CN107266567B

CN107266567B - Lcrmp4单克隆抗体及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN107266567B
Application number: CN201710414047.6A
Authority: CN
Inventors: 高新; 陈征
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangzhou Shikai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-06-05
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2021-06-04
Anticipated expiration: 2037-06-05
Also published as: CN107266567A

Abstract

本发明涉及一种LCRMP4单克隆抗体及其制备方法与应用，属于抗体制备应用领域。本发明LCRMP4单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：(1)针对LCRMP4蛋白N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列设计合成抗原肽；(2)抗原肽免疫动物；(3)培养杂交瘤细胞，收集培养上清液，离心，得到抗体；(4)亲和纯化步骤(3)所得的抗体；(5)将步骤(4)亲和纯化后的抗体进行筛选，得到LCRMP4单克隆抗体。本发明的LCRMP4单克隆抗体能用于前列腺癌早期诊断、前列腺癌转移早期预测与去势抵抗性前列腺癌进展早期预测。

Description

LCRMP4单克隆抗体及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种抗体及其制备方法与应用，具体涉及一种LCRMP4单克隆抗体及其制备方法与应用。

背景技术

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)已成为泌尿男性生殖系统发病率和死亡率最高、增长率最快的恶性肿瘤。肿瘤转移和去势抵抗是前列腺癌患者死亡的最主要原因(Ziaee S,Chu GC,Huang JM,Sieh S,Chung LW.Prostate cancer metastasis:roles ofrecruitment and reprogramming,cell signal network and three-dimensionalgrowth characteristics.Transl Androl Urol.2015；4(4):438-54.)。早期局限性PCa能够通过根治手术、放疗、冷冻治疗等得到治愈效果，但约1/3的患者复发并且出现远处转移。利用PCa细胞生长对雄激素的依赖特性，雄激素剥夺治疗(androgen deprivationtherapy，ADT)成为了复发性、晚期进展或者转移性PCa的主要治疗方式。很大部分ADT患者在2-3年内进展至转移性和/或去势抵抗性前列腺癌(castration resistant prostatecancer，CRPC)，该阶段为PCa致死性难治阶段，此时即使采用多学科联合治疗方式，患者预后均很差。

据报道，前列腺癌在其病程的早期即可以发生微转移，而不像传统观点所认为的只有肿瘤突破包膜才开始向全身进展。前列腺特异性抗原(Prostate-specific antigen,PSA)是前列腺癌筛查应用最广泛的指标，但PSA只有器官特异性无肿瘤特异性，即PSA特异性由前列腺分泌，但良恶性疾病均可导致PSA升高而非肿瘤所特有。术前以PSa、Gleason评分(Gleason Score，GS)及临床TNM分期建立的PCa风险评估尚不能准确反映PCa患者转移倾向及早期微转移。因此，建立早期准确诊断PCa、预测PCa转移和去势抵抗进展的评估方法能够指示早期治疗，早期对高风险转移进展患者进行干预，有利于改善患者生存时间和生活治疗。

CRMPs是在Sema3信号研究和神经分化研究中发现的神经系统高度表达的胞质磷酸蛋白，该家族有CRMP1-5五个成员，它们之间具有很高的序列同源性，对神经生长、分化起着重要作用。文献报道CRMPs在人类肿瘤组织中差异性表达，并与肿瘤临床病理特征和患者预后密切相关(Tan F,Thiele CJ,Li Z.Collapsin response mediator proteins:Potential diagnostic and prognostic biomarkers in cancers(Review).Oncologyletters.2014；7(5):1333-40.)。

