CN107266586A

CN107266586A - 一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法

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Publication number: CN107266586A
Application number: CN201710675967.3A
Authority: CN
Inventors: 赵俊; 韩国祥; 赵雨; 高耀辉; 戚仕梅; 马腾飞; 周炜; 程正阳
Original assignee: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ANHUI JIUCHUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2017-10-20
Also published as: CN108794640A

Abstract

本发明公开了一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法，所述融合蛋白由猪白细胞介素2与猪干扰素γ经柔性linker连接而形成，融合蛋白与冻干保护剂混配后经冷冻干燥即可得到重组猪长效干扰素γ。所述重组猪长效干扰素γ可显著提高猪干扰素的半衰期，较普通猪干扰素γ的半衰期提高13倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高猪自身的免疫应答。

Description

一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

近年来规模化集约化猪场在我国迅速兴起,我国生猪存栏量和猪肉生产总量稳居世界首位，传统的猪病防治方法已远不能适应大规模集约化养猪生产中传染病的控制。我国近20年来新出现了近20种畜禽传染病，加上原有的动物疫病，对我国养殖业造成了巨大的经济损失。据不完全统计，我国每年因各种病毒性疾病引起畜禽死亡率高达15％-20％，经济损失达数十亿元。

目前对猪病毒性疾病的预防和治疗途径主要是通过疫苗接种和使用抗生素，但由于养殖环境不完善，病毒变异以及机体抵抗力变化等原因，使传统的预防和治疗途径受到了巨大挑战，大部分抗生素类药物以及传统的口服抗病毒药物，由于药物残留问题，给健康带来负面影响；而传统的疫苗，由于它的高特异性以及副作用，无法抵抗病毒变异和新型病毒不断出现给猪养殖业带来的巨大危害。

IFN是一类病毒感染诱导机体产生具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质，1957年Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖以及发挥抗肿瘤等的活性。按照IFN的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥作用的不同，分为γ、β、γ三类。现已知，γ型IFN是由激活的T细胞和NK细胞产生，具有较强抗病毒和免疫调节功能。大量研究表明，干扰素γ除了具有广谱抗病毒功能外，对免疫系统也起着关键的调节作用，所以IFN-γ又称为免疫调节干扰素。虽然各种类型的干扰素均能够介导细胞对病毒感染的反应，但干扰素γ的免疫调节活性在协调免疫反应和确定机体长期的抗病毒状态中发挥更为重要的作用，因此干扰素γ具有极为重要的临床应用价值。

细胞因子IL-2即白细胞介素2，又名T细胞生长因子。主要由活化的T淋巴细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子，既可以促进淋巴细胞增殖，增强免疫功能，又能限制T细胞反应而增强机体的免疫耐受，故可用于治疗肿瘤、感染性疾病和自身免疫性疾病。在兽医中，由于IL-2能提高疫苗的免疫应答和减少疾病的发生，也出现广阔的应用前景。IL-2因能增强机体的免疫水平，提高机体的抗病能力，因而用于细菌性、病毒性和寄生虫性疾病的免疫治疗。此外，IL-2还可影响药物的代谢，使药物的代谢时间延长，作用时间增加，从而提高药物疗效。IL-2与其他细胞因子根据基因构建，组成融合蛋白，以增强疫苗的抗体产生和提高细胞免疫水平。

天然干扰素及人工重组干扰素目前普遍存在半衰期短的局限，半衰期一般为2-4个小时。半衰期短给治疗带来了极大的不便，治疗次数的增加，相应的时间成本及经济成本随之增加，而机体的耐受极限也有可能被突破导致不良反应的产生。半衰期短的主要原因有两个：干扰素的分子量过小在体内代谢过快，干扰素尤其是重组干扰素亲和力较差被免疫系统清除。而市面上常见的长效干扰素以聚乙二醇融合干扰素为代表，仅在分子量的层面上部分解决了干扰素分子量小而导致半衰期短的问题，同时聚乙二醇融合干扰素成本非常高，不利于临床上应用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法，所述重组猪长效干扰素γ可显著提高猪干扰素的半衰期，较普通猪干扰素γ的半衰期提高13倍以上，并具有广谱抗病毒作用并能提高猪自身的免疫应答。

本发明采取的技术方案为：

一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示，记为融合蛋白1；或如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示，记为融合蛋白2。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCELISTING 400〈3〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示，记为基因组2。

