CN107257851A

CN107257851A - 正面影响天然或工程化的真核细胞的生理学的细菌伴侣蛋白的组合

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Publication number: CN107257851A
Application number: CN201680005924.8A
Authority: CN
Inventors: 丹尼斯·蓬波; 斯特凡·吉尤埃; 吉利安·马克; 娜莎莉·戈雷塔; 卡里纳·比多; 克里斯特尔·布托内; 弗洛伦斯·博诺特
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National des Sciences Appliquees de Toulouse INSA; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2015-01-16
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2017-10-17
Also published as: CA2973912A1; BR112017015201A2; EP3245285A1; AU2016207978A1; JP2018501810A; WO2016113418A1; US20180187204A1; KR20170105079A

Abstract

本发明涉及在真核细胞中表达三种细菌伴侣蛋白的特定组合，所述表达显著改进了所述真核细胞的生长特性和其与对物理化学应激的抗性有关的特性，尤其在所述细胞包含使用至少一种非天然基因进行的另一种工程化时。伴侣蛋白的优选组合包含大肠杆菌(E.coli)的伴侣蛋白GroES和GroEL以及细长聚球藻(Synechococcus elongatus)的伴侣蛋白RbcX。

Description

正面影响天然或工程化的真核细胞的生理学的细菌伴侣蛋白的组合

本发明涉及细胞工程学领域，特别是真核细胞领域。更具体地，本发明涉及具有改进的生长和/或代谢特性的真核细胞，并且涉及其用于制备所关注的化合物的用途。本发明特别涉及表达伴侣蛋白的特定组合的真核细胞。本发明尤其适用于制备重组蛋白的领域。

背景技术

目前存在多种用于所关注蛋白的表达系统，其用于各种领域中：生物技术、食品加工、医学行业或诊断研究(基础理论研究和/或应用研究)。在这些表达系统中，真核细胞、特别是酵母起重要作用，尤其因为其糖基化能力和其在工业条件下易于培养。但这些细胞具有局限性，尤其因为与例如所关注产物(例如高浓度的乙醇或另一种醇)的积聚有关的毒性限制，或因为所表达的蛋白的直接或间接毒性，或因为需要存在表达质粒的能量负载。

发明内容

本发明提供具有改进的性能的真核细胞，从而能够开发优化的表达系统。

在针对在酵母中引入合成的卡尔文循环(Calvin cycle)的项目的上下文中，发明者惊讶地观察到，在酵母中共表达三种细菌伴侣蛋白(RbcX、GroES和GroEL)的组赋予真核细胞显著的代谢特性，尤其在异源或内源蛋白的表达和功能性折叠方面。继续调查研究，发明者还示出伴侣蛋白的此组合还可以加速酵母的生长和去除其它工程化的毒性作用，例如在激酶PRK在细胞中共表达时。对于有关各种真核细胞的性能，发明者进一步证实并且获得相同作用，从而证实这些意外结果的优点和重大可能性。

因此，本发明的一个目的涉及一种真核细胞，其特征在于所述真核细胞表达伴侣蛋白RbcX、GroES和GroEL。

在一个特定实施方式中，本发明涉及一种转化的真核细胞，其特征在于所述真核细胞含有：

(i)含有在适合启动子的转录控制下编码伴侣蛋白RbcX的序列的表达盒，所述伴侣蛋白RbcX参与细菌I型RuBisCO酶的折叠；

(ii)含有在适合启动子的转录控制下编码细菌通用伴侣蛋白GroES的序列的表达盒；以及

(iii)含有在适合启动子的转录控制下编码细菌通用伴侣蛋白GroEL的序列的表达盒。

本发明还针对一种真核细胞，其含有：

(i)在适合启动子的转录控制下编码伴侣蛋白RbcX的序列；

(ii)在适合启动子的转录控制下编码伴侣蛋白GroES的序列；以及

(iii)在适合启动子的转录控制下编码伴侣蛋白GroEL的序列。

根据一个特定的实施方式，本发明的真核细胞不含编码细菌I型RuBisCO酶的RbcL和/或RbcS亚基的序列。

本发明特别建议上文所指示的转化的酵母。

本发明的目的还有：能够表达伴侣蛋白RbcX以及伴侣蛋白GroES和GroEL的表达盒的组合的用途，其用于改进真核细胞的生理学，并且特别是提高所述真核细胞的生长速率，和/或提高所述真核细胞对环境应激的抗性，和/或提高所述细胞对由真核细胞合成的化合物的毒性的抗性，和/或制备重组蛋白。

本发明的目的还有：一种制备至少一种选自化学分子和蛋白的化合物的生物技术方法，其特征在于所述方法包括在使得根据本发明的真核细胞能够合成此化合物的条件下培养所述真核细胞的步骤，和收集所述化合物的步骤。

本发明更具体地建议一种制备重组蛋白的方法，其包括(i)将编码所述蛋白的序列插入到表达RbcX、GroES和GroEL的真核细胞中，(ii)在使得所述序列能够表达的条件下培养所述细胞，以及任选地(iii)收集或纯化所述蛋白。

附图说明

图1：菌株1b、18b、102、15、14b产生乙醇的动力学。误差棒表示三个独立培养物的标准偏差。

具体实施方式

在对真核细胞中某些细菌伴侣蛋白的表达进行研究时，本发明者很惊讶地发现细菌伴侣蛋白能够在真核细胞的细胞质中表达并且在所述真核细胞中保留其伴侣蛋白功能。除细胞质伴侣蛋白功能以外，细菌伴侣蛋白功能已经存在于真核细胞中。本发明者还发现，表达特定的三种伴侣蛋白，即细菌伴侣蛋白GroEL和GroES以及伴侣蛋白RbcX，在生长、表达和功能性蛋白折叠方面赋予表达其的转化的真核细胞特别有利的特性。

所观察到的作用必需要三种所引用的伴侣蛋白同时存在，所述蛋白优选来自至少两种不同微生物。如果已知伴侣蛋白共表达很可能在细菌系统中改进异源蛋白的折叠，因此可能改进依赖于此的生物过程的性能，那么并不能通过在真核细胞的情形下表达来预见三种细菌伴侣蛋白的特定生物体间组合能被证明是特别有效的。产生本发明作用的分子机制目前未知，即使其可能至少部分地与蛋白折叠有关，或与其细胞内命运的控制有关。在起互补作用的伴侣蛋白GroES和GroEL存在下，RbcX家族的蛋白起令人惊讶的一般作用(现有技术中描述为专门用于光合生物的RuBisCO复合物的功能结合)。本发明的此特征提示所观察的作用不能完全归因于促进的折叠的作用，并且可能涉及其它机制，如调节特定蛋白的寿命、复合物的组装或对其特性的修改，或所定义的性质的特定作用。

因此，在本发明的情形下，本发明建议转化真核细胞，以使其表达特定的三种伴侣蛋白，即细菌伴侣蛋白GroEL和GroES以及伴侣蛋白RbcX。此类转化的细胞可以具有多种应用，特别用于制备重组蛋白的情形下。

因此，本发明的一个目的为一种真核细胞，其特征在于所述真核细胞表达伴侣蛋白RbcX、GroES和GroEL。

伴侣蛋白GroEL和GroES属于热休克蛋白(HSP)家族。这些伴侣蛋白存在于多种细菌中。在本发明的上下文中，这些伴侣蛋白在已知其共同起作用以便使得相当多的蛋白能够有效折叠的意义上被称为“通用伴侣蛋白”(M.Mayhew等人,1996,“Protein folding inthe central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex”Nature 1996年2月1日；379(6564):420-6)。根据本发明，伴侣蛋白GroEL和GroES可以来自表达其的任何细菌，并且特别例如来自大肠杆菌(E.coli)(基因ID：948655和948665)、细长聚球藻(S.elongatus)(基因ID：3199735、3199535和3198035)、肺炎链球菌(S.pneumonia)(基因库登记号：AF117741)、化脓性链球菌(S.pyogenes)(基因库登记号：SPGROELGN)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)(基因库登记号：STAHSP)或铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)(基因库登记号：ATCC9027)。本领域技术人员完全能够在细菌中识别可能编码这些伴侣蛋白中的一种或另一种的核酸序列。出于信息的目的，注意到在来自细长聚球藻的GroEL1与来自大肠杆菌的GroEL之间，伴侣蛋白的序列类似性(在比对时相同氨基酸的％)是61％；在来自细长聚球藻的GroEL2与来自大肠杆菌的GroEL之间是56％；在来自细长聚球藻的GroEL1与GroEL2之间是63％。