CRMP1在肺癌中作用研究较为明确。Shih等人通过C-DNA微阵列方法测定肺癌细胞株的转移相关基因发现，与癌旁正常组织相比，肺癌组织CRMP1明显低表达，CRMP-1表达下调与疾病预后差相关，CRMP-1低表达患者出现疾病进展、淋巴结转移风险明显增加,术后早期复发、生存时间短。据此，他们认为CRMP-1是肺癌肿瘤侵袭转移的抑制因子，与非小细胞肺癌的预后密切相关，是独立预后预测因子(Shih JY,Yang SC,Hong TM,Yuan A,Chen JJ,Yu CJ,et al.Collapsin response mediator protein-1and the invasion andmetastasis of cancer cells.Journal of the National Cancer Institute.2001；93(18):1392-400；Chen JJ,Peck K,Hong TM,Yang SC,Sher YP,Shih JY,et al.Globalanalysis of gene expression in invasion by a lung cancer model.CancerRes.2001；61(13):5223-30；Shih JY,Lee YC,Yang SC,Hong TM,Huang CY,YangPC.Collapsin response mediator protein-1:a novel invasion-suppressorgene.Clinical&experimental metastasis.2003；20(1):69-76.)。有趣的是，他们发现CRMP1的异构体LCRMP1，序列分析显示其外显子1的氮端序列与CRMP-1的不同外，外显子2-14的碳端序列却完全相同。LCRMP1与非小细胞肺癌患者的临床结局和淋巴结转移相关，恰恰起着相反的作用。通过详细的机制研究，发现LCRMP-1通过增强伪足形成促进肿瘤侵袭性的能力可被CRMP-1拮抗(Shih JY,Yang SC,Hong TM,Yuan A,Chen JJ,Yu CJ,etal.Collapsin response mediator protein-1and the invasion and metastasis ofcancer cells.Journal of the National Cancer Institute.2001；93(18):1392-400；Pan SH,Chao YC,Chen HY,Hung PF,Lin PY,Lin CW,et al.Long form collapsinresponse mediator protein-1(LCRMP-1)expression is associated with clinicaloutcome and lymph node metastasis in non-small cell lung cancer patients.Lungcancer.2010；67(1):93-100；Pan SH,Chao YC,Hung PF,Chen HY,Yang SC,Chang YL,etal.The ability of LCRMP-1 to promote cancer invasion by enhancing filopodiaformation is antagonized by CRMP-1.The Journal of clinicalinvestigation.2011；121(8):3189-205.)。LCRMP1通过与WAVE-1结合增强伪足形成，稳定肌动蛋白，进而增强细胞迁移，侵袭力。LCRMP1还可能通过作用于Rho家族蛋白Cdc42，影响肌动蛋白重组。另一方面，CRMP1通过竞争性结合LCRMP1形成异源二聚体破坏LCRMP1和WAVE-1相互结合而抑制LCRMP4介导的肿瘤细胞进展(Pan SH,Chao YC,Hung PF,Chen HY,Yang SC,Chang YL,et al.The ability of LCRMP-1 to promote cancer invasion byenhancing filopodia formation is antagonized by CRMP-1.The Journal ofclinical investigation.2011；121(8):3189-205.)。

CRMP2与结直肠癌和乳腺癌密切相关(Wu CC,Chen HC,Chen SJ,Liu HP,HsiehYY,Yu CJ,et al.Identification of collapsin response mediator protein-2 as apotential marker of colorectal carcinoma by comparative analysis of cancercell secretomes.Proteomics.2008；8(2):316-32；Shimada K,Ishikawa T,Nakamura F,Shimizu D,Chishima T,Ichikawa Y,et al.Collapsin response mediator protein 2is involved in regulating breast cancer progression.Breast cancer.2014；21(6):715-23.)。Wu等人的研究报道CRMP2在结直肠癌组织中高表达。结直肠癌标本中CRMP2阳性率达58.6％，与早期淋巴结转移密切相关。与正常结直肠组织相比，胞质CRMP2在结直肠癌中过度表达,但统计学分析提示CRMP2表达水平与肿瘤转移或淋巴结转移无统计学上的相关。CRMP2在结直肠癌中高度表达，可能是一种新的结直肠癌生物分子标志(Wu CC,ChenHC,Chen SJ,Liu HP,Hsieh YY,Yu CJ,et al.Identification of collapsin responsemediator protein-2 as a potential marker of colorectal carcinoma bycomparative analysis of cancer cell secretomes.Proteomics.2008；8(2):316-32.)。相反，CRMP2无论在mRNA还是蛋白水平，在乳腺癌组织中比正常组织均明显下调。细胞核内磷酸化CRMP2表达水平与乳腺癌组织恶性度和三阴乳腺癌成正相关关系(Shimada K,Ishikawa T,Nakamura F,Shimizu D,Chishima T,Ichikawa Y,et al.Collapsinresponse mediator protein 2 is involved in regulating breast cancerprogression.Breast cancer.2014；21(6):715-23.)。