所述基因组1可编码所述融合蛋白1；所述基因组2可编码融合蛋白2。基因组2是对基因组1的核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0时被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现猪IL-2和IFN-γ原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.23、0.24，GC百分比为38.7％、39.2％；而通过对猪IL-2和IFN-γ基因优化后得到重组基因基因组2在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.97、1.0，GC百分比47.6％、45.4％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的表达载体。

进一步地，所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体。

本发明还提供了含有基因组1或基因组2的基因工程菌。

进一步地，所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNγ。

含有基因组1或基因组2的宿主细胞也属于本发明的保护范围，进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌宿主细胞，更进一步地，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

本发明还提供了一种重组猪长效干扰素γ，所述重组猪长效干扰素γ由所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

本发明还公开了所述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将含有基因组1或基因组2的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

所述表达载体为含有基因组1或基因组2的pET-32a大肠杆菌表达载体；

所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNγ，其制备方法为：

(1)设计引物，通过反转录得到或者人工合成连接有柔性linker序列的猪白细胞介素2和猪干扰素γ的目的基因；通过柔性linker将猪白细胞介素2和猪干扰素γ的目的基因连接起来，目的基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示或如SEQUENCELISTING 400〈4〉所示；

(2)将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

(3)将表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，即可得到基因工程菌pET-32a/rIL2-IFNγ。

所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号为V205。

所述基因组1的获取方法为：

a.引物设计

猪白细胞介素2(IL-2)的引物序列为：

上游IL-2-F1：ATAGAATTCATGTATAAGATGCAGCTCTTGC，带有EcoRI酶切位点；

下游IL-2-R1：

CCAGAACCACCTCCAGAACCTCCACCAGTCAGTGTTGAGTAGATGCTT，带有柔性linker；

猪干扰素γ(IFN-γ)的引物序列为：

上游IFN-γ-F1：

CTGGAGGTGGTTCTGGAGGTGGATCTATGAGTTATACAACTTATTTCTT，带有柔性linker；

下游IFN-γ-R1：CCAAGCTTTTTTGATGCTCTCTGGCCTTG，带有HindⅢ酶切位点；

b.从猪肝脏中提取RNA，通过反转录获得IL-2和IFN-γ的目的基因，两者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈5〉和SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示；

分别以IL-2和IFN-γ的目的基因为模板，并分别利用IL-2和IFN-γ的上下游引物进行PCR扩增，分别得到了连接有柔性linker的IL-2和IFN-γ的目的基因。

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，模板RNA 1.5μL，上下游引物各0.5μL，反转录酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker将IL-2基因与IFN-γ基因连接起来

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的IL-2基因模板DNA 1μL、，连接有柔性linker的IFN-γ模板DNA 1μL，IL-2上游引物0.5μL，IFN-γ下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为,9.0μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

基因组2是对基因组1进行优化之后，人工合成的基因，所述基因组2的获取方法为：

a.引物设计

猪白细胞介素2(IL-2)的引物序列为：

上游IL-2-F2：CATGCCATGGTATGTACAAAATGCAGC，带有NcoI酶切位点；

下游IL-2-R2：

ACCACCACCAGAACCACCACCACCGGTCAGGGTAGAGTAG，带有柔性linker；

猪干扰素γ(IFN-γ)的引物序列为：

上游IFN-γ-F2：

GGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTATGTCTTACACCACCT，带有柔性linker；

下游IFN-γ-R2：CCCTCGAGTTTAGAAGCACGCTG，带有XhoI酶切位点；

b.所述IL-2和IFN-γ的目的基因，两者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈7〉和SEQUENCE LISTING 400〈8〉所示；

分别以IL-2和IFN-γ的目的基因为模板，并分别利用IL-2和IFN-γ的上下游引物进行PCR扩增，分别得到了连接有柔性linker的优化后的IL-2和IFN-γ的目的基因。

PCR反应体系及条件为：在25μL的总反应体系中，基因组DNA 1.0μL，上下游引物各0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为10μL，加RNase Free水至25μL；所述RT-PCR反应的反应条件为：95℃预变性4min，进入循环；95℃变性45S，60℃退火45S，72℃延伸1kb/min，循环35次，最后72℃延伸10min。

c.利用柔性linker将IL-2基因与IFN-γ基因连接起来

连接的PCR反应体系及反应条件为：在25μL的总反应体系中，连接有柔性linker的IL-2基因模板DNA 1μL、，连接有柔性linker的IFN-γ模板DNA 1μL，IL-2上游引物0.5μL，IFN-γ下游引物0.5μL，Taq DNA聚合酶2.5μL，dNTP Mix为9.0μL，加RNase Free水至25μL；连接PCR反应条件为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明还提供了所述重组猪长效干扰素γ的应用，其半衰期长达55小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高猪自身的免疫应答。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.通过柔性linker将猪IL-2和猪干扰素γ基因实现融合，提高了干扰素半衰期，与普通干扰素相比，提高了13倍以上；

