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CN107208111A - 用于增强病毒基因转移至人造血细胞的化合物和方法 - Google Patents

用于增强病毒基因转移至人造血细胞的化合物和方法 Download PDF

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CN107208111A
CN107208111A CN201580055569.0A CN201580055569A CN107208111A CN 107208111 A CN107208111 A CN 107208111A CN 201580055569 A CN201580055569 A CN 201580055569A CN 107208111 A CN107208111 A CN 107208111A
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H-P·凯姆
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J·察格拉奥
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Fred Hutchinson Cancer Center
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Abstract

本文描述了用于增强诸如慢病毒基因转移等病毒基因转移和改善基因递送至诸如原始造血细胞等细胞的效率的方法和组合物。这些方法和组合物基于嘧啶并[4,5‑b]吲哚衍生物的使用。还描述了对适合于利用包括造血干细胞疗法的基因疗法进行治疗的治疗适应症有用的基于细胞的组合物和方法。

Description

用于增强病毒基因转移至人造血细胞的化合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年9月18日提交的美国临时申请序列号62/052,452的权益，以其整体通过引用并入本文。
技术领域
本发明大体上涉及病毒基因转移，更具体而言，涉及病毒基因转移至诸如造血干细胞(HSC)等细胞及其应用。
背景技术
将基因转移至造血干细胞(HSC)仍然是治疗多种遗传病症的有吸引力的方法。基因疗法领域的最新进展进一步提高了患有诸如β地中海贫血和镰状细胞性贫血等血红蛋白病患者受益于新治疗方法的希望。用携带β-珠蛋白基因的慢病毒载体修饰的造血细胞(HC)的移植已导致几种血红蛋白病症小鼠模型的长期校正(Imren等，Proc Natl Acad SciUSA.2002；99：14380-14385；Malik等，Ann NY Acad Sci.2005；1054：238-249；May等，Nature.2000；406：82-86；Pawliuk等，Science.2001；294：2368-2371)，但仅在一个β地中海贫血患者中导致输血独立性(Cavazzana-Calvo等，Nature.2010；467：318-322)。
然而，这种治疗的安全性和效用受限于难以获得足够数量的转导HSC，这要么是由于转导细胞较差的产率，要么是其较差的功能。已经报道了使用不同试剂来增强逆转录病毒的基因转移，例如纤连蛋白(US 5686278，Chono H等，J Biochem.2011年3月；149(3)：285-92；Lee HJ，Lee YS等，Biologicals.2009年8月；37(4)：203-9)，HIV Tat(Nappi F等，JGene Med.2009年11月；11(11)：955-65)，Vectofusin-1(Fenard D等，Mol Ther NucleicAcids.2013年5月7日；2：e90)，脱氧核苷(Ravot E等，J Gene Med.2002年3月至4月；4(2)：161-9)，和细胞因子(Géronimi F等，Stem Cells.2003；21(4)：472-80；Kiem HP等，Blood.1998年9月15日；92(6)：1878-86)。
因此，需要用于增强基因转移至HSC的新化合物和方法，特别是用于治疗或预防造血功能障碍的基因疗法的方法。
本说明书涉及多个文献，将其内容以其整体通过引用并入本文。
发明内容
本发明涉及以下条款[1]～[37]：
[1].一种将病毒载体转导入细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与通式I的化合物或其盐或前药接触；和用病毒载体转导所述细胞，
其中：
每个Y独立地选自N和CH；
Z是
1)-CN
2)-C(O)OR1，
3)-C(O)N(R1)R3，
4)-C(O)R1，或
5)-杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
其中，当(R1)和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
W是
1)-CN，
2)-N(R1)R3，
3)-C(O)OR1，
4)-C(O)N(R1)R3，
5)-NR1C(O)R1，
6)-NR1C(O)OR1，
7)-OC(O)N(R1)R3，
8)-OC(O)R1，
9)-C(O)R1，
10)-NR1C(O)N(R1)R3，
11)-NR1S(O)2R1，
12)-苄基，可选地，其取代有1、2或3个RA或R1取代基，
13)-X-L-(X-L)n-N(R1)R3，
14)-X-L-(X-L)n-杂芳基，可选地，其取代有连接在L和杂芳基基团之一或两者上的一个或多个RA或R4取代基，
15)-X-L-(X-L)n-杂环基，可选地，其取代有连接在L和杂环基基团之一或两者上的一个或多个RA或R4取代基，
16)-X-L-(X-L)n-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基。
17)-X-L-(X-L)n-NR1RA，或者
18)-(N(R1)-L)n-N+R1R3R5R6"
其中，n是等于0、1、2、3、4或5的整数，
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
每个X独立地选自O、S和NR1；
每个L独立地是
1)-C1-6亚烷基，
2)-C2-6亚烯基，
3)-C2-6亚炔基，
4)-C3-7亚环烷基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，或者
5)-C3-7亚环烯基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子
其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基和亚环烯基各自独立地可选地取代有一个或两个R4或RA取代基；
R1各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，或
11)-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是
1)-H，
2)-C1-6烷基，可选地，其取代有一个或多个RA取代基
3)-C(O)R4，
4)-L-杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基
5)-L-杂环基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4，或者
6)-L-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基；
R3各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，或
11)-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，或
11)-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R5各自独立地是
1)-C1-6烷基，
2)-C1-6亚烷基-C2-6烯基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子
3)-C1-6亚烷基-C2-6炔基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子
4)-L-芳基，可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基
5)-L-杂芳基，可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基
6)-C1-6亚烷基-C(O)O-
7)-C1-6亚烷基-C(O)OR1
8)-C1-6亚烷基-CN
9)-C1-6亚烷基-C(O)NR1R3，其中，可选地，R1和R3与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子；或者
10)-C1-6亚烷基-OH；
R6是
1)卤素
2)OC(O)CF3，或者
3)OC(O)R1；
RA各自独立地是
1)-卤素，
2)-CF3，
3)-OR1，
4)-L-OR1，
6)-SR1，
7)-CN，
8)-NO2，
9)-NR1R3，
10)-L-NR1R1，
11)-C(O)OR1，
12)S(O)2R4
13)-C(O)N(R1)R3，
14)-NR1C(O)R1，
15)-NR1C(O)OR1，
16)-OC(O)N(R1)R3，
17)-OC(O)R1，
18)-C(O)R4，
19)-NHC(O)N(R1)R3，
20)-NR1C(O)N(R1)R3，或者
21)-N3；及
Rd各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5
8)-苄基，或
9)-杂环基。
[2].如条款1所述的方法，其中，所述化合物具有式IA
或其盐或前药，
其中，W、Y、Z和R2各自如条款1中所定义。
[3].如条款2所述的方法，其中，
每个Y独立地选自N和CH；
Z是-CN、-C(O)OR1、-C(O)N(R1)R3或-杂芳基，可选地，杂芳基取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-CN、-N(R1)R3、-苄基(可选地，其取代有1、2或3个RA或R1取代基)、-X-L-(X-L)n-N(R1)R3、-X-L-(X-L)n-NR1RA或-(N(R1)-L)n-N+R1R3R5R6-
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
每个X独立地是O、S或NR1，
L各自独立地是-C1-6亚烷基、-C2-6亚烯基、-C2-6亚炔基、-C3-7亚环烷基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)，或者-C3-7亚环烯基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)，
其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基和亚环烯基各自独立地、可选地取代有一个或两个R4或RA取代基；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基(可选地，其取代有一个或多个RA取代基)、-C(O)R4、-L-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)、-L-杂环基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4)、或者-L-芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-芳基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R5各自独立地是-C1-6烷基、-L-芳基(可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基)、-L-杂芳基(可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基)、-C1-6亚烷基-C(O)O-、-C1-6亚烷基-C(O)OR1、-C1-6亚烷基-CN、-C1-6亚烷基-C(O)NR1R3，或-C1-6亚烷基-OH；
R6是卤素、-OC(O)CF3或OC(O)R1；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-L-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-L-NR1R1、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3、-NR1C(O)N(R1)R3或-N3；
Rd各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-苄基或-杂环基。
[4].如条款1所述的方法，其中，所述化合物具有式IIA：
IIA
或其盐或前药，
其中，Z、W和R2各自如条款1所定义。
[5].如条款4所述的方法，其中
Z是-CN、-C(O)O-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-6烷基或-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)，
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-NR1RA、-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1RA；
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、-C(O)R4、-C1-6亚烷基-杂芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)、-C1-6亚烷基-杂环基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4)或-C1-6亚烷基-芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-芳基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-L-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-L-NR1R1、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3、-NR1C(O)N(R1)R3或-N3；
Rd各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-苄基或-杂环基。
[6].如权利要求5所述的方法，其中：
Z是CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；
R2是苄基或H；及
W是NH-L-N(R1)R3，其中，L是C2-4亚烷基或C3-7亚环烷基，R1和R3是C1-4烷基或H；或者R1和R3与它们所连接的氮原子结合在一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4。
[7].如条款6所述的方法，其中，W是
[8].如条款1所述的方法，其中，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，
Z是-C(O)O-C1-4烷基、或者-杂芳基，优选为包含2～4个选自N和O的杂原子的5元环杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3，其中，n是等于0、1、2或3的整数，并且其中，当R1和R3连接到相同的氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成5～6元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N和O的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C3-7环烷基或-杂环基，
其中，烷基、环烷基、杂环基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、-C1-6亚烷基-杂芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；或-C1-6亚烷基-芳基(可选地，其在亚烷基或芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、其中，可选地，所述烷基取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是H、-C1-6烷基，其中，可选地，所述烷基取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3或-NR1C(O)N(R1)R3，及
Rd各自独立地是-H或-C1-6烷基。
[9].如条款1所述的方法，其中，所述化合物是：
或者它们的盐。
[10].如条款1～9中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括干细胞和/或祖细胞。
[11].如条款10所述的方法，其中，所述干细胞包括原始造血细胞。
[12].如条款11所述的方法，其中，所述原始造血细胞源自脐带血、骨髓或外周血。
[13].如条款1～12中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是整合缺陷型病毒载体。
[14].如条款1～13中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。
[15].如条款14所述的方法，其中，所述慢病毒载体是假型慢病毒载体。
[16].如条款15所述的方法，其中，所述慢病毒载体被水泡性口炎病毒G-蛋白(VSV-G)或RAD114包膜蛋白假型化。
[17].如条款1～16中任一项所述的方法，其中，所述细胞在所述转导之前与所述化合物接触。
[18].如条款1～16中任一项所述的方法，其中，所述细胞在所述转导之前和转导期间与所述化合物接触。