CRMP3位于10号染色体q25.2-q26(Honnorat J,Byk T,Kusters I,Aguera M,Ricard D,Rogemond V,et al.Ulip/CRMP proteins are recognized by autoantibodiesin paraneoplastic neurological syndromes.The European journal ofneuroscience.1999；11(12):4226-32.)，附近区域存在多种肿瘤抑癌基因(Trybus TM,Burgess AC,Wojno KJ,Glover TW,Macoska JA.Distinct areas of allelic loss onchromosomal regions 10p and 10q in human prostate cancer.Cancer Res.1996；56(10):2263-7；Peiffer SL,Herzog TJ,Tribune DJ,Mutch DG,Gersell DJ,GoodfellowPJ.Allelic loss of sequences from the long arm of chromosome 10 andreplication errors in endometrial cancers.Cancer Res.1995；55(9):1922-6.)。关于CRMP3在肿瘤生物学行为的研究较少。文献报道，80％的成胶质细胞瘤在CRMP3基因附近区域存在突变，Honnorat等人研究发现，CRMP3与恶性肿瘤的副癌神经综合征相关，提示CRMP3可能与肿瘤的发生发展相关，其具体作用机制尚需进一步研究阐明(Honnorat J,Byk T,Kusters I,Aguera M,Ricard D,Rogemond V,et al.Ulip/CRMP proteins arerecognized by autoantibodies in paraneoplastic neurological syndromes.TheEuropean journal of neuroscience.1999；11(12):4226-32.)。CRMP5也被认为与副癌综合征密切相关。研究报道，98.6％的高级别神经内分泌肺癌(小细胞肺癌和大细胞神经内分泌肺癌)标本中CRMP5广泛高表达(Meyronet D,Massoma P,Thivolet F,Chalabreysse L,Rogemond V,Schlama A,et al.Extensive expression of collapsin responsemediator protein 5(CRMP5)is a specific marker of high-grade lungneuroendocrine carcinoma.The American journal of surgical pathology.2008；32(11):1699-708.)。成神经胶质细胞瘤CRMP5高表达患者术后生存时间还不及CRMP5低表达患者的一半(Liang Y,Diehn M,Watson N,Bollen AW,Aldape KD,Nicholas MK,etal.Gene expression profiling reveals molecularly and clinically distinctsubtypes of glioblastoma multiforme.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America.2005；102(16):5814-9.)。

申请人前期研究通过蛋白质组学首次发现CRMP4在正常前列腺组织和局限性PCa组织中表达较高，且两组间无表达差异，在转移性PCa组织中表达明显降低。通过体外体内实验证实，下调CRMP4的表达可促进局限性前列腺癌的侵袭及转移,过表达CRMP4则抑制转移性前列腺癌细胞的侵袭转移，提示CRMP4是前列腺癌转移的抑制基因。通过对CRMP4启动子区域的结构进行分析发现，CRMP4基因的5’端存在2个CPG岛；其中，CpG岛1中的-848、-841、-690、-680、-678、-674、-671、-665、-660、-658位点在转移性前列腺癌细胞系(PC-3、PC-3M、DU-145)和转移性前列腺癌(原发灶和转移淋巴结)中高度或中度甲基化。TALE定点甲基化技术证实，CRMP4启动子甲基化是导致基因表达沉默，引起前列腺癌发生转移的重要机制(Gao X,Pang J,Li LY,Liu WP,Di JM,Sun QP,et al.Expression profilingidentifies new function of collapsin response mediator protein 4 as ametastasis-suppressor in prostate cancer.Oncogene.2010；29(32):4555-66；Li K,Pang J,Cheng H,Liu WP,Di JM,Xiao HJ,et al.Manipulation of prostate cancermetastasis by locus-specific modification of the CRMP4promoter region usingchimeric TALE DNA methyltransferase and demethylase.Oncotarget.2015；6(12):10030-44.)。有意义的是，申请人检测临床前列腺穿刺标本中癌组织CRMP4启动子甲基化水平能够准确预测前列腺癌转移，敏感性和特异性均在90％以上，这对于指导手术方式及术后辅助治疗决策，改善患者预后具有重大意义价值。然而，甲基化检测操作相对复杂，其在临床广泛应用推广带来局限。寻找一种实用简便能够准确预测PCa早期微转移和去势抵抗性进展风险的方法具有重大意义。

背景技术

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能够用于前列腺癌早期诊断，并能准确预测前列腺癌早期微转移和去势抵抗性前列腺癌进展的单克隆抗体及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种LCRMP4单克隆抗体的制备方法，其包括以下步骤：