根据本发明的细胞还表达蓝细菌和植物中已知的伴侣蛋白RbcX以参与Rubisco的RbcL和RbcS亚基的正确组装。在本发明的上下文中，此伴侣蛋白在已知此蛋白在蛋白复合物的功能性结合中起作用的意义上被称为“特异性伴侣蛋白”，在Rubisco的情况下尤其如此(S.Saschenbrecker等人,2007,“Structure and function of RbcX,an assemblychaperone for hexadecameric Rubisco”,Cell.2007年6月15日；129(6):1189-200)。根据本发明，伴侣蛋白RbcX可以来自表达其的任何蓝细菌，并且特别例如来自细长聚球藻(SEQID NO:3)、集胞藻属(Synechocystis sp.)(Kaneko等人,“Sequence analysis of thegenome of the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp.strainPCC6803.II.Sequence determination of the entire genome and assignment ofpotential protein-codingregions.”DNA Res.3(3),109-136(1996))、项圈藻属(Anabaena sp.)(Li等人,J.Bacteriol.(1997),179(11),3793-3796)、微胞藻属(Microcystis sp.)、常丝藻属(Tychonema sp.)、浮丝藻属(Planktothrix sp.)或念珠藻属(Nostoc sp.)(Rudi等人,J.Bacteriol.(1998),180(13),3453-3461)。

在本发明的上下文中，“伴侣蛋白活性”指对蛋白折叠和/或对蛋白复合物的功能性结合的作用。

在本发明的一个特定实施方式中，所用伴侣蛋白优选来自两种不同生物体。根据本发明，伴侣蛋白可以来自一种或多种不同细菌。优选地，三种伴侣蛋白来自至少两种远的革兰氏阴性细菌种，其中至少一种是蓝细菌。

根据本发明的另一个特定实施例，通用伴侣蛋白GroES和GroEL中的至少一种既不来自蓝细菌又不来自表达RuBisCO复合物的另一种细菌。根据本发明，伴侣蛋白GroES和GroEL可以来自相同细菌或来自两种不同细菌。在一个特定示例性实施方式中，伴侣蛋白GroES和GroEL来自大肠杆菌。

在一个特定示例性实施方式中，伴侣蛋白GroES和GroEL来自大肠杆菌，并且伴侣蛋白RbcX来自细长聚球藻(Synechococcus elongatus)。

在另一个示例性实施方式中，三种伴侣蛋白GroES、GroEL和RbcX来自细长聚球藻。在这样的情况下，转化的细胞可以表达伴侣蛋白GroEL的一种或另一种或两种同种型(GroEL1和GroEL2)，优选两种同种型。

在本发明的上下文中，蛋白在其与认为来自指定生物体的蛋白具有大于95％的氨基酸序列同一性并且具有与所述蛋白相同的功能时被认为“来”自所述生物体。

在本文中，“GroES”和“GroEL”指如下任何蛋白，其具有伴侣蛋白活性并且与来自大肠杆菌K 12的GroES和GroEL分别具有65％至100％的氨基酸同一性。或者，“GroES”和“GroEL”指具有较低同一性百分比、并且特别是55％至65％、并且更具体地56％至63％的通用伴侣蛋白，如来自细长聚球藻的通用伴侣蛋白。可以例如通过在下述各种实施例中用待评估的伴侣蛋白的变异体代替来自大肠杆菌的编码天然GroES或GroEL的表达盒来证实来自大肠杆菌的通用伴侣蛋白GroES和GroEL的变异体的伴侣蛋白活性。

伴侣蛋白RbcX与GroEL和GroES很远，并且其序列不能与这两种伴侣蛋白的序列比对。

在本文中，“RbcX”指如下任何蛋白，特别是来自蓝细菌的如下任何蛋白，其具有伴侣蛋白活性，与序列SEQ ID NO:3编码的伴侣蛋白RbcX具有大于50％的氨基酸序列同一性，并且保留此蛋白的特异性伴侣蛋白活性。可以通过以下方法来证实特异性伴侣蛋白活性：在表达来自细长聚球藻的RuBisCO的RbcL和RbcS亚基的酵母中通过用待评估的任何其它序列替换包括序列SEQ ID NO:3的表达盒，并且对于细胞提取物用体外测试测量因此获得的RuBisCO活性。

优选地，本发明用伴侣蛋白RbcX实施，其与SEQ ID NO:3编码的伴侣蛋白RbcX的氨基酸序列同一性大于80％，优选大于90％，更优选大于95％，甚至更优选大于99％。

本发明可以用来自单细胞或多细胞生物体的任何类型的真核细胞实施。具体来说，根据本发明的伴侣蛋白的组合可以在酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞等)中表达。

具体来说，本发明涉及一种表达特异性伴侣蛋白RbcX、细菌通用伴侣蛋白GroES和细菌通用伴侣蛋白GroEL的转化的酵母。

更具体地，本发明涉及一种转化的酵母，其特征在于所述酵母含有：

本发明可以用所关注的任何酵母实施。有利地，酵母选自酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)和毕赤酵母属(Pichia)。举例来说，根据本发明的转化的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。在另一个实施例中，根据本发明的转化的酵母是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞。

使用巴斯德毕赤酵母特别有利于制备重组蛋白。实际上，毕赤酵母在分泌与细胞内表达两者方面具有高效的真核蛋白表达系统。其特别适用于大规模生产重组的真核蛋白。具体来说，毕赤氏酵母可用于以高产率制备分泌的蛋白，以便相较于与哺乳动物细胞表达系统相关的结果降低生产成本并且缩短时间。

解脂耶氏酵母也适用于生产重组蛋白。实际上，耶氏酵母(i)具有高密度生长，(ii)具有高分泌率，(iii)不存在碱性蛋白酶AEP并且(iv)具有产生酿酒酵母转化酶的能力，该酶使得可以使用蔗糖作为碳源(Nicaud等人,1989)。后一个特性特别有利于工业生产的情况，因为此菌株可以有效地在便宜的衬底(如糖蜜)上生长。

本发明还涉及一种来自多细胞生物体的真核细胞，如动物细胞，并且特别是哺乳动物细胞，其被转化，表达特异性伴侣蛋白RbcX、细菌通用伴侣蛋白GroES和细菌通用伴侣蛋白GroEL。

在一个示例性实施方式中，这种真核细胞被转化为含有：

本发明特别涉及表达根据本发明的三种伴侣蛋白的转化的CHO细胞。

根据本发明，将编码伴侣蛋白GroEL、GroES和RbcX的基因以使其能够在真核细胞中表达的形式引入所述细胞中。因此，使编码伴侣蛋白的序列与使其能够转录的启动子序列结合。在一个实施方式中，相同的启动子序列与编码三种伴侣蛋白的序列结合。在另一个实施方式中，伴侣蛋白RbcX与特定启动子结合，该启动子与伴侣蛋白GroEL和GroES所结合的启动子不同。在另一个实施方式中，每种伴侣蛋白与不同的特定启动子结合。

可在本发明的上下文中使用的启动子包括组成性启动子，即在大多数细胞状态和环境条件下有活性的启动子；以及可诱导的启动子，其被外源物理或化学刺激激活或抑制，并且其因此随着这些刺激的存在或不存在诱导可变水平的表达。

对于酵母中的表达盒，组成性启动子的实例是具有基因TEF1、TDH3、PGI1、PGK、ADH1的启动子。可诱导的启动子的实例是启动子tetO-2、GAL10、GAL10-CYC1、PHO5。优选地，一个盒的所用启动子不同于另一个盒。本发明的表达盒还包含共用序列，如转录终止子和(必要时)其它转录调节元件。根据本发明的表达盒可以被插在宿主细胞的染色体DNA中，和/或由一种或多种染色体外复制子携带。这些蛋白的相对化学计量很可能在本发明的最佳实施例中起重要作用。以下实验部分中所述的共表达系统在这方面特别适当。然而，本发明并不限于使用这些系统，并且其可以用表达所提及的元件的任何变异体实施，该任何变异体具有至少同等的作用，使得这些作用可以例如通过测量转化的细胞在所述细胞的标准培养基中的生长来测量。

根据有利的实施方式，三个表达盒形成连续的遗传信息块。由单个附加体遗传元件携带三种伴侣蛋白的表达盒也可以是有利的。因此，本发明的特别有利的方面是由具有着丝粒复制起点的附加体元件携带的单个“遗传插入序列(genetic plug-in)”(连续的DNA序列)。用此元件转化足以在野生酵母或带有任何工程化的酵母中引入所关注的特性。

根据本发明，编码各伴侣蛋白的基因可以以一种或多种拷贝的形式引入到细胞中。具体来说，有可能引入一个、两个、三个或更多个含有编码GroES的序列的盒；一个、两个、三个或更多个含有编码GroEL的序列的盒；以及一个、两个、三个或更多个含有编码RbcX的序列的盒。同样地，盒可以含有编码GroES、GroEL或RbcX的序列的数个拷贝。在将编码伴侣蛋白的基因的数个拷贝引入细胞中的情况下，优选每次使用相同序列，即来自相同细菌的序列。还可以使用来自不同细菌的序列。

如上所述，根据本发明的细胞具有改进的特性(生长速率、抗性、生产能力等)。因此这些细胞特别适用于生产蛋白或其它化合物，或改进发酵方法。

蛋白的生产

本发明还涉及一种真核细胞，其被转化来表达上述伴侣蛋白的组合，并且其还包含至少一个除所述伴侣蛋白以外的异源蛋白的表达盒，和/或其已进行序列工程化来改变内源蛋白的表达水平和/或序列。