[19].如条款1～18中任一项所述的方法，其中，所述细胞与所述化合物接触约2小时～约22小时的时间。
[20].一种组合物，其包含：(i)条款1和10～12中任一项所定义的细胞，(ii)至少一种条款1～9中任一项所定义的化合物；及(iii)条款1和13～16中任一项所定义的病毒载体。
[21].如条款20所述的组合物，其进一步包含(iv)适于细胞扩增的培养基。
[22].如条款20或21所述的组合物，其中，所述细胞包括干细胞。
[23].如条款22所述的组合物，其中，所述干细胞包括原始造血细胞。
[24].如条款23所述的组合物，其中，所述原始造血细胞源自脐带血、骨髓或外周血。
[25].通过如条款1～19中任一项所述的方法获得的转导细胞的群体。
[26].一种药物组合物，其包含如条款25所述的转导细胞的群体。
[27].一种治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的如条款25所述的转导细胞的群体或如条款26所述的药物组合物。
[28].如条款27所述的方法，其中，所述方法包括：(i)在条款1～9中任一项所定义的通式I的化合物存在下，将病毒载体转导入来自所述受试者的细胞，从而获得包含转导细胞的群体；和(ii)对所述受试者施用有效量的(i)中所得的包含转导细胞的群体，或含有所述包含转导细胞的群体的药物组合物。
[29].如条款28所述的方法，其中，所述细胞如条款22～24中任一项所定义。
[30].如条款27～29中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有血液学或溶酶体贮积疾病。
[31].如条款30所述的方法，其中，所述血液学或溶酶体贮积疾病是威斯科特-奥尔德里奇综合症(WAS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、白细胞粘附缺陷、X连锁CGD、范可尼贫血、肾上腺脑白质营养不良、粘多糖病MIA、严重联合免疫缺陷(SCID)或腺苷脱氨酶(ADA)缺乏。
[32].条款25所述的转导细胞群体或如条款26所述的药物组合物用于治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的用途。
[33].条款25所述的转导细胞群体或如条款26所述的药物组合物用于制造用于治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的药物的用途。
[34].如条款32或33所述的用途，所述受试者患有血液学或溶酶体贮积疾病。
[35].如条款34所述的用途，其中，所述血液学疾病或溶酶体贮积疾病是威斯科特-奥尔德里奇综合症(WAS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、白细胞粘附缺陷、X连锁CGD、范可尼贫血、肾上腺脑白质营养不良、粘多糖病IMA、严重联合免疫缺陷(SCID)或腺苷脱氨酶(ADA)缺乏。
[36].一种用于在细胞中表达感兴趣的基因的方法，所述方法包括使所述细胞与条款1～9中任一项所定义的通式I的化合物接触；和用包含编码所述感兴趣的基因的核酸的病毒载体转导所述细胞。
[37].如条款36所述的方法，其中，所述病毒载体如条款1和13～16中任一项所定义。
参照附图，通过阅读以下具体实施方式的非限制性描述，本发明的其他目的、优点和特征将变得更加明显，所述具体实施方式仅作为实例提供。
附图说明
在附图中：
图1显示用化合物1(Cmpd1)和SR1扩增的人CD34+脐带血(CB)细胞比未操作的细胞更有效地转导。将新鲜的或8天的Cmpd1(35nM)和SR1(500nM)扩增的CD34+CB细胞预刺激24小时，并分别用MOI 10的编码GFP的VSV-G慢病毒转导16小时。冲洗细胞并用抗人CD34和CD45RA抗体染色，以用于在转导后72小时进行FACS分析。示出在两种条件下(新鲜的和利用Cmpd1+SR1培养8天)GFP-转导的细胞在总(左侧条)、CD34+(中间条)和CD34+CD45RA-(右侧条)群体中的百分比。
图2显示与DMSO对照相比，Cmpd1处理的细胞显示更高百分比的GFP转导的CD34+和CD34+CD45RA-细胞。将CD34+CB细胞预刺激48小时，并分别在载体(DMSO)或Cmpd1(35nM)的存在下用编码GFP(MOI：50或100)的VSV-G或RDT114慢病毒转导12小时。然后冲洗细胞，并在DMSO或Cmpd1中再次培养。在转导后3天和10天后进行流式细胞分析以测定所示群体内的GFP阳性细胞(深灰色)。
图3A和3B显示与对照相比，GFP转导和扩增的Cmpd1-CD34+CB细胞显示出更好的人CD45植入的植入潜力。将用Cmpd1(三角形)或DMSO(圆形)对照(图2中描述的)转导和扩增10天的1000个CD34+CB细胞的后代移植到亚致死性照射的(275cGy)雌性NSG小鼠中。在移植后30周后进行NSG骨髓细胞的流式细胞分析。图3A：人CD45+细胞在总NSG BM细胞中的百分比。图3B：显示人CD45细胞内的GFP+细胞。
图4显示用RD114和VSV-G假型慢病毒载体移植后30周的体内数据的总结。
图5A显示实验设计的示意图。通过FACS分离的20,000个CD34+脐带血细胞在100微升的加入人生长因子(100ng/ml SCF、100ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3、20ng/ml IL-6和20ng/ml G-CSF)的无血清培养基[补充有胎牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白(BIT，STEMCELL Technologies)、10μg/ml的低密度脂蛋白(LDL，STEMCELL Technologies)、10-4M2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、10-4M glutamax 500(STEMCELL Technologies)、青霉素链霉素)的Iscove's培养基]中在存在或不存在Cmpd1(35nM)和/或SR1(0.75μΜ)的情况下预刺激16小时。然后在相同培养基中将细胞暴露于GFP慢病毒载体(106iu/mL)6小时。(图5C中提供了慢病毒载体的细节和所用的病毒原液的产生和滴定)。在转导期结束时，冲洗细胞并在补充有DMSO、SR1(0.75μΜ)、Cmpd1(35nM)或SR1+Cmpd1的相同培养基中培养72小时。在培养基的末端，收获细胞，对CD34染色并通过流式细胞分析。
图5B显示GFP+(*p<0.05)的CD34+细胞的百分比比例。
图5C显示本文所述实验中使用的慢病毒载体的细节和病毒原液的产生和滴定。在这些研究中使用pCCI-c-MNDUSpgkGFP或pCCI-c-MNDUSpgkYFP慢病毒载体骨架(Logan AC等，Human Gene Therapy 2004)。克隆MN1的4000bp的cDNA或1743bp的NUP98-HOXD13或1640bp的NUP98-HOXA10hd融合基因以分别产生pCCI-c-MNDUSMN1pgkGFP或pCCI-c-MNDUSFND13pgkGFP或pCCI-c-MNDUSNA10hdpgkGFP。对载体构建体进行序列验证。通过使用标准的4-质粒包装系统瞬时转染293T细胞产生被水泡性口炎病毒糖蛋白-G假型化的高滴度重组病毒。通过超速离心浓缩含病毒的上清液以达到0.5×109～5×109感染单位/ml的滴度。通过用慢病毒载体的三个稀释物转导HeLa细胞来确定病毒滴度。
图6A显示实验设计的示意图。将通过FACS分离的20,000个CD34+脐带血细胞进行预刺激并在图5A所述的培养条件下用GFP慢病毒载体转导。在预刺激期间或在转导期期间加入Cmpd1(35nM)或DMSO。使用稀释的GFP慢病毒进行细胞转导，以覆盖从105～109病毒体/mL的最终病毒浓度范围(图5C中提供的病毒细节)。
图6B和6C显示与预刺激期(图6B)或转导期(图6C)期间暴露于Cmpd1(上侧条)或DMSO(下侧条)的细胞培养后，对CD34+细胞评估的基因转移作为所用病毒浓度的函数。
图6D和6E显示在预刺激期(图6D)或转导期(图6E)期间在Cmpd1或DMSO存在下人类造血细胞的不同亚群的基因转移效率。
图6F和6G显示在预刺激期(图6F)或转导期(图6G)期间在Cmpd1或DMSO存在下人造血亚群的产率。图6D～6G的数据用106iu/mL病毒浓度获得。
图7A显示评估Cmpd1对基因转移的影响和在体外和体内评估的原始细胞产率的实验设计；细胞用GFP或YFP转导以允许在共注射到受体免疫缺陷小鼠中时在不同条件下转导的细胞的体内跟踪(竞争性再增殖)。使用的培养条件、细胞数目和病毒分别如图5A和5C所述。对于这些实验，Cmpd1以35nM终浓度加入，并且GFP或YFP载体的病毒浓度为106iu/mL。所有培养重复三次。
图7B和7C显示在存在或不存在Cmpd1的情况下用GFP(图7B)或YFP(图7C)病毒转导3天后回收的细胞中CD34和GFP或YFP表达的代表性流式细胞分析。
图7D显示基因转移至用GFP载体(左，深灰色条)或YFP载体(右，浅灰色条)(n＝3；误差条表示SD；*P<0.05)转导的人CD34+CB细胞的效率。
图7E显示在3天培养结束时回收的CD34+细胞和GFP标记的CD34+细胞(左，深灰色条)或YFP标记的CD34+细胞(右，浅灰色条)的绝对数目(n＝3；误差条表示SD；*P<0.05)。
图7F、7G和7H显示在存在或不存在Cmpd1的情况下转导的细胞的体内竞争实验的结果。在预刺激和转导期(22小时)之后，立即冲洗YFP标记的细胞(在Cmpd1存在下转导)和GFP标记的细胞(在DMSO存在下转导)的等分试样(20000)，并注射入致死照射的NSG(n＝8)。在30周内监测骨髓抽吸物中的淋巴骨髓移植。图7F：移植的NSG小鼠的骨髓中的总人CD45+细胞(上侧黑色线)、YFP+(中间浅灰色线)或GFP+(下侧黑灰色线)细胞的检测。图7G：移植的NSG小鼠的骨髓中的人CD33+(骨髓)细胞(上侧黑色条)，YFP+(中间浅灰色条)或GFP+细胞(下侧深灰色条)的检测。图7H：移植的NSG小鼠的骨髓中的人CD19/20(B淋巴样)细胞(上侧黑色条)，YFP+(中间浅灰色条)或GFP+细胞(下侧深灰色条)的检测。
图8A～8E显示独立实验(实验2)，其显示基因转移至人CD34+CB细胞(体外)和在NSG小鼠中的人HSC(体内，n＝2)的Cmpd1刺激增强。实验设计如图7所示，其在如图5所述的培养条件下。病毒浓度和Cmpd1浓度如图7所述(分别为106iu/ml和35nM)。
图8A显示基因转移至用GFP载体(左侧深灰色条)或YFP载体(右侧浅灰色条)转导的人CD34+CB细胞的效率。
图8B显示在3天培养结束时回收的CD34+细胞和GFP标记的CD34+细胞(左侧深灰色条)或YFP标记的CD34+细胞(右侧浅灰色条)的绝对数目。
图8C显示作为移植后时间函数的移植的NSG小鼠的骨髓中的人CD45+细胞(上侧黑色线)、GFP+(中间深灰色线)或YFP+(下侧浅灰色线)细胞的检测。
图8D显示在移植的NSG小鼠的骨髓中人CD33(骨髓样)细胞(上侧黑色线)，GFP+(中间深灰色线)或YFP+(下侧浅灰色线)的检测。
图8E显示在移植的NSG小鼠的骨髓中人CD19/20(B淋巴样)细胞(上侧黑色线)、GFP+(中间深灰色线)或YFP+(下侧浅灰色线)细胞的检测。
图9A～9D显示独立实验(实验3)，其显示基因转移至人CD34+CB细胞(体外)和在NSG小鼠中的人HSC的Cmpd1刺激增强。
图9A显示实验设计的示意图。此实验的独特特征包括使用不同的脐带血池作为CD34+细胞来源；使用不同的GFP慢病毒制剂；和在有限的稀释下体内评价细胞，而不是竞争检验。其他培养条件包括如前所述的病毒和Cmpd1的浓度。
图9B显示基因转移至人CD34+CB细胞的效率。
图9C显示用不同剂量的细胞(全部作为起始细胞等同物)在移植后30周时小鼠骨髓中的人CD45+细胞。
图9D显示用不同剂量的细胞在移植30周后在骨髓中表达GFP的人细胞的比例。
图10A显示实验设计，其中CD34+CB细胞在预刺激或转导期期间暴露于Cmpd1不同的持续时间。在预刺激期开始时或在转导期的开始或结束时，最小暴露时间为2小时。
图10B显示在3天扩增培养(不存在Cmpd1)结束时回收的细胞的代表性流式细胞分析，以评估在各种条件下的基因转移至CD34+细胞和CD34+细胞的产率。
图10C～10P总结了在预刺激的最初2小时期间(图10C、10H和10M)，在预刺激的最后2小时期间(图10D、10I和10N)，在16小时的预刺激期间(图10E、10J和10O)，在转导的最初2小时期间(图10F，10K和10P)或在转导的最后2小时期间(图10G、10L和10Q)存在Cmpd1时，至各种CD34+亚区室的基因转移效率和产率。
图11A显示实验设计，其中在存在或不存在Cmpd1的情况下将细胞直接暴露于病毒而没有预先刺激，持续所示的时间。
图11B显示在培养期结束时回收的细胞的代表性流式细胞分析。随后的图总结了在标记为I、II和III的各种转导条件下的基因转移和对CD34+细胞和CD34+亚群的产率。
图12A显示实验设计，其中将人骨髓CD34+细胞和人CD34+动员的外周血预刺激24小时，并在补充有100ng/mL hSCF、100ng/mL hFLT3-L、100ng/mL hTPO和20ng/mL hlL3的无血清培养基中在Cmpd1(35nM)或DMSO(0.01％)的存在下转导24小时。然后冲洗细胞并再培养3天，以评估培养物中CD34+细胞和CD34+亚群的基因转移效率和产率。
图12B和12C显示来自骨髓(图12B)和动员的外周血(图12C)的原始人类造血细胞的不同亚型的转导细胞的基因转移效率和产率。
图13A显示使用RD114假型化慢病毒载体对人CD34+CB细胞转导的基因转移效率。
图13B显示使用VSV-G假型化慢病毒载体对人CD34+CB细胞转导的基因转移效率。
图13C显示通过非整合(整合酶缺陷型)慢病毒测试对人CD34+CB细胞的基因转移效率的实验设计。
图13D显示使用非整合型(整合酶缺陷型)慢病毒(图B)在存在或不存在CMPD1的情况下的基因转移至CD34+脐带血细胞的结果。
图14A和14B显示在不同生长因子组合下进行的基因转移实验的结果。将20000个CD34+CB细胞预刺激，并在补充有Cmpd1(35nM)或DMSO(0.01％)的具有5种生长因子(100ng/ml SCF，100ng/ml FLT3L，20ng/ml IL-3，20ng/ml IL-6和20ng/ml G-CSF)或具有3种生长因子的不同混合物(100ng/ml SCF、100ng/ml FLT3L，50ng/mL TPO)的全部先前实验中采用的标准条件下在SFM中转导。冲洗细胞并在相同培养基中另外培养细胞3天，以评估在3种生长因子(3GFS，左图)下相对于5种生长因子(5GFS，右图)条件下的CD34+细胞和CD34+亚群的基因转移效率和产率。图14A：基因转移效率(％GFP细胞)；图14B：绝对细胞计数。
图15A～15D显示使用慢病毒载体谱进行的基因转移实验的结果。将人CD34+细胞预刺激16小时，并在标准条件下在存在或不存在Cmpd1的情况下用不同的慢病毒载体转导6小时，在另外72小时后，评估对CD34+细胞的基因转移。产生携带一系列不同插入物(分别为LGB、NA10-HD、MN1、ND13，图15A～15D)的慢病毒载体，并在指定的病毒浓度下测试。
图16A和16B显示用Cmpd1变体进行的基因转移实验的结果。预刺激人CD34+CB细胞(16小时)，并在存在DMSO、Cmpd1或Cmpd1的不同变体的情况下转导(6小时)。然后冲洗细胞，并另外培养3天，通过FACS分析。Cmpd1和已知对人CD34+细胞的扩增有活性的Cmpd1的其他变体(Cmpd3、Cmpd4、Cmpd5、Cmpd6)而非Cmpd1的无活性变体(Cmpd7、Cmpd8)，增加了对人CD34+CB细胞(图16A)和不同的CD34+亚型(图16B)的基因转移效率。
图17A～17C显示在共培养±Cmpd1、化合物2(Cmpd2)和SR1后，猕猴脐带血CD34+细胞的扩增和植入。图17A：实验示意图。图17B显示移植后移植小鼠的血液中灵长类动物CD45+细胞的检测。图17C显示移植10周后的植入数据(上图)和代表性流式细胞分析(第10周)(下图)的总结。显著性水平：*p<0.05。
图18A～18G显示Cmpd1对来自猕猴骨髓的经基因修饰的CD34+和LT-HSC样细胞的转导和扩增的影响。图18A：实验示意图。图18B显示用Cmpd1/SR1扩增前和扩增后CD34+细胞的扩增和CFC的形成。图18C显示CD34+细胞+/-Cmpd1转导后的细胞产率。图18D显示在转导1周后的动员的骨髓CD34+细胞转导后经基因修饰的LT-HSC样细胞扩增的动力学。图18E显示转导细胞+/-Cmpd1/SR1(上图；左侧条＝总GFP+；中间条＝CD34+GFP+；右侧条＝LT-HSC+GFP+)的倍数扩增和扩增+/-Cmpd1/SR1(下图)后转导的动员骨髓CD34+细胞的CFC潜力。图18F显示与SR1相比，组合Cmpd1/SR1在动员的CD34+细胞的转导期间保持胚细胞。图18G显示图18F所示数据的代表性细胞离心涂片图像(cytospin images)。
图19A～19E显示SR1/Cmpd1扩增的转导的CD34+细胞在猕猴中的植入。图19A：实验示意图。图19B显示用SR1(左侧条)和SR1+Cmpd1(右侧条)转导的CD34+细胞中的基因转移。图19C显示在用SR1(左侧条)和SR1+Cmpd1(右侧条)共培养后，经基因修饰的CD34+细胞的倍数扩增。图19D显示在细胞移植1个月后骨髓和血液中的骨髓样和淋巴样细胞的检测。图19E显示移植后经基因修饰的粒细胞和淋巴细胞的检测(GFP+粒细胞＝浅灰色菱形；GFP+淋巴细胞＝浅灰色圆圈；mCherry+粒细胞＝深灰色菱形；mCherry+淋巴细胞＝深灰色圆圈)。
图20A～20E显示Cmpd1和雷帕霉素之间的协同，以增强慢病毒基因至人类造血细胞的转移效率。
图20A显示实验设计的示意图。通过FACS分离的20,000个CD34+脐带血细胞在100微升的加入人生长因子(100ng/ml SCF、100ng/ml FLT3L、20ng/ml IL-3、20ng/ml IL-6和20ng/ml G-CSF)的无血清培养基中在存在或不存在Cmpd1(35nM)和/或雷帕霉素(10μg/mL)的情况下预刺激16小时。然后在相同培养基中将细胞暴露于GFP慢病毒载体(106iu/mL)6小时。在转导期结束时，冲洗细胞并在具有生长因子的无血清培养基中培养72小时。在培养结束时，收获细胞，对HSC表面标记物染色，并通过流式细胞分析。
图20B显示基因转移至人HSC中的效率。左侧条＝DMSO；第二个条＝Cmpd1；第三个条＝雷帕霉素；第四个(右侧)条＝Cmpd1+雷帕霉素(Combo).
