CN107200767A

CN107200767A - 一种降血糖活性成分科罗索酸的制备方法

Info

Publication number: CN107200767A
Application number: CN201710135073.5A
Authority: CN
Inventors: 邹亲朋; 戴玲; 刘向前
Original assignee: Changsha Broad Ocean Bio Science and Technique Co Ltd
Current assignee: Changsha Broad Ocean Bio Science and Technique Co Ltd
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2017-09-26

Abstract

本发明公开了一种从吴茱萸五加中分离制备降血糖活性成分科罗索酸的方法，包括(1)吴茱萸五加粉碎后用超声提取的方法得到提取液，浓缩提取液得到浸膏；(2)浸膏溶于氢氧化钠溶液中，除去不溶物，溶液经酸中和后，乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩回收溶剂，得到粗提物；(3)将上述粗提物采用高速逆流色谱法分离，紫外检测器在线检测，收集馏分减压浓缩，结晶，干燥，得到科罗索酸。采用本发明制备科罗索酸，提取率高，操作过程简单，能耗低，无污染，回收率高，品质好，保护生理活性物质的活性等优点，易于产业化放大。

Description

一种降血糖活性成分科罗索酸的制备方法

技术领域

本发明属于天然有机化学领域，涉及一种降血糖活性成分植物胰岛素科罗索酸的制备方法。

背景技术

科罗索酸(corosolic acid)，2α-羟基熊果酸，商品名称：植物胰岛素，是存在于大叶紫薇、枇杷、金莲花等植物中的三萜类化合物。科罗索酸为白色无定型粉末，可溶于石油醚、苯、氯仿等有机溶剂，不溶于水，可溶于热乙醇、甲醇。在无水条件下与强酸(硫酸、磷酸、高氯酸)、中强酸(三氯乙酸)或Lewis氏酸(氯化锌、三氯化铝、三氯化锑)作用，会出现颜色反应或荧光。科罗索酸属于α-香树酯醇型或乌苏烷型五环三萜类化合物，其基本骨架为多氢蒎的五环母核。科罗索酸在植物体内可游离存在，也可以皂苷的形式存在。在植物体内，常常与其同分异构体山楂酸共同存在，结构和化学性质相似，分离较难。科罗索酸结构式如下：

科罗索酸具有很强的生物活性，包括降血糖等。科罗索酸已进入美国食品和药物管理局的III期临床药效学评价，作为食品补充剂已在国外得到认可，在食品、保健品等工业中具有较好的发展前景。科罗索酸的来源主要是从天然植物提取和有机合成。鞠建华等将枇杷叶采用95％的乙醇回流提取获得乙醇提取物，后经萃取、洗脱、低压柱色谱分离得到科罗索酸。陈龙胜等研究了乙醇提取枇杷叶中科罗索酸的提取工艺。纵伟等从大叶紫薇叶中，采用薄层色谱分离方法得到科罗索酸。目前科罗索酸的分离制备往往采用反复柱层析等手段，缺乏快速、简便的方法，限制了其应用。

中国专利申请200710009556.7，陈剑锋等报道了从枇杷叶中分离制备科罗索酸的方法，其做法是：采用80～100％亲水性有机溶剂水溶液，于50～80℃提取总三萜酸，在碱性条件下，趁热过滤除杂和活性炭脱色，枇杷叶提取液采用大孔吸附树脂富集纯化科罗索酸，活性炭脱色过程科罗索酸损失率较大，枇杷叶提取液粘度和水溶性杂质含量很高，严重限制了大孔吸附树脂对科罗索酸的吸附量和选择性，导致科罗索酸总收率较小、生产总成本居高不下、制备的科罗索酸纯度偏低。

中国专利200810071064.5，陈剑锋报道了从植物中提制科罗索酸的方法，其包括水溶性物质的水煮除杂、总三萜酸的碱性有机溶剂提取和科罗索酸的大孔吸附树脂富集纯化步骤，该方法中的大孔吸附树脂色谱法同样存在科罗索酸总收率较小、生产总成本高等问题。

高速逆流色谱法(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)是近几十年来发展起来的液-液色谱分离技术，利用溶质在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同，将不同物质进行有效分离。此项技术不需要固相载体，只需要被分离物在两相中分配，避免了固相载体带来的大量样品吸附、损失与污染等问题，样品回收率高，预处理及后处理都简单易行，已广泛应用于分离。与其它分离方法相比，它不使用固相载体作固定相，能采用不同的溶剂系统和正反相洗脱方式，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。HSCCC可采用不同物化特性的溶剂体系和多样性的操作条件，具有较强的适应性，为从复杂的天然产物粗制品中提取不同特性(如不同极性)的有效成分提供了有利条件。