根据本发明的一个优选实施例，转化的真核细胞是酵母。根据本发明的另一个优选实施例，转化的真核细胞是CHO细胞。

因此，本发明还具有如下目的：一种酵母或CHO细胞，其被转化来表达上述伴侣蛋白的组合，并且含有：

(iv)除所述伴侣蛋白以外的异源蛋白的表达盒；和/或

(v)已进行序列工程化来改变内源蛋白的表达水平和/或序列。

根据本发明，可以使用这种转化的细胞来生产一种或多种所关注的蛋白。

有利地，所关注的蛋白不是Rubisco。同样地，所关注的蛋白优选是除PKR以外的蛋白。此外，如果转化的真核细胞表达Rubisco和/或PKR，那么其有利地表达至少一种其它异源蛋白。

在一个特定实施方式中，还将表达三种伴侣蛋白GroES、GroEL和RbcX的转化的细胞改性以便表达并且分泌重组蛋白。

本发明还涉及一种制备至少一种选自化学分子、酶、激素、抗体和蛋白的化合物的生物技术方法，其特征在于所述方法包括在使得上述转化的细胞能够合成此化合物的条件下培养所述细胞的步骤，和任选地收集和/或纯化所述化合物的步骤。

本发明还涉及一种生产重组蛋白的方法，其包括(i)将编码所述蛋白的序列插入到表达三种伴侣蛋白RbcX、GroES和GroEL的真核细胞中，(ii)在使得所述序列能够表达的条件下培养所述细胞，以及任选地(iii)收集和/或纯化所述蛋白。有利地，所述蛋白是酶或激素。

在一个特定实施方式中，将根据本发明的细胞转化以便生产至少一种异源酶。举例来说，将细胞转化来生产选自内毒素(如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素)、脂肪酶、枯草杆菌蛋白酶、纤维素酶和荧光素酶的酶。

在另一个特定实施方式中，将根据本发明的细胞转化以便生产医学关注的至少一种分子。举例来说，将细胞转化来生产激素、生长因子、抗体等。优选地，医学关注的分子选自促红细胞生成素、I型和/或II型α-干扰素、粒细胞集落刺激因子、胰岛素、生长激素、组织型纤溶酶原激活剂。

有利地，相较于不表达本发明的伴侣蛋白的组合的重组细胞，根据本发明的转化的细胞具有改进的所关注蛋白的生产。在本发明的上下文中，“改进的”生产意指数量和/或质量方面。具体来说，根据本发明的转化的细胞可以生产如下所关注的蛋白，相较于由不表达本发明的伴侣蛋白的组合的重组细胞生产的异源蛋白，其更具有活性和/或更稳定，因此不太可能降解，从而使得所述蛋白能够较大量地积聚。因此，根据本发明的转化的真核细胞所产生的重组蛋白的表达水平增加特别通过所述蛋白在细胞和/或培养基中具有较大的稳定性并且因此较大量地积聚来解释。此外，由转化的细胞表达伴侣蛋白的组合可以有利地提高重组细胞对其所表达的重组蛋白的抗性，因此还参与提高生产产率。

本发明还涉及能够在真核细胞中表达特异性伴侣蛋白RbcX以及通用伴侣蛋白GroES和GroEL的表达盒的组合的用途，其用于改进所述真核细胞的生理学和/或性能(特别是生长速率)。根据本发明的此方面的一个优选实施例，寻求改进的生理学的真核细胞是酵母。根据另一个优选实施例，尚未将所述真核细胞转化来表达编码细菌I型RuBisCO酶的RbcL亚基的序列和/或编码所述RuBisCO酶的RbcS亚基的序列。

如上所述，能够表达通用伴侣蛋白GroES和GroEL以及特异性伴侣蛋白RbcX的表达盒的组合特别适用于改进真核细胞的生理学，该真核细胞已进行序列工程化来改变内源蛋白的表达水平和/或序列，或包含至少一个除所述伴侣蛋白以外的异源蛋白的表达盒，例如附加体遗传元件的形式。

具体来说，细胞中通用伴侣蛋白GroES和GroEL以及特异性伴侣蛋白RbcX的相伴表达可以提高所述细胞的生长速率和/或提高所述细胞对环境应激的抗性，特别是由于细胞的培养基中存在的成分的毒性所产生的应激。另一个有利的应用是提高细胞对所合成的化合物的毒性的抗性，以及由此提高所关注的化合物的产量。

可以设想本发明的很多应用，特别是与改进与转化的真核细胞同源或异源的蛋白的折叠或稳定性(对化学试剂或热的抗性、固有寿命)有关的所有应用。其可以是在酶学催化中关注的或因为固有特性而关注的蛋白本身(复合物内的抗体、治疗性蛋白、结构蛋白等)；与改进合成或半合成的代谢链的性能有关的应用(涉及转化的真核细胞的蛋白)；在此情况下，优点主要是改进其对生产所关注产物(化学分子)的作用的结果。此作用可能是因为改进了折叠或稳定性，也可能是因为其它现象，例如亚细胞传输、促进或改变的复合物的形成、偶联机制的调节等；由以下原因产生的应用：在生长、活力、适应性、对应激的抗性或从应激的回收率的方面对生物体产生正面整体作用，没有已知或可解释的机制形成所关注产物。

本发明的工业应用的实例包括(但不限于)：

对蛋白折叠/稳定性的作用

可以通过本发明的实施改进所关注的某些重组蛋白的生产，该生产被认为是难以或甚至不可能制成可溶形式和功能形式。此特别通过在根据本发明的转化的真核细胞中纠正所述蛋白的折叠缺陷来解释。此可能特别适用于健康、能源、化学、食品加工等领域中。

针对所关注的工程化的产物或此工程化的中间体所诱导的毒性的保护

生物学生产如下分子可能是一个问题，所述分子对宿主细胞具有毒性，或其生产方法涉及毒性中间体，例如药物(氢化可的松、青蒿酸或trictosinide、某些类黄酮采用开发的方法)或反应性分子，如不饱和酮、醛(例如香兰素)等。其它实例对应于生产如下分子的方法，其在高浓度下变得有毒的，例如乙醇或其它醇。乙醇生产例如受酵母菌株对高的醇浓度的耐受性限制。其它实例涉及生产高度变化的工业化学分子、当前产品的前体或化学中间体和当然生物燃料。其还可以是重组蛋白，其通过重组细胞进行的生产倾向于使代谢不平衡，从而诱导细胞死亡。使用表达根据本发明的伴侣蛋白的组合的真核细胞可以有利地提高转化的细胞对其所表达的重组蛋白所诱导的毒性的抗性。

耐热性

改进特定酶或生物体(如酵母)的耐热性是多种例如难溶性分子的生物技术生产率的一个重要因素。

提高由定量碳源产生的微生物的生物质量

其为在分子水平不理解但在下文详述的第一实验中观察到的作用。

如上所述，本发明还涉及核酸分子，其包含：

这种“遗传插入序列”的一个实例是一种连续的DNA序列，其包含由具有着丝粒复制起点的附加体元件携带的三个上述盒(以任何顺序)。

以下实验部分通过提供以下内容来说明但不限制本发明：

-所产生的结构和所实施的方法(实施例1)；

-第一系列的测试，其比较了伴侣蛋白的各种组合对I型RuBisCO的活性的重建的作用，该I型RuBisCO由属于两个不同类型的16个肽链的组件组成。将伴侣蛋白的各种结合的表达与“I型RuBisCO”的RbcL和RbcS多肽的表达组合。这使得可以分析伴侣蛋白的组合对RuBisCO活性的作用，该作用在体外对酵母细胞提取物进行测量(实施例2)；

-第二系列的测试，其涉及在有条件地表达细长聚球藻的磷酸核酮糖激酶(PRK)的酵母中共表达伴侣蛋白系统。在不存在本发明的情况下，诱导PRK表达会在酵母中诱导大的毒性作用，视酿酒酵母菌株和培养条件(培养基、含氧量、pH值)而定，该毒性作用范围从极缓慢的生长到全部致死(>99.99％)。该示例说明本发明在不干扰PRK酶的活性的情况下“治愈”了此病态，PRK酶仍具有全部活性(实施例3)；

-第三系列的测试，其示出了本发明恢复了携带甚至被中性质粒互补的自养性序列的菌株的生长的野生水平(中性质粒本身不导致除其自身复制外的功能的表达)。此情形是涉及附加体遗传元件的代谢工程化的典型。在该实施例中，本发明完全纠正了与附加体遗传结构的存在有关的对生长的负面影响(实施例4)；以及