图20C显示在培养结束时回收的总细胞数。左侧条＝DMSO；第二个条＝Cmpd1；第三个条＝雷帕霉素；第四个(右侧)条＝Cmpd1+雷帕霉素(Combo)。
图20D显示培养物中产生的HSC的绝对数目。左侧条＝DMSO；第二个条＝Cmpd1；第三个条＝雷帕霉素；第四个(右侧)条＝Cmpd1+雷帕霉素(Combo)。
图20E显示在培养结束时回收的细胞的代表性流式细胞分析。
具体实施方式
在本文所述的研究中，本发明的发明人已经显示，人类造血细胞对某些嘧啶并[4,5-b]吲哚衍生物的短期暴露(例如约2小时～22小时)(其显示在延长培养(12天)后刺激人类造血细胞的扩增)，显著增强病毒介导的基因转移。用已知刺激原始人类造血细胞扩增的另一个小分子StemRegenin 1(SR1)没有观察到这种增强慢病毒介导的基因转移能力。在不同来源(包括脐带血、成体骨髓和成体动员的外周血)和不同表型(大量CD34+以及高度纯化的CD34+亚型(其包括干细胞高度富集的亚型))的原始造血细胞中，和不同类型的病毒(不同的慢病毒，其包括整合缺陷型慢病毒和不同的假型慢病毒)测量这种增强，表明这些化合物可以广泛应用于增强诸如造血细胞等细胞中的病毒基因转移。
因此，第一方面，本发明提供了用于将病毒载体(例如慢病毒载体)转导入细胞(例如，诸如干细胞和/或祖细胞等原代细胞)的方法，所述方法包括使所述细胞与如本文所定义的通式I的化合物或其盐或前药接触；和用病毒载体转导所述细胞，
其中：
每个Y独立地选自N和CH；
Z是-CN；-C(O)OR1；-C(O)N(R1)R3；-C(O)R1；或-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)，其中，当(R1)和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
W是-CN；-N(R1)R3；-C(O)OR1；-C(O)N(R1)R3；-NR1C(O)R1；-NR1C(O)OR1；-OC(O)N(R1)R3；-OC(O)R1；-C(O)R1；-NR1C(O)N(R1)R3；-NR1S(O)2R1；-苄基(可选地，其取代有1、2或3个RA或R1取代基)；-X-L-(X-L)n；-N(R1)R3；-X-L-(X-L)n-杂芳基(可选地，其取代有连接在L和杂芳基的任一个或两个上的一个或多个RA或R4取代基；-X-L-(X-L)n-杂环基(可选地，其取代有连接在L和杂环基的任一个或两个上的一个或多个RA或R4取代基；-X-L-(X-L)n-芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)；-X-L-(X-L)n-NR1RA或-(N(R1)-L)n-N+R1R3R5R6-，其中，n是等于0、1、2、3、4或5的整数，
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
每个X独立地选自O、S、和NR1；
L各自独立地是-C1-6亚烷基；-C2-6亚烯基；-C2-6亚炔基；-C3-7亚环烷基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)；或-C3-7亚环烯基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)，其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基和亚环烯基各自独立地、可选地取代有一个或两个R4或RA取代基；
R1各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-杂环基；-芳基；-杂芳基；或-苄基，其中，烷基、烯基、炔基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H；-C1-6烷基(可选地，其取代有一个或多个RA取代基)；-C(O)R4；-L-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)；-L-杂环基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4)；或-L-芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-杂环基；-芳基；-杂芳基；或-苄基，其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-杂环基；-芳基；-杂芳基；或-苄基；其中烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R5各自独立地是-C1-6烷基；-C1-6亚烷基-C2-6烯基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)；-C1-6亚烷基-C2-6炔基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)；-L-芳基(可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基)；-L-杂芳基(可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基)；-C1-6亚烷基-C(O)O-；-C1-6亚烷基-C(O)OR1；-C1-6亚烷基-CN；-C1-6亚烷基-C(O)NR1R3，其中，R1和R3，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子；或-C1-6亚烷基-OH；
R6是卤素；-OC(O)CF3；或-OC(O)R1；
RA各自独立地是-卤素；-CF3；-OR1；-L-OR1；-OCF3；-SR1；-CN；-NO2；-NR1R3；-L-NR1R1；-C(O)OR1；-S(O)2R4；-C(O)N(R1)R3；-NR1C(O)R1；-NR1C(O)OR1；-OC(O)N(R1)R3；-OC(O)R1；-C(O)R4；-NHC(O)N(R1)R3；-NR1C(O)N(R1)R3；或-N3；及
Rd各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-苄基；或-杂环基。
根据一个实施方式，所述化合物具有式IA
或其盐或前药，
其中W、Y、Z和R2各自如本文所定义。
根据一个实施方式，所述化合物具有式I或IA，其中，
每个Y独立地选自N和CH；
Z是-CN、-C(O)OR1、-C(O)N(R1)R3或-杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-CN、-N(R1)R3、-苄基(可选地，其取代有1、2或3个RA或R1取代基)、-X-L-(X-L)n-N(R1)R3、-X-L-(X-L)n-NR1RA或-(N(R1)-L)n-N+R1R3R5R6-
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
X各自独立地是O、S或NR1，
L各自独立地是-C1-6亚烷基、-C2-6亚烯基、-C2-6亚炔基、-C3-7亚环烷基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)或-C3-7亚环烯基(可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子)
其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基和亚环烯基各自独立地、可选地取代有一个或两个R4或RA取代基；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基是各自独立，可选地，其取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基(可选地，其取代有一个或多个RA取代基)、-C(O)R4、-L-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)、-L-杂环基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4)或-L-芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-芳基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R5各自独立地是-C1-6烷基、-L-芳基(可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基)、-L-杂芳基(可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基)、-C1-6亚烷基-C(O)O-、-C1-6亚烷基-C(O)OR1、-C1-6亚烷基-CN、-C1-6亚烷基-C(O)NR1R3或-C1-6亚烷基-OH；
R6是卤素、OC(O)CF3或OC(O)R1；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-L-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、NR1R3、-L-NR1R1、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3、-NR1C(O)N(R1)R3或-N3；
Rd各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-苄基或-杂环基。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐或前药，
其中，Z、W和R2各自如本文所定义。
根据一个实施方式，所述化合物具有式I、IA或IIA
Z是-CN；-C(O)O-C1-6烷基；-C(O)NH-C1-6烷基；或-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)，
W是-N(R1)R3；-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3；-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3；-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3；-NR1-C1-6亚烷基-NR1RA；-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3；或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1RA
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-杂环基；-杂芳基；或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H；-C1-6烷基；-C(O)R4；-C1-6亚烷基-杂芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；-C1-6亚烷基-杂环基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4)；或-C1-6亚烷基-芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)，
R3各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-杂环基；-芳基；-杂芳基；或-苄基，其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基是各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素；-CF3；-OR1；-L-OR1；-OCF3；-SR1；-CN；-NO2；-NR1R3；-L-NR1R1；-C(O)OR1；S(O)2R4；-C(O)N(R1)R3，-NR1C(O)R1，-NR1C(O)OR1，-OC(O)N(R1)R3，-OC(O)R1；-C(O)R4；-NHC(O)N(R1)R3；-NR1C(O)N(R1)R3；或-N3
Rd各自独立地是-H；-C1-6烷基；-C2-6烯基；-C2-6炔基；-C3-7环烷基；-C3-7环烯基；-全氟化C1-5；-苄基；或-杂环基。
根据另一个实施方式，本公开提供了增强慢病毒基因至原始造血细胞的转移效率的方法，所述方法包括使包含原始造血细胞的细胞群体与通式I-VI的化合物接触；和用慢病毒载体转导所述细胞，所述化合物具有式I、IA或IIA
Z是CN、-C(O)O-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-6烷基或-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-NR1RA、-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1RA
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子连接在一起以形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个其他杂原子(N、O或S)，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、-C(O)R4、-C1-6亚烷基-杂芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)、-C1-6亚烷基-杂环基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4)、或-C1-6亚烷基-芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-芳基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-L-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-L-NR1R1、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3、-NR1C(O)N(R1)R3或-N3
Rd各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-苄基或-杂环基。
在一个实施方式中，Z是-C(O)OR1或-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R1取代基)，R2是H、-C1-6烷基(可选地，其取代有一个或多个RA取代基)或-L-芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)，W是-N(R1)R3，其中，R1是被RA取代的C3-7环烷基，且R3是H。
在一个实施方式中，Z是-C(O)O-C1-4烷基或5元环杂芳基，所述杂芳基包含2～4个其他杂原子(N或O)，R2是H或-L-芳基(可选地，其被卤素取代)、OR1、C1-6烷基(可选地，其被RA取代)、C(O)R4、-杂环基、C(O)OR4或C2-6炔基，W是-N(R1)R3，其中，R1是被RA取代的环己基，且R3是H。
在一个实施方式中，Z是COOMe、COOEt、四唑或恶二唑。
在一个实施方式中，R2是＝H或-CH2-芳基(可选地，其被卤素取代)、OR1、C1-6烷基(可选地，其被RA取代)、C(O)R4、-杂环基、C(O)OR4或C2-6炔基，其中，所述芳基是苯基。
在一个实施方式中，R2是H、-C1-6亚烷基-杂芳基或-C1-6亚烷基-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式I、IA或IIA，其中，Z是CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；
R2是苄基或H；且
W是NH-L-N(R1)R3，其中，L是C2-4亚烷基或C3-7亚环烷基，且R1和R3是C1-4烷基或H；或者R1和R3与它们所连接的氮原子结合在一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式I、IA或IIA，其中，W是
在另一个实施方式中，所述化合物是
在另一个实施方式中，所述化合物是
根据另一个实施方式，所述化合物是
或优选是
或者它们的盐，
其中，
在式I中，每个Y相同或不同，并且独立地选自N和CH
Z是-C(O)O-C1-4烷基、或-杂芳基，优选地，其包含2～4个选自N和O的杂原子的5元环杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3、或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到相同的氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成5～6元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N和O的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C3-7环烷基或-杂环基，
其中，烷基、环烷基、杂环基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、-C1-6亚烷基-杂芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；或-C1-6亚烷基-芳基(可选地，其在亚烷基或芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H或-C1-6烷基，其中，可选地，烷基基团取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H或-C1-6烷基，其中，可选地，烷基取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3或-NR1C(O)N(R1)R3，且
Rd各自独立地是-H或-C1-6烷基。
根据另一个实施方式，所述化合物是
或其盐，
其中，
Z是-C(O)O-C1-4烷基或-杂芳基，优选地，其是包含2～4个选自N和O的杂原子的5元环杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到相同的氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成5～6元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N和O的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C3-7环烷基或-杂环基，
其中，烷基、环烷基、杂环基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、-C1-6亚烷基-杂芳基(可选地，其在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；或-C1-6亚烷基-芳基(可选地，其在亚烷基或芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基)；
R3各自独立地是-H或-C1-6烷基，其中，可选地，烷基基团取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H或-C1-6烷基，其中，可选地，烷基取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-OR1、-NR1R3、-C(O)OR1、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1或-NR1C(O)N(R1)R3，且
Rd各自独立地是-H或-C1-6烷基。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，
Z是-C(O)O-C1-4烷基或5元环杂芳基，所述杂芳基包含2～4个选自N和O的杂原子；
R2是H、-C1-6亚烷基-杂芳基或-C1-6亚烷基-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基；
W是-X-L-N(R1)R3(其中，X独立地选自O、S、和NR1)或优选为-NR1-L-N(R1)R3，其中，L是C2-4亚烷基或C3-7亚环烷基，且R1和R3是C1-4烷基或H；或者R1和R3与它们所连接的氮原子结合在一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中
