至50℃，加入2M NaOH溶液 2ml，交联剂环氧氯丙烷2g，降速搅拌，搅拌速度250rpm，交联反应1h；

5. 撤去加热，静置后溶液分层，下层为琼脂糖微球。将上层液体倒出，下层固体依次用乙醇、20%乙醇-水溶液、和去离子水洗涤，洗涤可以采用离心分离的形式，也可采用静置分离或是用分样筛过滤洗涤；

6. 产物应保存在20%的乙醇-水溶液或者去离子水中，制作临时玻片，通过光学显微镜观察琼脂糖微球的形态和大小。

实施例 2 ：交联琼脂糖微球的制备

1. 称取2g琼脂糖粉末与50g去离子水中，100℃条件下加热搅拌至琼脂糖全部溶解，形成4%（w/w）的琼脂糖水溶液，溶解之后溶液粘度较大；

2. 用移液枪移取50ml正辛烷，加入2g乳化剂Span-80，搅拌溶解，然后用机械搅拌装置进行高速搅拌，搅拌速度1000rpm，在这一过程中同时升温到65℃；

4. 将反应体系温度降至50℃，加入2M KOH溶液 2ml，交联剂环氧氯丙烷2g，降速搅拌，搅拌速度250rpm，交联反应1h；

实施例 3 ：交联琼脂糖微球的制备

4. 将反应体系温度降至50℃，加入2M KOH溶液 2ml，交联剂1,3-二溴-2-丙醇2g，降速搅拌，搅拌速度250rpm，交联反应1h；

实施例 4：交联琼脂糖微球的尺寸筛分

将分散在去离子水中的琼脂糖微球置于分样筛上，其中上层69目对应250微米，下层190目对应80微米。经过大量去离子水的反复冲洗，符合粒径要求（80-250微米）的微球会留在筛的中间层中，较大的微球保留在上层中，较小的微球会随着去离子水被洗掉。保存中间层微球，并取部分烘干，计算其干重。

实施例 5 ：琼脂糖微球交联性能验证

取1g已交联的微球分散在5ml去离子水中，置于95℃的烘箱中加热过夜，观察微球其是否溶解，并用光学显微镜来表征加热前后的微球结构。

实施例 6 ：交联琼脂糖微球表面接枝1,6-己二胺

1. 取2g己二胺溶解于50ml 0.1M NaHCO₃中；

2. 取4g（湿重）活化后琼脂糖微球加入上述溶液中，50℃下反应，磁力搅拌，反应约5h；

3. 撤去加热，将反应后得到的微球置于分样筛（190目）上，用大量去离子水洗涤至滤液呈中性，说明未反应的己二胺已被除去；用元素分析方法验证己二胺接枝上去并验证接枝量，结果见表1，可证明己二胺成功接枝到琼脂糖上。

实施例 7：交联琼脂糖微球表面接枝乙二胺

1. 取1g乙二胺溶解于25ml 0.1M NaHCO₃中；

2. 取2g（湿重）活化后琼脂糖微球加入上述溶液中，65℃下反应，磁力搅拌，反应约4h；

3. 撤去加热，将反应后得到的微球置于分样筛（190目）上，用大量去离子水洗涤至滤液呈中性，说明未反应的乙二胺已被除去；用元素分析方法验证己二胺接枝上去并验证接枝量。

实施例 8：微球表面接枝异硫氰酸荧光素（FITC）

1. 将10 mg异硫氰酸荧光素（异构体I）分散在100 ml去离子水中，超声15 min使其溶解；

2. 加入2g（湿重）表面接枝己二胺的琼脂糖微球，常温下磁力搅拌18 h；

3. 将反应过后得到的微球置于分样筛（190目）上，微球呈橙黄色，用大量去离子水洗涤，直至洗涤液无色，过程中微球的橙黄色未褪去。

实施例 9：微球表面接枝吲哚菁绿

1. 将20 mg吲哚菁绿分散在100 ml去离子水中，超声15 min使其溶解；

2. 加入1g（湿重）表面接枝己二胺的琼脂糖微球，常温下磁力搅拌12 h；

3. 将反应过后得到的微球置于分样筛（190目）上，用大量去离子水洗涤，直至洗涤液无色。

实施例 10 ：与载体透明质酸混合制备注射填充材料

将交联琼脂糖微球和透明质酸粉末以50 mg/ml和15 mg/ml的浓度和配比与去离子水混合，搅拌过夜使体系均匀。得到的凝胶体系粘度很大。取2 ml左右凝胶装入2 ml注射器中以备后续动物实验使用。

