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CN107312067A - 寡肽γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile、浓厚味赋予剂、调味料及其制备方法 - Google Patents

寡肽γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile、浓厚味赋予剂、调味料及其制备方法 Download PDF

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CN107312067A CN201710511214.9A CN201710511214A CN107312067A CN 107312067 A CN107312067 A CN 107312067A CN 201710511214 A CN201710511214 A CN 201710511214A CN 107312067 A CN107312067 A CN 107312067A
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崔春
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    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
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Abstract

本发明公开了寡肽γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile、浓厚味赋予剂、调味料及其制备方法。所述寡肽γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile的氨基酸序列为γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile。浓厚味赋予剂由所述寡肽和其他肽组成。所述调味料含有300mg/kg以上的γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile。这种γ‑谷氨酰胺肽γ‑Glu‑γ‑Glu‑Ile在300mg/kg的浓度下可显著提高食品特别是调味品的厚味。

Description

寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile、浓厚味赋予剂、调味料及其制备 方法
技术领域
本发明涉及具有呈味效果的肽，具体涉及具有厚味的γ-谷氨酰肽及其应用。
背景技术
γ-谷氨酰肽广泛存与多种动植物和发酵食品中，是一种安全天然、安全的食品成分。常见的谷胱甘肽其一级结构是γ-Glu-Cys-Gly，是一种典型的γ-谷氨酰肽。现代研究表明γ-谷氨酰肽与生物体的代谢活动和生理功能有关，此外大部分γ-谷氨酰肽具有镇定减压、舒缓疲劳、抗癌解毒、络合重金属离子、维持细胞金属离子平衡等生理功能。
近年来，人们发现γ-谷氨酰肽还具有较强的呈味特性。2002年日本味之素株式会社公开了通过探索具有CaSR激动剂活性的多种多样的化合物，发现具有更优异的浓味赋予作用，特别是具有前味型的浓味赋予作用，且具有优异的稳定性，可以简便而低成本地生产的能够赋予浓味的物质，提供包含该物质的浓味赋予剂，以及将该物质与其他具有CaSR激动剂活性的物质组合使用而成的复合浓味赋予剂。包含γ-Glu-Abu(L-γ-谷氨酰-L-2-氨基丁酸)的浓味赋予剂，以及该物质与其他具有CaSR激动剂活性的物质组合使用而成的复合浓味赋予剂(专利申请号201080024054.1)。
在低浓度条件下的大部分γ-谷氨酰肽具有轻微涩味，随着浓度的提高，γ-谷氨酰肽开始呈现基本味道。例如γ-Glu-Glu在浓度为10mmol/L时有鲜味，γ-Glu-tyr的苦味阈值是其涩味阈值的两倍。在鲜味溶液中，γ-谷氨酰肽具有厚味，阈值也在明显下降。随着人们对呈味肽的进一步了解，学者发现γ-谷氨酰肽具有厚味物质的特征：1.在水溶液中基本没有味道或只有轻微的味道(涩味或酸味)；2.能够与体系中的其他呈味物质发生协同增效作用，添加到含有鲜味物质的溶液体系中，不会改变溶液的基本味觉强度，但是能协调各种味道，显著增加浓厚感(kokumi)；3.与纯水溶液相比，在鲜味溶液中阈值明显下降。
表1已报道γ-谷氨酰肽呈味特性和阈值一览表
迄今为止，尚未见γ-Glu-γ-Glu-Ile具有浓厚味的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的上述不足，提供一种利用谷氨酰胺酶合成γ-谷氨酰肽的制备方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile，其氨基酸序列为γ-Glu-γ-Glu-Ile。
本发明还提供了浓厚味赋予剂，由所述寡肽和如下一种以上的肽组合而成：γ-Glu-X-Gly、γ-Glu-Val-Y、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu和γ-Glu-Cys(S-Me)；X、Y表示氨基酸或氨基酸衍生物。
本发明还提供了含有所述寡肽的调味料，其含有300mg/kg以上的γ-Glu-γ-Glu-Ile。
进一步地，所述的调味料含有1000重量mg/kg以上的γ-Glu-γ-Glu-Ile。
所述寡肽的制备方法具体是：谷氨酰胺与游离异亮氨酸，摩尔比为1～2:1，溶于水中得溶液，调节反应pH为7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶0.02-1％(w/w)，在25-50℃反应3-12小时，后用4mol/L盐酸回调pH至7～8之间，90℃灭酶10min，得到富含γ-Glu-γ-Glu-Ile的反应液。
上述寡肽的制备方法中，采用XSelect HSS T3 5μm 4.6x 250mm分析柱，流动相A液为0.1％(V/V)甲酸-水溶液；流动相B液为0.1％(V/V)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1mL/min，反应液的进样量10μL，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，9.440min出的峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile。
进一步地，所述溶液中谷氨酰胺的浓度为400-1000mmol/L。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