2.通过对猪IL-2和猪干扰素γ基因进行优化，提高了IL-2和猪干扰素γ融合蛋白的表达量。

3.以重组大肠杆菌BL21/pET-32a-IL2-IFNγ作为表达菌株，通过引入分子伴侣pGro7质粒，在蛋白表达时不产生包涵体，形成可溶性蛋白，避免了包涵体变性和复性的过程，大大缩短了融合蛋白表达的时间；

4.本发明公开的由猪IL-2和猪干扰素γ组成的融合蛋白不仅具有干扰素γ的广谱抗病毒作用，同时显著提高了猪自身的免疫应答。

附图说明

图1为实施例1中的猪IL-2基因与猪干扰素γ基因RT-PCR扩增的结果；泳道M：DNAMarker DL2000；泳道1：猪干扰素γ基因RT-PCR扩增产物；泳道2：猪IL2基因RT-PCR扩增产物；

图2为实施例1中的猪IFNγ和猪IL-2的目的基因连接之后的PCR扩增的结果；泳道M：DNA Marker DL2000；泳道1：猪干扰素γ基因与猪白介素2基因连接扩增产物；

图3为实施例1中的阳性克隆质粒的PCR扩增及双酶切鉴定结果；泳道M：DNAMarker DL10000；泳道1：重组质粒双酶切结果；泳道2：质粒PCR结果；

图4为实施例1中的重组蛋白的SDS-PAGE电泳检查结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导后的菌体破碎后上清；泳道2：重组菌诱导后的菌体破碎后沉淀；泳道3：空菌对照；

图5为实施例1得到的融合蛋白的Western Blot鉴定结果；泳道M：蛋白Marker；泳道1：重组菌诱导破碎后沉淀；泳道2：为重组菌诱导破碎后上清；

图6为实施例5中由实施例1中的融合蛋白制得的重组猪长效干扰素γ对VSV致细胞病变的抑制作用；1为VSV病毒对照孔；2为HEp-2细胞对照孔；A3-12为梯度稀释(从右向左)的人干扰素标准品处理孔；B3-12为梯度稀释(从右向左)的重组猪长效干扰素γ处理孔；

图7为实施例8中由实施例1中的融合蛋白制得的重组猪长效干扰素γ肌肉注射血药浓度-时间变化曲线。

具体实施方式

实施例1

一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其制备方法如下：

1.猪白细胞介素2(IL-2)与猪干扰素γ(IFN-γ)目的基因的获取与扩增引物设计：

根据Genebank中已报道的目的基因序列设计合成引物见表1，在猪白介素2的上游引物和下游引物中分别引入EcoRI酶切位点和Linker序列，在猪干扰素γ的上游引物和下游引物中分别引入Linker序列和HindⅢ酶切位点。

表1PCR扩增引物

RT-PCR获取目的基因：

从猪肝脏组织中提取RNA，通过反转录获得IL-2和IFN-γ的目的基因，两者的基因序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈5〉和SEQUENCE LISTING 400〈6〉所示；

RT-PCR反应体系(25μL)见表2

表2RT-PCR反应体系

RNase Free水	10μL
		dNTP Mix	10μL
反转录酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组RNA	1.5μL

反应参数为：50℃反转录30min，95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在490bp和530bp左右出现特异条带，其结果如图1所示。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接连段目的基因，25μL反应体系如表3所示：

表3PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；58℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在990bp左右出现特异条带，其结果如图2所示，图2中出现了猪白介素2扩增产物和猪干扰素γ扩增产物的条带，这是因为在猪白介素2基因和猪干扰素γ基因PCR连接的过程中，出现了非特异反应。得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序后无误的PCR的胶回收产物与pET-32a质粒均使用EcoRI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切和回收，按表4中的20μL体系做双酶切：

表4双酶切体系

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表5中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表5

目的片段DNA	10μL
		表达载体	3μL
buffer	2μL
		连接酶	1μL
RNase Free水	4μL

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜；取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒经EcoRI和HindⅢ双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，得到了工程菌pET-32a/rIL2-IFNγ；PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在990bp左右处出现单一条带，其结果如图3所示。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌pET-32a/rIL2-IFNγ于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中37℃摇菌1h复苏工程菌活性，在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h后，测OD值达到1.0时即可；加入IPTG，IPTG的终浓度为100μg/mL，32℃诱导表达5h；收集细菌，经SDS-PAGE电泳检测，其结果如图4所示，从图中可以看出，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在54.6KD左右处可见优势表达条带，说明在沉淀和上清中均成功表达了融合蛋白。