发明内容

针对以上问题，本发明的目的在于提供一种操作简单，溶剂用量少，无样品吸附、损失和污染，效率高的科罗索酸的制备方法。

本发明采用如下技术方案：

一种降血糖活性成分科罗索酸的分离制备方法，其特征在于，所述的方法具体步骤如下：

(1)将吴茱萸五加粉碎，按照液料比1∶5-15的比例加入溶剂，超声提取，浓缩提取液，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于氢氧化钠溶液中，除去不溶物，溶液经酸中和后，乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩回收溶剂，得到粗提物；

(3)将上述粗提物采用高速逆流色谱法分离。高速逆流色谱的两相溶剂系统由烷烃、脂肪酯或醚、脂肪醇或脂肪酮和水体积比3-6∶3-7∶4-8∶4-6组成，将两相溶剂系统按比例混匀静置后，分开上下相，超声，选择其中一相作为固定相，另一相作为流动相，将固定相泵入管路，待充满整个管路后，停泵，启动主机，然后以一定速度泵入流动相，当上下相平衡时，取步骤(2)制备的粗提物，溶解于固定相中，进样，紫外检测器在线检测，收集馏分减压浓缩，结晶，干燥，得到科罗索酸。

步骤(1)中所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、水或者其混合物。

吴茱萸五加为吴茱萸五加的干燥根、茎、叶子或其混合物。

吴茱萸五加为吴茱萸五加的干燥叶子。

步骤(3)中所述的烷烃为正己烷或环己烷，所述的脂肪酯为乙酸乙酯或乙酸甲酯，所述的醚为乙醚或石油醚，所述的脂肪醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；所述的脂肪酮为丙酮。

步骤(3)中两相溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水3-6∶3-7∶4-8∶4-6比例组成。

步骤(3)中两相溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水4∶5∶5.5∶6比例组成。

步骤(3)中的高速逆流色谱法的分离条件为：主机转速750-1000rpm/min，流动相流速1-15ml/min，水浴温度10-40℃。

步骤(3)中的溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相。

本发明的优点如下：

高速逆流色谱法(High-Speed Counter-Current Chromatography，HSCCC)利用溶质在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同，将不同物质进行有效分离。此项技术不需要固相载体，只需要被分离物在两相中分配，避免了固相载体带来的大量样品吸附、损失与污染等问题，样品回收率高，预处理及后处理都简单易行，与其它分离方法相比，它不使用固相载体作固定相，能采用不同的溶剂系统和正反相洗脱方式，客服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。

本发明科罗索酸的分离制备方法具有操作简单，溶剂用量少，无样品吸附、损失和污染，效率高等优点，本分明的科罗索酸的分离制备方法可制备得到纯度98％以上的科罗索酸。

附图说明

图1高速逆流制备科罗索酸紫外检测图谱

图2科罗索酸HPLC图谱

图3科罗索酸¹H-NMR图谱

图4科罗索酸¹³C-NMR图谱

具体实施方式

以下结合具体情况对本发明的具体实施方式做详细说明。

实施例1

(1)取干燥的吴茱萸五加粉碎，按照液料比1∶10的比例加入甲醇，在超声功率600W、40℃条件下，超声提取20min，提取3次，减压浓缩提取液，回收甲醇，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于pH＝10的氢氧化钠溶液中，充分搅拌均匀后，静置，过滤，除去不溶物，溶液经1mol/L盐酸中和后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩回收溶剂，得到粗提物；

(3)将上述粗提物采用TBE-300A高速逆流色谱仪进行分离。具体步骤为：在分液漏斗里配制正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水两相溶剂体系，按体积比5∶4.5∶5∶5混合，振摇后静置分层，得上、下相，超声，分别超声脱气30min。取上相注满高速逆流色谱仪作为固定相，转动主机，转速825rpm/min，同时以10mL/min的流速泵入下相作流动相，水浴温度为30℃，建立动态平衡后，用适量流动相溶解粗提物，由进样阀进样，紫外检测器在215nm波长下在线监测，收集目标成分，连续制备，相应合并回收试剂，浓缩后甲醇结晶，干燥，得到科罗索酸。

实施例2

(1)取干燥的吴茱萸五加粉碎，按照液料比1∶8的比例加入80％乙醇，在超声功率600W、40℃条件下，超声提取20min，提取3次，减压浓缩提取液，回收甲醇，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于pH＝10的氢氧化钠溶液中，充分搅拌均匀后，静置，过滤，除去不溶物，溶液经0.5mol/L硫酸中和后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩回收溶剂，得到粗提物；

(3)将上述粗提物采用TBE-300A高速逆流色谱仪进行分离。具体步骤为：在分液漏斗里配制正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水两相溶剂体系，按体积比4∶5∶5.5∶6混合，振摇后静置分层，得上、下相，超声，分别超声脱气30min。取上相注满高速逆流色谱仪作为固定相，转动主机，转速870rpm/min，同时以8mL/min的流速泵入下相作流动相，水浴温度为30℃，建立动态平衡后，用适量流动相溶解粗提物，由进样阀进样，紫外检测器在215nm波长下在线监测，收集目标成分，连续制备，相应合并回收试剂，浓缩后甲醇结晶，干燥，得到科罗索酸。