(1)针对LCRMP4蛋白N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列设计合成抗原肽；

(2)抗原肽免疫动物；

(3)培养杂交瘤细胞，收集培养上清液，离心，得到抗体；

(4)亲和纯化步骤(3)所得的抗体；

(5)将步骤(4)亲和纯化后的抗体进行筛选，得到LCRMP4单克隆抗体。

前列腺癌分子标志研究众多，但目前为止包括PSA在内并无一种分子标志物能够准确早期诊断前列腺癌和早期预测前列腺癌早期转移和去势抵抗性前列腺癌并且广泛应用于临床，为了能够早期诊断前列腺癌，并能准确预测前列腺癌早期微转移和去势抵抗性前列腺癌进展，本发明申请人研究了前列腺癌患者标本中LCRMP4表达情况。然而，现有CRMP4抗体多数是在未发现长链异构体LCRMP4前研制，各种CRMP4蛋白的多克隆和单克隆抗体均是针对长短链CRMP4共同氨基酸序列设计为抗原肽而制备，要么就是只进行了单一长链LCRMP4或者短链CRMP4蛋白检测鉴定筛选未进行相对应的异构体排他筛选。实际应用时既能够检测短链CRMP4蛋白也能检测出长链LCRMP4蛋白。如果将现有CRMP4抗体应用于前列腺癌标本LCRMP4表达水平检测，尽管western blot中可以通过蛋白分子量大小(LCRMP4约70kd，CRMP4约65kd)进行区分，但在免疫组化、免疫荧光等实验检测却无法反应LCRMP4的水平。

进一步结构分析发现，短链CRMP4和长链LCRMP4的主要不同之处在于LCRMP4的N端1-127氨基酸残基为其所特有，本发明中申请人针对LCRMP4蛋白N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列设计合成了抗原肽，并采用杂交瘤技术制备LCRMP4单克隆抗体。针对LCRMP4的N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列设计的特异性抗体能准确反应LCRMP4的表达水平。

作为本发明所述LCRMP4单克隆抗体的制备方法的优选实施方式，所述抗原肽包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示抗原肽。

作为本发明所述LCRMP4单克隆抗体的制备方法的优选实施方式，所述LCRMP4单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(2)抗原肽免疫动物：向载体蛋白溶液中加入偶联剂，混合后进行透析；再向步骤(1)所得抗原肽中加入透析所得产物，混匀，得到抗原肽与载体蛋白的偶联物；将抗原肽与载体蛋白的偶联物和佐剂混匀，以背部皮下免疫的方式注射动物；

(3)抗体获取：将步骤(2)中经免疫的动物的脾细胞与同系骨髓瘤细胞混合，再加入促融合剂，筛选培养能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，收集培养上清液，离心，得到抗体；

(4)以巯基偶联柱对步骤(3)所得的抗体进行亲和纯化；

(5)采用蛋白质印迹法对步骤(4)亲和纯化后的抗体进行筛选，得到能够结合LCRMP4蛋白的抗体。

作为本发明所述LCRMP4单克隆抗体的制备方法的优选实施方式，所述载体蛋白为血蓝蛋白，所述偶联剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，所述动物为小鼠，所述促融合剂为聚乙二醇。

另外，本发明还提供了采用上述方法制备所得的LCRMP4单克隆抗体。本发明制备的单克隆抗体只特异性检测LCRMP4表达而不检测CRMP4，使前列腺癌标本特异性检测LCRMP4表达。通过分析LCRMP4表达与临床病理特征的关系，发现前列腺癌组织标本或者患者血液检测LCRMP4表达能够早期诊断前列腺癌，早期准确预测前列腺癌转移和去势抵抗性前列腺癌进展。ELISA诊断前列腺癌阈值20.1ng/ml，敏感性94.4％，特异性88.5％；诊断前列腺癌转移的阈值为30.3ng/ml，敏感性87.0％，特异性91.2％；诊断去势抵抗性前列腺癌45.2ng/ml，敏感性95.5％，特异性91.7％。

再者，本发明还提供了用于前列腺癌早期诊断、前列腺癌转移早期预测或去势抵抗性前列腺癌进展早期预测的试剂盒，为实现此目的，本发明采取的技术方案为：一种用于前列腺癌早期诊断、前列腺癌转移早期预测或去势抵抗性前列腺癌进展早期预测的试剂盒，其包括上述LCRMP4单克隆抗体。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒为免疫组化检测试剂盒或ELISA试剂盒。