加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀；-20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3S，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1His亲和层析

粗制融合蛋白用0.22μm孔径的滤膜过滤后，上样通过连接在AKTA explorer 100蛋白纯化系统上，用Binding Buffer Ⅰ(PBS)平衡好的His亲和层析柱，用PBS缓冲液洗去未结合的蛋白，直到A280nm稳定，再用Elution buffer Ⅰ(50mM三羟甲基氨基甲烷，20～500mM咪唑，PH8.0)洗脱，收集rIL2-IFNγ蛋白峰。

5.2DEAE阴离子交换层析

将经过His亲和层析纯化后收集的蛋白置换到Binding Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，PH6.5)中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，再用Binding Buffer Ⅱ过柱至A280nm值稳定后，用Elution Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，PH6.5)线性梯度洗脱，收集rIL2-IFNγ蛋白峰。

5.3分子筛层析

将离子交换层析收集到的样品浓缩后上样通过用Binding Buffer Ⅲ(50mMNa2HPO4，0.15M NaCl，PH7.4)平衡好Superdex 200分子筛层析柱，用Binding BufferⅢ洗脱，收集rIL2-IFNγ蛋白峰。

5.4样品鉴定

测定rIL2-IFNγ效价及比活性，比活性≥1.0×10⁶IU/mg蛋白为合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示。

实施例2

一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其他同实施例1，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例1对照，上清液中54.6KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。

所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号V205。

实施例3

1.猪白细胞介素2(IL-2)与猪干扰素γ(IFN-γ)目的基因的获取与扩增

对实施例1中的IL-2和IFN-γ进行优化，人工合成IL-2和IFN-γ目的基因，优化后，两者的核苷酸序列分别如SEQUENCE LISTING 400〈7〉和SEQUENCE LISTING 400〈8〉所示。

1.1密码子优化

遗传密码子有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)。实际上，常用做蛋白表达或生产的每种生物(包括大肠杆菌，酵母，哺乳动物细胞，植物细胞和昆虫细胞)都表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。大肠杆菌、酵母和果蝇中对含最佳密码子的基因的表达效率明显高于含低利用率的密码子的基因的表达效率。因此，在异源表达系统中，密码子的偏爱性很大程度上影响了重组蛋白的表达。利用偏爱密码子(preferred codons)并避免利用稀有的密码子进行基因合成，这种基因的重新设计叫密码子优化。因此，本实施例中对猪的IL-2和IFN-γ基因密码子进行优化。

1.2密码子优化后结果分析

通常密码子适应指数(CAI)＝1.0时被认为该基因在该表达系统中的最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现猪IL-2和IFN-γ原始基因的密码子在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)分别为0.23、0.24，GC百分比为38.7％、39.2％；而通过对猪IL-2和IFN-γ基因优化后得到重组基因在大肠杆菌中密码子适应指数(CAI)为0.97、1.0，GC百分比47.6％、45.4％。通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

1.3引物设计：

表6PCR扩增引物

将优化后的IL-2和IFN-γ的基因组DNA分别稀释至0.05mg/mL。利用PCR扩增获得目的基因，25μL反应体系如表7所示：

表7PCR反应体系

RNase Free水	10.5μL
		dNTP Mix	10.0μL
Taq DNA聚合酶	2.5μL
		上、下游引物	各0.5μL
基因组DNA	1.0μL

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：94℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

IL-2与IFN-γ的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分别在490bp和530bp左右出现特异条带，说明制备得到了连接有柔性linker的优化后的IL-2和IFN-γ的目的基因。

2.目的基因的连接

将目的基因均稀释到10ug/mL，利用重叠PCR连接目的基因，25μL反应体系如表8所示：

表8PCR反应体系

反应参数为：95℃预变性4min，进入循环：95℃变性45s；60℃退火45s，72℃延伸1kb/min，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在990bp左右出现特异条带，说明成功得到了IL-2和IFN-γ连接后的目的基因，得到的目的基因的核苷酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示。

