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CN107311983A - 吲哚类小分子c‑met抑制剂 - Google Patents

吲哚类小分子c‑met抑制剂 Download PDF

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Publication number
CN107311983A
CN107311983A CN201710544705.3A CN201710544705A CN107311983A CN 107311983 A CN107311983 A CN 107311983A CN 201710544705 A CN201710544705 A CN 201710544705A CN 107311983 A CN107311983 A CN 107311983A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
bases
methyl
pyrroles
amino
Prior art date
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Pending
Application number
CN201710544705.3A
Other languages
English (en)
Inventor
赵国磊
赵云萍
胡媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Wanquan Dezhong Medical Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Beijing Wanquan Dezhong Medical Biological Technology Co Ltd
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Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Wanquan Dezhong Medical Biological Technology Co Ltd filed Critical Beijing Wanquan Dezhong Medical Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201710544705.3A priority Critical patent/CN107311983A/zh
Publication of CN107311983A publication Critical patent/CN107311983A/zh
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本发明属于医药技术领域，提供了用于治疗肺癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌和胃癌等癌症的吲哚类化合物。

Description

吲哚类小分子C-MET抑制剂
技术领域
本申请属于医药技术领域，具体涉及一类作用于C-MET的高活性吲哚类C-MET抑制剂。
背景技术
C-MET是酪氨酸激酶生长因子受体家族的成员，其表达发生在内皮细胞、上皮细胞和间充质细胞中。不同于其他激酶，正受体酪氨酸激酶c-Met作为肿瘤信号网络通路中的关键节点蛋白,可以与细胞表面其他激酶、受体相互作用而备受关注。c-Met在绝大部分的癌及部分肉瘤中高表达并异常激活,在肿瘤发生发展、侵袭转移、化疗抗性等各个环节均发挥关键作用。
现在已经报告了多种C-MET抑制剂，然而，对于未曾发现的具有抑制C-MET作用的化合物仍需要不断地进行探索，以望效力改进。本申请提供了被认为具有通过抑制C-MET而治疗癌症的临床用途的新型吲哚化合物。
发明内容
本申请提供了式I的化合物或其药用盐。
以下结构式的化合物：
，
其中：
R1是H或甲基；
R2是H或甲基；
R3是苯基或对位F、氨基或甲基取代的苯基；
R4是H或甲基；
R5是H或F；
X和Y是O、S、酰胺基或酯基，二者可以相同，亦可不同；
Z是氨基、二甲基氨基、氟、环丙基、任选被氨基取代基或1-2个甲基取代基取代的吡咯基、任选被两个甲基取代基取代的吡唑基、2-甲氧基-嘧啶-5-基、4-甲基磺酰基苯基、四氢-2H-吡喃-4-基-氨基、（四氢-2H-吡喃-4-基）氨基羰基或吗啉-4-基取代基：
，
其中Ra、Rb和Rc独立地选自H或甲基。