Z是CO2Me、COOEt、四唑或恶二唑，Z优选为CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；
R2是H、-C1-6亚烷基-杂芳基或-C1-6亚烷基-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，R2优选为苄基或H；
W是-X-L-N(R1)R3(其中，X独立地选自O、S、和NR1)或优选为-NH-L-N(R1)R3，其中，L是C2-4亚烷基或C3-7亚环烷基，且R1和R3是C1-4烷基或H；或者R1和R3与它们所连接的氮原子结合在一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中
Z是COOMe、COOEt、四唑或恶二唑，Z优选为CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；
R2是H、-C1-6亚烷基-杂芳基(其中，杂芳基是吡啶基、嘧啶基或噻吩基)或-C1-6亚烷基-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，优选的是，R2可选地取代有苄基或H；
W是
或优选为
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐
其中，
Z是CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；
R2是H、-CH2-杂芳基(其中，杂芳基是吡啶基、嘧啶基或噻吩基)或者可选地经取代的苄基，或H；
W是
或优选为
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，
Z是-C(O)OR1或-杂芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R1取代基)，
R2是H、-C1-6烷基(可选地，其取代有一个或多个RA取代基)或者-L-芳基(可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基)。
W是X-L-N(R1)R3(其中，X独立地选自O、S、和NR1)或者优选为-N(R1)R3，其中，R1是被RA取代的C3-7环烷基，并且R3是H。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，Z是-C(O)O-C1-4烷基或5元环杂芳基，所述杂芳基包含2～4个选自N和O的杂原子；R2是H或-L-芳基(可选地，其被卤素取代)、OR1、C1-6烷基(可选地，其被RA取代)、C(O)R4、-杂环基、C(O)OR4或C2-6炔基；W是X-L-N(R1)R3(其中，X独立地选自O、S、和NR1)或者优选为-N(R1)R3，其中R1是被RA取代的环己基，并且R3是H。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，Z是CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；R2是苄基或H；且W是X-L-N(R1)R3(其中，X独立地选自O、S和NR1)或优选为NH-L-N(R1)R3，其中，L是C2-4亚烷基或C3-7亚环烷基，且R1和R3是C1-4烷基或H；或者R1和R3与它们所连接的氮原子结合在一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4。
根据另一个实施方式，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，Z是CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；R2是苄基或H；且W是
或优选为
在实施方式中，所述化合物是下表1中所示化合物#1～90中的一个或多个。
本文公开的包括其制备和表征的式I、II和IIA的化合物(包括上文所示的代表性化合物)在PCT公开号WO 2013/110198中进行描述，将其内容以其整体通过参考并入本文，以及在下面的合成方法部分中找到。这些化合物在下文中称为“本文定义的化合物”。
如本文使用的，术语“烷基”旨在包括具有指定数目碳原子的支链和直链饱和脂肪族烃基，例如C1-C6烷基中的C1-C6被定义为包括具有直链或支链饱和排列的1、2、3、4、5或6个碳的基团。如上定义的C1-C6烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基和己基。如本文所用，术语“环烷基”意指其中具有指定数目的碳原子的单环饱和肪族烃基，例如，C3-C7环烷基中C3-C7被定义为包括具有单环饱和排列的3、4、5、6或7个碳的基团。如上定义的C3-C7环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
如本文使用的，术语，“烯基”意指其中具有指定数目的碳原子的且其中至少两个碳原子通过双键彼此键合的不饱和直链或支链烃基，并具有E或Z区域化学及其组合。例如，C2-C6烯基中的C2-C6被定义为包括具有直链或支链排列的2、3、4、5或6个碳的基团，至少两个碳原子通过双键键合在一起。C2-C6烯基的实例包括但不限于乙烯基(乙烯基)、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基等。
如本文使用的，术语“炔基”意指其中具有指定数目的碳原子且其中至少两个碳原子通过三键键合在一起的不饱和直链烃基。例如，C2-C4炔基被定义为包括在链中具有2、3或4个碳原子的基团，至少两个碳原子通过三键键合在一起。这种炔基的实例包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基等。
如本文使用的，术语“环烯基”意指其中具有指定数目的碳原子的单环饱和脂肪族烃基，例如，C3-C7环烯基中的C3-C7被定义为包括具有单环排列的3、4、5、6或7个碳的基团。如上定义的C3-C7环烯基的实例包括但不限于环戊烯基、环己烯基等。
如本文使用的，术语“卤素”意指氟、氯、溴或碘。
如本文使用的，术语“卤代烷基”意指如上所定义的烷基，其中每个氢原子可以相继被卤素原子替代。卤代烷基的实例包括但不限于CH2F、CHF2和CF3。
如本文使用的，单独或与另一个基团组合的术语“芳基”意指含有6个碳原子的碳环芳族单环基团，其可以进一步稠合到可以是芳族的、饱和或不饱和的第二个5或6元碳环基团。芳基的实例包括但不限于苯基、茚满基、1-萘基、2-萘基、四氢萘基等。芳基可以在环烷基环或芳环上的合适位置连接到另一个基团。
如本文使用的，术语“杂芳基”意指至多10个原子的单环或双环系统，其中，至少一个环是芳族的，并且含有1～4个选自由O、N和S组成的组的杂原子。杂芳基可以经由环碳原子或杂原子中的一个连接。杂芳基的实例包括但不限于噻吩基、苯并咪唑基、苯并[b]噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、呫吨基、2H-吡咯基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基，哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、异噻唑基、异色满基、苯并二氢吡喃基、异恶唑基、呋咱基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、噻唑并[4,5-b]吡啶、四唑基、恶二唑基、噻二唑基、噻吩基、嘧啶并-吲哚基、吡啶并-吲哚基、吡啶并-吡咯并-嘧啶基、吡咯并-二吡啶基和荧光素衍生物。
如本文使用的，术语“杂环”、“杂环的”或“杂环基”意指含有1～4个选自O、N和S组成的组的杂原子的3、4、5、6或7元非芳族环系统。杂环的实例包括但不限于吡咯烷基、四氢呋喃基、哌啶基、3,5-二甲基哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、咪唑烷基、吗啉基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、四氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-2(3H)-酮、二嗪基等，其中与环的连接可以在该环的氮原子或碳原子上，如下文所述：
如本文使用的，术语“可选地取代有一个或多个取代基”或其等同术语“可选地取代有至少一个取代基”意指随后描述的情况事件可以发生或可以不发生，并且该描述包括事件或情况发生的情况和不发生的情况。该定义意指0～5个取代基。
如本文使用的，术语“受试者”或“患者”意指人和非人哺乳动物，诸如灵长类动物、猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔、大鼠、小鼠等。
如果取代基自身与本文所述的合成方法不相容，则可以用对这些方法中使用的反应条件稳定的适合的保护基团(PG)保护取代基。保护基团可以在该方法的反应顺序中的适合的点除去，以提供所需的中间体或靶标化合物。适合的保护基团和使用所述适合的保护基团保护和去保护不同取代基的方法是本领域技术人员熟知的；其实例可以在T.Greene和P.Wuts，“Protecting Groups in Chemical Synthesis”(第4版)，John Wiley&Sons，NY(2007)中找到，以其整体通过引用并入本文。自始自终使用的保护基团的实例包括但不限于Fmoc、Bn、Boc、CBz和COCF3。在某些情况下，可以特异性地选择取代基以使其在本文所述的方法中使用的反应条件下具有反应性。在这些情况下，反应条件将所选择的取代基转化为另一种取代基，另一种取代基可用于本文所述方法中的中间体化合物中或是靶标化合物中的所需取代基。
如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”意指酸和碱的加成盐。
如本文使用的，术语“药学上可接受的酸加成盐”意指保留游离碱的生物学有效性和性质的那些盐，它们不是生物学上或其他方面不期望的，并且其是与诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，以及诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、丁二酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等有机酸形成的盐。
如本文使用的，术语“药学上可接受的碱加成盐”意指保留游离酸的生物学有效性和性质的那些盐，它们不是生物学上或其他方面不期望的。这些盐是通过将无机碱或有机碱加入到游离酸中制备的。源自无机碱的盐包括但不限于钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝的盐等。源自有机碱的盐包括但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括天然存在的取代胺的取代胺的盐、环胺和碱性离子交换树脂的盐，例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等的盐。
根据本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以包含一个或多个不对称中心、手性轴和手性平面，并且因此可以产生对映异构体、非对映异构体和其他立体异构形式，并且可以根据绝对立体化学来定义，诸如(R)-或(S)-，或者对于氨基酸而言(D)-或(L)-。本发明意在包括所有这些可能的异构体，及它们的外消旋和光学纯的形式。光学活性(+)和(-)、(R)-和(S)-、或者(D)-和(L)-异构体可以使用手性合成子或手性试剂制备，或者使用诸如反相HPLC等常规技术进行拆分。可以制备外消旋混合物，然后分离成单独的光学异构体，或者这些光学异构体可以通过手性合成制备。对映体可以通过本领域技术人员已知的方法拆分，例如通过形成非对映异构体盐，然后可以通过结晶，气-液或液相色谱(对映体与对映体特异性试剂的选择性反应)来分离。本领域技术人员还将理解，当通过分离技术将所需的对映体转化成另一种化学实体时，则需要另外的步骤来形成所需的对映体形式。作为另一种选择，可以通过使用光学活性试剂、底物、催化剂或溶剂的不对称合成，或者通过不对称转化将一种对映异构体转化为另一种来合成特定的对映体。
根据本发明的某些化合物可以作为差向异构体的混合物存在。差向异构体是指在相应化合物中存在的两个以上的立体中心中仅一个具有相反构型的非对映异构体。
根据本发明的化合物可以以两性离子形式存在，并且本发明包括这些化合物及其混合物的两性离子形式。
此外，本发明的化合物还可以以水合和无水形式存在。本发明包括本文所述的任何式的化合物的水合物。在另一个实施方式中，根据本文所述的任何式的化合物是一水合物。在本发明的实施方式中，本文所述的化合物包含约10重量％以下、约9重量％以下、约8重量％以下、约7重量％以下、约6重量％以下、约5重量％以下、约4重量％以下、约3重量％以下、约2重量％以下、约1重量％以下、约0.5重量％以下、约0.1重量％以下的水。在其他实施方式中，本文所述的化合物包含约0.1重量％以上、约0.5重量％以上、约1重量％以上、约2重量％以上、约3重量％以上、约4重量％以上、约5重量％以上或约6重量％以上的水。
制备、纯化和/或处理前药形式的化合物可能是方便或需要的。因此，如本文使用的术语“前药”涉及当代谢(例如，体内)时产生所需活性化合物的化合物。通常，前药是无活性的，或是比所需的活性化合物更低的活性，但可以提供有利的处理、施用或代谢性质。除非另有说明，提及特定化合物也包括其前药。
如本文使用的，术语“EC50”意指与载体培养物(DMSO)相比，导致CD34+CD45RA-细胞计数增加50％的浓度。
另一方面，本发明提供了用于增强病毒基因至细胞的转移效率的方法，所述方法包括使细胞群与如本文定义的通式I、IA或IIA的化合物接触；和用病毒载体转导所述细胞。
另一方面，本发明还提供了用于增加用病毒载体培养的细胞群体的转导效率的方法，所述方法包括：在包含至少一种本文所定义的化合物的培养基中培养细胞群体和病毒载体，持续足以增加所述转导效率的时间。在某些方面，使用本文所述的方法转导至少约30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞群体。
另一方面，本发明提供了用于将感兴趣的基因(或感兴趣的多肽)表达到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与至少一种本文所定义的化合物接触；和用包含编码所述感兴趣的基因(或感兴趣的多肽)的核酸的病毒载体转导所述细胞。术语“感兴趣的基因”意指编码蛋白质(天然或突变的)或其活性片段(即感兴趣的多肽)的任何基因。感兴趣的基因可以例如是在给定疾病中不存在或缺陷的基因。
在一个实施方式中，在本文所述的方法和组合物中使用本文所定义的化合物的组合。在另一个实施方式中，本文所定义的化合物可以与已知增加造血细胞转导效率的其他试剂或方法组合使用，例如纤连蛋白或纤连蛋白片段(CH-296)、重组人纤粘连蛋白(retronectin)、HIV Tat、vectofusin-1、脱氧核苷、细胞因子(例如IL-6、SCF、FLT-3配体)、诸如PGE2等调节前列腺素信号传导的化合物(参见WO 2014/026110)和/或mTOR抑制剂(例如雷帕霉素)。
在一个实施方式中，细胞是原代细胞，例如脑/神经细胞、外周血细胞(例如，淋巴细胞、单核细胞)、脐带血细胞、骨髓细胞、心脏细胞、内皮细胞、表皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肝细胞或肺细胞。在一个实施方式中，细胞是骨髓细胞、外周血细胞或脐带血细胞。
在一个实施方式中，细胞是干细胞。如本文使用的术语“干细胞”是指具有使它们分化为功能性成熟细胞的多能性的细胞。它包括原始造血细胞、祖细胞、以及在人体各种组织中发现的未分化的细胞的成体干细胞，它们能自我更新并产生特化细胞类型和组织的细胞来源(例如，肌肉干细胞、皮肤干细胞、脑或神经干细胞、间充质干细胞、肺干细胞、肝脏干细胞)。
在一个实施方式中，细胞是原始造血细胞。如本文使用的，术语“原始造血细胞”用来指具有使它们能够分化为功能性成熟血细胞的多能性的细胞，所述成熟血细胞诸如为粒细胞(例如，早幼粒细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如，网织红细胞、红细胞)、血小板(例如，成巨核细胞、血小板生成巨核细胞、血小板)、和单核细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞)，其在维持其多能性的同时其可以能够或不能够再生(自我更新)。它包括“造血干细胞”或“HSC”，其是同时具有使它们能够分化为诸如粒细胞、红细胞、血小板、单核细胞等功能性成熟细胞的多能性，及保持其多能性的同时能够再生(自我更新)的细胞，以及不具有自我更新能力的多能造血细胞。在一个实施方式中，所述细胞群体包含HSC。HSC可以获自身体或含有造血起源的细胞的身体器官。这些来源包括未分级骨髓(来自股骨、髋关节、肋骨、胸骨、和其他骨头)、脐带血、外周血、肝脏、胸腺、淋巴结和脾。所有上述粗制或未分级血液制品可以以本领域技术人员已知的方式富集具有HSC特征的细胞。HSC通过其小尺寸、缺乏谱系(lin)标志物、用诸如罗丹明123(罗丹明DULL，也称为rho10)或Hoechst33342等活性染料低染色(侧群体)、及在其表面存在/不存在各种抗标志物(许多属于分化系列的簇，例如：CD34、CD38、CD90、CD133、CD105、CD45和c-kit)进行表型鉴定。
在一个实施方式中，细胞群体包括造血干细胞(HSC)。
在一个实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。
如本文使用的，术语“病毒载体”是指能够转导细胞并将其遗传物质引入细胞的重组病毒。可用于基因疗法的病毒载体的实例包括逆转录病毒(慢病毒)、腺病毒、腺病毒相关病毒、疱疹病毒(单纯疱疹病毒)、甲病毒和牛痘病毒(痘病毒)。在一个实施方式中，病毒载体是慢病毒载体。
术语“慢病毒载体”是指包含主要来源于慢病毒的LTR外部的结构和功能遗传元件的载体。慢病毒载体能够在体外和体内提供转基因到非分裂细胞中的有效递送、整合和长期表达。多种慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等(1996a，1996b和1998)；Zufferey等，(1997)；Dull等，1998，美国专利6,013,516号和5,994,136号，其中任意一个可以适于产生用于本发明的方法和组合物中的适合的转移载体。示例性的慢病毒包括但不限于：HIV(人类免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)；维斯那-梅迪病毒(VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马感染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一方面，基于HIV的载体骨架是优选的。在一个实施方式中，慢病毒载体是复制缺陷型慢病毒。
如对本领域技术人员显而易见的，术语“慢病毒载体”用于指介导核酸转移的慢病毒颗粒。慢病毒颗粒通常会包括除核酸以外的各种病毒组分，有时还包括宿主细胞组分。在特定方面，术语“慢病毒载体”、“慢病毒表达载体”用于指慢病毒转移质粒和/或感染性慢病毒颗粒。
在一个实施方式中，慢病毒载体是假型慢病毒载体。假型慢病毒载体由携带来自其他包膜病毒的包膜蛋白(糖蛋白，GP)的载体颗粒组成。这样的颗粒具有包膜蛋白来源的病毒的向性。由于所得假型的非常广泛的向性和稳定性，用于假型慢病毒载体的广泛使用的糖蛋白之一是水泡性口炎病毒GP(VSV-G)。假型慢病毒载体是本领域众所周知的，几个实例例如描述于Cronin等，Curr.Gene Ther.5(4)：387-398。它包括用以下病毒假型化的病毒：狂犬病病毒GP、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)GP、甲病毒属GP(例如，Ross River病毒(RRV)、塞姆利基森林病毒(SFV)和辛德毕斯病毒GP)、丝状病毒GP(例如马尔堡病毒和埃博拉扎伊尔病毒GP)、伽马逆转录病毒GP(例如亲嗜性MLV、双嗜性4070A MLV、10A1 MLV、异嗜性NZB MLV、貂细胞聚集形成病毒、长臂猿白血病(GALV)病毒、RD114GP)和杆状病毒GP(GP64)。
在一个实施方式中，病毒载体是整合缺陷型病毒载体，诸如非整合型腺病毒载体或整合酶缺陷型慢病毒(IDLV)。IDLV可以通过使用使原病毒整合最小化的整合酶蛋白中的突变产生。所得IDLV在转导的靶标细胞中产生环状载体附加体，其通过在分裂细胞中稀释而逐渐丢失(瞬时表达)，但在静止细胞中稳定。与整合慢病毒相比，IDLV固有地具有大大降低的导致插入诱变的风险。因此，IDLV在需要瞬时表达的应用或用于诸如在静止细胞中的持续附加型表达(例如用于接种、癌症疗法、定点基因插入、基因破坏策略和细胞重编程)是特别有用的。IDLV的设计和应用例如描述于Shaw和Cornetta，Biomedicines 2014，2，14-35中。