3.表达载体构建

选择连接后的目的基因经测序后无误的PCR的胶回收产物与pET-32a质粒均使用NcoI、XhoI限制性内切酶进行双酶切和回收，按表9中的20μL体系做双酶切：

表9双酶切体系

通用buffer	2μL
		限制性内切酶(一对)	1μL+1μL
载体或回收片段	2μL
		RNase Free水	14μL

将连接后的目的基因与pET-32a质粒的酶切回收产物按表10中的体系进行连接，4℃过夜连接：

表10

转化连接产物至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将感受态涂布于含氨苄青霉素的LB培养基平板培养过夜；取LB平板上生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒经NcoI、XhoI双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功，PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳在990bp左右处出现单一条带，说明含有IL-2和IFN-γ连接后的目的基因的表达载体构建成功，得到了工程菌pET-32a/rIL2-IFNγ。

4.重组蛋白的表达

挑取工程菌pET-32a/rIL2-IFNγ于含氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中37℃摇菌1h复苏工程菌活性；在LB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中放大培养4h后，测OD值达到1.0时即可；加入IPTG，IPTG的终浓度为100μg/mL，32℃诱导表达5h；收集细菌，经SDS-PAGE电泳检测，重组菌诱导5h后的菌体破碎后上清和沉淀在54.6KD左右处可见优势表达条带，说明在上清和沉淀中均得到了重组蛋白。

加入质量体积比1:1的PBS重悬沉淀；－20℃于室温反复冻融沉淀3次；4℃超声裂解细菌沉淀，工作10s，间隔3S，超声6min，整个过程重复3～4次；4℃，12000r/min离心15min，分别取上清、沉淀，得到粗制融合蛋白。

5.融合蛋白纯化

5.1His亲和层析

5.2DEAE阴离子交换层析

5.3分子筛层析

5.4样品鉴定

测定rIL2-IFNγ效价及比活性，比活性≥1.0×10⁶IU/mg蛋白为合格；无菌分装，-80℃保存。即可得到由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其氨基酸序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

实施例4

一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其他同实施例3，只是将其中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞替换为了带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。其融合蛋白的SDS-PAGE电泳结果同实施例3对照，上清液中54.6KD左右处优势表达条带较粗，说明引入分子伴侣pGro7后，目的蛋白在上清液中的表达更好，得到的融合蛋白量更高。大肠杆菌表达的蛋白大部分存在于包涵体中；通过在表达菌株中引入分子伴侣，协同表达蛋白正确折叠，达到蛋白可溶性表达。所述带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞购自上海近岸科技有限公司/欣百诺生物，货号V205。

实施例5

一种重组猪长效干扰素γ，由实施例1、2、3、4中的融合蛋白分别与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖，用10mmol/L PBS为缓冲液，三者的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例6

实施例1～4得到由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白的鉴定

6.1蛋白含量的定量检测

用Lowry法，以中国食品药品生物制品检定院的标准蛋白作标准测定，测定实施例1～4得到的融合蛋白浓度均大于1.2mg/ml。

6.2SDS-PAGE电泳检测

与空菌相比，融合蛋白在54.6KD左右有一条浓染的新增蛋白条带，如图4、所示。

6.3Western Blot结果

分别检测实施例1～4中融合蛋白，以abcam公司鼠抗猪γ干扰素(1:5000稀释)为一抗，以山羊抗小鼠IgG-HRP为二抗(1:10000稀释)。重组猪长效干扰素γ样品能与抗猪干扰素γ单克隆抗体发生特异性反应，54.6KD左右处出现特异性条带，如图5所示。

实施例7

实施例5中的四份重组猪长效干扰素γ冻干剂的效价检测

按照微量细胞病变抑制法，用培养基将Hep-2细胞配成5×10⁵细胞/ml细胞悬浮液，每孔接种0.1ml移入96孔细胞培养板。37℃、5％CO2培养24h，加入不同剂量的重组猪长效干扰素γ，24h后吸弃，再分别接种100TCID₅₀VSV病毒。

试验结果

结果表明获得的重组猪长效干扰素γ对VSV引起HEp-2细胞的病变具有明显的抑制作用。未经处理的细胞接种病毒后均出现细胞变圆、脱落、崩解等病变。而获得的重组猪长效干扰素γ处理后的细胞接种病毒后，在倒置显微镜下连续观察，细胞形态正常，未出现任何病变，测得效价≥1.0×10⁶IU/ml，如图6所示。

实施例8

实施例5中的分别由实施例1～4的融合蛋白得到的四份重组猪长效干扰素γ冻干剂(分别记为A、B、C、D)在猪体内的半衰期的测定

细胞病变抑制法测定rIL2-IFNγ的血药浓度与时间关系

取六只体重大致相同的仔猪(雌雄各半)，肌肉注射2mg/ml猪长效猪干扰素γ冻干剂2ml，分别在1h、2h、4h、8h、16h、24h、36h、48h、60h、88h静脉采血，血样4℃凝固，3500rpm低温离心10min分离血清，各时点每只猪血样于-20℃保存待测。采用细胞病变抑制法测定血清样品中rIL2-IFNγ的浓度，用DAS药动学软件进行曲线拟合并计算参数。拟合曲线如图7所示；参数计算结果见表11。