本申请所提供得化合物或其药用盐可用于治疗肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、头部癌症、遗传性乳头状肾细胞癌，儿童期肝细胞癌和胃癌中的癌症。
本申请的化合物是胺类，大多数或全部的本申请的化合物能够与许多无机酸和有机酸反应形成药用酸加成盐。这种药用酸加成盐以及其普通的制备方法在本领域众所周知，本申请优选药用盐是甲磺酸盐。
优选的式I化合物，其中：
(a1)R1是H；
(a1)R1是甲基；
(b1)R2是H；
(b2)R2是甲基；
(c)R1是H，且R2是H；
(d1)R3是苯基；
(d2)R3是4-氟苯基；
(d3)R3是4-氨基苯基；
(d4)R3是4-甲基苯基；
(e)R1是H，R2是H，R3是4-氟苯基；
(f1)R4是H；
(f2)R4是甲基；
(g)R1是H，R2是H，R3是4-甲基苯基，R4是甲基；
(h1)R5是H；
(h2)R5是F；
(i)R1是H，R2是H，R3是4-氟苯基，R4是甲基，R5是H；
(j1)Z是氨基、二甲基氨基、环丙基、吡咯-3-基、吡唑-4-基或下式的吗啉-4-基：
；
(j2)Z是氨基、二甲基氨基、吡咯-3-基、吡唑-4-基或吗啉-4-基；
(j3)Z是吡咯-3-基、吡唑-4-基；
(j4)Z是吡咯-3-基；
(k)R1是H，R2是H，R3是4-氟苯基，R4是甲基，R5是H，Z是吡咯-3-基；
(l1)X是亚甲基、O、NH、S、酰胺基或羧基；
(l2)X是酰胺基、羧基；
(l4)X是酰胺基；
(l5)X是酯基；
(m1)Y是O、S、酰胺基或酯基；
(m2)Y是O、S、酰胺基或羧基；
(m3)Y是O、S；
(m4)Y是O；
(m5)Y是酰胺基；
(n)R1是H，R2是H，R3是4-氟苯基，R4是甲基，R5是H，Z是吡咯-3-基，X是酰胺基，Y是O；
(o) R1是H，R2是H，R3是4-氟苯基，R4是甲基，R5是H，Z是吡咯-3-基，X是酰胺基，Y是酯基。
本申请的化合物能够根据下面的合成反应路线通过本领域公知且完全了解的方法来制备，这些反应路线的步骤的适合的反应条件是本领域公知的。制备本申请的化合物所需的特定步骤次序取决于所要合成的特定化合物、起始化合物以及取代结构部分的相对倾向性，这是熟练化学工作者所充分领会的。除非另有说明，所有取代基如前面所定义，且所有试剂在本领域中是公知的。
本申请的化合物可以如以下反应路线所示合成，基团如上所定义。
反应路线I：
。
化合物8能够如上述反应路线所示制备，其中R4’、Z’和R5如以上所定义。
化合物1与化合物2在高温下在合适的碱的存在下反应，可获得化合物3，化合物3与适当的甲基化试剂如甲基碘在适合的溶剂中于适合的碱中甲基化，从而获得化合物4，其中R4’是甲基。化合物3还可以用适合的保护试剂如DHP在适当的溶剂如THF中，在酸如甲基磺酸存在下保护，从而获得化合物4，其中R4’是保护基如2-四氢吡喃基 (保护基引入和去除的方法在本领域中是公知的)。
化合物4能够在各种过渡金属促进的偶联条件下反应，从而提供具有如以上所定义的适当的取代的Z’的化合物5。更具体地说，若是碳-碳偶联，化合物5能够在诸如Suzuki偶联之类的偶联条件下用适合的硼酸、适当的催化剂如PdCl2(dppf)和适当的减如CsF在适合的溶剂如1,4-二噁烷中在高温下制备。若是碳-氮偶联，化合物5能够在诸如Buchwald-Hartwig偶联反应之类的偶联条件下用适当的含氮的反应试剂例如吗啉、适合的配体如2-二叔丁基膦基-2’-甲基联苯、碱如氢氧化钾和催化剂如Pd(dba)3在适当的溶剂如叔丁醇中在高温下来制备。偶联反应可以再普通加热条件下或在本领域技术人员公知的微波反应条件下进行。
化合物5能够在本领域技术人员公知的各种还原条件下还原为氨基化合物。更具体地说，化合物5可以与氯化亚锡在适合的溶剂中如乙酸乙酯/乙醇在高温下反应，从而得到所需化合物6。如果R4’是氮保护基，保护基将被分裂，R4’在还原之后将是质子。
化合物5还可以通过与N,N-二甲肼和氯化铁在适当的溶剂中反应或钯碳催化加氢还原。这两种还原条件仅将硝基还原为氨基，而氮保护基R4’保持不变。
本申请的化合物可以通过本领域技术人员公知的标准肽偶联条件来制备。化合物6与化合物7在肽偶联试剂作用下反应从而获得化合物8。如果R4’是适合的氮的保护基或者Z’是用氮保护基保护的官能团，则需要脱保护来获得本申请的化合物。
反应路线II：
。
化合物7能够如上述反应路线所示制备，其中R4’’、Z’’和R5如以上所定义。
化合物1与适当的甲基化试剂如甲基碘在适合的溶剂中于适合的碱中甲基化获得化合物2，其中R4’是甲基；化合物1还可以用适合的保护试剂如DHP在适当的溶剂如THF中，在酸如甲基磺酸存在下保护，从而获得化合物2，其中R4’是保护基，如2-四氢吡喃基，保护基引入和去除的方法在本领域中是公知的。化合物2于适合的碱下反应可获得化合物3。