在另一方面，本发明提供了用于将感兴趣的基因瞬时表达到细胞中的方法，所述方法包括使所述细胞与至少一种本文所定义的化合物接触；和用包含编码所述感兴趣的基因的核酸的非整合型病毒载体转导所述细胞。
在另一方面，本发明提供了慢病毒载体，其包含指导在特定细胞类型或细胞谱系中表达感兴趣的多核苷酸的表达控制序列。细胞类型或细胞谱系表达控制序列的使用提供了在单个谱系中将多核苷酸表达限制到期望的细胞分化阶段的安全优势；因此，本发明的载体缓解了涉及不期望的细胞类型中多肽的异位表达的关注。
在一个实施方式中，表达控制序列可以是指导造血干细胞、造血祖细胞、骨髓样细胞、淋巴样细胞、血小板生成谱系、肥大细胞、红细胞生成谱系细胞、粒细胞生成谱系细胞、和单核细胞生成谱系细胞中的感兴趣的多核苷酸表达的细胞类型或细胞谱系特异性表达控制序列。一方面，载体包含可操作地连接到感兴趣的基因的造血细胞启动子、增强子或启动子/增强子。
感染性病毒颗粒和病毒原液(stock solution)的产生可以使用常规技术进行。制备病毒原液的方法是本领域已知的，例如通过以下所示，Y.Soneoka等.(1995)Nucl.AcidsRes.23：628-633，和N.R.Landau等.(1992)J.Virol.66：5110-5113。
在特定方面中，可以通过在生产细胞中共表达病毒粒子包装元件和转移载体来产生基于HIV-1的病毒颗粒。这些细胞可以用一些质粒进行瞬时转染。通常使用3～4个质粒，但是根据慢病毒组分分解为单独单元的程度，该数目可以更大。例如，一种质粒可以编码来自HIV-1的病毒粒子的核和酶组分。该质粒称为包装质粒。另一种质粒通常编码包膜蛋白，最常见的是水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白，因为其高稳定性和广泛的向性。该质粒可以称为包膜表达质粒。另一种质粒编码待转移到靶标细胞的基因组，即载体本身，并称为转移载体。包装质粒可以通过包括磷酸钙转染、脂质转染或电穿孔的已知技术引入人类细胞系。可以通过该技术及其变体产生具有几百万转导单位(或感染单位，IU)/毫升(TU/ml)的滴度的重组病毒。在超速离心后，可以获得约108TU/ml、109TU/ml、1010TU/ml、1011TU/ml、1012TU/ml或约1013TU/ml的浓缩原液。
可以使用常规技术从包装的细胞收集感染病毒颗粒。例如，如本领域已知的，可以通过细胞裂解或收集细胞培养物的上清液来收集感染颗粒。可选地，如果需要，可以纯化收集的病毒颗粒。适合的纯化技术是本领域技术人员众所周知的。
如本文使用的，术语“转导”是指遗传物质从病毒颗粒(例如，慢病毒)到细胞基因组(例如，原始造血细胞基因组)的稳定转移。它还包括将非整合的病毒载体引入细胞中，其导致存在于病毒载体中的感兴趣的基因的瞬时或附加表达。如本文所用，术语“足以增加转导效率的时间”是指这样的时间段，与不存在本文所定义的化合物的情况下，类似的细胞群体与类似的病毒载体接触相比，细胞群体可以与本文所定义的化合物一起培养，当细胞群体与病毒载体接触时，使得用病毒载体以更高的转导效率转导细胞，其被定义为用病毒载体转导的细胞的百分比。在具体的实施方式中，转导效率的增加表示与用单独的病毒载体处理的未处理细胞相比，用本文所定义的化合物处理的转导细胞富集至少2倍、至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍或至少100倍。
使用本领域众所周知的技术，病毒可以用于在体内、离体或体外感染细胞。例如，当细胞(例如CD34+细胞或干细胞)离体转导时，使用通常为1～100或1～50的感染复数(MOI)的剂量，载体颗粒可以与细胞一起温育，所述剂量也对应于1×105～100或50×105个病毒载体的转导单位/105个细胞。当然，其包括对应于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、和50MOI的载体量。
在一个实施方式中，细胞(例如，原始造血细胞)，可以在用病毒载体转导之前和/或在转导期间与本文所定义的化合物接触(预刺激)。在一个实施方式中，细胞(例如，原始造血细胞)，可以在用病毒载体转导之前与本文所定义的化合物接触(预刺激)。在特定方面中，在转导前将细胞与本文所定义的化合物一起培养至少约1小时或2小时。在其他方面中，在转导前将细胞与本文所定义的化合物一起培养至少约2小时、3小时或4小时。在实施方式中，在转导前将细胞与本文所定义的化合物一起培养约1小时～约24小时、约2小时～约24小时或约2小时～约22小时的时间。在进一步的实施方式中，在转导前将细胞与本文所定义的化合物一起培养约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时或22小时。
在其他方面中，在转导(共刺激)期间，在本文所定义的化合物的存在下培养细胞。在一方面，在转导期间(共刺激)，在本文所定义的化合物的存在下培养细胞至少1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或24小时。在某些其他方面中，在转导的最初24小时期间，或在转导的最初36小时或48小时期间，在本文所定义的化合物的存在下培养细胞。可以在转导期间的任何时间，例如在最初几小时(即最初2小时、3小时或4小时)期间，在转导结束时(在最后2小时、3小时或4小时期间)，和/或在转导期的中间，在本文所定义的化合物的存在下培养细胞。
在另一方面，可以在转导之前(预刺激)和转导期间(共刺激)，在本文所定义的化合物的存在下培养细胞。在特定方面中，在转导后，可冲洗或另外处理细胞群体以去除某些或全部本文所定义的化合物。
可以使用本领域众所周知的方法，基于诸如CD34、CD38和/或CD45RA等某些细胞表面标志物的表达来富集起始细胞群体(即与本文所定义的化合物接触和转导的细胞群体)。因此，起始细胞群体可以例如富含CD34+细胞、CD34+CD45RA-细胞或CD34+CD38-细胞。此外，起始细胞群体可以直接使用或者冷冻并储存以便在稍后的时间点使用。
因此，可以首先对细胞群体进行富集或纯化步骤，其包括基于特异性细胞标志物(CD34、CD38和/或CD45RA)对细胞进行阴性和/或阳性选择，以提供起始细胞群体，例如提供富含HSC的起始细胞群体。基于特异性细胞标志物分离所述起始细胞群体的方法可以使用荧光激活细胞分选(FACS)技术或与特异性细胞表面标志物相互作用的抗体或配体结合的固体或不溶性底物。例如，可以使细胞与含有抗体的固体支撑物(例如，珠的柱、烧瓶、磁性颗粒)接触，并除去任何未结合的细胞。当使用包含磁性或顺磁性珠的固体支撑物时，可以通过磁性分离器(磁性细胞分选，)容易地地分离与珠结合的细胞。在一个实施方式中，起始细胞群体富含CD34+细胞。用于使血液细胞群体富含CD34+细胞的方法包括由Miltenyi (CD34+ direct 试剂盒，Miltenyi Bergisch，Gladbach，德国)或通过(3000)市售的试剂盒。用于从骨髓或血液富集人类造血祖细胞的试剂盒也可商业可得的是(例如，StemSepTM人类造血祖细胞富集试剂盒)。
在一个实施方式中，起始细胞群体源自已富含CD34+细胞的新生儿脐带血细胞。在一个相关实施方式中，所述起始细胞群体源自一个或两个脐带血单位。
在另一个实施方式中，起始细胞群体源自已富含CD34+细胞的人动员的外周血细胞。在一个实施方式中，起始细胞群体可以优选包含至少50％的CD34+细胞，在某些实施方式中，大于60％、70％、80％、90％或95％的CD34+细胞。
在转导之前、期间和/或之后，可以在适合于细胞的维持、生长或增殖的培养基中培养细胞。细胞群体的培养条件将根据不同的因素，特别是起始细胞群体而变化。适合的培养基和条件是本领域众所周知的。就组合物而言，本发明的方法可以在天然培养基、半合成培养基或合成培养基中进行，就形状而言，可以在固体培养基、半固体培养基或液体培养基中进行，用于HSC和/或造血祖细胞培养的任何营养物培养基可以补充有一种或多种上述因子。这样的培养基通常包含钠、钾、钙、镁、磷、氯、氨基酸、维生素、细胞因子、激素、抗生素、血清、脂肪酸、糖类等。在培养中，其他化学组分或生物组分可以根据需要单独或组合掺入。掺入培养基中的这些组分可以是胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、一硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原蛋白、甲基纤维素、各种细胞因子、各种生长因子等。适合于扩增HSC的方法的所述基础培养基的实例包括但不限于StemSpanTM无血清扩增培养基(SFEM)(StemCell Vancouver，加拿大)、StemSpanTMH3000-定义培养基(StemCell Vancouver，加拿大)、CellGroTM、SCGM(CellGenixTM，Freiburg，德国)、StemProTM-34 SFMDulbecco's改良的Eagles's培养基(DMEM)、Ham's营养物混合物H12混合物F12、McCoy's 5A培养基、Eagles's最小必需培养基(EMEM)、αMEM培养基(α改良的Eagles's最小必需培养基)、RPMI 1640培养基、Isocove's改良的Dulbecco's培养基(IMDM)、StemPro34TM X-VIVOTM 10X-VIVOTM 15和StemlineTM II
转导后，转导的细胞可在适于其维持、生长和/或增殖的条件下培养。在特定方面中，将转导的细胞在移植前培养约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天。
用于保持和/或扩增诸如HSC等原始造血细胞的培养条件是本领域众所周知的。通常，培养条件包括使用本领域通常已知的用于HSC扩增的因子，例如细胞因子和生长因子。这样的细胞因子和生长因子可以是生物制剂或小分子，它们包括但不限于IL-1、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF、SCF、FIT3-L、血小板生成素(TPO)、促红细胞生成素及其类似物。如本文使用的，“类似物”包括具有作为天然存在形式的生物活性的细胞因子和生长因子的任何结构变体，其包括但不限于具有比天然存在形式或细胞因子受体激动剂(诸如针对TPO受体的激动剂)抗体增强或降低的生物活性的变体(例如专利公开WO 2007/145227中详述的VB22B sc(Fv)2等)。选择细胞因子和生长因子的组合以维持/扩增HSC和祖细胞，同时限制终末分化的细胞的产生。在一个具体实施方式中，一种或多种细胞因子和生长因子选自由SCF、Flt3-L和TPO组成的组。培养基可以补充促进HSC扩增的因子，包括SR1。此外，考虑到本文所定义的化合物已经显示促进HSC扩增的事实(参见WO 2013/110198)，可以在扩增期期间将该化合物进一步加入培养基中。
人IL-6或白介素-6(也称为B细胞刺激因子2)已通过(Kishimoto，Ann.reviewof1mm.23:1 2005)进行描述并且是可商业可得的。人SCF或干细胞因子(也称为c-kit配体，肥大细胞生长因子或青灰因子)描述于(Smith，M A等，ACTA Haematologica，105，3：143，2001)并且是可商业可得的。Flt3-L或FLT-3配体(也称为FL)是结合flt3受体的因子。其描述于(Hannum C，Nature 368(6472)：643-8)，并且是可商业可得的。TPO或血小板生成素(也称为巨核细胞生长因子(MGDF)或c-Mpl配体)描述于(Kaushansky K(2006).N.Engl.J.Med.354(19)：2034-45)，并且是可商业可得的。
上述化学组分和生物组分不仅可以通过将它们加入到培养基中，而且可以通过将其固定在用于培养的基底或支持物的表面上来使用，具体而言，通过将所用的组分溶解在适当的溶剂中，用所得溶液涂覆基底或支持物，然后洗去多余的组分。可以将待用的此类组分加入到预先用结合到该组分上的物质涂覆的基底或支持物上。
诸如HSC等原始造血细胞可以在通常用于动物细胞培养的培养容器中培养，例如陪替氏培养皿、烧瓶、塑料袋、TeflonTM袋，可选地，其在用细胞外基质或细胞粘附分子的预先涂覆之后进行。这种涂覆材料可以是I～XIX型胶原、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白1～12、氮、腱生蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病因子、骨皮质素、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘蛋白、桥粒芯蛋白(desmocolin)、桥粒核心糖蛋白(desmoglein)、各种整联蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、免疫球蛋白超家族、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、壳多糖、壳聚糖、藻酸凝胶、水凝胶或其片段。这种涂覆材料可以是具有人工修饰的氨基酸序列的重组材料。诸如HSC等原始造血细胞可以通过使用生物反应器来培养，所述生物反应器可以机械控制培养基组成、pH等并获得高密度培养物(chwartz R M，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，88：6760，1991；Koller M R，Bone Marrow Transplant，21：653，1998；Koller，M R，Blood，82：378，1993；Astori G，BoneMarrow Transplant，35：1101，2005)。
然后可以冲洗细胞群体以去除本发明的化合物或组合物和/或细胞培养物的任何其他组分，并重悬浮于适当的细胞悬浮培养基中，以用于短期使用或用在长期存储的培养基中，例如适合于冷冻保存的培养基，例如具有40％FCS和10％DMSO的DMEM。用于制备培养细胞的冷冻原液的其他方法对于本领域技术人员也是可得的。
本发明还提供通过本文所述的方法获得的转导细胞群体。本发明还提供了包含通过本文所述的方法获得的转导细胞的细胞群体。在一个实施方式中，细胞群体包含至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的转导细胞，即其包含病毒载体和/或表达在病毒载体中存在的感兴趣的基因。
本发明进一步涉及包含在培养基中的细胞培养物的基于细胞的组合物，所述培养基包含病毒载体和至少一种本文所定义的化合物。如本文通篇所述，在特定方面中，本发明组合物和方法对于离体和体内基于细胞的基因疗法是有用的。在某些方面中，细胞培养基是药学上可接受的细胞培养基。
本发明的制剂和组合物可以包含配制在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液(例如，培养基)中的转导或非转导细胞或其组合、病毒载体、多肽、多核苷酸、和一种或多种化合物(例如本文所定义的化合物)的任何数量的组合，其用于单独或与一种或多种其他治疗形式组合施用于细胞、组织、器官或动物。
本发明进一步包括药物组合物，其包含根据本文所述方法产生的转导细胞和药学上可接受的载剂。在其他方面中，本发明提供了药物组合物，其包含病毒载体和一种或多种本文所定义的化合物。
短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备在本领域是众所周知的。通常，将这样的组合物制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制剂也可以是乳化的。
如本文使用的，“载剂”包括任何和全部溶剂、分散介质、载体、涂料、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载剂溶液、悬浮液、胶体等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。也可以将补充的活性成分掺入组合物中。
如本文使用的“药学上可接受的载剂”包括生理上相容的任何和全部溶剂、分散介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，其包括药学上可接受的细胞培养基。在一方面，包含载剂的组合物适合于肠外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌内施用。药学上可接受的载剂包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。所述介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与转导细胞不相容，否则考虑其在本发明的药物组合物中的用途。
本发明的组合物可以包含配制在药学上可接受的或生理学上可接受的溶液中的一种或多种多肽、多核苷酸、包含其的载体、化合物和转导的细胞等，以用于单独或与一种或多种其他治疗方式组合施用于细胞或动物。还应理解的是，如果需要，本发明的组合物也可以与其他试剂组合施用，例如细胞因子、生长因子、激素、小分子或各种药学活性剂。
在特定方面中，用本发明的病毒载体转导的宿主细胞或靶标细胞表达治疗性多肽，并施用于受试者以治疗和/或预防疾病、紊乱或病症。
转导细胞和相应的病毒载体提供改善的基因疗法。如本文使用的，术语“基因疗法”是指将基因引入细胞的基因组中。在各个方面中，本发明的病毒载体包含表达编码多肽的治疗性转基因的造血表达控制序列，所述治疗性转基因为诊断为或怀疑患有单基因疾病、紊乱或疾病，或者的适于造血干细胞治疗的疾病、紊乱或病症的受试者提供治疗性、预防性或改善益处。
本发明考虑本发明的载体、病毒颗粒和转导细胞用于在受试者中治疗、预防和/或改善造血系统的单基因疾病、紊乱或病症或者造血系统的疾病、紊乱或病症，例如血红蛋白病。血红蛋白病是指涉及血液中存在异常血红蛋白分子的病症。血红蛋白病的实例包括但不限于血红蛋白C病、血红蛋白镰状细胞病(SCD)、镰状细胞性贫血、和地中海贫血。还考虑治疗、预防和/或改善适于基于HSC的基因疗法的其他疾病，其包括某些血液学和溶酶体贮积疾病(诸如威斯科特-奥尔德里奇综合症(WAS)(Aiuti等，Science 341(6148))、异染性脑白质营养不良(MLD)(Biffi等，Science 341(6148))、白细胞粘附缺陷、X连锁CGD、范可尼贫血、肾上腺脑白质营养不良、粘多糖病IIIA)，免疫缺陷(诸如严重联合免疫缺陷(SCID)和腺苷脱氨酶(ADA)缺乏)，和感染性疾病(诸如HIV(Watts等，Cytotherapy 13(10)：1164-71))。对于这样的治疗，病毒载体包含编码一种或多种在疾病中有缺陷的蛋白质的核酸。病毒载体(例如整合缺陷型病毒载体)还可以例如包含编码抗原或免疫原(用于疫苗接种)或一种或多种分化因子(用于细胞重编程)的核酸。
本发明还提供了治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的转导细胞群体或包含本文所定义的转导细胞群体的药物组合物。在一个实施方式中，所述方法包括：(i)在本文所定义的通式I化合物存在下将病毒载体转导入来自所述受试者的细胞中，从而获得包含转导细胞的群体；和(ii)对所述受试者施用有效量的(i)中获得的包含转导细胞的群体，或包含所述含转导细胞群体的药物组合物。
本发明还提供了包含通过本文所定义的方法获得的转导细胞(或包含其的药物组合物)群体用于治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的用途。本发明还提供了包含通过本文所定义的方法(或包含其的药物组合物)获得的转导细胞群体在制备用于治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的药物中的用途。在一个实施方式中，所述用途包括：(i)进行将病毒载体转导入本文所定义的细胞中以获得包含转导细胞的群体的方法，和(ii)使用(i)中获得的包含转导细胞的群体(或包含其的药物组合物)以治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者。
包含转导细胞的药物组合物以用于本文所述方法的任何常规方式配制。通过本领域普通技术人员已知有效的任何途径进行施用。例如，组合物经口、肠胃外(例如静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、经皮、体外、鼻内或局部施用。
优选的施用方法是静脉内输注。输入的细胞数量将考虑诸如性别、年龄、体重、疾病或病症的类型、病症的阶段、细胞群体中所需细胞的百分比和产生治疗益处所需细胞的量等因素。在一个具体的实施方式中，组合物通过静脉内输注施用，并且对于脐带血包含至少≥0.3×105个CD34+细胞/kg或>2×106个CD34+细胞，对于骨髓或动员外周血细胞包含2.5×105个CD34+细胞/kg以上。