表11重组猪长效干扰素γ肌肉注射后血清中主要动力学参数

结果表明重组猪长效干扰素γ有较长的半衰期。经测定半衰期能达到55h左右，较普通干扰素提高约13倍。

实施例9

实施例5中的四份重组猪长效干扰素γ冻干剂对猪细胞免疫应答影响的测定

取六只体重大致相同的仔猪分为两组，记为实验组和对照组；实验组颈部皮下注射2mg/ml重组猪长效干扰素γ冻干剂2ml，对照组颈部皮下注射2mL的PBS，取注射4周后猪外周血，之后每周取一次血，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，淋巴细胞经过无血清RPMI1640培养基洗2次后，用完全培养基重悬、调整细胞浓度为2×10⁶个/ml，24孔细胞培养板每孔加入1ml淋巴细胞，37℃，5％CO₂培养72h，收集淋巴细胞培养时上清。ELISA检测培养上清中IL-4含量，按试剂盒说明书进行，检测结果如表12所示：

表12ELISA检测各组猪细胞免疫应答水平

结果表明注射重组猪长效干扰素γ后，能够显著提高猪外周血中细胞因子IL-4的含量，增强了细胞免疫应答水平，显著提高免疫力水平。

上述参照实施例对重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽九川生物科技有限公司

<120> 一种重组猪长效干扰素γ及制备此长效干扰素γ的融合蛋白及其制备方法

<130> 1

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 332

<212> PRT

<213> 重组猪长效干扰素γ融合蛋白1

<400> 1

Met Tyr Lys Met Gln Leu Leu Cys Cys Ile Ala Leu Thr Leu Ala Leu

1 5 10 15

Met Ala Asn Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Thr Lys Lys

20 25 30

Gln Leu Glu Pro Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Lys Glu Val

35 40 45

Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Asp Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Val

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Gly Val Leu Asn Leu Gly Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Ser Asp Ser Ala Asn Ile Lys Glu Ser Met Asn Asn Ile Asn Val

100 105 110

Thr Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Phe Lys Cys Glu Tyr

115 120 125

Asp Asp Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr

130 135 140

Phe Cys Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Arg Ser Thr Ser Arg Thr

145 150 155 160

Thr Ser Arg Thr Ser Thr Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe

165 170 175

Gln Leu Cys Val Thr Leu Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gln Ala Pro

180 185 190

Phe Phe Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr

195 200 205

Ser Gly Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Glu Asn

210 215 220

Trp Lys Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser

225 230 235 240

Phe Tyr Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln

245 250 255

Arg Ser Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu Asn

260 265 270

Gly Ser Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Val Lys Ile Pro

275 280 285

Val Asp Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys

290 295 300

Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg

305 310 315 320

Ser Gln Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

325 330

<210> 2

<211> 330

<212> PRT

<213> 重组猪长效干扰素γ融合蛋白2

<400> 2

Met Tyr Lys Met Gln Leu Leu Cys Cys Ile Ala Leu Thr Leu Ala Leu

1 5 10 15

Met Ala Asn Gly Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Asn Thr Lys Lys

20 25 30

Gln Leu Glu Pro Leu Leu Leu Asp Leu Gln Leu Leu Leu Lys Glu Val

35 40 45

Lys Asn Tyr Glu Asn Ala Asp Leu Ser Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Val

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Ala Leu Glu Gly Val Leu Asn Leu Gly Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Ser Asp Ser Ala Asn Ile Lys Glu Ser Met Asn Asn Ile Asn Val

100 105 110

Thr Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Ser Phe Lys Cys Glu Tyr

115 120 125

Asp Asp Glu Thr Val Thr Ala Val Glu Phe Leu Asn Lys Trp Ile Thr

130 135 140

Phe Cys Gln Ser Ile Tyr Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly

145 150 155 160

Gly Gly Gly Ser Met Ser Tyr Thr Thr Tyr Phe Leu Ala Phe Gln Leu

165 170 175

Cys Val Thr Leu Cys Phe Ser Gly Ser Tyr Cys Gln Ala Pro Phe Phe

180 185 190

Lys Glu Ile Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Phe Asn Ala Ser Thr Ser Gly

