CN107200769A

CN107200769A - 一种具有防治肿瘤转移作用的救必应酸衍生物

Info

Publication number: CN107200769A
Application number: CN201710514649.9A
Authority: CN
Inventors: 南敏伦; 赫玉芳; 王雪; 赵昱玮; 何忠梅; 赵全成
Original assignee: First Clinical Hospital of Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: First Clinical Hospital of Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2017-09-26
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: CN107200769B

Abstract

本发明提供了一种救必应酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。通过体外实验表明，本发明的救必应酸衍生物对肿瘤细胞的增殖、粘附、迁移等具有显著的抑制作用；且对人体正常细胞安全低毒。体内动物实验表明，其可有效减少小鼠B16‑F10黑色素瘤的实验性肺转移，提示其具有较好的抗肿瘤转移作用。本发明的救必应酸衍生物可应用于肿瘤转移的预防药物中，开拓了救必应酸衍生物在肿瘤预防和治疗的新用途，为开发肿瘤转移的新生药物而预防恶性肿瘤的术后再转移提供了新的选择。且本发明衍生物较救必应酸具有更明显的药理活性。

Description

一种具有防治肿瘤转移作用的救必应酸衍生物

技术领域

本发明涉及预防恶性肿瘤术后转移的药物，具体地说是救必应酸衍生物在预防和治疗肿瘤转移药物中的应用，属于医药领域。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一，肿瘤患者死亡原因大多为恶性肿瘤晚期转移所致。肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发瘤游离，向周围组织浸润、侵袭进入循环系统并随之在体内转移，并且与内皮细胞粘附浸润形成转移瘤等过程。肿瘤转移是肿瘤难以治愈和复发的主要原因之一，也是导致肿瘤患者死亡的关键因素。临床诊断结果显示，约60％以上的初诊肿瘤患者已经发生转移，其5年生存率不到20％。目前，只有极少数的肿瘤转移患者能够通过手术进行有效治疗，而其他临床治疗方式效果非常有限。因此，肿瘤转移的防治面临着非常严峻的挑战，如何阻断肿瘤的浸润转移是提高肿瘤治疗水平及治愈肿瘤的关键。

目前临床使用抗肿瘤药物绝大数为化疗药物，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上，抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，又杀伤正常组织的细胞，尤其是杀伤人体中生长发育旺盛的血液、淋巴组织细胞等，而这些细胞与组织是人体重要的免疫防御系统，破坏了人体的免疫系统，癌症就可能迅速发展，造成严重后果。化疗药物大多缺乏选择性，体内分布广泛，易引发毒副作用，导致患者不能耐受，降低药物疗效。因此，近年来人们一直致力于新型抗肿瘤药物的研究，其中有效抑制肿瘤细胞转移的药物是一个新的药物开发方向。

救必应酸主要存在于中药救必应(Ilicis routundae cortex)中，具有广泛的药理作用，如抗癌、保肝、抗炎、抗病毒、抗氧化等。近些年来，救必应酸尤以其低毒高效的特点及多样化的抗癌作用机制日益受到人们重视，显示出较大的临床应用潜力和良好的应用前景。但是救必应酸难溶于水，导致其制剂制备困难和体内生物利用低等问题，因此通过对救必应酸的结构进行修饰，以提高难溶性救必应酸的溶解度，从而进一步提高其抗癌活性，并有效改善其生物利用度，正日益成为科研工作者研究的热点和难点。

我们的研究已经证明了救必应酸具有预防和治疗心脑血管疾病的药理活性(专利公开号：CN101856357A)，同时具有降血脂等药理作用(专利公开号：CN101849950A)；另外，本发明人研究证明了救必应酸氨基酸衍生物具有抗肿瘤的作用(专利公开号：CN102391352B)；救必应酸酰化衍生物具有抗肿瘤的作用(专利公开号：CN102127142B)；本发明人还研究证明了救必应酸与丁二酸酐反应生成的衍生物具有防治心血管疾病的作用(专利公开号：CN102140126B)。这些救必应酸衍生物相对救必应酸母体本身，虽对肿瘤细胞抗癌活性有一定的提高，但未涉及对正常细胞毒性及其在抗肿瘤转移方面的研究；本课题组在前期研究的基础上发现了本发明的化合物，可明显改善救必应酸的溶解度，化合物理化性质稳定；此外跟救必应酸相比，其对不同种类肿瘤细胞均具有更显著的增殖抑制作用，且对正常细胞毒性较低，提示其具有安全、高效和低毒的特点，可望将其应用于肿瘤转移的早期预防和治疗中。鉴于此，以本发明救必应酸衍生物为研究对象，探讨其在预防和治疗肿瘤转移方面的应用。发明者合成的救必应酸衍生物其主要优势在于：