本文还提供了试剂盒，其包含填充有一种或多种本文所述组分的一个或多个容器。可选地，所述试剂盒包含需要或期望的溶液和缓冲液。可选地，试剂盒包含通过上述方法制备的细胞群体，例如干细胞，或者可以包含用于制备HSC群体的容器或组合物。特别是，本发明提供了用于离体转导诸如原始造血细胞(例如，造血干细胞)等细胞的试剂盒，其包含本文所定义的化合物，及在细胞转导方法中使用这种化合物的说明书，及可选地，一种或多种细胞因子，或用于细胞生长的培养基，特别是用于如上所述的HSC生长的培养基。试剂盒可以进一步包含用于转导细胞的病毒载体，例如包含感兴趣的基因的病毒载体。试剂盒可以进一步包含用于监测细胞产生的抗体，例如抗CD34、抗CD38和/或抗CD45RA抗体。在一个具体的实施方式中，这样的试剂盒进一步包含选自由IL6、FLT3-L、SCF和TPO组成的组中的一种或多种细胞扩增因子。
本发明的方法和组合物可用于其中高基因转移是有利条件的各种应用，包括体外研究(例如，基因的功能研究、具有特定功能的基因的筛选、基因表达分析、基因编辑)，体内研究(例如，功能性研究、基因疗法途径的评估)。
不希望受任何特定理论的束缚，预期本发明的组合物和方法可用于以显著更少的病毒转导显著更多的细胞，从而使治疗性细胞的基因组中原癌基因的基因组改变和/或插入激活的风险最小化。最小化原癌基因的插入激活和治疗性细胞中其他基因组改变的风险是设计合适的基因疗法方案的重要考虑因素，因为其使包含癌样特征的转导细胞在体内克隆扩增并产生癌症、肿瘤或涉及异常细胞增殖的其他疾病的机会最小化。此外，本领域已经注意到，使用大量病毒的转导通常对转导的细胞具有细胞毒性。因此，本发明的组合物和方法进一步增强转导细胞的存活性。因此，本发明提供了更安全和更有效的基因疗法。
除非本文中另有说明，否则本文中数值范围的列举仅旨在用作单独涉及落在该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值如同其在本文中单独列举一样并入本说明书中。该范围内的值的所有子集也如同它们在本文中单独列举一样并入本说明书中。
类似地，本文中具有各种取代基和针对这些取代基列举的各种残基的一般化学结构旨在用作分别指通过任何取代基的任何残基的组合获得的每个和每种分子用于任何取代基的简化方法。每个单独的分子如同其在本文中被单独引用一样并入本说明书中。此外，一般化学结构内的分子的所有子集也如同它们在本文中单独引用一样并入本说明书中。
本文中，术语“约”具有其通常的含义。术语“约”用于表示包括用于确定该值的装置或方法的误差的固有变化的值，或包括接近所述值的值，例如在所述值(或值的范围)的10％或5％内。
执行本发明的方式
本发明通过以下非限制性实施例进一步详细说明。
与实施例1相关的材料和方法(图1～4)
人CD34+脐带血细胞收集
使用RosetteSepTM CD34预富集混合物分离人CD34+脐带血(CB)细胞，然后使用EasySepTM(StemCell Technologies)进行CD34阳性选择。
CD34+细胞培养
将人CD34+细胞在由StemSpan SFEM(StemCell Technologies)组成的HSC扩增培养基中培养，所述培养基补充有人100ng/ml干细胞因子(SCF，R&D Systems)、100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3，R&D Systems)、50ng/ml血小板生成素(TPO，R&D Systems)、和10g/ml低密度脂蛋白(StemCell Technologies)。
化合物
Cmpd1[35nM]、SR1(Alichem，41864)[750nM]或者Cmpd1[35nM]+SR1[500nM]的组合。
慢病毒载体制备
用以下质粒对HEK293细胞进行共转染：pCCL-c-MNDU-eGFP、pCMV-Gag/Pol(PLP1；sigma)、pRSV-Rev(PLP2；sigma)和pCMV-VSV/G(PLP；sigma)或pCMV-RDT。转染后48小时后收集慢病毒汤状物。通过PEG-itTM(System Biosciences)沉淀浓缩慢病毒颗粒。在HEK293细胞上进行病毒滴度测量。为了增强慢病毒介导的基因转移，根据制造商的指南将慢病毒预装载到RetroNectin(Takara)包被的平板中。
人CD34+CB细胞转导
新鲜的(24小时或48小时预刺激的)或培养的CD34+CB细胞通过MOI为10、50或100的VSV或RDT包膜的GFP病毒转导12小时或16小时。然后冲洗细胞，并在感染后保持培养中3天或10天。进行FACS分析以监测GFP转导的细胞在总的、CD34+或CD34+CD45RA-群体的百分比。
流式细胞术
在BD LSR II细胞仪上进行流式细胞分析。新鲜的或培养的GFP-转导的CD34+CB细胞在4℃在补充有2％胎牛血清(FBS)的PBS中用APC-标记的抗人CD34(BD Biosciences)和PE-标记的抗人CD45RA(BD Biosciences)染色15分钟。使用BD FACSDivaTM软件进行数据分析。
异种移植
所有使用动物的实验在由蒙特利尔大学的动物委员会批准的方案下进行。通过尾静脉注射将对于10天的载体(DMSO)或Cmpd1[35nM]而言经GFP-转导或未扩增的1000个CD34+CB细胞的后代移植到亚致死性照射(250cGy，<移植前24小时)8周～12周龄的雌性NSG(NODScidlL2Rγnull，Jackson Laboratory)中。在移植后30周通过流式细胞术监测NSG骨髓(BM)中的人细胞。通过冲洗两个股骨、胫骨和髋部收集NSG BM细胞。然后用1×红细胞裂解缓冲液(StemCell Technologies)处理细胞，并用太平洋蓝标记的抗人CD45(BioLegend)、APC-eFluo-标记的780抗小鼠CD45(eBioscience)染色以监测NSG BM细胞中的人血液重建。
实施例1～9涉及的材料和方法(图5～20)
病毒载体和病毒生产
除非另有说明，在这些研究中使用pCCI-c-MNDUSpgkGFP或pCCI-c-MNDUSpgkYFP慢病毒载体骨架(Logan AC等，Human Gene Therapy 2004)。对载体构建体进行序列验证。通过使用标准的4-质粒包装系统瞬时转染293T细胞产生用水泡性口炎病毒糖蛋白-G假型化的高滴度重组病毒。通过超速离心浓缩含病毒的上清液以达到0.5×109～5×109感染单位/ml的滴度。通过用慢病毒载体的三个稀释液转导HeLa细胞来测定病毒滴度。对于慢病毒的非整合制剂的测试，在修饰的骨髓增生性肉瘤病毒LTR(MND-GFP-IDLV)的控制下表达GFP的慢病毒载体的病毒上清液(Dr.Donald Kohn赠与，微生物学、免疫学和分子遗传学系和儿科系，加州大学洛杉矶分校)，使用催化失活的整合酶产生(Joglekar AV等，Mol Ther.2013年9月；21(9)：1705-17，PMID 23857176)。
人脐带血、动员的外周血和成体骨髓细胞的分离和培养
根据英属哥伦比亚大学研究伦理委员会批准的程序同意收集脐带血(CB)和动员的外周血(mPB)细胞。CD34+富集的成体骨髓细胞购自STEMCELL Technologies。使用第一RosetteSepTM CD34预富集混合物(STEMCELL Technologies)将CD34+CB和mPB细胞富集至>90％的纯度，然后使用磁珠(EasySep试剂盒，STEMCELL Technologies)进行阳性选择。在某些情况下，通过使用Influx II分选仪(BD Bioscience)分选CD34+细胞进行额外的富集。CD34+CB细胞在补充有100ng/mL FLT3-配体(FL)、100ng/mL青灰因子(Steel Factor，SF)、20ng/mL IL-3、IL-6和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(全部来自STEMCELL Technologies)的无血清培养基(SFM；补充有牛血清白蛋白、胰岛素和转铁蛋白(BIT，STEMCELLTechnologies)、10μg/ml低密度脂蛋白(LDL，STEMCELL Technologies)、10-4M 2-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)、10-4M glutamax 500(STEMCELL Technologies)、青霉素和链霉素的Iscove's培养基)中预刺激16小时。在一个实验中，CB细胞在仅有3种生长因子(100ng/mLFL、100ng/mL SF和50ng/mL TPO(STEMCELL Technologies))的存在下预刺激。成体BM和mPBCD34+细胞在补充有100ng/mL FL、100ng/mL青灰因子SF、100ng/mL TPO和20ng/mL IL-3的SFM中预刺激24小时。细胞在存在或不存在Cmpd1(35nM)、SR1(0.75μΜ)或DMSO(不超过0.01％)时进行预刺激。在一个实验中，在存在或不存在Cmpd1(35nM)时，在预刺激期期间加入雷帕霉素(10μg/mL)。
人CD34+细胞的转导
在预刺激结束时，将细胞重悬于补充新鲜生长因子的SFM中，所述SFM具有浓缩的慢病毒(GFP或YFP，在一个实验中，还使用珠蛋白、NA10HD、MN1、和ND13病毒)和5μg/mL硫酸鱼精蛋白，并在1×106IU/mL或1×107IU/mL的病毒浓度下在37℃温育6小时(对于)，和24小时(对于BM和mPB细胞)，并置于包被有5μg/cm2纤连蛋白(Sigma-Aldrich)的96孔板上。在存在或不存在Cmpd1(35nM)、SR1(0.75μΜ)或DMSO(不超过0.01％)的情况下转导细胞。在一个实验中，还在存在或不存在Cmpd1(35nM)的情况下在雷帕霉素(10μg/mL)的存在下转导细胞。在感染结束时，用PBS冲洗细胞几次，并用于体内实验，并在补充新鲜生长因子的SFM中再培养72小时。用以下抗人特异性抗体(全部来自eBioscience，除非另有说明)在细胞染色后测定基因转移至各种CD34+细胞亚群的效率：CD34-APC(克隆8G 12，STEMCELLTechnologies)、CD38-PECy7(克隆HIT2)、Thy1-PE(克隆eBio5E10)、CD45RA-APC780(克隆HI100)和CD49f-EF450(克隆eBioGoH3)。所有流式细胞分析使用LSRII (BDBiosciences)进行。
小鼠
NOD.Cg-Prkdcscid II2rγtm1Wj1/SzJ(NOD/SCID-IL-2rγC-null，NSG)(最初获自Jackson Labs)小鼠在英属哥伦比亚癌症研究中心的动物资源中心繁殖。所有小鼠实验程序由英属哥伦比亚大学批准根据加拿大动物保护委员会指南进行。
异种移植和体内跟踪在小鼠中转导的人细胞
在异种移植研究中，在移植前24小时对8周～12周龄的NSG小鼠进行亚致死性照射(137Csγ射线的315cGy)24小时。在竞争性再增殖测定中，在存在Cmpd1和存在DMSO时每只小鼠静脉内注射20,000个CD34+CB转导细胞的后代。对于有限稀释实验，在Cmpd1或DMSO的存在下，小鼠接受20,000个、4,000个或800个CD34+CB转导细胞的后代。通过在移植后3周、12周、20周和25周的BM抽吸以及对表达GFP和YFP的人细胞进行的FACS分析，监测NSG骨髓(BM)中的人淋巴-骨髓样重建30周。在红细胞裂解后，将BM细胞与封闭试剂(具有2％FBS、5％人血清、抗CD16/CD32抗体(2.4G2)的PBS)温育，并用以下抗人特异性抗体染色：CD45-Alexa700(克隆HI30，Biolegend)、CD33-PECY7(克隆WM-53，eBioscience)、CD19-PE(克隆，HIB19，Biolegend)、CD20-PE(克隆L27，StemCell Technologies)。每只小鼠分析最少200,000个BM细胞。全部流式细胞分析使用LSRII(BD Biosciences)进行。全部流式细胞数据使用软件(Version 8.8，TreeStar)分析。
移植和转导猕猴动员的BM细胞的体内跟踪
将G-CSF/SCF动员的BM CD34+细胞分成两部分。在SR1(1μΜ)和细胞因子(青灰因子、FLT3-L和TPO)的存在下，用表达mCherry的慢病毒转导一部分，在SR1和Cmpd1(40nM)和相同的细胞因子的存在下用表达GFP的慢病毒转导第二部分。在存在或不存在Cmpd1(40nM)的情况下扩增10天后，在动物接受清髓性预处理(1020cGy照射)后，将两种基因修饰的细胞部分共同输注到原始HSC猕猴供体中。
统计分析
结果显示为平均值±SEM或SD和几何值±SD。使用在prism graphpad上直接计算的学生t检验(成对的或不成对的，选择适当的)评估组之间的差异。*P值<0.05被认为是显著的。
实施例1：Cmpd1增强慢病毒基因转移至人类造血细胞的效率。
图1显示用Cmpd1和SR1扩增的人CD34+脐带血(CB)细胞比未操作的细胞更有效地转导。在转导后3天和10天，与DMSO对照相比，Cmpd1处理的细胞显示更高百分比的GFP转导的CD34+和CD34+CD45RA-细胞(图2)。图3和4显示，与DMSO对照相比，GFP转导和扩增的Cmpd1-CD34+CB细胞显示人CD45植入的更好的移入潜能。同时，图5A和5B中描绘的数据表明，如对来自脐带血的富含CD34+干细胞/祖细胞的细胞在感染后3天所评估得，人造血细胞对Cmpd1的短期暴露可以显著增强慢病毒介导的基因转移，增强约70％。这种差异是统计学显著的，并且SR1未观察到，SR1为另一种具有刺激原始人类造血细胞扩增能力的小分子。
实施例2：仅在预刺激或转导期期间短期暴露于Cmpd1，足以在广泛的滴度范围内增强慢病毒介导的对原始人类造血细胞的基因转移。
图6A～6G中描述的结果证明Cmpd1对基因转移的刺激效在宽范围的病毒滴度中存在。在较低的病毒浓度下，其效果强烈。例如，病毒浓度为105的基因转移等价于仅在不存在Cmpd1时约100倍以上的病毒浓度实现的基因转移。即使在使用最高病毒浓度时，当细胞在预刺激或转导期期间暴露于Cmpd1时，存在增强的基因转移。重要的是，该效果在高度纯化的造血细胞亚群中是明显的，其包括包含HSC的CD34+CD38-和CD34+CD45RA-。另外感兴趣的是，即使在短期暴露于Cmpd1的情况下，包括转导细胞的各种CD34+亚群的产率也有额外的增加。
实施例3：对Cmpd1的短期暴露(22小时)增强了基因转移至人类HSC。
图7A～7H中描述的数据显示Cmpd1增强基因转移至真正淋巴-骨髓样长期再增殖细胞(HSC)。通过使用竞争性移植方法，在存在或不存在Cmpd1的情况下转导的细胞直接在相同接收者中针对体内再增殖进行评估，提供独特的能力来解决差异。与造血亚群体的体外分析显示的相比，Cmpd1的增强的量度是9倍或甚至更大。这可能是由于与晚期细胞相比，Cmpd1对真正HSC的基因转移的甚至更大的影响，以及甚至在短(22小时)培养期间HSC产率的可能增强。
实施例4：在NSG小鼠中Cmpd1刺激基因转移至人CD34+CB细胞(体外)和人HSC的增强。
图8A～8E和图9A～9D中描述的结果证实了Cmpd1对刺激基因转移至人脐带血HSC的显著影响。图9A～9D证实了在体外和在使用不同来源的CB和病毒的移植后评估的基因转移至CB细胞的的增强。不论细胞是否暴露于Cmpd1，在移植接收者中观察到等同的嵌合体总水平，因此提供了Cmpd1对HSC产率没有显著影响的证据。然而，来自标记的GFP细胞的嵌合体的评估证实当在Cmpd1存在下转导细胞时显著增加。这种增加在一定范围的移植剂量下是明显的。在此实验中评估的基因转移至HSC的总体增加为约16倍。
实施例5：短期暴露于Cmpd1仅2小时增加了基因转移至原始人类造血细胞的效率。
图10A～10Q显示在转导期的开始(条件IV)或结束(条件V)时，细胞暴露仅2小时，观察到基因转移至CD34+细胞和CD34+亚群的显著增加。在转导期结束时暴露2小时达到转导细胞的最大基因转移和产率，并且其等同于在整个预刺激(16小时，条件III)期间暴露所达到的转移。重要的是，高度富含HSC/祖细胞(CD34+CD38-CD45RA-CD90+)的大量CD34+细胞和亚群观察到这些结果。同时，图11A和11B中描述的数据显示在无预刺激时暴露于Cmpd1的所有条件下都观察到增加的基因转移和产率，其包括在转导期的前2小时或最后2小时内仅暴露2小时。
实施例6：Cmpd1增加基因转移至扩展到成体骨髓和成体动员的外周血来源的原始造血细胞的能力。
图12A和12B中描绘的数据提供了Cmpd1增强基因转移至除脐带血中的细胞以外，包括成体骨髓和成体动员的外周血来源的原始造血细胞的能力的证据。
实施例7：使用具有不同包膜的慢病毒载体，非整合型慢病毒，并且在不同条件下暴露于Cmpd1增加了基因转移至CD34+CB细胞的效率。
Cmpd1增强了使用用VSV-G和RD114(图13A和13B)假型化(携带包膜)的慢病毒的基因转移，因此表明Cmpd1可以增强在更宽范围的假型病毒中的基因转移。图13D进一步显示Cmpd1增强了使用催化失活的整合酶产生的慢病毒的瞬时基因转移效率，因此使慢病毒非整合(整合缺陷型慢病毒，IDLV)。图14和14B的结果证明了Cmpd1刺激基因转移至原始人造血细胞的能力不限于特定的生长因子混合物，而是出现在于不同生长因子组合存在下培养的细胞中。此外，图15A～15D中描绘的数据表明Cmpd1刺激基因转移至原始人类造血细胞的能力扩展至多个慢病毒载体，因此不限于独特的载体。
实施例8：基因转移至原始人造血细胞的增强与对于扩增刺激有活性的Cmpd1变体相关。
图16A和16B显示已知对人CD34+细胞(化合物3～6)的扩增具有活性的Cmpd1和Cmpd1的其他变体增加了基因转移至人CD34+CB细胞和不同CD34+亚群的效率。同时，对于Cmpd1的较少活性变体(化合物7和8)没有观察到这种增强效果。
下表说明了化合物及其在扩增人CD34+细胞中的功效。这些化合物中的一些已经在WO 2013/110198和PCT/CA2015/050330中说明。
表1.实施例的结构、分析HPLC保留时间、LCMS数据和生物学数据。
EC50定义为相对于载体培养物(DMSO)，导致CD34+CD45RA-的细胞计数增加50％时的浓度。*EC50：A>1000nM；B＝500-1000nM；C＝250-500nM；D＝100-250；E＝<100nM；F＝化合物显示>1.3倍的扩增。
实施例9：Cmpd1增强来自猕猴骨髓的基因修饰的CD34+和LT-HSC样细胞的转导和扩增。
图17A～17C显示在Cmpd1存在下，移植后移植小鼠的血液中灵长类动物CD45+细胞的比例增加，这是SR1不能获得的效果。图18A～18G和19A～19E显示在Cmpd1存在下，转导后经标记的猴细胞的百分比增加；当细胞感染然后在Cmpd1存在下培养7天时，转导的CD34+细胞的产率增加；在用于Cmpd1存在下体外转导和扩增的细胞移植的猴中经标记细胞的比例增加。
实施例10：Cmpd1与雷帕霉素协同以增强慢病毒基因转移至人类造血细胞的效率。
图20A～20E显示在用Cmpd1和雷帕霉素的组合处理的细胞中慢病毒基因转移至CD34+细胞和CD34+亚群的增加，高于仅用Cmpd1或仅用雷帕霉素处理的细胞，表明这两种化合物协同增强慢病毒基因转移至人类造血细胞的效率。
实施例11：合成方法
化合物1～4的合成方法呈现于WO 2013/110198。对于化合物5～8，使用以下合成方法。以下概述的合成方法涉及本发明的实施方式，其中取代基Z位于嘧啶并吲哚核的7-位。如本领域技术人员将会理解的，对于其中取代基Z在不同的位置，例如在5、8或6位，特别是在6位的本发明的实施方式，可以进行具有对于技术人员是显而易见变化的类似合成方法。
方案1描述了本发明化合物的共同前体(1-VI)的合成。在第一步骤中，在诸如但不限于氢化钠等碱的存在下，用氰基乙酸烷基酯1-II处理芳基氟化物1-I。然后用诸如但不限于锌粉等还原剂在乙酸中处理所得产物1-III以提供氨基吲哚1-IV，其在用甲酰胺和甲酸铵处理时转化为嘧啶1-V。用诸如磷酰氯或磷酰溴等试剂处理化合物1-V，以提供反应性中间体1-VI，其用胺1-VII处理从而提供本发明的化合物1-VIII。
Base＝碱Reducing agent＝还原剂acid＝酸activating agent＝活化剂heat＝加热
实施例
一般
报告的HPLC保留时间用于使用以下条件的反相HPLC(Agilent，1200系列)：溶剂A：MeOH:H2O:TFA(5:95:0.05)；溶剂B：MeOH:H2O:TFA(95:5:0.05)；流速：3.0mL/min；梯度0～100％B，2.0分钟；柱：ZorbaxC18，3.5微米，4.6×30mm：波长220nm。
使用以下LC条件在来自Agilent Technologies的6210G1969A LC/MSD TOF光谱仪或在来自Agilent Technologies的Quadrupole LC/MS(型号：G6120B)记录质谱：溶剂A：AcCN:H2O:HCOOH(5:95:0.05)；溶剂B：AcCN:H2O:HCOOH(95:5:0.05)；梯度0～100％B，2.0分钟；流速：0.3mL/min；柱：ZorbaxC18，3.5微米，2.1×30mm：波长220nm。
化合物5