化合物3能够在各种过渡金属促进的偶联条件下反应，从而提供具有如以上所定义的适当的取代的Z’的化合物4。更具体地说，若是碳-碳偶联，化合物4能够在诸如Suzuki偶联之类的偶联条件下用适合的硼酸、适当的催化剂如PdCl2(dppf)和适当的碱如CsF在适合的溶剂如1,4-二噁烷中在高温下制备。若是碳-氮偶联，化合物4能够在诸如Buchwald-Hartwig偶联反应之类的偶联条件下用适当的含氮的反应试剂例如吗啉、适合的配体如2-二叔丁基膦基-2’-甲基联苯、碱如氢氧化钾和催化剂如Pd(dba)3在适当的溶剂如叔丁醇中在高温下来制备。偶联反应可以再普通加热条件下或在本领域技术人员公知的微波反应条件下进行。
化合物4能够在本领域技术人员公知的各种还原条件下还原为氨基化合物。更具体地说，化合物4可以与氯化亚锡在适合的溶剂中如乙酸乙酯/乙醇在高温下反应，从而得到所需化合物5。如果R4’是氮保护基，保护基将被分裂，R4’在还原之后将是质子。
化合物4还可以通过与N,N-二甲肼和氯化铁在适当的溶剂中反应或钯碳催化加氢还原。这两种还原条件仅将硝基还原为氨基，而氮保护基R4’保持不变。
本申请的化合物可以通过本领域技术人员公知的条件来制备。化合物5与化合物6在合适的试剂作用下反应从而获得化合物7。如果R4’’是适合的氮的保护基或者Z’’是用氮保护基保护的官能团，则需要脱保护来获得本申请的化合物。
具体实施实例
以下结合实例对本申请进行更详细的描述，但不作为对本申请的限制。
实施例1：6-溴-5-(4-硝基苯氧基)-1H-吲哚
将7.5g 6-溴-5-羟基-1H-吲哚、4.7g4-氟硝基苯、2.8gNaHCO3加入到DMF中，加热升温至80℃搅拌反应5h。加入10%氯化锂，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥有机相，过滤，浓缩。柱层析提纯分离（石油醚：二氯甲烷=1:1），得产品6.2g，收率56%。MS(m/z)：334.1（M+H）。
实施例2：6-溴-5-(4-硝基苯氧基) -1-甲基-1H-吲哚
称取6.0g6-溴-5-(4-硝基苯氧基)-1H-吲哚和1.3g氢氧化钾加入150ml丙酮中，冰水浴冷却，滴加1ml甲基碘，滴加完毕于0℃反应3h，于室温下搅拌过夜。除溶，所得固体柱层析分离提纯，得产物5.2g，收率84%。MS(m/z)：348.2（M+H）。
实施例3：6-溴-5-(4-硝基苯氧基) -1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲哚
向加有5.0g6-溴-5-(4-硝基苯氧基)-1H-吲哚的40ml四氢呋喃溶液中加入2.5gDHP及1.0g甲基磺酸，室温下搅拌反应1.5h。加入乙酸乙酯和碳酸氢钠水溶液，分离有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯分离，得产物5.6g，收率89%。MS(m/z)：418.3（M+H）。
实施例4：5-(4-硝基苯氧基) -6-(1H-吡咯-3-基) -1-甲基-1H-吲哚
将5.0g6-溴-5-(4-硝基苯氧基)-1-甲基-1H-吲哚、4.0g3-吡咯硼酸、2.3gPdCl2(dppf)和6.5gCsF溶于80ml1,4-二噁烷，加热升温至110℃下搅拌过夜。加入氯化铵水溶液和乙酸乙酯萃取，分离有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离提纯，得产物3.8g，收率79%。MS(m/z)：334.3（M+H）。
实施例5：3-(1-甲基-5-(4-硝基苯氧基)-1H-吲哚-6-基)-1H-吡咯-1-甲酸叔丁酯
向3.5g5-(4-硝基苯氧基)-6-(1H-吡咯-3-基)-1-甲基-1H-吲哚的80mlTHF溶液中添加3.5g二碳酸二叔丁酯和15ml三乙胺，室温下搅拌反应4h，加入乙酸乙酯及饱和氯化铵水溶液，分离有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯，得产物3.3g，收率73%。MS(m/z)：434.5（M+H）。
实施例6：3-(1-甲基-5-(4-氨基苯氧基)-1H-吲哚-6-基)-1H-吡咯-1-甲酸叔丁酯
将2.5g3-(1-甲基-5-(4-硝基苯氧基)-1H-吲哚-6-基)-1H-吡咯-1-甲酸叔丁酯溶于THF，加入0.25g5%Pd/C，于氢气环境下加热至45℃反应10h，降温，过滤，浓缩，得产物2.1g，收率91%。MS(m/z)：404.5（M+H）。
实施例7：5-(4-硝基苯氧基) -6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚（脱保护）