1)本发明衍生物可进一步改善救必应酸的溶解度，在理化性质和成药性方面具有更好的优点；

2)本发明衍生物对各种肿瘤细胞的抗癌活性明显优于救必应酸母体，对正常细胞安全低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤转移候选药物。因此，发明者将本发明衍生物应用于预防和治疗肿瘤转移药物研究，并通过体内外实验探讨本发明衍生物预防和治疗肿瘤转移的作用及机制。

在本发明完成之前，除本发明人研究外，还没有文献报道救必应酸的衍生物具有预防和治疗肿瘤转移的作用，也未发现救必应酸的衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移药物应用的报道。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术的缺陷，提供了救必应酸衍生物在预防和治疗肿瘤转移药物中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现：

一种具有预防和治疗肿瘤转移作用的救必应酸衍生物，其结构式如下：

如上所述的一种具有预防和治疗肿瘤转移作用的救必应酸衍生物由以下方法得到：

1、乙醇提取中药救必应(Ilicis routundae cortex)，经纯化、分离、碱降解而获得的救必应酸。

2、救必应酸溶解于DMF中，在无水碳酸钾的催化下，与1,2-二氯乙烷反应，进行硅胶柱分离，得到化合物救必应酸-(2-氯)乙酯。

3、取化合物救必应酸-(2-氯)乙酯溶于DMF中，加入无水碳酸钾、碘化钾作、三乙胺为催化剂，与六水合哌嗪反应，硅胶柱分离，得到化合物救必应酸-(2-哌嗪)乙酯。

取化合物救必应酸-(2-哌嗪)乙酯，溶于干燥的二氯甲烷中，加入吡啶甲酸、EDC·HCL、HOBT，室温反应，硅胶柱分离，得到本发明衍生物。

本发明衍生物实验数据为：分子量：705.97，白色粉末，分子式为C₄₂H₆₃N₃O₆；¹H NMR(400MHz,DMSO)δ:8.58-8.56(1H)，7.95-7.89(1H)，7.56-7.54(1H)，7.50-7.45(1H)，5.16(1H，12-CH)，4.42-4.38(1H，19-OH)，4.16-4.14(1H，3-OH)，4.00(2H，1'-CH₂)，3.86(1H，23-OH)，3.62(2H，哌嗪，N-CH₂)，3.47-3.35(2H，哌嗪，N-CH₂)，3.31-3.30(2H，3-CH，23-CH₂)，3.09-3.04(1H，23-CH₂)，2.59-2.55(5H，11-CH₂，哌嗪，N-CH₂)，2.44-2.39(3H，2'-CH₂，18-CH)，1.99-1.37(14H)，1.29(3H，30-CH₃)，1.24-1.13(5H)，1.08(3H，27-CH₃)，0.93-0.91(1H)，0.85-0.83(6H，24-CH₃，29-CH₃)，0.61(3H，26-CH₃)，0.53(3H，25-CH₃)；¹³C NMR(100MHz,DMSO)δ:176.83(C-28)，166.55(C-1″)，154.00(C-2″)，148.30(C-3″)，138.32(C-13)，137.29(C-5″)，127.24(C-12)，124.51(C-4″)，123.09(C-6″)，71.64(C-03)，70.50(C-19)，64.66(C-23)，61.53(C-1')，55.65(C-2')，53.29(C-18)，52.98(哌嗪，N-C，重叠)，52.43(哌嗪，N-C，重叠)，47.43(C-05)，46.68(C-09)，46.53(C-17)，41.83(C-20)，41.60(C-14)，41.37(C-08)，41.10(C-01)，38.02(C-04)，37.16(C-22)，36.24(C-10)，32.24(C-07)，27.97(C-15)，26.55(C-21)，26.35(C-29)，25.82(C-02)，25.12(C-16)，24.04(C-27)，23.14(C-11)，17.56(C-06)，16.51(C-25)，16.19(C-26)，15.43(C-30)，12.58(C-24)。