将4-氟苄腈(5g，41.3mmol)、二丁基氧化锡(2.055g，8.26mmol)、和三甲基甲硅烷基叠氮化物(8.22mL，61.9mmol)在甲苯(165mL)中的混合物加热至100℃并搅拌16.5小时。冷却至室温后，有机层用1M NaOH(83mL)萃取，水性层用EtOAc(2×85mL)冲洗。将水性层用2M HCl(41.3mL)酸化至pH 2。将水性混合物用EtOAc(200mL，然后100mL)萃取两次，将合并的有机层用盐水(60mL)冲洗，用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩至干燥，得到白色固体的中间体1A，(5-(4-氟苯基)-2H-四唑，6.61g，98％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 7.42-7.53(m，2H)8.04-8.14(m，2H)；MS m/z 165.2(M+H)+；HPLC>99.5％，RT＝1.96分钟。
将中间体1A(6.61g，40.3mmol)、K2CO3(6.68g，48.3mmol)、和碘甲烷(3.02mL，48.3mmol)在乙腈(115mL)中的混合物加热至回流(约82℃)1小时。冷却后，将混合物浓缩至干燥，残余物在水(75mL)和EtOAc(100mL)之间分配。分离各层，水性层用EtOAc(50mL)反萃取，将合并的有机层用水(50mL)和盐水(50mL)冲洗。用无水MgSO4干燥有机层，过滤并浓缩，得到9.5g无色油状物，其在放置后固化。通过快速色谱法纯化残余物，得到2种主要产物：作为白色固体的中间体1B(N2异构体)：5-(4-氟苯基)-2-甲基-2H-四唑(5.09g，70.9％产率)：在4.42ppm处的甲基和芳族质子之间未观察到NOE；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.42(s，3H)7.33-7.45(m，2H)8.03-8.14(m，2H)；MS m/z 179.2(M+H)+；HPLC>99.5％，RT＝1.75分钟。
N1异构体：作为白色固体的5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-四唑(1.87g，26.1％产率)：在4.16ppm的甲基和7.89ppm～7.97ppm处的两个芳族质子之间观察到的NOE确认了此结构；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.16(s，3H)7.43-7.53(m，2H)7.89-7.97(m，2H)；MS m/z179.2(M+H)+；HPLC>99.5％，RT＝1.29分钟。
将中间体1B(1g，5.61mmol)在硫酸(16.45mL，309mmol)中的溶液冷却至0℃，然后滴加发烟硝酸(0.288mL，6.17mmol)。2.5小时后，加入更多的发烟硝酸(0.065mL，1.403mmol)，将混合物温热至20℃。5小时后，将混合物倒入2:1冰-水混合物(150mL)中，从而形成白色悬浮液。30分钟后，过滤固体，用水冲洗(4×10mL，直到冲洗液为中性pH)，在25℃时在高真空下干燥直至恒重，得到作为米白色(off white)固体的5-(4-氟-3-硝基苯基)-2-甲基-2H-四唑(1.16g，93％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.47(s，3H)7.81(dd，J＝11.2，8.8Hz，1H)8.44(ddd，J＝8.7，4.2，2.3Hz，1H)8.68(dd，J＝7.2，2.2Hz，1H)；MSm/z 224.2(M+H)+；HPLC 98.3％，RT＝1.72分钟。
向溶解在DMF(5.67mL)中的矿物油(0.443g，11.08mmol)中的60重量％氢化钠的冷(0℃)悬浮液加入2-氰基乙酰胺(0.888g，10.56mmol)在DMF中的溶液(注意：氢气释放)。将所得混合物在0℃下搅拌30分钟。然后加入5-(4-氟-3-硝基苯基)-2-甲基-2H-四唑(1.15g，5.15mmol)在DMF(2.3mL)中的溶液，得到深紫色溶液。3小时后，将反应混合物缓慢倒入冰-水混合物(33.0mL)和浓HCl(0.952mL)中。将所得黄色浆液搅拌30分钟，过滤固体，用水(3×5mL)冲洗，然后用己烷(2×5mL)冲洗，在40℃时高真空干燥直至恒重，得到作为黄色固体的中间体1C(2-氰基-2-(4-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-2-硝基苯基)乙酰胺)(1.41g，95％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.49(s，3H)5.77(s，1H)7.77(s，1H)7.95(d，J＝8.2Hz，1H)8.03(s，1H)8.51(dd，J＝8.2，1.8Hz，1H)8.70(d，J＝1.8Hz，1H)；MS m/z 288.1(M+H)+；HPLC 96.4％@220nm，RT＝1.31分钟。
将三氯化铁六水合物(2.82g，10.44mmol)和锌(2.276g，34.8mmol)分批加入到2-氰基-2-(4-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-2-硝基苯基)乙酰胺(1g，3.48mmol)在DMF(8.71mL)和水(8.71mL)中的混合物中，得到黄色悬浮液，将其加热至100℃持续1.25小时。然后将混合物冷却至20℃，用MeOH(50.0mL)稀释，经硅藻土过滤并在减压下浓缩至约20mL(以除去大部分MeOH)。然后将混合物用水(50mL)和EtOAc(100mL)稀释，剧烈搅拌并过滤。水性层用EtOAc(2×50mL)萃取，合并的有机层用饱和NaHCO3(50mL)和盐水(50mL)冲洗。有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到489mg紫色固体，将其通过快速色谱纯化，得到作为紫色固体的中间体1D(2-氨基-6-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-1H-吲哚-3-甲酰胺)(356mg，39.7％产率)；1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.38(s，3H)6.57(s，2H)7.01(s，2H)7.61-7.69(m，2H)7.81(s，1H)10.77(s，1H)；MS m/z 258.2(M+H)+；HPLC约78％，RT＝1.34分钟。
将在甲醇(3.03mL)中的中间体1D(2-氨基-6-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-1H-吲哚-3-甲酰胺，0.35g，1.361mmol)、2-苯基乙酸甲酯(0.288mL，2.041mmol)和在MeOH(0.467mL)中的25重量％的甲醇钠的混合物在微波炉中加热至140℃持续1小时。冷却至室温并用水(1mL)和AcOH(4mL)稀释后，将混合物搅拌30分钟以使其结晶。将固体过滤，用MeOH(5×1mL)洗涤，并在40℃时在高真空下干燥直至恒重，得到作为棕色固体的2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-醇(220mg，45.2％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.03(s，2H)4.43(s，3H)7.24-7.29(m，1H)7.34(t，J＝7.8Hz，2H)7.37-7.43(m，2H)7.92(dd，J＝8.0，1.4Hz，1H)8.04-8.10(m，2H)12.38(s，1H)12.47(s，1H)；MS m/z 358.2(M+H)+；HPLC 82.9％，RT＝1.89分钟。
在2mL～5mL微波小瓶中加入粗产物2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-醇(0.220g，0.616mmol)和POCl3(3.90mL，41.9mmol)，得到棕色悬浮液。将小瓶置于微波炉中并加热至175℃持续15分钟，然后使其冷却。然后将反应混合物倒入水和冰的混合物(80ml)中，通过缓慢加入50重量％的NaOH(11mL)，然后加入EtOAc(80mL)碱化至pH 8。过滤一些固体，并分离各层。水性层用EtOAc(80mL)萃取，有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩至干，得到作为棕色固体的相应的氯衍生物：2-苄基-4-氯-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚(189mg，82％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 4.31(s，2H)4.46(s，3H)7.20-7.26(m，1H)7.28-7.39(m，4H)8.09(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)8.21-8.25(m，1H)8.39(d，J＝8.2Hz，1H)12.93(s，1H)；MS m/z 376.2(M+H)+；HPLC 95.6％，RT＝2.30分钟。
将如上所制备的2-苄基-4-氯-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚(0.865g，2.302mmol)和3,3'-二氨基-N-甲基二丙胺(2.60mL，16.11mmol)在MeOH(17.4mL)中的混合物在微波炉中加热30分钟至140℃。冷却并蒸发溶剂后，残余物通过快速色谱纯化，得到作为黄色固体的N1-(3-氨基丙基)-N3-(2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)-N1-甲基丙烷-1,3-二胺(832mg，74％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.52(quin，J＝6.85Hz，2H)1.80(quin，J＝6.85Hz，2H)2.18(s，3H)2.36(t，J＝7.24Hz，2H)2.41(t，J＝6.65Hz，2H)2.53-2.61(m，2H)3.64(q，J＝6.52Hz，2H)4.04(s，2H)4.43(s，3H)7.14-7.23(m，1H)7.28(t，J＝7.43Hz，2H)7.38(d，J＝7.43Hz，2H)7.49(t，J＝5.09Hz，1H)7.91(d，J＝8.22Hz，1H)8.08(s，1H)8.32(d，J＝8.22Hz，1H)；HPLC254nm处99.4％，RT 1.608分钟；HRMS m/z485.2884(M+H)+。
向2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酸(0.224g，0.774mmol)在DMF(3.00mL)中的溶液中加入HATU(0.294g，0.774mmol)和DIPEA(0.270ml，1.548mmol)。将溶液搅拌10分钟，然后加入N1-(3-氨基丙基)-N3-(2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)-N1-甲基丙烷-1,3-二胺(0.300g，0.619mmol)。在20℃搅拌3小时。加入2,2-二甲基-4,7,10-三氧代-3-氧杂-5,8,11-三氮杂十三烷-13-酸(0.112g，0.387mmol)、HATU(0.147g，0.387mmol)和DIPEA(0.135ml，0.774mmol)并在20℃搅拌16小时。将反应混合物倒入水(30mL)中。水性层用EtOAc(2×30mL)萃取。将合并的有机层用水(20mL)，然后用盐水(20mL)冲洗。有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到764mg黄色泡沫状物。残余物通过快速色谱法纯化，得到作为黄色固体的(16-((2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)氨基)-13-甲基-2,5,8-三氧代-3,6,9,13-四氮杂十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(380mg，81％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.36(s，9H)1.52-1.65(m，2H)1.73-1.86(m，2H)2.18(br.s.，3H)2.33(br.s.，2H)2.41(br.s.，2H)3.02-3.14(m，2H)3.57(d，J＝5.87Hz，2H)3.65(m，J＝5.50Hz，4H)3-72(d，J＝5.48Hz，2H)4.05(s，2H)4.43(s，3H)7.01(t，J＝5.48Hz，1H)7.15-7.22(m，1H)7.28(t，J＝7.63Hz，2H)7.37(d，J＝7.43Hz，2H)7.43(t，J＝5.28Hz，1H)7.72(br.s.，1H)7.91(dd，J＝8.22，1.17Hz，1H)8.08(s，3H)8.33(d，J＝8.22Hz，1H)12.00(s，1H)；HPLC 254nm处98.1％，Rt1.74分钟；MS m/z 756.4(M+H)+。
向(16-((2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)氨基)-13-甲基-2,5,8-三氧代-3,6,9,13-四氮杂十六烷基)氨基甲酸叔丁酯(0.380g，0.503mmol)在CH2Cl2(8.00ml)中的溶液加入三氟乙酸(2.000ml，26.0mmol)。将反应混合物搅拌30分钟。加入甲苯(5mL)，将混合物浓缩至干燥，得到580mg黄色泡沫状物。残余物通过快速色谱法纯化，得到作为黄色泡沫状物的2-氨基-N-(2-((2-((3-((3-((2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)氨基)丙基)(甲基)氨基)丙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)乙酰胺(340mg，100％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm1.63(dt，J＝14.28，6.95Hz，2H)1.87(dt，J＝13.99，6.90Hz，2H)2.33(s，3H)2.52-2.56(m，2H)2.61(br.t，J＝6.70，6.70Hz，2H)3.05-3.14(m，2H)3.55(s，2H)3.60-3-71(m，4H)3.83(d，J＝5.48Hz，2H)4.05(s，2H)4.43(s，3H)7.15-7.23(m，1H)7.28(t，J＝7.43Hz，2H)7.38(d，J＝7.43Hz，2H)7.43(t，J＝5.48Hz，1H)7.87(t，J＝5.67Hz，1H)7.91(dd，J＝8.22，1.17Hz，1H)8.08(d，J＝1.20Hz，1H)8.22(t，J＝5.67Hz，1H)8.35(d，J＝8.22Hz，1H)8.55(t，J＝5.48Hz，1H)12.02(br.s.，1H)；HPLC 254nm处99.4％，Rt 1.57分钟；HRMS m/z 656.3529(M+H)+。
化合物6
向1-(3-氯丙基)哌啶盐酸盐(0.500g，2.52mmol)在THF(14.83ml，181mmol)中的悬浮液添加三异丙基硅烷硫醇(1.092ml，5.05mmol)和四丁基碘化铵(0.093g，0.252mmol)。分批加入在矿物油(0.252g，6.31mmol)中的60重量％的氢化钠。将所得白色悬浮液加热至50℃并搅拌18.5小时。冷却至20℃并用水(15mL)稀释反应混合物。混合物用EtOAc(4×15mL)萃取。将合并的有机层用水(2×15mL)，然后用盐水(15mL)冲洗。有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到1.51g橙色油状物。残余物通过快速色谱法纯化，得到作为无色油状物中间体2A，1-(3-((三异丙基甲硅烷基)硫基)丙基)哌啶(714mg，90％产率)。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.06(d，J＝7.0Hz，18H)1.14-1.29(m，3H)1.36(m，J＝5.1Hz，2H)1.46(quin，J＝5.4Hz，4H)1.65(quin，J＝7.0Hz，2H)2.29(m，J＝6.7Hz，6H)2.53(t，J＝7.3Hz，2H)；MSm/z 316.2(M+H)+；HPLC>95％，RT＝2.19分钟。
将在矿物油(3.41g，85mmol)中的60重量％的NaH分批加入2-氰基乙酰胺(7.18g，85mmol)在DMF(53mL)中的冷溶液中。在室温下30分钟后，滴加4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(8.5g，42.7mmol)在DMF(15mL)中的溶液。3小时后，加入冰、水和12mL HCl(10％)的混合物。将所得固体过滤，用水冲洗并在高真空下干燥，得到9.1g的4-(2-氨基-1-氰基-2-氧代乙基)-3-硝基苯甲酸甲酯：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm3.93(s，3H)5.78(s，1H)7.77(s，1H)7.91(d，J＝7.83Hz，1H)8.04(s，1H)8.39(dd，J＝8.02，1.76Hz，1H)8.56(d，J＝1.56Hz，1H)。
将三氯化铁六水合物(1.540g，5.70mmol)和锌(1.242g，19.00mmol)加入上述制备的粗氰基-酰胺(0.5g，1.900mmol)在DMF(4.75mL)和水(4.75mL)中的溶液，而得到黄色悬浮液。放热后，将混合物加热至100℃保持45分钟，然后缓慢冷却至20℃并搅拌22小时。过滤固体，用DMF(3×3mL)冲洗，在0℃搅拌的同时用水(40mL)稀释滤液。过滤固体，用水冲洗块状物(2×5mL)。固体含有大部分杂质。水性层用EtOAc(3×50mL)萃取，将合并的有机层用水(50mL)，然后用盐水(30mL)冲洗。有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩，得到287mg棕色固体，将其用丙酮(6mL)处理，得到固体悬浮液，将其用己烷(5mL)稀释。然后收集固体，在40℃的高真空下干燥直至恒重，得到作为米白色固体的中间体2C：2-氨基-3-氨基甲酰基-1H-吲哚-6-甲酸甲酯(162mg，36.6％产率)：1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 3.80(s，3H)6.62(br.s.，2H)7.04-7.18(m，2H)7.53-7.63(m，2H)7.72(s，1H)10.80(s，1H)；MS m/z 232.2(M+H)+；HPLC约96％，RT＝1.37分钟。
将在甲醇(1.0mL)中的中间体2C(0.100g，0.429mmol)、2-苯基乙酸甲酯(0.302mL，2.14mmol)和在MeOH中的30重量％的甲醇钠(0.402mL，2.14mmol)的混合物置于微波炉中，并加热至140℃保持30分钟。冷却后，加入AcOH(0.125mL，2.19mmol)，将所得浆液在20℃搅拌1小时。过滤固体，用MeOH(3×0.5mL)洗涤，在20℃高真空下干燥直至恒重，得到作为褐色固体的中间体2D(2-苄基-4-羟基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯)(91mg，63.7％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm3.87(s，3H)4.03(s，2H)7.22-7.29(m，1H)7.29-7.42(m，4H)7.83(dd，J＝8.2，1.6Hz，1H)7.98-8.04(m，2H)12.46(br.s，1H)12.50(br.s.，1H)；MS m/z 334.2(M+H)+；HPLC 88.5％@220nm和86.3％@254nm，RT＝1.96分钟。
将2-苄基-4-羟基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.685g，2.O5mmol)在POCl3(12.64mL，136mmol)中的混合物加热至90℃持续16小时。冷却后，反应混合物浓缩至干燥。将所得固体悬浮于饱和NaHCO3(50mL)和EtOAc(75mL)。剧烈搅拌15分钟，然后过滤混合物。分离各层。水性层用EtOAc(2×50mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥。过滤并浓缩至干燥，得到作为褐色固体的2-苄基-4-氯-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(621mg，86％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 3.92(s，3H)4.31(s，2H)7.19-7.26(m，1H)7.28-7.39(m，4H)7.99(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)8.14(d，J＝1.2Hz，1H)8.34(d，J＝8.2Hz，1H)12.97(s，1H)；MS m/z 352.2(M+H)+；HPLC 92％，RT＝2.39分钟。