1)本发明首次公开了γ-Glu-γ-Glu-Ile具有厚味特性。
2)首次公开了利用谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶催化制备γ-Glu-γ-Glu-Ile。
附图说明
图1为酶促反应后混合物的液相色谱图；
图2为γ-Glu-γ-Glu-Ile的二级质谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体是实施作进一步举例，但本发明的实施和保护不限于此。
实施例1
将解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SWJS22(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8425，已经经在中国专利申请号201510222162.4的申请中提交了保藏证明)以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉)中，37～39℃发酵培养30h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即谷氨酰胺酶粗酶液。
将400mM谷氨酰胺和600mM异亮氨酸于100g水中，分别调节溶液的pH值至9.5，加入1g粗酶液，在40℃分别反应12h后，用4mol/L盐酸回调pH至7.0后，90℃灭酶10min，得到含有γ-Glu-γ-Glu-Ile的反应液。
采用XSelect HSS T3 5μm 4.6x 250mm分析柱，流动相A液为0.1％(V/V)甲酸-水溶液；流动相B液为0.1％(V/V)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1mL/min，反应液的进样量10μL，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱(条件：0min时90％的A液和10％的B液梯度5min内降低到85％的A液和15％的B液，下一个5min内降低到20％A液和80％的B液)。9.440min的峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile。收集9.440min的寡肽峰，进行感官评价和UPLC-MS/MS分析。
UPLC-MS/MS对反应产物进行定性分析：包括：An Agilent 1290series UPLCsystem(Agilent Technologies)用于分离各γ-Glu-peptides,带有an elec-trosprayionization(ESI)的质谱系统(Q-TOF MS/MS，Bruker Daltonics)进行定性分析。色谱柱为：Agilent ZORBAX RRHD SB-C18(2.1x 50mm,1.8μm)。进样量为5μL。液相条件为：溶液A为0.1％甲酸-水溶液，和溶液B为0.1％甲酸-乙腈溶液，梯度洗脱程序为：0–10％B,0-5.0min；10-15％B,5.0-10.0min；然后100％B,10.0-12.0min。MS条件：Ionization(离子化)：正离子模式；Drying gas(干燥气体)：350℃下10L/min；Nebulizer(喷雾器压力)：25psig；Fragmentor(毛细管电压)：30V。对收集物进行UPLC-MS/MS分析，其检测结果如图2。由图2可知，其一级结构为γ-Glu-γ-Glu-Ile。
实施例2
将枯草芽胞杆菌ATCC 6633以1％的接种量接种于发酵培养基(发酵培养基的组成为：4％豆粕、2％麸皮、2％玉米粉)中，37～39℃发酵培养48h。将发酵液于4℃，10000r/min条件下高速离心10min，过滤得上清液，即γ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液。
将600mM谷氨酰胺和400mM异亮氨酸溶于100g水中，分别调节溶液的pH值至8.0，加入1gγ-谷氨酰胺转肽酶粗酶液，在40℃分别反应6h后，用4mol/L盐酸回调pH至7.0后，90℃灭酶10min，得到富含γ-Glu-γ-Glu-Ile的反应液。采用XSelect HSS T3 5μm 4.6x 250mm分析柱，流动相A液为0.1％(V/V)甲酸-水溶液；流动相B液为0.1％(V/V)甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1mL/min，反应液的进样量10μL，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，9.440min的寡肽峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile。
实施例3
添加0.03％(g/g)γ-Glu-γ-Glu-Ile或γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-Ile酱油中，评价其呈味特性变化。其中，酱油为市售海天金标酱油。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成。感官评价结果表明，添加0.03g％γ-Glu-γ-Glu-Ile的酱油，其厚味均具有明显提高。。
实施例4
称取0.03g和0.06g的γ-Glu-γ-Glu-Ile，以及0.5g食盐和0.3g味精，溶解于100g水中，并和空白样(0.5g食盐溶于100g水中)进行感官评价。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的7位男性和9位女性组成，感官评价结果见表1。
由表1可见，γ-Glu-γ-Glu-Ile在食盐水中的阈值为0.06g/100g，添加味精可明显降低γ-Glu-γ-Glu-Ile的刺激呈味阈值，为0.03g/100g。
表1
16位感官评价小组中有13人发现0.5％食盐和0.3％味精溶液中添加γ-Glu-γ-Glu-Ile的样品具有显著的厚味增强效果，3人认为厚味略有增强。
实施例5
将牛肉与9倍重量去离子水混合，100℃煮沸60min后，过滤去除不溶性物质和油脂，加入牛肉汤重量0.3％的食盐后，分别添加牛肉汤重量0.03％和0.04％的γ-Glu-γ-Glu-Ile，并交由感官评价小组对鸡汤的厚味进行评价，结果见表2。感官评价实验由30-41岁有感官评价经验的11位男性和9位女性组成，
表2
由表2可见，牛肉汤中添加0.03-0.04％的γ-Glu-γ-Glu-Ile，超过90％以上的感官评价小组认为厚味有显著或略有增加。