-另一个系列的测试，其说明本发明的细胞特别适用于生产化合物和特别地重组蛋白(实施例5)。

实施例：

在以下实施例中，并且除非另外规定，否则在表格与表格之间以及实验与实验之间，相同的简称用于表示相同的元件。

实施例1：材料和方法-“伴侣蛋白插入序列”和载体的构建-各种菌株的构建-培养和测量方法

1.1酿酒酵母的“伴侣蛋白插入序列”和载体的构建

下述某些构建物能够表达源自细长聚球藻pCC6301的RuBisCO(pFPP45)和磷酸核酮糖激酶(PRK)(pFPP20)的两种RbcS和RbcL亚基。产生下述其它构造以便可以从单个表达载体获得以下伴侣蛋白的表达的可变组合：来自细长聚球藻的特异性伴侣蛋白RbcX和来自大肠杆菌的通用伴侣蛋白GroES(基因ID：948655)、GroEL(基因ID：948665)或来自细长聚球藻的其同源物GroES(基因ID：3199735)、GroEL1(基因ID：3199535)和GroEL2(基因ID：3198035)。

制备如下合成基因并且克隆到质粒pBSII(Genecust)中，其编码来自细长聚球藻pCC6301的RuBisCO的RbcS(基因ID：3200023)和RbcL(基因ID：3200134)亚基以及特异性伴侣蛋白RbcX(基因ID：3199060)，并且被优化成在酵母中表达。还构建了被优化成在酵母中表达的变异体，其中在编码序列的3'端添加HA标签。分别在附录中的序列表中以编号SEQID NO:1至SEQ ID NO:3指示这些合成基因的序列(无HA标签)。

同样地，构建了如下合成基因并且进行克隆，其编码磷酸核酮糖激酶(PRK)(SEQID NO:4)(pFPP20)以及来自细长聚球藻pCC6301的通用伴侣蛋白GroES(SEQ ID NO:5)、GroEL1(SEQ ID NO:6)和GroEL2(SEQ ID NO:7)，并且被优化以在酵母中表达。

从大肠杆菌培养物扩增编码来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroES和GroEL的序列并且克隆到质粒pSC-B-amp/kan(Stratagene)中。

将从克隆载体回收的序列引入酵母表达载体中。这些宿主载体列在下表I中。

表I：所用载体的清单。

注解：pGAL10-CYC1：合成启动子，其由GAL10基因的UAS和CYC1基因的转录起始组成(Pompon等人,Methods Enzymol,272,51-64,1996)。

将因此获得的表达盒列在下表II中。

表II：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	标签	终止子
					CAS6	TDH3p	RbcL	无	ADH1
CAS7	TetO7p	PRK	无	CYC1t
					CAS16	TEF1	RbcS	无	PGK
CAS19	TEF1p	RbcX	无	PGK
					CAS21	PGI1p	GroES大肠杆菌	无	CYC1
CAS22	TDH3	GroEL大肠杆菌	无	ADH
					CAS23	PGl1p	GroES细长聚球藻	无	CYC1t
CAS25	TDH3p	GroEL2细长聚球藻	无	ADH1t
					CAS28	PGI1p	聚合连接子	无	CYC1t
CAS33	TEF1p	聚合连接子	无	PGKt

在某些载体中，插入两个或三个盒。为此，在细菌大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)DH5α中扩增质粒并且通过maxiprep制备，接着用适合的限制酶消化。最后，通过用T4连接酶(FERMENTAS)连接或通过在酵母中直接同源重组将片段整合到宿主载体中。下表III中指示所构建的载体的清单。

表III：表达载体

名称

来源类型

盒1

盒2

盒3

标记物

宿主载体

pFPP13

ARS415-CEN6

CAS33

无

LEU2

pFL36

pFPP20

ARS416-CEN4

CAS7

无

TRP

pCM185

pFPP45

2μ

CAS6

CAS16

无

URA3

pFPP5/pFPP10

pFFP53

ARS415-CEN6

CAS19

CAS28

无

LEU2

pFL36

pFPP56

ARS415-CEN6

CAS19

CAS21

CAS22*

LEU2

pFPP13

pFB05

ARS415-CEN6

CAS19

CAS25*

CAS21

LEU2

pFFP56

pFB07

ARS415-CEN6

CAS23

CAS22*

CAS19

LEU2

pFFP56

pFB08

ARS415-CEN6

CAS23

CAS25*

CAS19

LEU2

pFFP56

pFB09

ARS415-CEN6

CAS21

CAS22*

无

LEU2

pFFP56

1.2各种酿酒酵母菌株的构建

构建以上各种质粒以便能够按需要在酵母菌株内表达个别组分或这些组分的联合。因此，使用各种载体或载体的组合转化数个酿酒酵母菌株(W303.1B、FY1679和CEN.PK1605)。CEN.PK 1605是菌株1605的原养型。因此，它是“生理学性能”的阳性对照。下面表IV第一栏中编译的每一个数字对应于同一个表的相应行所述的载体的结合。因此，对于每一个所用菌株，相关参考数字提供关于重建的工程化的信息。出于清晰的缘故，仅示例了CEN.PK 1605菌株(表IV)，但其它两个菌株的命名相同。

表IV.质粒和菌株的组合(参考表III.)

(syn：细长聚球藻；L2 syn：GroEL2细长聚球藻，L1syn：GroEL1细长聚球藻)

关于某些表格的注解：

1.pCM185：商购的质粒(ATCC 87659)

2.pFL36：商购的质粒(ATCC 77202)

3.PYeDP51：“空”质粒，其描述于以下文章中：Urban P,Mignotte C,Kazmaier M,Delorme F,Pompon D.Cloning,yeast expression,and characterization of thecoupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases with P450 CYP73A5.J Biol Chem.1997年8月1日；272(31):19176-86。

4.GroES大肠杆菌基因ID：6061370；GroEL大肠杆菌基因ID：6061450

5.酿酒酵母菌株CEN.PK 113-7D：Mat a原养型

6.酿酒酵母菌株CEN.PK 1605：来自CEN.PK 113-7D的Mat a HIS3leu2-3.112trp1-289ura3-52MAL.28c.菌株

7.其它缩写指数据库中所述的酿酒酵母基因。

8.合成基因：编码RuBisCO亚基的细长聚球藻基因、特异于RuBisCO组件的伴侣蛋白(RbcX)、PRK和通用伴侣蛋白GroES、GroEL1和GroEL2在对实施不均一的密码子偏倚的酵母进行专用的再编码后合成，并且克隆到pCC6301(商购)中。附录中提供这些蛋白的编码序列(再编码后)(SEQ ID NO:1:RbcS编码序列；SEQ ID NO:2:RbcL编码序列；SEQ ID NO:3:RbcX编码序列；SEQ ID NO:4:PRK编码序列；SEQ ID NO:5:GroES编码序列；SEQ ID NO:6:GroEL1编码序列；SEQ ID NO:7:GroEL2编码序列)。

9.从细菌扩增大肠杆菌伴侣蛋白GroES和GroEL的编码序列，克隆在pSC-B-amp/kan(Stratagene)中，并且在不在表达载体(参见上文)中再编码的情况下组装。

10.通过在酵母中共转化两个分子进行同源重组将编码细长聚球藻伴侣蛋白的cDNA的再编码序列插入之前线性化的载体pUC57中。类似地，通过PCR从上述构建物扩增ORF，从而产生与载体pFPP56所携带的启动子和终止子同源的侧区。这使得可以通过共转化酵母菌株中的此PCR产物与之前线性化的载体pFPP56来同源重组而进行克隆，从而根据表II中所述的盒产生表III中所述的各种表达载体。

1.3构建整合不同来源的伴侣蛋白的各种酿酒酵母菌株

评估了来自各种细菌的伴侣蛋白。因此，还通过组合来自细长聚球藻的RbcX与来自细长聚球藻的GroES、GroEL1和/或GroEL2测试了包括来自相同种(细长聚球藻)的蛋白的组合。

表V：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	标签	终止子
					CAS19	TEF1p	RbcX优化的细长聚球藻	无	PGKt
CAS21	PGI1p	GroES大肠杆菌	无	CYC1t
					CAS22	TDH3p	GroEL大肠杆菌	无	ADH1t
CAS23	PGl1p	GroES优化的细长聚球藻	无	CYC1t
					CAS24	TEF2p	GroEL1优化的细长聚球藻	无	TEF1t
CAS25	TDH3p	GroEL2优化的细长聚球藻	无	ADH1t

表VI：表达载体

表VII：质粒和菌株的组合

(syn：细长聚球藻；L2 syn：GroEL2；L1 syn：GroEL1细长聚球藻)

1.4构建巴斯德毕赤酵母菌株

为了维持插入序列中所含有的基因的功能性表达，将启动子和终止子替换成在巴斯德毕赤酵母GS115中起作用的启动子和终止子(Thermo Fisher Scientific C181-00)。

在质粒pFPP56(表III)上，将控制RbcX、GroES和GroEL基因从CAS19、CAS20和CAS21(表II)表达的每种启动子用根据文献的相容启动子(下表VIII)替换。

