CN107212029A - 仙鹤草提取物在制备用于去除番茄植株中植物病毒的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用仙鹤草提取物去除番茄植株中植物病毒的方法。针对当前生产上尚未有去除植物体内病毒的有效方法来实现病毒病治疗的问题，利用仙鹤草提取物处理番茄植株，可去除番茄植株中番茄黄化曲叶病毒，有利于植物病毒病的治疗。仙鹤草乙醇提取物通过如下方法制备：用万能粉碎机将中药仙鹤草粉碎，称取200g干粉放入1000mL三角瓶中，加入75％乙醇500mL，在室温下浸提14天，过滤，用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩，蒸掉酒精，得中药提取物并干燥，后溶解于25mL丙酮中，仙鹤草乙醇提取物的原始浓度按以下公式来表示：浓度＝药材干重/终体积，按此计算，仙鹤草的原始浓度均为8g/mL，提取液保存于4℃冰箱中备用，即得。
Description
一、技术领域
本发明属于病虫害防治技术领域，具体涉及仙鹤草提取物在制备用于去除番茄植株中植物病毒的药物中的应用。
二、技术背景
对于植物病毒病的防控，主要采取利用抗病品种、用病毒拮抗剂控制病毒等手段，由媒介昆虫传播的植物病毒病，还可通过化学或物理手段控制传毒介体来控制病害。关于病毒拮抗剂，主要通过抑制病毒侵染、抑制病毒增殖和转运、抑制病毒症状表达、诱导植物抗病性等达到控制病毒病的目的，对于植物体内已经存在的病毒如何清除，尚未见相关研究报道。也因此，当前生产上对于病毒病仍以防为主，对于已经发生的植物病毒病，常无有效治疗手段。发掘有效去除植物体内病毒的方法对于病毒病的治理至关重要。
番茄黄化曲叶病毒属双生病毒科Geminiviridae菜豆金色花叶病毒属Begomovirus病毒，为单链环状DNA病毒，由烟粉虱传播。烟粉虱入侵性强，也因此已造成了番茄黄化曲叶病毒病在亚洲、非洲、美洲等地区多个国家的流行，在我国，番茄黄化曲叶病已蔓延到江苏、浙江、云南等大多数省份，造成番茄大面积减产和品质下降。
从自然界中寻找抗植物病毒活性物质是获取抗病毒药物的重要途径。植物源提取物来源丰富，已发现一些植物源提取物对植物病毒的拮抗作用，如丁香酚可对番茄黄化曲叶病毒有拮抗作用，但植物源提取物能否去除植物体内的病毒，尚不清楚。仙鹤草Agrimonia pilosa Ledeb.是一种蔷薇科多年生草本植物，在我国很多地区有分布，其在医学上具有抗肿瘤、抗炎镇痛、降血糖、降血压和增强机体免疫功能等多种作用，是一种用途较广的中药。关于仙鹤草提取物在农业上的作用，已发现其可提高昆虫寄生蜂的寄生能力和耐药性，也可提高蜘蛛对害虫的捕食能力(已获发明专利)。研究仙鹤草提取物对番茄植株中番茄黄化曲叶病毒的影响，以期望开发应用仙鹤草提取物作为去除番茄植株中植物病毒的药物，从而能实现病毒病的治疗，在植物病毒病防控方面发挥作用。
三、发明内容
1、发明目的
提供一种利用仙鹤草提取物制备去除番茄植株中植物病毒药物的方法，能完全去除一些番茄植株内番茄黄化曲叶病毒，也可降低未完全去除病毒番茄植株中植物病毒的含量，此将为番茄黄化曲叶病的治疗打开通道。
2、技术方案
本发明为一种番茄植株中植物病毒的去除方法，其特征在于利用仙鹤草乙醇提取物去除番茄植株中番茄黄化曲叶病毒的方法。
3、有益效果
本发明的方法与现有技术相比，产生以下有益效果：(1)与常规的病毒拮抗剂通过抑制病毒增殖等控制番茄黄化曲叶病相比，本发明通过有效去除番茄植株中植物病毒来控制病毒病，可实现病毒病的直接治疗；(2)与化学药剂防治病毒病相比，本发明利用仙鹤草乙醇提取物进行控制，可切实提高病毒病控制的无公害控制水平，有效减少环境污染。
四、具体实施方式
本发明的实施例是采用室内测定的方法。
测定方法如下：
1、番茄植株上接种病毒
带毒烟粉虱接入健康番茄植株苗，每10盆即10株苗为一个重复(放在同一养虫笼内)，接入刚羽化且携带番茄黄化曲叶病毒的烟粉虱30头，在接虫7天后，将烟粉虱移出，番茄植株用于后面的处理。
2、仙鹤草的乙醇提取
用万能粉碎机将中药仙鹤草粉碎，称取200g干粉放入1000mL三角瓶中，加入75％乙醇500mL，在室温下浸提14天，过滤，用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩，蒸掉酒精，得中药提取物并干燥，后溶解于25mL丙酮中，仙鹤草乙醇提取物的原始浓度按以下公式来表示：浓度＝药材干重/终体积，按此计算，仙鹤草的原始浓度均为8g/mL，提取液保存于4℃冰箱中备用。
3、仙鹤草乙醇提取物处理番茄苗
灌根处理经烟粉虱传毒的番茄苗，处理分3种，分别为0.1g/mL仙鹤草乙醇提取物处理、发病清水对照(即接入带毒烟粉虱)和未发病清水对照(即未接入带毒烟粉虱)，每株苗灌根处理用20ml药液或清水。灌根处理后，将苗放在养虫笼中，相同处理每10株(盆)苗放一养虫笼。每处理重复4组共40株苗，每株苗均进行编号。番茄苗用于观察生长和发病状况以及病毒的定性和定量检测。实验在放有植物生长灯的室内进行，温度为27℃，每天光照时间为14h。