3.0g5-(4-硝基苯氧基)-6-(1H-吡咯-3-基)-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲哚（制备参照实施例4）溶于20ml乙醇，缓慢加入7ml浓盐酸，加毕，80℃反应2h。加入碳酸氢钠水溶液及乙酸乙酯，分液，无水硫酸镁干燥有机相，浓缩，柱层析分离提纯，得产物2.1g，收率88%。MS(m/z)：320.3（M+H）。
实施例8：4-((6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)氧基)苯胺 (例41)（硝基还原）
2.0g5-(4-硝基苯氧基)-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚和11.0g氯化亚锡二水合物在150ml乙酸乙酯与乙醇的混合溶液（1/1）中于80℃搅拌反应15h，加入碳酸氢钠水溶液和乙酸乙酯，分液，无水硫酸镁干燥有机相，过滤，浓缩，柱层析分离提纯，得产物1.2g，收率67%。MS(m/z)：290.3（M+H）。
实施例9：6-溴-5-羟基-1-甲基-1H-吲哚
称取5.0g6-溴-5-羟基-1H-吲哚和2.0g氢氧化钾加入50ml丙酮中，冰水浴冷却，滴加2ml甲基碘，滴加完毕于0℃反应2h，于室温下搅拌反应20h。除溶，所得固体柱层析分离提纯，得产物4.3g，收率81%。MS(m/z)：227.1（M+H）。
实施例10：6-溴-5-羟基-1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吲哚
向含5.0g6-溴-5-羟基-1H-吲哚的40ml四氢呋喃溶液中加入4.0gDHP及1.5g甲基磺酸，室温下搅拌反应1h。加入乙酸乙酯和碳酸氢钠水溶液，分离有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析提纯分离，得产物5.9g，收率84%。MS(m/z)：297.2（M+H）。
实施例11：(6-溴-1-甲基-1H-吲哚-5-基)对硝基苯甲酸酯
向5.0g6-溴-5-羟基-1-甲基-1H-吲哚的50ml丙酮溶液中加入0.5g二环己基碳二亚胺和7.4g对硝基苯甲酸，加热升温，回流反应13h，浓缩，加入乙酸乙酯，加热至回流，趁热过滤，滤液浓缩，二氯甲烷打浆，过滤，干燥，得产物5.9g，收率74%。MS(m/z)：362.2（M+H）。
实施例12：(1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)对硝基苯甲酸酯
将3.0g(6-溴-1-甲基-1H-吲哚-5-基)对硝基苯甲酸酯、1.8g3-吡咯硼酸110.9、1.3gPdCl2(dppf)和3.8gCsF溶于100ml1,4-二噁烷，加热升温至110℃下搅拌过夜。加入氯化铵水溶液和乙酸乙酯萃取，分离有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离提纯，得产物2.0g，收率67%。MS(m/z)：362.1（M+H）。
实施例13：(1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)对氨基苯甲酸酯
将1.0g(1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)对硝基苯甲酸酯溶于15mlTHF，加入0.1g5%Pd/C（加入前除水），于氢气环境下加热至65℃反应5h，降温，过滤，浓缩，得产物0.8g，收率84%。MS(m/z)：332.4（M+H）。
实施例14：2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯
向反应瓶中加入8g2-羟基烟酸、2ml浓硫酸、300ml甲醇及70ml甲苯，加热至回流，反应过夜。降温冷却至室温，过滤，浓缩，150ml二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠水溶液中和，150ml二氯甲烷萃取，干燥，浓缩，得产物6.5g，收率74%。MS(m/z)：154.0（M+H）。
实施例15：1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯
向反应瓶中加入250ml二氯甲烷、5.0g 2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯、14.0g4-氟苯基硼酸、12.0g乙酸铜、10.0g吡啶，添加4g4A分子筛，室温下搅拌过夜，过滤，水洗涤，滤液经100ml二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥有机相，过滤，浓缩，柱层析分离提纯，得产物8.0g，收率99.6%。MS(m/z)：248.1（M+H）。