表VIII：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	终止子
				CAS50	PEX8	RbcX	TEF1
CAS51	AOX1	GroES	PGK
				CAS52	FLD1	GroEL	ADH1

通过PCR扩增包括三个以下表达盒(表IX)的区域，并且NotI克隆在商购的质粒pPIC3.5(Thermo Fisher K1710-01)中。

表IX：表达载体

名称

来源类型

盒1

盒2

盒3

标记物

宿主载体

pCB05

ARS415-CEN6

CAS50

CAS51

CAS52

LEU2

pFL36

pCB06

整合的

CAS50

CAS51

CAS52

HIS4

pPIC3.5

将这些质粒预先线性化，根据EasySelect毕赤酵母表达试剂盒方案(ThermoFisher)个别地转化在组胺酸营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS115(Thermo FisherC181-00)中，并且在30℃下在基本培养基和葡萄糖上选择。

表X：质粒和菌株

1.5构建解脂耶氏酵母菌株

使用从废水分离的野生菌株W29(ATCC 20460，MatA)。

在质粒pFPP56(表III)上，将控制RbcX、GroES和GroEL基因从CAS19、CAS20和CAS21(表II)表达的每种启动子用根据文献的相容启动子(下表XI)替换。

表XI：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	终止子
				CAS55	TEF	RbcX	TEF1
CAS56	EXP	GroES	PGK
				CAS57	GDP	GroEL	ADH1

通过PCR扩增包括三个以上表达盒(表XI)的区域，并且克隆在商购的质粒pYLEX1中。

表XII：表达载体

名称

来源类型

盒1

盒2

盒3

标记物

宿主载体

pCB07

整合的

CAS19

CAS20

CAS21

LEU2

pYLEX1

将这些质粒线性化，根据YLOS转化试剂盒方案(Yeastearn Biotech)个别地转化在亮氨酸营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株中，并且在28℃下在基本培养基和葡萄糖上选择。(YLEX表达试剂盒，Yeastearn Biotech，目录号：FYY201-1KT)

表XIII：质粒和菌株

解脂耶氏酵母PO1f

基因型：MATA ura3-302 leu2-270 xpr2-322 axp2-deltaNU49 XPR2::SUC2

在28℃下，进行伴侣蛋白对在无亮氨酸的合成培养基中菌株PO1f_01和PO1f_02的培养物的影响的评估72h。

1.6构建CHO细胞

为了确保容易并且多样地处理和高效地转移更高级真核细胞的细胞组上的“伴侣蛋白”插入序列，选择第四代慢病毒转导系统。这些慢病毒颗粒可以同等地转移来自各种更高级真核细胞(如人类或鼠细胞)的原代细胞、无限增殖化的细胞或转化的细胞中的插入序列。

在质粒pFPP56(表III)上，将控制来自CAS20和CAS21(表II)的GroES和GroEL基因表达的每种启动子用根据文献的相容启动子(下表XIV)替换。

表XIV：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	终止子
				CAS54	CMV	RbcX	hβ血球蛋白
CAS55	hEF-1a	GroES	hPKG1
				CAS56	hUBC	GroEL	hGAPDH

通过PCR扩增包括RbcX的开放阅读框的区域和两个表达盒CAS55和CAS56，并且XhoI-KpnI克隆在商购的质粒pLVX-Puro(Clontech，目录号632164)中。

表XV：表达载体

名称

来源类型

盒1

盒2

盒3

标记物

宿主载体

pCB10

整合的

CAS54

CAS55

CAS56

Puro

pLVX-Puro

使用Lenti-X包装系统(Clontech)根据试剂盒的方案在Lenti-X293T细胞(Clontech)中转化质粒pLVX-Puro或pCB10。过滤含有病毒颗粒的上清液并且以1/5或1/2的稀释度添加到培养在10cm皮氏培养皿(Petridish)中的CHO细胞中，培养基的最终体积是5ml。

转导24h后，用PBS洗涤细胞并且添加补充有2μg/ml嘌呤霉素的新鲜培养基以在37℃下在48h内进行选择。

将因此形成的细胞系维持在培养基中0.5μg/ml嘌呤霉素的浓度下。

表XVI：质粒和菌株

1.7方法

培养方法1：在葡萄糖上生长

使转化的细胞在30℃下在环境空气中在补充有6.7g/l硫酸铵、20g/l葡萄糖、20g/l琼脂的YNB培养基(无氮碱的酵母培养基)上并且在2μ/ml多西环素(doxycycline)存在下生长，其中琼脂补充有商购的CSM培养基(MP Biomedicals)，该CSM培养基适合于转化所用质粒的选择标记物(-ura、-leu、-trp)。在指数生长期末期之前的一代，通过在4℃下冷却终止培养。将培养物离心，接着通过在高渗的山梨糖醇培养基(1.2M山梨糖醇)中用消解酶-解旋酶混合物进行细胞壁的酶消化来制备原生质球。在高渗的山梨糖醇培养基中在饱和浓度的PMSF和EDTA(蛋白酶抑制剂)存在下洗涤原生质球，接着通过反复吸取和温和的超声处理在等渗的山梨糖醇培养基(0.6M)中破碎。在低速(1500rpm)下离心来消除大碎片，接着在中速(4000rpm)下离心来收集中等尺寸的碎片和线粒体后，收集上清液并且通过布雷德福法(Bradford method)将蛋白浓度定量。

RuBisCO活性的体外测试

在体外，将来自此细胞溶解物的15μg蛋白样品添加到适合缓冲液(50mM Tris/HClpH7.4、10mM MgCl₂ ⁺、60mM碳酸氢钠)中的合成分子RuBP(最终2mM)中，反应体积为200μl，使得酵母溶解产物中表达的RuBisCO复合物能够催化磷酸甘油酸分子的形成。在可变时间下，通过添加HCl(12.1M)终止反应，并且通过HPLC/MS分析反应产物以便通过分析随时间产生的磷酸甘油酸来评估蛋白样品的羧化酶活性。

在受控的培养基中的培养物

在化学限定培养基上制备预培养物。解冻后，用1ml储料管(-80℃)接种含有10ml培养基的青霉素瓶(100ml)，在30℃和120rpm下培育18小时。在厌氧生活(将瓶子预先用氮气冲洗)下并且在多西环素存在下制备预培养物以避免PRK基因存在下观察到的毒性问题。接着用生理盐水(NaCl，9g/l)洗涤预培养物三次(离心、再悬浮、涡旋15s)，随后将细胞球再悬浮在无多西环素的培养基中。

接着将源自预培养物的这些细胞接种，以便达到0.05(或0.1g/l)的初始光密度。在好氧生活下起始培养物体积是50ml(250ml带挡板的依氏烧瓶(Erlenmeyer flask))，或在厌氧生活下是35ml(100ml青霉素瓶)。

所有葡萄糖消耗或乙醇产生停止后终止培养。每种培养物制备一式三份。

分析：细胞外代谢物的表征

通过高效液相色谱法(HPLC)测量葡萄糖、甲酸和主要代谢物(乙醇；甘油；乙酸、丁二酸和丙酮酸)的浓度。所用装置是色谱仪(Waters，Alliance 2690)，其配备有Aminex HPX87-H⁺(300mm×7.8mm)管柱。分子的检测用折光率检测器(Waters 2414折射仪)提供。洗脱剂是流动速率为0.5ml/min的8mM H₂SO₄，并且柱温设定在50℃。在厌氧生活下，对单瓶的每种菌株进行此分析。在此情况下，对质量损失进行标准偏差的计算，接着用于代谢物。

实施例2：伴侣蛋白的组合对酵母中I型RuBisCO的羧化酶活性的重建的作用。

卡尔文循环使得植物和蓝细菌能够从二氧化碳生产葡萄糖。关键步骤是将CO₂固定在1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)(一种具有五个碳的分子)上。此步骤需要称为RuBisCO(表示核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶)的酶。此酶使得能够形成不稳定的六碳分子，其迅速地产生两个三碳3-磷酸甘油酸分子。存在数种RuBisCO形式。I型由两种类型的亚基组成：大亚基(RbcL)和小亚基(RbcS)，其正确组装还需要至少一种特异性伴侣蛋白RbcX的介入。RuBP为RuBisCO的底物，其通过5-磷酸核酮糖与ATP反应形成；此反应用磷酸核酮糖激酶(PRK)催化。

在此实施例中，通过用上表IV中载体第3号和第4号的组合共转化酵母菌株CEN.PK1605来重建人工卡尔文循环，从而使得来自细长聚球藻的RuBisCO的RbcS和RbcL亚基、特异性伴侣蛋白RbcX和PRK酶能够同时表达，其中根据组合编号表达(组合3和组合101)或不表达(组合4)来自大肠杆菌或聚球藻属的通用伴侣蛋白GroEL和GroES。

因此，在三个独立实验(A、B和C)中从葡萄糖上的酵母培养物(方案如上详述，要点1.3)的蛋白提取物进行RuBisCO活性的测试；通过测量磷酸甘油酸生产随时间的变化来评估其产率。结果提供于下表XVII中。