195 200 205

Val Pro Asn Gly Gly Pro Leu Phe Leu Glu Ile Leu Glu Asn Trp Lys

210 215 220

Glu Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr

225 230 235 240

Phe Lys Phe Phe Glu Ile Phe Lys Asp Asn Gln Ala Ile Gln Arg Ser

245 250 255

Met Asp Val Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln Arg Phe Leu Asn Gly Ser

260 265 270

Ser Gly Lys Leu Asn Asp Phe Glu Lys Leu Val Lys Ile Pro Val Asp

275 280 285

Asn Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys Val Met

290 295 300

Asn Asp Leu Ser Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln

305 310 315 320

Thr Met Phe Gln Gly Gln Arg Ala Ser Lys

325 330

<210> 3

<211> 996

<212> DNA

<213> 重组猪长效干扰素γ基因组1

<400> 3

atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60

gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat 120

ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc 180

acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta 240

gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca 300

gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct 360

gaaacaagtt tcaaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac 420

aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga ctagatccac ctccagaacc 480

acctccagaa cctccaccat gagttataca acttatttct tagcttttca gctttgcgtg 540

actttgtgtt tttctggctc ttactgccag gcgccctttt ttaaagaaat aacgatccta 600

aaggactatt ttaatgcaag tacctcaggt gtacctaatg gtggacctct tttcttagaa 660

attttggaga attggaaaga ggagagtgac aaaaaaataa ttcagagcca aattgtctcc 720

ttctacttca aattctttga aatcttcaaa gataaccagg ccattcaaag gagcatggat 780

gtgatcaagc aagacatgtt tcagaggttc ctaaatggta gctctgggaa actgaatgac 840

ttcgaaaagc tggttaaaat tccggtagat aatctgcaga tccagcgcaa agccatcagt 900

gaactcatca aagtgatgaa tgatctgtca ccaagatcta acctaagaaa gcggaagaga 960

agtcagacta tgttccaagg ccagagagca tcaaaa 996

<210> 4

<211> 990

<212> DNA

<213> 重组猪长效干扰素γ基因组2

<400> 4

atgtacaaaa tgcagctgct gtgctgcatc gctctgaccc tggctctgat ggctaacggt 60

gctccgacct cttcttctac caaaaacacc aaaaaacagc tggaaccgct gctgctggac 120

ctgcagctgc tgctgaaaga agttaaaaac tacgaaaacg ctgacctgtc tcgtatgctg 180

accttcaaat tctacatgcc gaaacaggct accgaactga aacacctgca gtgcctggtt 240

gaagaactga aagctctgga aggtgttctg aacctgggtc agtctaaaaa ctctgactct 300

gctaacatca aagaatctat gaacaacatc aacgttaccg ttctggaact gaaaggctcg 360

gaaaccagct tcaaatgcga atacgacgac gaaaccgtta ccgctgttga attcctgaac 420

aaatggatca ccttctgcca gtctatctac tctaccctga ccggtggtgg tggttctggt 480

ggtggtggtt ctatgtctta caccacctac ttcctggctt tccagctgtg cgttaccctg 540

tgcttctctg gttcttactg ccaggctccg ttcttcaaag aaatcaccat cctgaaagac 600

tacttcaacg cttctacctc tggtgttccg aacggtggtc cgctgttcct ggaaatcctg 660

gaaaactgga aagaagaatc tgacaaaaaa atcatccagt ctcagatcgt ttctttctac 720

ttcaaattct tcgaaatctt caaagacaac caggctatcc agcgttctat ggacgttatc 780

aaacaggaca tgttccagcg tttcctgaac ggttcttctg gtaaactgaa cgacttcgaa 840

aaactggtta aaatcccggt tgacaacctg cagatccagc gtaaagctat ctctgaactg 900

atcaaagtta tgaacgacct gtctccgcgt tctaacctgc gtaaacgtaa acgttctcag 960

accatgttcc agggtcagcg tgcttctaaa 990

<210> 5

<211> 462

<212> DNA

<213> 猪IL-2

<400> 5

atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60

gcacctactt caagctctac aaagaacaca aagaaacaac tggagccatt gctgctggat 120