实施例16：1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸
称取5.0g1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸甲酯溶于100ml75%的甲醇水溶液中，添加1.0gKOH，室温搅拌反应0.5h。蒸馏除甲醇，缓慢滴加浓盐酸至白色固体沉淀不在增加，过滤，水洗涤，干燥，得所需产物4.4g，收率94%。MS(m/z)：234.2（M+H）。
实施例17：N-(4-((1-甲基-6-(-1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)氧基)苯基) -1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
称取1.4g 3-(1-甲基-5-(4-氨基苯氧基)-1H-吲哚-6-基)-1H-吡咯-1-甲酸叔丁酯和1.3g1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸，1.5gEDCl，0.8gHOBt加至反应瓶，量取15mlDMF，2mlDIPEA，反应液于室温下搅拌反应过夜。加入300ml乙酸乙酯稀释，饱和氯化钠溶液洗涤，乙酸乙酯萃取水相，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，旋蒸除溶剂，柱层析分离提纯。
量取50ml二氯甲烷溶解所得，加入三乙基硅烷2ml，18mlTFA，室温下搅拌反应2h。除溶，加入150ml二氯甲烷，饱和碳酸氢钠水溶液洗涤两次，分液，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除溶，所得残留物经柱层析分离提纯得目标产物1.0g，呈灰白色固体状，收率57%。MS(m/z)：519.5（M+H）。
实施例18：N-(4-((1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)氧基)苯基) -1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺
将4-( 6-(1H-吡咯-3-基)- 1H-吲哚-5-基氧基)苯胺（9mmol）和1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸（11.2mmol）加入50mlDMF中，添加HOBt（10mmol）、EDCl（10mmol）和5mlN-甲基吗啉。加热升温至60℃反应过夜，加入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液，分液，有机相干燥，浓缩，乙酸乙酯打浆，过滤，干燥，得目标产物，收率50%。MS(m/z)：519.5（M+H）。
实施例19：N-(4-((1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)氧基)苯基) -1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺甲磺酸盐
将上述所得N-(4-((1-甲基-6-(-1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺溶解于丙酮溶剂中，加入甲基磺酸，室温搅拌反应1h，除溶，乙醚淋洗，干燥，得目标产物的甲磺酸盐，收率95%。MS(m/z)：615.2（M+H）。
实施例20：(1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)-4-(1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯甲酸酯
将(1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)对氨基苯甲酸酯（9mmol）和1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酸（15mmol）加入70mlDMF中，添加HOBt（12mmol）、EDCl（11mmol）和6mlN-甲基吗啉。加热升温至50℃反应过夜，加入乙酸乙酯和饱和氯化铵水溶液，分液，有机相干燥，浓缩，乙酸乙酯打浆，过滤，干燥，得目标产物，收率50%。MS(m/z)：547.6（M+H）。
申请内容所定义化合物可参考所给实施例方式制备，但不局限于此方法。