表XVII：从在葡萄糖上生长并且含有第一栏中所示的工程化的CEN-PK菌株的提取物进行RuBisCO活性的体外测试。在80min培育期间，在室温下，用0.01-0.02mg来自酵母的可溶性提取物的蛋白进行测试，反应体积是200μl，反应体积中含有2mM二磷酸核酮糖。活性以提取物中每分钟每毫克总蛋白形成的3-磷酸甘油酸的纳摩尔数提供。

实验A示出，尽管伴侣蛋白RbcX特异于RuBisCO复合物，但其单独存在不足以使得活性酶复合物能够表达。仅来自大肠杆菌的通用伴侣蛋白GroES与GroEL两者的组合使得可能检测到磷酸甘油酸生产随时间增加，其中该组合以适合于RbcX的存在的化学计量结合。

此外，实验C示出在来自细长聚球藻的RbcL/RbcS亚基与来自相同生物体的同源伴侣蛋白RbcX、GroES、GroEL2结合时，RuBisCO活性显著降低超过90％。此清晰地说明异源伴侣蛋白结合的优点。

此实施例可以明确地确定异源细菌通用伴侣蛋白与细菌特异性伴侣蛋白RbcX的结合为在酵母中优化合成的RuBisCO复合物的活性所必需。

实施例3：伴侣蛋白的组合针对重组蛋白的毒性的保护作用

在独立于RuBisCO的情况下，对去除与体内核酮糖激酶表达有关的毒性的作用

所实施的方法和分析描述于以上实施例1中。

相较于野生菌株(WT)，在酵母(菌株18b)中仅表达核酮糖激酶涉及长的潜伏期(超过50个小时)并且其最大生长速率急剧下降(在好氧生活下70％，并且在厌氧生活下82％)(表XVIII)。

表XVIII：菌株WT、1b、18b、102、15、14b的基因型、最大生长速率和生长延迟期。

由PRK诱导的此毒性可以通过在菌株102中共表达来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroES/GroEL(在厌氧生活下去除26％对生长速率的毒性，并且在好氧生活下去除42％对生长速率的毒性)或在菌株14b中共表达来自细长聚球藻的伴侣蛋白RbcX(在厌氧生活下去除34％对生长速率的毒性，并且在好氧生活下去除10％对生长速率的毒性)而部分地去除。

在菌株15中共表达来自大肠杆菌的伴侣蛋白GroES/GroEL和来自细长聚球藻的RbcX使得可能恢复近乎全部生长(在厌氧生活下去除78％对生长速率的毒性，并且在好氧生活下去除63％对生长速率的毒性)。此共表达还使得可能完全消除长的潜伏期。

与核酮糖激酶(PRK)表达有关的毒性影响乙醇发酵，其特征为乙醇生产率下降(菌株18b)(图1)，此与潜伏期的存在和生长速率下降直接有关。表达“伴侣蛋白”工程化(来自大肠杆菌的GroES+GroEL+来自细长聚球藻的RbcX)不仅可以完全去除核酮糖激酶(PRK)的毒性，并且更具体地可以积聚PRK催化的反应的产物，而且因此提高乙醇生产率(菌株15)，而通用伴侣蛋白对GroES/GroEL仅具有部分作用(菌株102)，并且仅表达RbcX无作用(菌株14b)。

实施例4：对转化的细胞的生长的一般作用的示例

4.1.对发酵中酿酒酵母生长的一般作用

所实施的方法和分析描述于以上实施例1中。结果提供于下表XIX中。

表XIX：菌株WT、1b、103、13b的基因型、最大生长速率和生长延迟期。

有利地，相较于含有三个“空”质粒的对照菌株(菌株1b)或仅表达大肠杆菌通用伴侣蛋白GroES/GroEL的菌株103，表达“伴侣蛋白”工程化向菌株13b(RbcX+(Gros/GroEL)大肠杆菌)提供30％的增殖优势。

此外，在好氧生活和厌氧生活下，菌株13b的生长速率分别等于未转化的野生菌株(WT)CEN.PK 113-7D的生长速率的96％和86％，因此并未受到应激(表XVIII)。

4.2.对发酵中巴斯德毕赤酵母生长的一般作用

在30℃下，在含有甘油的基本培养基上培养菌株PPGC115_01和PPGC115_02 14h并且用1％甲醇诱导48h至100h后，根据F.Wang等人,2015(PLoS One.2015年3月17日；10(3):e0120458.“High-level expression of endo-β-N-acetylglucosaminidase H fromStreptomyces plicatus in Pichia pastoris and its application for thedeglycosylation of glycoproteins.”)中所述的方案进行伴侣蛋白的影响的评估。

在发酵100h后评估以相同细胞浓度接种的两种菌株，相对于对照菌株PPGC115_01，菌株PPGC115_02在生长曲线的指数期计算的菌株的μ最大值具有大约30％的增殖优势。

4.3.对发酵中解脂耶氏酵母生长的一般作用

根据JM Nicaud等人,2002(Protein expression and secretion in the yeastYarrowia lipolytica.FEMS Yeast Res.2002年8月；2(3):371-9)中所述的方案评估菌株PO1f_01和PO1f_02。表型示出表达伴侣蛋白的组合的菌株的生长增加。增殖优势被评估为超过35％。

4.4.对CHO细胞生长的一般作用

以相同密度(每10cm培养皿2×10⁶个细胞)接种细胞系CHO-01和CHO-02，并且在4天内评估生长。通过用胰蛋白酶处理将细胞解离并且个体化，并且每天使用自动计数器计数。细胞系CHO-02的细胞生长速率比对照细胞系CHO-01高约25％。伴侣蛋白的组合对细胞倍增时间具有作用。

这些研究示出此“伴侣蛋白”工程化有可能(i)使含有或不含另一种工程化但经受物理化学应激的真核细胞恢复正常生长，并且(ii)与在相同条件下使用的菌株/细胞相比提供增殖优势。

实施例5：对生产重组蛋白的作用的示例

5.1.酿酒酵母中人生长激素的生产

根据下述盒合成人生长激素基因(基因库：K02382.1)并且克隆在组成性启动子TEF1的下游。

表XX：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	终止子
				CAS54	TEF1p	hGH	PGK

表XXI：表达载体

名称

来源类型

盒1

盒2

盒3

标记物

宿主载体

pCB09

2μ

CAS54

URA3

PYeDP51

pFPP56

ARS415-CEN6

CAS19

CAS21

CAS22

LEU2

pFL36

根据先前描述的转化方案在菌株CEN.PK 1605中共同转化这些质粒。在合成培养基(-leu-ura)上选择菌株。

表XXII：菌株

使菌株200、230和231在合成培养基(-leu-ura)中生长直到OD 600nm为0.7为止。收集细胞并且用1ml冷溶解缓冲液(1×PBS pH 7.4，1mM PMSF)洗涤一次，接着再悬浮于0.3ml拉米利缓冲液(Laemmli buffer)中并且在98℃下培育5min。制备连续稀释液(1:10)并且将相同体积的每种样品沉积在SDS-PAGE凝胶(梯度4％-20％)上，转移在硝化纤维膜上。用抗体[GH-1](ab9821，Abcam)评估hGH表达并且关于遍在基因GAPDH(ab9485，Abcam)表达标准化。此外，通过ELISA使用并且根据人生长激素ELISA试剂盒的方案(ThermoScientific，目录号：EHGH1)定量hGH表达。

菌株230中评估的所生产的hGH蛋白的数量比菌株211中所获得的数量高40％。

5.2.评估酿酒酵母中的内源荧光素酶活性

根据下述盒从载体pGL4(Promega)扩增萤火虫荧光素酶基因，并且克隆在组成性启动子TEF1的下游。

表XXIII：表达盒

名称	启动子	开放阅读框	终止子
				CAS53	TEF1p	fLuc	PGK

表XXIV：表达载体

名称

来源类型

盒1

盒2

盒3

标记物

宿主载体

pCB08

2μ

CAS53

URA3

PYeDP51

pFPP56

ARS415-CEN6

CAS19

CAS21

CAS22

LEU2

pFL36

表XXV：质粒和菌株

使菌株200、210和211在合成培养基(-leu-ura)中生长直到OD 600nm为0.7为止。收集细胞并且用1ml冷溶解缓冲液(1×PBS pH 7.4，1mM PMSF)洗涤一次，接着再悬浮于0.3ml相同缓冲液中。用玻璃珠(Fast Prep)溶解悬浮的细胞。

通过布雷德福法(BioRad)测定粗溶解产物的浓度，稀释到0.5mg/ml，使用荧光素酶分析系统(Promega)每种样品使用5μl溶解产物测定荧光素酶活性并且在光度计上评估发光。

将活性关于总蛋白的数量标准化。

菌株210中评估的荧光素酶活性比菌株211中评估的活性高60％。

5.3.酿酒酵母中重组纤维素酶的活性的评估

在启动子TEF2下将伴侣蛋白工程化与用于表达来自埃默森蓝状踝节菌(Talaromyces emersonii)(基因库登记号AAL89553)的纤维素酶——纤维二糖水解酶1(CBH1)的工程化结合。纤维素酶活性的分析如Y.Ito等人,2015(Combinatorial Screeningfor Transgenic Yeasts with High Cellulase Activities in Combination with aTunable Expression System.PLoS One.2015年12月21日；10(12))中所述进行。

对于在伴侣蛋白存在下共表达纤维素酶工程化的菌株所记录的活性比仅表达纤维素酶工程化的菌株的活性产率高37％。

5.4.蛋白生产的改进

使用伴侣蛋白改进先前对于酵母所述的蛋白生产可以容易地在任何所关注的真核细胞中并且特别在毕赤酵母和耶氏酵母中实施，以便因此优化内源或异源蛋白的产率和/或活性。本领域技术人员可以特别参考以下出版物来使根据本发明的表达伴侣蛋白的组合的酵母生产各种所关注的蛋白来用于食物加工工业、药物领域、生物质水解、能量等：

Spohner SC,Müller H,Quitmann H,Czermak P.Expression of enzymes forthe usage in food and feed industry with Pichia pastoris.J Biotechnol.2015年5月20日；202:118-34.