Claims (7)

1.一种寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile，其特征在于其氨基酸序列为γ-Glu-γ-Glu-Ile。
2.浓厚味赋予剂，其特征在于由权利要求1所述寡肽和如下一种以上的肽组合而成：γ-Glu-X-Gly、γ-Glu-Val-Y、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Ala、γ-Glu-Gly、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Met、γ-Glu-Thr、γ-Glu-Val、γ-Glu-Orn、Asp-Gly、Cys-Gly、Cys-Met、Glu-Cys、Gly-Cys、Leu-Asp、D-Cys、γ-Glu-Met(O)、γ-Glu-γ-Glu-Val、γ-Glu-Val-NH2、γ-Glu-Val-ol、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Tau、γ-Glu-Cys(S-Me)(O)、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile、γ-Glu-t-Leu和γ-Glu-Cys(S-Me)； X、Y表示氨基酸或氨基酸衍生物。
3.一种含有权利要求1所述寡肽的调味料，其特征在于含有300mg/kg以上的γ-Glu-γ-Glu-Ile。
4.根据权利要求3所述的调味料，其特征在于含有1000重量mg/kg以上的γ-Glu-γ-Glu-Ile。
5.权利要求1所述寡肽的制备方法，其特征在于谷氨酰胺与游离异亮氨酸，摩尔比为1~2:1，溶于水中得溶液，调节反应pH为7.0-10.0，添加谷氨酰胺酶或γ-谷氨酰胺转肽酶0.02-1%（w/w），在25-50℃反应3-12小时，后用4 mol/L 盐酸回调pH至7~8之间，90℃灭酶10min，得到富含γ-Glu-γ-Glu-Ile的反应液。
6.根据权利要求6所述寡肽的制备方法，其特征在于：采用XSelect HSS T3 5μm 4.6x250mm分析柱，流动相A 液为0.1％（V/V） 甲酸-水溶液；流动相B 液为0.1％(V/V) 甲酸-乙腈溶液，柱温为40℃，流速为1 mL/min，反应液的进样量 10 μL，采用高效液相色谱对反应液进行梯度洗脱，9.440min出的峰即为寡肽γ-Glu-γ-Glu-Ile。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述溶液中谷氨酰胺的浓度为400-1000mmol/L。
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