最后，本发明还提供了上述LCRMP4单克隆抗体在制备用于前列腺癌早期诊断、前列腺癌转移早期预测或去势抵抗性前列腺癌进展早期预测的试剂盒中的应用。

作为上述应用的优选实施方式，所述试剂盒为免疫组化检测试剂盒或ELISA试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明针对LCRMP4蛋白N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列设计合成了抗原肽，并采用杂交瘤技术制备LCRMP4单克隆抗体，制得的单克隆抗体能够特异性检测LCRMP4表达；

(2)使用LCRMP4单克隆抗体检测穿刺样本或者患者血液中LCRMP4表达水平，能够协助早期诊断前列腺癌，并能在术前预测淋巴结转移风险；且在晚期转移接受雄激素剥夺治疗治疗患者中检测LCRMP4表达情况，能够预测去势抵抗性前列腺癌进展。此外，LCRMP4单克隆抗体能够检测出影像学上未显示转移进展征象的早期隐匿性微转移。

附图说明

图1为Flag验证质粒表达的结果图；

图2为LCRMP4单克隆抗体的检测结果图；

图3为ELISA检测LCRMP4诊断前列腺癌ROC曲线分析图；

图4为ELISA检测LCRMP4诊断前列腺癌转移的ROC曲线分析图；

图5为ELISA检测LCRMP4诊断去势抵抗性前列腺癌的ROC曲线分析图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例中，相关术语的解释和说明如下：

KLH：血蓝蛋白；

Sulfo-SMCC：4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；

Western blot：蛋白质印迹法；

PBST：PBS与Triton的混合物；

TBST：Tris-HCl缓冲溶液与吐温20的混合物。

实施例1 LCRMP4单克隆抗体的制备

本发明LCRMP4单克隆抗体及其制备方法的一种实施例，本实施例所述LCRMP4单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)抗原肽设计合成

根据生物信息学(LCRMP4蛋白N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列)分析在线设计两条抗原肽peptide-1:CSGRRGWDSSHEDD(如SEQ ID NO:1所示)，peptide-2:CRSGQGSDRGSGSR(如SEQ ID NO:2所示)。通过HPLC/MC质检确定抗原肽完全符合。

(2)抗原肽免疫动物

KLH-抗原肽偶联：称取40mgKLH置于4mL管中，加入2mLPBS溶解KLH。取出,称取8mgSulfo-SMCC加入1mL纯水溶解后加入到KLH中，37℃静置30分钟。将KLH溶液加入到透析袋中，置于500mL 5×PBS中，搅拌透析过夜。第二天再换新的500mL5×PBS溶液，搅拌透析3-6小时。取出透析产物，置于4mL管中。取出抗原肽，分别溶解于200μL多肽溶解液中。分别取100μL抗原肽溶解物，加入到Eppendof管中，剩余100μL在-20℃保存。取出300μlKLH透析产物加入到150μl抗原肽溶液中，上下颠倒混匀。37℃放置1-2小时，期间每20分钟上下颠倒混匀一次，得到抗原肽与血蓝蛋白的偶联物。将所得偶联物于-20℃保存物。首免：取2mL注射器，抗原肽与血蓝蛋白的偶联物以及1ml佐剂，混匀5-10分钟。注射免疫小鼠时采取背部皮下免疫，每只小鼠免疫点数不可低于4点，靠近颈部的区域要优先保证免疫(免疫周期2,2,2,1,(星期))。

(3)抗体获取

眼球摘除放血法处死动物，无菌操作取出脾脏，研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。HAT选择性培养基培养筛选杂交瘤细胞。筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。

(4)亲和纯化抗体

巯基偶联柱，取25ml-30ml(每个管子取15ml混匀)抗血清至15ml离心管中，4000rpm离心5分钟。将血清混合倒入层析柱柱中，至流干。PBS洗柱2次，每次10ml。取新的15ml管子加入400μl pH 8.8的Tris(1.5M),作为收集管。在柱中加入2ml甘氨酸(200mM,pH2.5)洗柱2次，每次2ml,中间隔5分钟。混匀收集管中的溶液，用pH试纸测定是否接近8.0。再加入5ml甘油，上下轻柔混匀20-30次。PBS洗柱2次。20％乙醇洗柱1次，流干后加入20％乙醇保存。