Kim H,Yoo SJ,Kang HA.Yeast synthetic biology for the production ofrecombinant therapeutic proteins.FEMS Yeast Res.2014年8月12日.

Ahmad M,Hirz M,Pichler H,Schwab H.Protein expression in Pichiapastoris:recent achievements and perspectives for heterologous proteinproduction.Appl Microbiol Biotechnol.2014年6月；98(12):5301-17.doi:10.1007/s00253-014-5732-5.Epub 2014年4月18日.Review.

Weinacker D,Rabert C,Zepeda AB,Figueroa CA,Pessoa A,FaríasJG.Applications of recombinant Pichia pastoris in the healthcareindustry.Braz J Microbiol.2014年3月10日；44(4):1043-8

Rabert C,Weinacker D,Pessoa A Jr,Farías JG.Recombinants proteinsfor industrial uses:utilization of Pichia pastoris expression system.Braz JMicrobiol.2013年10月30日；44(2):351-6.

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序列表

<110> 法国农业科学研究院

图卢兹国家应用科学研究院

法国国家科学研究中心

<120> 正面影响天然或工程化的真核细胞的生理学的细菌伴侣蛋白的组合

<130> B2160PC00

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 336

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 1

atgtcaatga agacgctccc taaagaaagg agatttgaaa cgttttcata tctgccccct 60

ctctctgata gacaaatcgc tgctcaaatc gaatatatga tcgaacaagg ttttcatcca 120

ttaatcgaat ttaatgaaca ttctaatcca gaagaatttt attggactat gtggaagctc 180

cctctttttg attgtaaatc tcctcaacag gttttagatg aagtgagaga gtgtagatct 240

gaatatggtg attgttatat cagagttgct ggttttgata atatcaaaca atgtcaaact 300

gtttctttta tcgttcatag acctggaaga tactaa 336

<210> 2

<211> 1419

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 2

atgcctaaga ctcaatcggc tgccggttac aaggcaggtg taaaagatta caaactaact 60

tattatactc cagattatac acccaaagac actgacttac tagccgcctt tcgcttttcg 120

ccccagccag gtgttccagc tgatgaagct ggtgctgcta tcgctgctga atcttctact 180

ggtacttgga ctactgtttg gactgattta ttaactgata tggacagata caaaggcaaa 240

tgttaccata ttgaaccggt tcaaggtgag gaaaattctt attttgcttt tatcgcatac 300

cctctagatc tttttgaaga gggttctgtt actaatatct taacttctat cgtcggtaat 360

gtctttggct ttaaggccat tcgtagccta cgtcttgaag acatcaggtt tccagttgct 420

ttagttaaaa cttttcaagg tccaccacat ggtatccaag tagaacggga tcttttaaat 480

aaatatggca gaccgatgct cgggtgcacg attaagccga agctcgggct ttctgctaaa 540

aattatggta gagctgttta tgaatgttta cgtggtggtt tagattttac taaagatgat 600

gaaaatatca attctcaacc gttccagcgt tggcgggacc gattcctctt tgtggccgac 660

gcgatccata aatctcaagc tgaaactggt gaaatcaaag gtcattattt aaatgtaacg 720

gcgcctacat gtgaagaaat gatgaagcga gcagaatttg ctaaggaact aggtatgcct 780

atcatcatgc atgatttttt aactgctggt tttactgcta atactacttt agctaaatgg 840

tgccgggaca atggagtcct attacatatc catcgtgcca tgcacgcggt cattgatcgt 900

caaaggaatc atggtatcca ttttagagtt ttagctaaat gtttaagatt atctggtggt 960

gatcatttac attctggtac tgtcgtggga aagcttgagg gtgacaaggc atctacatta 1020

ggttttgttg atttaatgag agaagatcat atcgaagctg atagatctag aggtgttttt 1080

tttactcaag actgggcgtc gatgccgggg gtgctcccag ttgcttctgg tggtatccat 1140

gtttggcaca tgccggcgtt agttgaaatc tttggtgatg attctgtttt acaatttggt 1200

ggtggtactt taggtcatcc atggggtaat gcaccaggtg ctactgctaa tagagttgct 1260

ttagaagctt gtgttcaagc tagaaatgaa ggtagagatt tatatagaga gggtggtgat 1320

attttaaggg aagcaggtaa atggtcgcct gaactggcag ccgccctcga tttatggaaa 1380

gaaatcaaat ttgaatttga aactatggat aaattataa 1419

<210> 3

<211> 486

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 3

atgcaattta tgggtactgc ttctaggatg gcgtcgacgc aacgggccaa gcctatggag 60

atgccgagga ttagccgtga tactgctaga atgttagtta attatttaac ttatcaagct 120

gtttgtgtta tcagagatca attagctgaa actaatccag ctggtgccta tagattacaa 180

gttttttctg ctgaattttc ttttcaagat ggtgaagctt atttagctgc tttattaaat 240

catgatagag aattaggact aagggtgatg acggtaaggg aacatttagc tgaacatatt 300

ctagattatc ttccagaaat gacgattgcc caaattcaag aggccaacat taaccataga 360

agagcacttt tagaaaggtt aacaggcctt ggggctgagc catctttacc ggaaacggag 420

gtctcagaca gaccctcaga ttctgctact ccagatgatg cttctaatgc ttctcatgct 480

gattaa 486

<210> 4

<211> 1002

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 4

atgtctaaac cagatagagt tgttttaatc ggtgttgctg gtgattctgg ttgtggtaaa 60

tctacatttc ttaacaggtt agctgattta tttggtactg aattaatgac tgttatttgt 120

ttagatgatt atcattcgtt agatcgtaaa ggcagaaagg aagcgggtgt aactgcttta 180

gatcctagag ctaataattt tgatttaatg tatgaacaag ttaaagcttt aaaaaatggt 240

gaaactatca tgaaaccaat ctataatcat gaaactggtt taatcgatcc acctgaaaag 300

atcgagccaa acagaattat tgtaattgaa gggttacacc cactttatga cgaacgagtt 360

cgcgaacttt tagatttttc tgtttattta gatatcgatg atgaagttaa aatcgcttgg 420

aaaatccaaa gagatatggc cgaaagaggt cattcttatg aagatgtttt agcctcaatt 480

gaggctagaa ggccagattt taaagcatat attgaaccgc aacggggaca cgctgatatc 540

gttattcgtg taatgcccac tcaacttatc ccgaatgaca ctgagaggaa agtcctaagg 600

gtacaattaa tccagagaga aggaagggat ggatttgaac cagcttattt atttgatgaa 660

ggttctacaa ttcaatggac gccttgtggc agaaagttaa catgtagcta tcctggcatt 720

cgcttagctt atggtccaga tacttattat ggtcatgaag tttctgtcct tgaagtggat 780

ggacaatttg aaaatttaga agaaatgatt tacgttgaag gtcatttatc taaaactgat 840

actcaatatt atggtgaatt aactcatcta cttttacaac acaaagatta tccaggttct 900

aataatggta ctggtttatt ccaagtgcta acgggtctca agatgcgggc cgcctatgaa 960

aggttaactt ctcaagctgc tccagttgct gcttctgttt aa 1002

<210> 5

<211> 312

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 5

atggctgccg tctcattatc tgtttctact gttactccat taggtgatag agtttttgtt 60

aaagttgctg aagctgaaga aaaaactgct ggtggtatca tcttaccaga taatgctaaa 120

gaaaaaccac aagtcggtga aattgtcgct gttggtccag gtaaaagaaa tgatgatggt 180

tcaagacaag ctccagaagt taaaatcggt gataaagttt tatattctaa atatgctggt 240

actgatatta aattaggtaa tgatgattat gttcttttat ctgaaaaaga tatcttagct 300

gttgtcgctt aa 312

<210> 6

<211> 1668