实施例 11 ：动态流变学测试

配置了三种不同混合比的凝胶并进行动态流变学测试，结果如图7所示。图示中HA表示透明质酸（15mg/ml），AG表示琼脂糖微球（50mg/ml），二者以不同体积比混合。

实施例 12：小动物活体成像测试

将交联琼脂糖荧光微球和透明质酸粉末以50 mg/ml和15 mg/ml的浓度和配比与去离子水混合，搅拌过夜使体系均匀。得到的凝胶用注射器注射0.8ml在老鼠皮下，用活体成像分别测试其在注射前后的状态。

表1为实施例6中接枝己二胺后用元素分析测试结果

Claims

1.一种膀胱输尿管反流注射治疗用凝胶，其特征在于，是一种通过反相悬浮法制备的琼脂糖微球与透明质酸交联形成的凝胶，或者是一种通过反相悬浮法制备的带有荧光基团的琼脂糖微球与透明质酸交联形成的凝胶。

2.一种膀胱输尿管反流注射治疗用凝胶的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）以琼脂糖粉末和去离子水为原料配制成浓度为1-10%（w/w）琼脂糖水溶液；

（5）步骤（4）得到的交联琼脂糖微球与透明质酸配制成凝胶，作为注射用填充剂；或者将步骤（4）得到的交联琼脂糖微球接枝荧光分子，然后再与透明质酸配制成凝胶，作为注射用填充剂。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述反相悬浮法，是采用正辛烷为液相，使用Span-80作为乳化剂，在高速机械搅拌、50-85℃温度下，加入琼脂糖水溶液，经反应得到琼脂糖微球。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述交联反应在150-1000rpm的搅拌速度下进行，交联反应温度为35-80℃，反应时间为0.5-6h；所述交联剂选自环氧氯丙烷、1,3-二溴-2-丙醇，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸氢钠、碳酸钠中的一种，或者多种。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）中所述分离洗涤用溶液为乙醇、20%乙醇-水溶液以及去离子水；分离采用离心分离，离心转速1000-5000rpm, 1-10min，或者采用静置分离，静置时间0.5-5h；然后用65-190目分样筛过滤洗涤，得到粒径为80-250微米均匀分布的交联琼脂糖微球。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，交联琼脂糖微球直接与透明质酸配制成凝胶，其浓度为1-100 mg/ml，交联琼脂糖微球接枝荧光分子后再与透明质酸配制成的凝胶，其浓度为1-50 mg/ml。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述交联琼脂糖微球接枝荧光分子的流程为：取步骤（4）得到的产物按湿重计为1-5g放于二胺溶液中，磁力搅拌下35-50℃反应0.5-5h，二胺溶液是由0.1-2g二胺加入到50ml 0.1M 碱性溶液中配制而成；反应完成后撤去加热，将反应得到的微球置于分样筛上，用大量去离子水洗涤至滤液呈中性；将1-10 mg荧光素分散在100 ml去离子水中，超声15 -30min使其溶解，加入按湿重计为0.1-2g表面接枝己二胺的琼脂糖微球，室温下磁力搅拌反应1-18 h；将反应过后得到的微球置于分样筛上，用大量去离子水洗涤，直至洗涤液无色记得到接枝荧光基团的交联琼脂糖微球。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的二胺为乙二胺，丙二胺，丁二胺，戊二胺，己二胺中的一种。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述的荧光素为异硫氰酸荧光素（异构体I）、吲哚菁绿、罗丹明中的一种。

10.一种如权利要求 1 所述的凝胶在制备膀胱输尿管反流注射剂中的应用。