本发明救必应酸衍生物具有预防和治疗肿瘤转移的作用，肿瘤包括但不限于肝癌、黑色素瘤。

以上所述的一种具有预防和治疗肿瘤转移作用的救必应酸衍生物，可用于制备在预防和治疗肿瘤转移的药物，所制成的制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、丸剂、注射剂等剂型。

本发明的特点为：对从救必应中提取的救必应酸为先导化合物进行化学修饰，得到本发明衍生物，经药理实验证明，具有对肿瘤细胞的转移具有明显的抑制作用，且活性明显优于母体化合物救必应酸。也是首次将救必应酸及救必应酸衍生物用于预防和治疗肿瘤转移方面的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明衍生物可进一步改善救必应酸的溶解度，在理化性质和成药性方面具有更好的优点；

(2)本发明救必应酸衍生物对肿瘤细胞的抑制作用有较好的选择性，对正常细胞安全低毒，是一种潜在的高效低毒的抗肿瘤转移药。

(3)本发明救必应酸衍生物能抑制肿瘤细胞对细胞外基质及人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的粘附。

(4)本发明救必应酸衍生物能抑制肿瘤细胞的运动迁移能力。

(5)本发明救必应酸衍生物能防治小鼠B16-F10黑色素瘤发生肺部转移。

具体实施方式

下面结合实例，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1救必应酸及衍生物对肝癌细胞HepG2的增殖抑制及对正常肝细胞LO2毒性的研究

将处于对数生长期肝癌细胞HepG2和人正常肝细胞LO2消化后，细胞密度调整为1×10⁵个/mL，接种于96孔板，每孔100μL，置37℃，5％CO₂培养箱中培养24h；移去旧的培养基，加入受试药物(救必应酸及衍生物)用培养基将受试药物存储液稀释，设定不同的浓度，每孔100μL，另设空白对照组，每组设5个复孔。药物作用24h后，吸弃含药培养基，于每孔中加入无血清无酚红培养基100μL，再加入0.5mg/mL MTT的溶液100μL，继续孵育4h后，终止培养；吸弃96孔板孔内上清液，每孔加入100μL DSMO，振荡10min，于570nm波长处在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，计算细胞成活率(％)＝(用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％。实验结果见表1。

表1救必应酸及衍生物对HepG2的增殖抑制及对LO2毒性实验结果

实验结果表明本发明衍生物对肝癌细胞HepG2具有显著的抑制增殖作用，且具有剂量依懒性，而救必应酸本身效果不明显；低浓度的(0.25-5μM)本发明衍生物对肝癌细胞HepG2作用24h后的具有一定的增殖抑制作用，其抑制率为9.6％-61.8％；该浓度范围的LO2细胞的存活率均大于89％，对正常肝细胞LO2毒性较小。而随着本发明衍生物浓度的升高，化合物对肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用及对正常肝细胞LO2的毒性均显著的增强。在0.25-5μM浓度范围内，本发明衍生物的抗癌活性明显高于救必应酸本身，且本发明衍生物较救必应酸对正常细胞的毒性更低，兼具安全低毒的特点。

实施例2救必应酸及衍生物抑制肝癌细胞HepG2对细胞外基质的粘附作用

将保存于-20℃的纤粘蛋白FN(fibronectin)静置于37℃水浴至完全融解，用无血清培养液，配置成为浓度为10μg/ml的FN工作液。使用100μL/孔FN工作液完全覆盖于96孔板，室温放置过夜，轻轻吸去液体。取对数生长期HepG2细胞，制成单细胞悬液，细胞浓度为5×10⁵/ml，与不同浓度的药物(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μM)混合，接种于FN包被的96孔板中。37℃，5％CO2孵育2h后，PBS轻洗3遍，控干后加入MTT的培养液10μl，继续孵育4h，弃上清，加入100μl DMSO，溶解后使用酶联检测仪检测570nm处的OD值。

粘附抑制率(％)＝(1-用药组平均OD值/空白对照组平均OD值)×100％。

表2救必应酸及衍生物抑制肝癌细胞HepG2对细胞外基质的粘附作用

结果显示本发明衍生物能明显抑制人肝癌细胞HepG2对FN胶的粘附能力，抑制率为4.9％-51.4％，具有剂量依赖性；而救必应酸仅5μM组的抑制效果(17.6％)与对照组比较存在显著性差异。