以上显示和描述了本申请的基本原理，主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本申请不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本申请的原理，在不脱离本申请的精神和范围的前提下，本申请还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。本申请要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
下面的试验证明，某些本申请的化合物有效地抑制细胞中的c-Met磷酸化，有效地抑制活体内c-Met，并在某些异种移植模型中证明了剂量依赖性抗肿瘤活性。
c-Met蛋白表达和提纯
将人c-Met的激酶结构域克隆到pFastBacHT载体中。使用Bac-to-Bac系统将His-c-MetKD结构体转座到杆状病毒DNA中。SF9细胞用重组杆状病毒感染。该受感染细胞通过离心来收获，收集细胞颗粒，在-80℃下储藏。细胞在缓冲液A中溶解。将细胞溶解物匀质化和离心。上清液用次氮基三乙酸镍树脂孵育，装载到柱中。蛋白质用缓冲液B洗脱，将含有c-Met的级分汇集在一起，填充到Superdex®200柱中，缓冲液C洗脱。
HGF刺激的Met（pY1349）NCI-H460细胞型ELISA
将NCI-H460细胞在补充有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，以20000细胞/孔的密度和80μL体积平板接种到96孔平地板中。细胞然后在细胞培养孵育器中孵育过夜，并使之附着于板上。下一个早晨，细胞用两倍体积的低血清培养基洗涤。在除去最后一次洗液之后，将80μL的RSM添加到细胞板的每一个孔中。将细胞板在细胞培养孵育器中孵育2.5h，定量加入化合物。化合物抑制剂首先以10mM溶解在100%二甲亚砜中，然后用2%DMSO RSM稀释至100μM。随后，制备在100μM-0.005μM范围内的化合物系列稀释物（1:3）.细胞计量添加20μL的化合物备料，以产生0.4%的最终DMSO浓度和20-0.001μM之间最终化合物浓度剂量。在定量添加化合物后，将细胞板轻轻搅动以便混合，然后在细胞培养孵育器中孵育30min。在定量添加完成后，通过以在RMS中的100ng/ml的最终浓度添加20μL/孔的肝细胞生长因子来刺激细胞。在细胞培养孵育器中孵育10分钟后，从细胞板孔中除去液体，通过添加补充有磷酸酶I和II和蛋白酶抑制剂的50μL的冰冷的MesoScale Discovery ®1X溶解缓冲液来使细胞溶解。在室温下溶解30分钟后，将溶解物转移和捕获到BSA封闭的MSD® Multi-Spot 96孔4-spot PhosphoMet 板上，然后用Tris洗涤缓冲液洗涤一次。在2小时捕获（在室温下）之后，从MSD®板上除去溶解物，再用1X Tris洗涤缓冲液洗涤板。在印迹之后，将25μL的5nMSulfo-Tag Anti-Total Met抗体添加到MSD®板的孔中。在1小时捕获之后，MSD® 板孔用1XTris洗涤缓冲液洗涤，然后添加150μL的1X Read Buffer T。在添加Read Buffer之后，立即用SECTOR 6000 MSD ®Imager读板器分析板。相对IC50值使用MSD®活性单位通过计算相对于板上“MIN”和“MAX”对照物的抑制百分率，然后将抑制百分率值和十点剂量反应数据拟合到四参数逻辑斯蒂方程来测定。该试验具有2.06的最小显著性比率（MSR）。对于所有实施例化合物，IC50值小于0.2μM。例如，本试验中的实施例1的平均（n=6）IC50值是0.0352μM，指示它有效地抑制细胞中的c-Met磷酸化。
c-Met活体内靶点抑制试验
S114细胞在补充有10%胎牛血清的生长培养基中培养和扩展。收获细胞，用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，将2*106个细胞与等体积的BD MatrigelTM基质混合，皮下注射到裸鼠的胁腹中。在植入之后8天，通过经口管饲法，将化合物以50mg/kg给药于动物。在给药后2小时处死动物，采集肿瘤，冷冻储藏至需要时。
冷冻肿瘤使用研钵-研棒粉碎。将该粉碎组织转移到装有Lysing Matrix D珠粒和600μL溶解缓冲液的管内。使用FastPrep细胞破碎仪来破碎组织和裂解细胞。溶解物通过20号针，转移到清洁管内。蛋白浓度通过Bradford方法来测定。
将肿瘤溶解物加载到MSD ®phosphor-Met ELISA 板上，phosp-
hor-c-Met水平使用与H460细胞型ELISA相同的操作规程来测定。对于所有实施例化合物，在50mg/kg的剂量下S114活体内抑制值为等于或大于50%。例如，实施例的化合物是c-Met磷酸化的有效抑制机，具有2.9mg/kg的ED50值，指示它是有效的活体内c-Met抑制剂。