(5)抗体筛选

构建含Flag标签蛋白的Flag-LCRMP4,Flag-CRMP4质粒及空载体质粒，分别转染CRMPs阴性细胞293T细胞，提取总蛋白，BCA定量蛋白浓度。

Western blot：制备12％的SDS-PAGE胶，每孔上样30ug总蛋白，上样顺序为：1)Flag-LCRMP4，2)Flag-CRMP4，3)Flag-LCRMP4和Flag-CRMP4的1：1混合蛋白，4)转染空质粒蛋白。电泳转膜后，分别使用Flag抗体(abcam 18230)和纯化的LCRMP4抗体4℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5分钟，室温摇床孵育二抗1小时，ECL化学发光液浸泡后曝光仪曝光。筛选出能够结合LCRMP4蛋白的抗体进行下一步验证。Flag验证质粒表达的结果如图1所示；LCRMP4单克隆抗体的检测结果如图2所示。由图1可见，质粒表达成功。

(6)抗体大量制备

取Balb/c小鼠，腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖并产生和分泌单克隆抗体。抽取腹水，通过亲和纯化获得大量单克隆抗体。

实施例2穿刺标本免疫组化检测LCRMP4表达，诊断前列腺癌及预测其转移

本实施例采用穿刺标本免疫组化检测LCRMP4表达，诊断前列腺癌及预测其转移，本实施例的具体步骤如下：

1)烤片：将切片置于烤箱中55℃1小时，或者37℃过夜；

2)脱蜡：准备三缸二甲苯，各低火5分钟；

3)水化：梯度酒精：100％，95％，80％，75％，各3-5分钟，期间略摇一下；去离子水I、去离子水II各1分钟，把水沥干净；

4)去除内源性过氧化物酶：3％的H₂O₂中微波低火3分钟，或室温浸泡10分钟；

5)去离子水I、去离子水II各1分钟，把水沥干净；

6)抗原修复：10mM柠檬酸钠(PH6.0)修复，

高压CB修复：配制2L枸橼酸纳/柠檬酸盐缓冲液放入高压锅中，能够浸没放有玻片的架子，煮沸，小阀门升起喷气后2min断开电源，在修复液中自然冷却；

7)去离子水I、去离子水II各1分钟；

8)三缸PBST(PBS 200mL+4％Triton 250uL)润洗，各5min。Triton破膜作用，利于胞内染色；

9)玻片甩干，擦片，免疫组化笔画圈，范围可稍大避免边缘效应；

10)湿盒上平铺玻片，滴加一抗：1:100浓度，4℃过夜；

11)三缸PBST洗5min×3次；

12)甩干，擦干背侧及圈外水分，滴加二抗，37℃温箱中30min；

13)甩干，PBST洗5min×3次；

14)DAB显色：使用DAB显色试剂盒配好显色液(用时现配)，显色时间不定，若有着色立即终止，显色时间不超过15min；

15)清水终止；

16)苏木素复染：1min(视染色情况定)；

17)清水冲洗；

18)酒精盐酸分化(95-100％乙醇：盐酸＝99：1)，2s；

19)流水冲洗；

20)脱水：梯度酒精(75％，80％，95％，100％)各3-5分钟；

21)二甲苯I、二甲苯II各5min；

22)中性树胶封片，风干2-3天。

结果判定：

在不知道任何临床资料和病理资料的情况下，对免疫组化切片进行评估，本研究入选的所有患者病理玻片均由两位医师在相同条件下观察每张切片后对结果作出判断。阳性染色程度分为四级：无染色为0分(-)，淡黄色定为1分(+)，棕黄色评为2分(++)，棕褐色则为3分(+++)。阳性细胞百分率的判断：每张切片随机地至少选取4个不同高倍镜下取视野，每个视野计数至少100个细胞，计算阳性细胞所占百分比进行评分：0分：0％；1分：1-25％；2分：26-50％；3分：51-75％；4分：76-100％^[26]。结果判定：将染色强度评分与阳性细胞百分比相乘为每个样本的最终实际的综合评分：0分为阴性，1-2分表示弱阳性(+)，3-8分提示中度阳性(++)，9-12分定为强阳性(+++)。本研究以综合评分≥4分为阳性，﹤4分为阴性。

数据统计学分析：

所有统计分析均采用SPSS 16.0进行分析。连续变量用均值±标准差，t检验比较组间差异。而等级资料用秩和检验比较组间差异。ROC曲线设定LCRMP4临界阈值，计算曲线下面积及对应敏感新和特异性。P值小于0.05认为有统计学意义。