实施例3救必应酸及衍生物抑制肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞的粘附实验

人脐静脉内皮细胞分离自正常妊辰分娩的脐带静脉，进行培养。将处于对数期的HUVEC细胞消化后接种于24孔板，待上述24孔板的内皮细胞长满孔板时，用PBS清洗两三次，然后加入含有内皮刺激因子IL-1β，浓度为1ng/L的培养基，在37℃，5％CO2的条件下孵育4h。4h后取出孔板，用PBS清洗两三次后，取对数生长期HepG2细胞，荧光标记后制成4×10⁵/ml^-1单细胞悬液，并加入不同浓度本发明衍生物的RPM-1640培养液，药物终浓度分别为：0、0.25、0.2、1.0、2.5、5.0μM，每孔500μl。37℃、5％CO2孵育2h后，PBS轻洗3遍，控干后加入无血清培养液500μl。然后在荧光显微镜下进行拍照，随机拍取10个视眼后并记录每个视眼的细胞数，计算不同浓度的救必应酸及其衍生物对内皮细胞粘附抑制率。

粘附率(％)＝(用药组平均细胞数/空白对照组平均细胞数)×100％。

表3救必应酸及衍生物抑制肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞的粘附实验

由表3可知，与对照组比较，0.25-5μM的本发明衍生物对肝癌HepG2细胞与HUVEC细胞的粘附的抑制率分别为9.3％，19.8％、34.3％、49.2％、55.2％，差异显著。而0.25-5μM的救必应酸对肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞粘附的抑制作用不明显；5μM的救必应酸对肝癌细胞HepG2与HUVEC细胞粘附的抑制率仅为13.5％。

实施例4救必应酸及衍生物对人肝癌细胞HepG2迁移的影响

选取对数生长期的HepG2细胞，经胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度为2×10⁵/ml，以2ml/孔接种于6孔板中，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养12h，细胞单层铺满孔板时；PBS轻洗3遍，分别加入救必应酸和衍生物(0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0μM)测定距离，培养24h后，测定迁移距离。实验重复三次计算细胞迁移率。

细胞迁移率＝(用药组0h平均距离-用药组24h平均距离)/(对照组0h平均距离-对照组24h平均距离)×100％

表4救必应酸及衍生物对人肝癌细胞HepG2迁移的影响

实验结果结果表明：与对照组相比，5μM的救必应酸对肝癌细胞的迁移抑制率为18.5％，对肝癌细胞HepG2的迁移抑制作用不明显。不同浓度的本发明组合物对肝癌细胞HepG2的迁移抑制作用具有剂量依赖性，随着浓度的增加，HepG2细胞的迁移率显著降低；5μM的本发明衍生物对肝癌HepG2细胞作用24h后，细胞的迁移抑制率高达60.5％。

实例5救必应酸及衍生物对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞人工肺转移瘤形成的抑制作用

取对数生长期B16-F10细胞，PBS缓冲液调整细胞浓度至1×10个ml^-1。C57/BL6小鼠尾静脉注射，每只0.2ml。随机分为生理盐水组、实验组共5组，每组8只。对照组给予生理盐水，本发明衍生物分为低中高三个剂量组，给药剂量为10mg·kg^-1、20mg·kg^-1、40mg·kg^-1，救必应酸(40mg·kg^-1)组。肿瘤接种后次日采用灌胃方式给药，每只一次给药0.2ml，每天1次，连续给药21d。于给药结束后次日脱颈椎处死小鼠，取肺，福尔马林固定液固定，解剖显微镜下计数肺转移瘤灶数，按下式计算抑制率。

抑制率＝(1-给药组平均转移瘤灶数/生理盐水组平均转移瘤灶数)×100

表5救必应酸及衍生物对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞人工肺转移瘤形成的抑制作用

实验结果表明，不同剂量的本发明衍生物给药后，与生理盐水组比较，可以不同程度的抑制肺转移灶的形成；本发明衍生物高剂量用药组对B16-F10细胞的肺转移抑制率高达63.6％；而同剂量组的救必应酸用药组，抑制率仅为19.0％，细胞的肺转移无明显的抑制作用。

Claims

1.一种救必应酸衍生物，其结构特征为：

2.根据权利要求1所述的救必应酸衍生物在制备预防和治疗肿瘤转移的药物中的应用。