实施例3

(1)取干燥的吴茱萸五加粉碎，按照液料比1∶12的比例加入60％甲醇，在超声功率600W、40℃条件下，超声提取20min，提取3次，减压浓缩提取液，回收甲醇，得到浸膏；

(2)上述浸膏溶于pH＝10的氢氧化钠溶液中，充分搅拌均匀后，静置，过滤，除去不溶物，溶液经0.4mol/L磷酸中和后，加入等量乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯萃取液，浓缩回收溶剂，得到粗提物；

(3)将上述粗提物采用TBE-300A高速逆流色谱仪进行分离。具体步骤为：在分液漏斗里配制正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水两相溶剂体系，按体积比4∶4.5∶5.5∶5混合，振摇后静置分层，得上、下相，超声，分别超声脱气30min。取上相注满高速逆流色谱仪作为固定相，转动主机，转速915rpm/min，同时以12mL/min的流速泵入下相作流动相，水浴温度为30℃，建立动态平衡后，用适量流动相溶解粗提物，由进样阀进样，紫外检测器在215nm波长下在线监测，收集目标成分，连续制备，相应合并回收试剂，浓缩后甲醇结晶，干燥，得到科罗索酸。

实施例4 纯度检查

仪器：LC-10AT型高效液相色谱仪，SPD-10A型紫外可见检测器，CBM-10A型色谱工作站，色谱柱Promosil C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇∶1％冰醋酸(80∶20)；流速：1mL/min；柱温：30℃；检测时间为30min，检测波长：215nm。

取实施例1-3任一实施例中获得的科罗索酸白色结晶粉末，精密称定，加甲醇溶解并定容，摇匀，过0.45μm微孔滤膜滤过，按上述色谱条件进行测定，HPLC检测图谱见图1。

实施例5 结构鉴定

取实施例1-3任一实施例中获得的科罗索酸白色结晶性粉末，m.p.312-314℃，易溶于甲醇，丙酮，难溶于石油醚。TLC检查，展开剂石油醚∶乙酸乙酯(10∶3)，10％硫酸-乙醇显色为紫红色斑点，Rf≈0.45，Liebermann-Burchard反应呈阳性，Molish反应阴性。

氘代氯仿溶剂，使用DRX 400/300核磁共振仪(Bruker公司)分析其核磁数据。主要核磁数据如下：¹H-NMR(400MHz，C₃D₆O)中，δ0.82(3H，s)，δ0.87(3H，s)，δ0.90(3H，d，J＝5.0Hz)，δ0.97(9H，brs，3*CH₃)，δ1.09(3H，s)，δ2.75(1H，d，J＝9.2Hz)δ2.78(1H，d，J＝9.2Hz)，δ3.51(1H，s)，δ5.23(1H，s)；¹³C-NMR(100MHz，C₃D₆O)：48.1(C-1)，68.7(C-2)，83.9(C-3)，40.2(C-4)，56.1(C-5)，19.0(C-6)，33.6(C-7)，39.9(C-8)，48.2(C-9)，38.6(C-10)，23.9(C-11)，125.7(C-12)，139.4(C-13)，42.7(C-14)，28.9(C-15)，24.8(C-16)，48.1(C-17)，53.6(C-18)，39.5(C-19)，39.5(C-20)，31.2(C-21)，37.6(C-22)，29.5(C-23)，17.8(C-24)，17.1(C-25)，17.6(C-26)，24.0(C-27)，178.0(C-28)，21.5(C-29)，17.6(C-30)

谱图如图3、图4所示。科罗索酸结构式如下：

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例和实验例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。

Claims

1.一种降血糖活性成分科罗索酸的分离制备方法，其特征在于，所述的方法具体步骤如下：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取溶剂为甲醇、乙醇、水或者其混合物。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于吴茱萸五加为吴茱萸五加的干燥根、茎、叶子或其混合物。

4.如权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，吴茱萸五加为吴茱萸五加的干燥叶子。

5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的烷烃为正己烷或环己烷，所述的脂肪酯为乙酸乙酯或乙酸甲酯，所述的醚为乙醚或石油醚，所述的脂肪醇为甲醇、乙醇、异丙醇或正丁醇；所述的脂肪酮为丙酮。

6.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中两相溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水3-6∶3-7∶4-8∶4-6比例组成。

7.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中两相溶剂体系由正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水4∶5∶5.5∶6比例组成。

8.如权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的高速逆流色谱法的分离条件为：主机转速750-1000rpm/min，流动相流速1-15ml/min，水浴温度10-40℃。

9.如权利要求1-8任一项所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中的溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相。