异种移植肿瘤模型
将人恶性胶质瘤细胞U87MG、人胃癌细胞MKN45、人非小细胞肺癌细胞H441和人肾癌细胞Caki-1扩增培养，采集，并皮下注入到无胸腺裸鼠的后胁上。试验化合物在适当的载体中制备，当建立肿瘤时通过经口管饲法给药。肿瘤反应通过在治疗过程中每周两次进行的肿瘤体积测量来确定。肿瘤体积抑制通过比较治疗组与载体对照组来计算。体重被作为毒性的一般衡量标准。实施例的化合物在这些模型中证明了优异的剂量依赖的抗肿瘤活性。当剂量为1.5mg/kg时，实施例的化合物能够导致U87MG肿瘤的56%生长抑制。在4.5mg/kg剂量时，获得了80%生长抑制。在12.5mg/kg剂量时达到88%的生长抑制。
c-Met相关肿瘤和异种移植模型
c-Met超量表达是包括肺部肿瘤、乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、胃部肿瘤、肾脏肿瘤、胰腺肿瘤、头和颈部肿瘤在内的许多人体肿瘤的共同特征。激酶结构域中的c-Met激活突变被暗示为几种肿瘤的原因。
本申请的化合物优选作为通过各种途径给药的药物组合物配制。最优选，这种组合物用于口服给药。这种药物组合物及其制备方法是本领域所公知的。
本申请的化合物一般在宽剂量范围内是有效的。例如，日剂量正常是在约1mg到约200mg总日剂量，优选1mg到150mg总日剂量。在有些情况下，在上述范围的下限以下的剂量水平可能绰绰有余，而在其他情况下，可以使用更大的剂量。以上剂量范围没有打算以任何方式闲置本申请的范围。给药的化合物的量应根据相关情况决定，包括所要治疗的疾病、所选择的给药途径、实际给药的一种或多种化合物、个体患者的年龄、体重和反应以及患者症状的严重程度。

Claims (10)

1.下式化合物或其药用盐：
，
其中：
R1是H或甲基；
R2是H或甲基；
R3是苯基或对位F、氨基或甲基取代的苯基；
R4是H或甲基；
R5是H或F；
X和Y是O、S、酰胺基或酯基，二者可以相同，亦可不同；
Z是氨基、二甲基氨基、氟、环丙基、任选被氨基取代基或1-2个甲基取代基取代的吡咯基、任选被两个甲基取代基取代的吡唑基、2-甲氧基-嘧啶-5-基、4-甲基磺酰基苯基、四氢-2H-吡喃-4-基-氨基、（四氢-2H-吡喃-4-基）氨基羰基或吗啉-4-基取代基：
，
其中Ra、Rb和Rc独立地选自H或甲基。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中Z是氨基、二甲基氨基、环丙基、任选被氨基取代基或1-2个甲基取代基取代的吡啶基、吡咯-3-基、吡唑-4-基或吗啉-4-基。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中Z是氨基、吡咯-3-基、吡唑-4-基或吗啉-4-基。
4.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中Z是吡咯-3-基。
5.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药用盐，其中X和Y分别是酰胺基和O或S或酯基或酰胺基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的化合物或其药用盐，其中X和Y分别是酰胺基和O或酯基。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中所述化合物是
(1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)-4-(1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺基)苯甲酸酯，
。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药用盐，其中所述化合物是N-(4-((1-甲基-6-(1H-吡咯-3-基)-1H-吲哚-5-基)氧基)苯基)-1-(4-氟苯基)-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-甲酰胺，
。
9.根据权利要求1-4任一项所述的化合物或其药用盐，其中所述药用盐是甲磺酸盐。
10.根据权利要求1-9任一项所述的化合物或其药用盐用于治疗癌症，所述癌症选自肺癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、结肠直肠癌和胃癌。
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