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 6

atggctaaat taatcttatt tcatgaagat tcaagacaag cattagaaag gggtgttaat 60

gctttagcta atgctgttaa agttacttta ggtccaagag gtagaaatgt tttattagaa 120

aaaaaatttg gtgctccaga aatcatcaat gatggtgttt ctatcgctaa agaaatcgaa 180

ttagaagatc cacatgaaaa tgcaggtgca agactagttc aagaagttgc tgctaaaact 240

aaagaaatcg ctggtgatgg tactactact gctactgttt tagctcaagc tatcgttaga 300

gaaggtttaa ctaatgttgc tgctggtgct aatccaatcg ttttaagaag aggtatcgaa 360

aaagctgttg ctactttagt tgaagctatc gctgctaaag ctcaaccagt tgctgatgaa 420

gctgctatca gatctatcgc tgctgtttct gctggtaatg atgatgaagt tggtcaaatg 480

atcgctgatg ctgttgctaa agttactaaa gatggtgtta tcacagttga agaatctaaa 540

tctttagcta ctgaattaga agtcgttgaa ggtatgcaat ttgatagagg ttatttatct 600

ccatattttg ttactgatca agatagacaa gtagttgaat atgataatcc attaatctta 660

ttaactgata aaaaaatcgc ttctatccaa gatttagttc cagttttaga agatgttgct 720

agagctggta gaccattatt aatcatcgct gaagatatcg aaggtgaagc tttagctact 780

ttagttgtta ataaagctag aggtgtttta aatactgttg ctgttaaagc tccagctttt 840

ggtgatagaa gaaaagctat cttacaagat atcgctgttt taactggtgg tcaagttatc 900

tctgaagaag ttggtttatc tttagctgat gctaattctt ctgttttagg taaagctcaa 960

aaaatcacta tctctaaaga tactactatc atcgttgctg gtgatgaaaa taaagctgat 1020

gttgctgcta gaatcgctca aatcagaaga tctttagaag aaactgattc tgattatgat 1080

agagaaaaat tacaagaaag aatcgctaaa ttagctggtg gtgttgctgt tatcaaagtt 1140

ggtgctccaa ctgaaactga attaaaaaat agaaaattaa gaatcgaaga tgctttaaat 1200

gctactagag ctgctatcga agaaggagtt gttccaggtg gtggtactac tttattacat 1260

ttagcttctg ctttaacttc tttacaagct tctttaactg ttgctgatga aaaattaggt 1320

gttgaaatcg ttgctagagc tttagaagct ccattaagac aaattgctga taatgctggt 1380

gcagaaggtt ctgttgttgt cgaaaaatta agagataaag attttaattt tggttataat 1440

gctttaactg gtcaatatga agatttagtt gcttctggta tcttagatcc agctaaagtt 1500

gttagatctg ctttacaaga tgctgcttct gttgcttctt taatcttaac tactgaagtt 1560

ttagttgttg atcaacctga accagaacca gctatgcctg ctggtggtga tatgggtggt 1620

atgggtggta tgggtatgcc tggtatgggt ggtatgggta tgatgtaa 1668

<210> 7

<211> 1635

<212> DNA

<213> Synechococcus elongatus

<400> 7

atggctaaaa gaatcatcta taatgaaaat gctagaagag ctttagaaaa aggtatcgat 60

atcttagctg aagctgttgc tgttacttta ggtccaaaag gtagaaatgt cgtcttagaa 120

aagaaatttg gtgcaccaca aattatcaat gatggtgtta ctatcgctaa agaaatcgaa 180

ttagaagatc atatcgaaaa tactggtgtt gctttaatca gacaagcagc ttcaaaaaca 240

aatgatgctg ctggtgatgg tactactact gctactgttt tagctcatgc tgttgtcaaa 300

gaaggtttaa gaaatgttgc tgctggtgct aatgctatct tattaaaaag aggtatcgat 360

aaagctacaa attttcttgt cgaacaaatt aaatcacatg ctcgtccagt cgaagattct 420

aaatctatcg cacaagttgg tgcaatctct gctggtaatg attttgaagt tggtcaaatg 480

atcgctgatg ctatggataa agttggtaaa gaaggtgtta tctctttaga agaaggtaaa 540

tctatgacta ctgaattaga agttactgaa ggtatgcgtt ttgataaagg ttatatctct 600

ccatattttg ctactgatac tgaaagaatg gaagccgtct ttgatgaacc atttatctta 660

atcactgata aaaaaatcgg attagttcaa gatcttgtcc cagttttaga acaagttgct 720

agagctggta gaccattagt tattatcgca gaagatatcg aaaaagaagc tttagctact 780

ttagttgtta atagattaag aggtgtctta aatgttgcag ctgtcaaagc tccaggtttt 840

ggtgatagaa gaaaagctat gttagaagat atcgctgttc ttacaggtgg tcaacttatc 900

acagaagatg ctggtttaaa attagatact actaaattag atcaattagg taaagctaga 960

agaatcacta tcactaaaga taatactact atcgttgctg aaggtaatga agctgctgtt 1020

aaagctagag tcgatcaaat tagaaggcaa attgaagaaa cagaaagctc ttatgataaa 1080

gaaaagttac aagaaagatt agctaaatta tctggtggtg tcgcagttgt caaagttggt 1140

gctgctactg aaactgaaat gaaagataga aaattaagat tagaagatgc tatcaatgct 1200

actaaagctg ctgttgaaga aggtatcgtt ccaggtggtg gtactacttt agctcattta 1260

gctccacaat tagaagaatg ggcaactgct aatttatctg gtgaagaatt aactggtgct 1320

caaatcgttg ctagagcttt aactgctcca ttaaaaagaa tcgctgaaaa tgctggttta 1380

aatggtgctg ttatctctga aagagtcaaa gaattaccat ttgatgaagg ttatgatgca 1440

tcaaataatc aatttgttaa tatgtttact gctggtattg ttgatccagc taaagttaca 1500

agatcagctt tacaaaatgc tgcttctatc gctgctatgg ttttaactac tgaatgtatc 1560

gttgttgata aaccagaacc aaaagaaaaa gctccagctg gtgctggtgg tggtatgggt 1620

gattttgatt attaa 1635

Claims

1.一种转化的真核细胞，其特征在于所述真核细胞含有：

2.根据权利要求1所述的真核细胞，其特征在于所述伴侣蛋白RbcX是蓝细菌伴侣蛋白。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的真核细胞，其特征在于通用伴侣蛋白GroES和GroEL中的至少一种既不来自蓝细菌又不来自表达RuBisCO复合物的另一种细菌。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的真核细胞，其特征在于这三个表达盒形成连续的遗传信息块。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的真核细胞，其特征在于这三种伴侣蛋白的表达盒是由单个附加体遗传元件携带的。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的真核细胞，其特征在于所述真核细胞还包含至少一个除所述伴侣蛋白以外的异源蛋白的表达盒，或者其特征在于所述真核细胞已进行序列工程化来改变内源蛋白的表达水平和/或序列。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的真核细胞，其特征在于所述真核细胞不含编码细菌I型RuBisCO酶的RbcL或RbcS亚基的序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的细胞，其特征在于所述细胞为酵母，优选选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。

9.一种能够表达伴侣蛋白RbcX以及伴侣蛋白GroES和GroEL的表达盒的组合的用途，其用于改进真核细胞的生理学。

10.根据权利要求9所述的用途，其用于改进酵母菌株的生理学。

11.根据权利要求9或10所述的用途，其用于改进真核细胞的生理学，所述真核细胞包含至少一个除所述伴侣蛋白以外的异源蛋白的表达盒，或已进行序列工程化来改变内源蛋白的表达水平和/或序列。

12.根据权利要求8至11中任一项所述的用途，其用于提高所述真核细胞的生长速率。

13.根据权利要求8至12中任一项所述的用途，其用于提高所述真核细胞对环境应激的抗性。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述环境应激是由于所述真核细胞的培养基中存在的成分的毒性所产生的。

15.根据权利要求8至14中任一项所述的用途，其用于提高所述细胞对由所述真核细胞合成的化合物的毒性的抗性。

16.根据权利要求1至8中任一项所述的真核细胞的用途，其用于生产重组蛋白。

17.一种生产至少一种选自化学分子和蛋白的化合物的生物技术方法，其特征在于所述方法包括在使得根据权利要求1至8中任一项所述的真核细胞能够合成所述化合物的条件下培养所述真核细胞的步骤，和任选地收集所述化合物的步骤。

18.一种生产重组蛋白的方法，其包括(i)将编码所述蛋白的序列插入到表达RbcX、GroES和GroEL的真核细胞中，(ii)在使得所述序列能够表达的条件下培养所述细胞，以及任选地(iii)收集或纯化所述蛋白。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于所述蛋白是酶。

20.根据权利要求17或18所述的方法，其特征在于所述蛋白是激素。