4、番茄植株DNA的提取
分别在处理前、处理后不同时间进行取样，每次每处理取每株上部叶片各一片，放入冰箱-20℃内，用于番茄黄化曲叶病毒的检测。病毒的定性分析样品按单株叶片单独进行DNA提取，在处理后一个月和两个月分别取样；定量检测按每重复即10株为一组进行DNA提取，分别在处理后6周和10周进行取样。
DNA提取：在1.5ml的离心管中加入样品和20μL的DNA碱裂解液(50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1％SDS)，充分研磨。加1μL蛋白酶K(20mg/ml)，离心30秒，60℃水浴1小时，追加1μL蛋白酶K，离心30s，继续水浴2小时，加178μL的双蒸水，100℃水浴5min，灭活蛋白酶K。取100μL提取液于另一离心管中，加2倍体积的预冷无水乙醇，充分混匀，4℃冰箱沉淀过夜后4℃13000rpm离心10分钟，倒出乙醇，晾干后加20μL的双蒸水溶解DNA，-20℃保存。
5、番茄植株中番茄黄化曲叶病毒的定性检测
定性检测番茄黄化曲叶病毒的特异性引物为：
TV_P833(5’-GGTCTACACGCTTACGCCTTATT-3’)
PATY_R(5’-TTCCATCCGAACATTCAGGCAGC-3’)
扩增片段大约为800bp左右。PCR的反应体系为10μL，包含5μLmix(100mM KCl，20mMTris-HCl，3mM MgCl2，400μM dNTPs，溴酚蓝)，0.2μL taq酶(5U/μL)，0.5μL引物TV_P833，0.5μL引物PATY_R，3.2μL H2O，0.6μLDNA模板。PCR参数为：95℃预变性5min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，35个循环，循环结束后72℃延伸20min。PCR产物进行电泳和克隆测序，明确其病毒种类。记录各处理携带病毒的番茄植株数，计算病毒携带率。
6、番茄植株中番茄黄化曲叶病毒的定量检测
番茄黄化曲叶病毒基因组1462(+)至1601(-)片段的拷贝数通过ABI StepOne荧光定量PCR仪来测定，用于扩增番茄黄化曲叶病毒基因组1462(+)至1601(-)片段的引物为：
(YG3)5’-GAGTTCCCCTGTGCGTGAA-3’
(YG5)5’-CTGTTCGCAAGTATCAATCAAGGT-3’
反应体系为：Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(Takara)，引物各0.6μL，Reference Dye II 0.4μL，DNA 1μL和ddH2O 7.4μL。
扩增程序：52℃ 2min，95℃ 1min，40个循环：95℃ r 5s，60℃ 30s，72℃。
7、数据分析
用统计分析软件SPSS17.0对番茄植株中番茄黄化曲叶病毒感染率和含量均采用t检验法进行处理与对照间的差异显著性分析。
五、实施效果：
1、仙鹤草乙醇提取物对番茄植株内番茄黄化曲叶病毒感染率的影响
对仙鹤草乙醇提取物处理番茄植株中番茄黄化曲叶病毒感染率的分析表明，在处理前，仙鹤草乙醇提取物和对照组番茄苗的番茄黄化曲叶病毒感染率分别为95％和90％，无显著差异(t＝1，P＝0.3559)；处理一个月后，仙鹤草乙醇提取物和对照组番茄黄化曲叶病毒感染率分别为60％和87.5％，处理组也未显著高于对照组(t＝2.2，P＝0.0701)；处理两个月后，处理组病毒感染率进一步下降，仙鹤草乙醇提取物处理组感染率为42.5％，而此时对照组番茄黄化曲叶病毒感染率高达97.5％，处理组显著低于对照组(t＝6.96，P＝0.0004)，表明仙鹤草乙醇提取物处理有效去除了部分番茄植株内番茄黄化曲叶病毒。
2、仙鹤草乙醇提取物对番茄植株中番茄黄化曲叶病毒含量的影响
对仙鹤草乙醇提取物处理番茄植株中番茄黄化曲叶病毒含量的分析表明，处理6周后，仙鹤草乙醇提取物处理组番茄植株内番茄黄化曲叶病毒含量显著低于对照组(t＝3.95，P＝0.0168)；处理10周后，病毒量仍显著低于对照(t＝3.3，P＝0.0298)，表明仙鹤草乙醇提取物处理有效降低了番茄植株内番茄黄化曲叶病毒的含量。
Claims (1)
1.仙鹤草提取物在制备用于去除番茄植株中植物病毒的药物中的应用，其中所述的仙鹤草乙醇提取物通过如下方法制备：用万能粉碎机将中药仙鹤草粉碎，称取200g干粉放入1000mL三角瓶中，加入75％乙醇500mL，在室温下浸提14天，过滤，用旋转蒸发仪在水浴中减压浓缩，蒸掉酒精，得中药提取物并干燥，后溶解于25mL丙酮中，仙鹤草乙醇提取物的原始浓度按以下公式来表示：浓度＝药材干重/终体积，按此计算，仙鹤草的原始浓度均为8g/mL，提取液保存于4℃冰箱中备用，即得。
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