ttacagttgc ttttgaagga agttaagaat tacgagaatg ctgatctctc caggatgctc 180

acatttaaat tttacatgcc caagcaggct acagaattga aacaccttca gtgtttagta 240

gaagaactca aagctctgga gggagtgcta aatttaggtc aaagcaaaaa ctctgactca 300

gcaaatatca aggaatcaat gaacaatatc aacgtaacag ttttggaact aaagggatct 360

gaaacaagtt tcaaatgtga atatgatgat gagacagtaa ctgctgttga atttctgaac 420

aaatggatta ccttttgtca aagcatctac tcaacactga ct 462

<210> 6

<211> 498

<212> DNA

<213> 猪IFN-γ

<400> 6

atgagttata caacttattt cttagctttt cagctttgcg tgactttgtg tttttctggc 60

tcttactgcc aggcgccctt ttttaaagaa ataacgatcc taaaggacta ttttaatgca 120

agtacctcag gtgtacctaa tggtggacct cttttcttag aaattttgga gaattggaaa 180

gaggagagtg acaaaaaaat aattcagagc caaattgtct ccttctactt caaattcttt 240

gaaatcttca aagataacca ggccattcaa aggagcatgg atgtgatcaa gcaagacatg 300

tttcagaggt tcctaaatgg tagctctggg aaactgaatg acttcgaaaa gctggttaaa 360

attccggtag ataatctgca gatccagcgc aaagccatca gtgaactcat caaagtgatg 420

aatgatctgt caccaagatc taacctaaga aagcggaaga gaagtcagac tatgttccaa 480

ggccagagag catcaaaa 498

<210> 7

<211> 462

<212> DNA

<213> 猪IL-2

<400> 7

atgtacaaaa tgcagctgct gtgctgcatc gctctgaccc tggctctgat ggctaacggt 60

gctccgacct cttcttctac caaaaacacc aaaaaacagc tggaaccgct gctgctggac 120

ctgcagctgc tgctgaaaga agttaaaaac tacgaaaacg ctgacctgtc tcgtatgctg 180

accttcaaat tctacatgcc gaaacaggct accgaactga aacacctgca gtgcctggtt 240

gaagaactga aagctctgga aggtgttctg aacctgggtc agtctaaaaa ctctgactct 300

gctaacatca aagaatctat gaacaacatc aacgttaccg ttctggaact gaaaggctcg 360

gaaaccagct tcaaatgcga atacgacgac gaaaccgtta ccgctgttga attcctgaac 420

aaatggatca ccttctgcca gtctatctac tctaccctga cc 462

<210> 8

<211> 498

<212> DNA

<213> 猪IFN-γ

<400> 8

atgtcttaca ccacctactt cctggctttc cagctgtgcg ttaccctgtg cttctctggt 60

tcttactgcc aggctccgtt cttcaaagaa atcaccatcc tgaaagacta cttcaacgct 120

tctacctctg gtgttccgaa cggtggtccg ctgttcctgg aaatcctgga aaactggaaa 180

gaagaatctg acaaaaaaat catccagtct cagatcgttt ctttctactt caaattcttc 240

gaaatcttca aagacaacca ggctatccag cgttctatgg acgttatcaa acaggacatg 300

ttccagcgtt tcctgaacgg ttcttctggt aaactgaacg acttcgaaaa actggttaaa 360

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aacgacctgt ctccgcgttc taacctgcgt aaacgtaaac gttctcagac catgttccag 480

ggtcagcgtg cttctaaa 498

Claims

1.一种由猪白细胞介素2与猪干扰素γ组成的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的氨基酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示，记为融合蛋白1；或如SEQUENCE LISTING400〈2〉所示，记为融合蛋白2。

2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列表如SEQUENCE LISTING 400〈3〉所示，记为基因组1；或如SEQUENCE LISTING 400〈4〉所示，记为基因组2。

3.含有如权利要求2所述基因的表达载体。

4.含有如权利要求2所述基因的基因工程菌。

5.一种重组猪长效干扰素γ，其特征在于，所述重组猪长效干扰素γ由权利要求1所述的融合蛋白与冻干保护剂混配之后，经冷冻干燥而成。

6.根据权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：将权利要求3所述的表达载体导入到大肠杆菌宿主细胞中，获得基因工程菌，基因工程菌经IPTG诱导表达后得到所述融合蛋白的粗品，经纯化后即可得到融合蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述基因工程菌为pET-32a/rIL2-IFNγ，其制备方法为：

(2)将连接后的目的基因连接到pET-32a质粒上获得表达载体；

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌宿主细胞为BL21(DE3)感受态细胞或带有pGro7质粒的BL21(DE3)感受态细胞。

9.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述纯化的方法为：融合蛋白的粗品先后经亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析纯化。

10.根据权利要求5所述的重组猪长效干扰素γ的应用，其特征在于，所述重组猪长效干扰素γ的半衰期长达55小时以上，具有广谱抗病毒作用并能提高猪自身的免疫应答。