实施例3

本实施例采用穿刺标本免疫组化检测LCRMP4表达，预测雄激素剥夺治疗治疗过程CRPC(去势抵抗性前列腺癌)进展，本实施例的实验方法、结果判定和数据统计学分析均同实施例2。

实施例4 ELISA检测血清LCRMP4水平，早期诊断前列腺癌、预测前列腺癌转移及诊断去势抵抗性前列腺癌

本实施例采用ELISA检测血清LCRMP4水平以早期诊断前列腺癌、预测前列腺癌转移及诊断去势抵抗性前列腺癌，本实施例的具体步骤如下：

1)包被：用0.05M PH9.0碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为10μg/mL,在每个反应孔中加100uL，室温2小时，然后4℃过夜；次日，弃去孔内溶液，洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

2)加样：加待检样品血清100uL于上述已包被后的反应孔中，37℃孵育1小时。洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟，同时设置空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔；

3)加酶标抗体：加入新鲜稀释的酶标抗体100uL；37℃孵育1小时，洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

4)加底物液显色：TMB底物溶液每孔100uL(现配现用)，37℃30分钟；

5)终止反应：各反应孔中加入2M硫酸0.05mL；

6)结果判定：酶标仪在450nm检测OD值，以空白对照孔调零后测各孔OD_450nm值。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示,当P/N大于2时作为抗体的效价。

统计分析

所有统计分析均采用SPSS 16.0进行分析。连续变量用均值±标准差，t检验比较组间差异。而等级资料用秩和检验比较组间差异。ROC曲线设定LCRMP4临界阈值，计算曲线下面积及对应敏感性和特异性。P值小于0.05认为有统计学意义。

ELISA检测LCRMP4诊断前列腺癌ROC曲线分析图如图3所示；ELISA检测LCRMP4诊断前列腺癌转移的ROC曲线分析图如图4所示；ELISA检测LCRMP4诊断去势抵抗性前列腺癌的ROC曲线分析图如图5所示。由图3～5可见，ELISA诊断前列腺癌阈值20.1ng/ml，敏感性94.4％，特异性88.5％；诊断前列腺癌转移的阈值为30.3ng/ml，敏感性87.0％，特异性91.2％；诊断去势抵抗性前列腺癌45.2ng/ml，敏感性95.5％，特异性91.7％。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 高新

<120> LCRMP4单克隆抗体及其制备方法与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Ser Gly Arg Arg Gly Trp Asp Ser Ser His Glu Asp Asp

1 5 10

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Cys Arg Ser Gly Gln Gly Ser Asp Arg Gly Ser Gly Ser Arg

1 5 10

Claims

1.一种制备LCRMP4单克隆抗体的抗原肽，其特征在于：所述抗原肽为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

2.一种LCRMP4单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

（1）针对LCRMP4蛋白N端第1位氨基酸至第127位氨基酸的序列设计合成抗原肽；

（2）抗原肽免疫动物；

（3）培养杂交瘤细胞，收集培养上清液，离心，得到抗体；

（4）亲和纯化步骤（3）所得的抗体；

（5）将步骤（4）亲和纯化后的抗体进行筛选，得到LCRMP4单克隆抗体所述抗原肽，其特征在于，所述抗原肽为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

3.如权利要求2所述的LCRMP4单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

（2）抗原肽免疫动物：向载体蛋白溶液中加入偶联剂，混合后进行透析；再向步骤（1）所得抗原肽中透析所得产物，混匀，得到抗原肽与载体蛋白的偶联物；将抗原肽与载体蛋白的偶联物和佐剂混匀，以背部皮下免疫的方式注射动物；

（3）抗体获取：将步骤（2）中经免疫的动物的脾细胞与同系骨髓瘤细胞混合，再加入促融合剂，筛选培养能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增，收集培养上清液，离心，得到抗体；

（4）以巯基偶联柱对步骤（3）所得的抗体进行亲和纯化；

（5）采用蛋白质印迹法对步骤（4）亲和纯化后的抗体进行筛选，得到能够结合LCRMP4蛋白的抗体。

4.如权利要求3所述的LCRMP4单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述载体蛋白为血蓝蛋白，所述偶联剂为4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐，所述动物为小鼠，所述促融合剂为聚乙二醇。