向2-苄基-4-氯-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.050g，0.142mmol)和1-(3-((三异丙基甲硅烷基)硫基)丙基)哌啶(0.058g，0.185mmol)在NMP(0.750ml)中的溶液加入四丁基氟化铵三水合物(0.056g，0.178mmol)并在20℃搅拌6小时。加入另外的1-(3-((三异丙基甲硅烷基)硫基)丙基)哌啶(0.033g，0.104mmol)和四丁基氟化铵三水合物(0.029g，0.092mmol)，继续搅拌4天。将反应混合物用CH2Cl2(25mL)稀释。用水(3×7.5mL)冲洗。有机层用无水MgSO4干燥，过滤并浓缩至干燥。残余物通过快速色谱法纯化，得到为褐色固体的化合物6，2-苄基-4-((3-(哌啶-1-基)丙基)硫基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(53mg，79％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.30-1.44(m，2H)1.51(br.s.，4H)1.81-1.96(m，2H)2.17-2.47(m，6H)3.43(t，J＝7.2Hz，2H)3.90(s，3H)4.26(s，2H)7.17-7.25(m，1H)7.30(t，J＝7.6Hz，2H)7.34-7.41(m，2H)7.95(dd，J＝8.2，1.6Hz，1H)8.07-8.14(m，2H)12.56(s，1H)；HPLC 254nm处95.1％，RT 2.02分钟；HRMS m/z 475.2155(M+H)+。
化合物7
在0℃下在DMF(125mL)中将2-氰基乙酸乙酯(10.9mL，102mmol)缓慢加入到在矿物油中60重量％的氢化钠悬浮液(4.10g，102mmol)中。将混合物在0℃下搅拌15分钟，加入在DMF(125mL)中的4-氟-3-硝基苯甲酸甲酯(10.2g，51mmol)。将所得的深红色混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌3小时。将反应混合物用1N HCl(40mL)和EtOAc(40mL)稀释。将分离的水性层用EtOAc(3×50mL)萃取。将有机层合并，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩得到残余物(26g)，残余物通过快速色谱法纯化，得到4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-硝基苯甲酸甲酯(14.9g，100％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.19(t，J＝7.0Hz，3H)3.93(s，3H)4.23(q，J＝7.0Hz，2H)6.38(s，1H)7.87-7.99(m，1H)8.42(d，J＝7.8Hz，1H)8.64(br.s.，1H)；LCMS m/z 291.0(M-H)-，HPLC>95％，RT 1.76分钟。
向4-(1-氰基-2-乙氧基-2-氧代乙基)-3-硝基苯甲酸甲酯(14.9g，51.0mmol)在乙酸(255mL)中的溶液中按比例加入锌粉(16.7g，255mmol)超过35分钟。将混合物加热至100℃保持15小时。使混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤并用乙酸乙酯冲洗。蒸发溶剂，得到残余物，将其在二氯甲烷和己烷的混合物中研磨。过滤固体，用己烷(3×15mL)冲洗，并在20℃在高真空下干燥直至恒重，得到作为紫色固体的中间体3A(3-乙基6-甲基-2-氨基-1H-吲哚-3,6-二羧酸酯)(6.3g，47.1％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.32(t，J＝7.0Hz，3H)3.81(s，3H)4.24(q，J＝7.0Hz，2H)6.99(s，2H)7.55-7.64(m，2H)7.74(s，1H)10.84(s，1H)；LCMS m/z 263.2(M+H)+，HPLC 70％，RT 1.90分钟。
将3-乙基6-甲基2-氨基-1H-吲哚-3,6-二羧酸酯(1.1g，4.19mmol)、甲酸铵(0.53g，8.39mmol)在甲酰胺(16.7mL，419mmol)中的悬浮液加热至165℃持续12小时。将混合物冷却至室温，并加入水。将所得沉淀物过滤，空气干燥并在高真空下干燥，得到作为灰色固体的4-羟基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(1.1g，108％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 3.89(s，3H)7.86(dd，J＝8.2，1.6Hz，1H)8.05-8.08(m，2H)8.21(d，J＝3.9Hz，1H)12.36(br.s.，1H)12.51(br.s，1H)；LCMS m/z 244.2(M+H)+；HPLC 71％，RT 1.51分钟。
将4-羟基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(1.1g，4.5mmol)和三氯氧化磷(15mL，161mmol)的混合物加热至90℃持续16小时。将反应混合物冷却至室温，减压蒸发。将残余物悬浮于CH2Cl2(20mL)中，通过硅藻土过滤。将滤液浓缩至干燥，得到作为橙色固体的4-氯-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(360mg，30.4％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 3.93(s，3H)8.02(dd，J＝8.20，1.20Hz，1H)8.19(s，1H)8.40(d，J＝8.22Hz，1H)8.86(s，1H)13.07(s，1H)；LCMS m/z 262.0(M+H)+，HPLC 71％，RT 2.02分钟。
将4-氯-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(86mg，0.33mmol)、三乙胺(0.09mL，0.66mmol)和3-(哌啶-1-基)丙烷-1-胺(0.078mL，0.49mmol)在甲醇(2mL)中的混合物在微波反应器中加热至140℃持续15分钟。将混合物冷却至室温，减压蒸发。粗物质通过快速色谱法纯化，得到作为米白色固体的中间体3B(4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯)(40mg，33.1％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.38(m，J＝4.70Hz，2H)1.49(quin，J＝5.48Hz，4H)1.82(quin，J＝7.04Hz，2H)2.21-2.45(m，6H)3.64(q，J＝6.52Hz，2H)3.89(s，3H)7.42(t，J＝5.67Hz，1H)7.84(dd，J＝8.20，1.20Hz，1H)8.04(d，J＝1.20Hz，1H)8.38(s，1H)8.41(d，J＝8.22Hz，1H)12.15(br.s.，1H)；LCMS m/z 368.2(M+H)+，HPLC 96.8％@254nm；RT 1.38分钟。
将4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(40mg，0.109mmol)和H2SO4(87μL，1.633mmol)在丙醇(1mL)中的混合物加热至70℃持续3天。浓缩为约0.5mL并用EtOAc(10mL)和水(10mL)稀释。用固体K2CO3(约100mg)中和至pH 7-8。分离各层。水性层用EtOAc(10mL)萃取。将合并的有机层用无水MgSO4干燥。过滤并浓缩至干燥，得到化合物7，作为白色固体的4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸丙酯(17mg，40％产率)；1H NMR(400MHz，甲醇-d4)δppm 8.36(s，1H)，8.24(d，J＝8.2Hz，1H)，8.19(s，1H)，7.97(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)，4.33(t，J＝6.7Hz，2H)，3.74(t，J＝6.8Hz，2H)，2.41-2.59(m，6H)，1.93-2.05(m，2H)，1.78-1.92(m，2H)，1.56-1.68(m，4H)，1.49(br.s.，2H)，1.08(t，J＝7.4Hz，3H)；HPLC 254nm处>95％，Rt 1.67分钟；LCMS m/z 396.2(M+H)+。
化合物8
将中间体2C(80mg，0.343mmol)和苯甲醛(70μL，0.686mmol)在乙酸(1mL)中的混合物加热至110℃持续22小时。将反应混合物冷却至20℃，并用二乙醚(10mL)稀释。将固体过滤，用Et2O(3×1mL)冲洗，在20℃高真空下干燥直至恒重，得到作为褐色固体的中间体4A，4-羟基-2-苯基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(47mg，42.9％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 3.89(s，3H)7.53-7.65(m，3H)7.87(dd，J＝8.22，1.56Hz，1H)8.06-8.12(m，2H)8.18-8.24(m，2H)12.55(br.s.，2H)；LCMS m/z 320.2(M+H)+。
将4-羟基-2-苯基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.050g，0.157mmol)在POCl3(1mL，10.73mmol)中的混合物加热至95℃持续16小时。冷却后，将反应混合物浓缩至干燥。将所得固体悬浮于饱和NaHCO3(10mL)中，并搅拌30分钟。过滤固体，用Et2O(3×1mL)冲洗，在20℃高真空下干燥直至恒重，得到作为褐色固体的4-氯-2-苯基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(40mg，75％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 3.93(s，3H)7.51-7.64(m，3H)7.95-8.06(m，1H)8.13-8.20(m，1H)8.38(d，J＝8.22Hz，1H)8.42-8.51(m，2H)13.08(s，1H)；MS m/z 338.2(M+H)+；HPLC99.2％@254nm，RT＝2.48分钟。
将4-氯-2-苯基-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯(0.043g，0.127mmol)、三乙胺(35μL，0.255mmol)和3-(哌啶-1-基)丙烷-1-胺(32μL，0.191mmol)在MeOH(0.6ml)中的混合物在微波炉中加热25分钟至140℃。冷却至20℃并浓缩至干燥。
在制备型HPLC上纯化，得到作为浅黄色固体的化合物8，2-苯基-4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯2,2,2-三氟乙酸盐(32mg，45.0％产率)；1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δppm 1.35(br.s.，1H)1.51-1.70(m，3H)1.70-1.85(m，2H)2.08-2.28(m，2H)2.76-2.97(m，2H)3.33-3.50(m，2H)3.50-3.66(m，2H)3-79-3.98(m，5H)7.40-7.58(m，3H)7.63(br.s.，1H)7.77-7.95(m，1H)8.06(br.s.，1H)8.40-8.56(m，3H)8.89-9.24(m，1H)12.28(br.s.，1H)；HPLC 254nm处99.9％，Rt 1.82分钟；HRMS m/z444.2435(M+H)+。
权利要求的范围不应受实施例中阐述的优选实施方式的限制，而是应当给予与作为整体描述一致的最宽泛的说明。在权利要求中，词语“包括”用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”。除非上下文另有明确指示相反，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括相应的复数指代。

Claims (37)

1.一种将病毒载体转导入细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与通式I的化合物或其盐或前药接触；和用病毒载体转导所述细胞，
其中：
每个Y独立地选自N和CH；
Z是
1)-CN
2)-C(O)OR1，
3)-C(O)N(R1)R3，
4)-C(O)R1，或
5)-杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
其中，当(R1)和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
W是
1)-CN，
2)-N(R1)R3，
3)-C(O)OR1，
4)-C(O)N(R1)R3，
5)-NR1C(O)R1，
6)-NR1C(O)OR1，
7)-OC(O)N(R1)R3，
8)-OC(O)R1，
9)-C(O)R1，
10)-NR1C(O)N(R1)R3，
11)-NR1S(O)2R1，
12)-苄基，可选地，其取代有1、2或3个RA或R1取代基，
13)-X-L-(X-L)n-N(R1)R3，
14)-X-L-(X-L)n-杂芳基，可选地，其取代有连接在L和杂芳基的任一个或两个上的一个或多个RA或R4取代基，
15)-X-L-(X-L)n-杂环基，可选地，其取代有连接在L和杂环基的任一个或两个上的一个或多个RA或R4取代基，
16)-X-L-(X-L)n-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
17)-X-L-(X-L)n-NR1RA，或
18)-(N(R1)-L)n-N+R1R3R5R6-
其中，n是等于0、1、2、3、4或5的整数，
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
每个X独立地选自O、S和NR1；
每个L独立地是
1)-C1-6亚烷基，
2)-C2-6亚烯基，
3)-C2-6亚炔基，
4)-C3-7亚环烷基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，或者
5)-C3-7亚环烯基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子
其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基和亚环烯基各自独立地、可选地取代有一个或两个R4或RA取代基；
R1各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，或
11)-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是
1)-H，
2)-C1-6烷基，可选地，其取代有一个或多个RA取代基，
3)-C(O)R4，
4)-L-杂芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基，
5)-L-杂环基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4，或
6)-L-芳基，可选地，其取代有一个或多个RA或R4取代基；
R3各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，或
11)-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，或
11)-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R5各自独立地是
1)-C1-6烷基，
2)-C1-6亚烷基-C2-6烯基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子
3)-C1-6亚烷基-C2-6炔基，可选地，其包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子
4)-L-芳基，可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基
5)-L-杂芳基，可选地，其包括一个或多个RA或R4取代基
6)-C1-6亚烷基-C(O)O-
7)-C1-6亚烷基-C(O)OR1
8)-C1-6亚烷基-CN
9)-C1-6亚烷基-C(O)NR1R3，其中，可选地，R1和R3与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子；或
10)-C1-6亚烷基-OH；
R6是
1)卤素
2)OC(O)CF3或
3)OC(O)R1；
RA各自独立地是
I)-卤素，
2)-CF3，
3)-OR1，
4)-L-OR1，
5)-OCF3
6)-SR1，
7)-CN，
8)-NO2，
9)-NR1R3，
10)-L-NR1R1，
11)-C(O)OR1，
12)S(O)2R4
13)-C(O)N(R1)R3，
14)-NR1C(O)R1，
15)-NR1C(O)OR1，
16)-OC(O)N(R1)R3，
17)-OC(O)R1，
18)-C(O)R4，
19)-NHC(O)N(R1)R3，
20)-NR1C(O)N(R1)R3，或
21)-N3；且
Rd各自独立地是
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，
5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-全氟化C1-5
8)-苄基，或
9)-杂环基。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物具有式IA
或其盐或前药，
其中，W、Y、Z和R2各自如权利要求1所定义。
3.如权利要求2所述的方法，其中，
每个Y独立地选自N和CH；
Z是-CN、-C(O)OR1、-C(O)N(R1)R3或-杂芳基，可选地，-杂芳基取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-CN、-N(R1)R3、可选地取代有1、2或3个RA或R1取代基的-苄基、-X-L-(X-L)n-N(R1)R3、-X-L-(X-L)n-NR1RA或-(N(R1)-L)n-N+R1R3R5R6-
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
每个X独立地是O、S或NR1，
L各自独立地是-C1-6亚烷基、-C2-6亚烯基、-C2-6亚炔基、可选地包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子的-C3-7亚环烷基、或者可选地包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子的-C3-7亚环烯基，
其中，亚烷基、亚烯基、亚炔基、亚环烷基和亚环烯基各自独立地、可选地取代有一个或两个R4或RA取代基；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、可选地取代有一个或多个RA取代基的-C1-6烷基、-C(O)R4、可选地取代有一个或多个RA或R4取代基的-L-杂芳基、可选地取代有一个或多个RA或R4取代基的-L-杂环基，或可选地取代有一个或多个RA或R4取代基的-L-芳基；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-芳基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R5各自独立地是-C1-6烷基、可选地包括一个或多个RA或R4取代基的-L-芳基、可选地包括一个或多个RA或R4取代基的-L-杂芳基，-C1-6亚烷基-C(O)O-、-C1-6亚烷基-C(O)OR1、-C1-6亚烷基-CN、-C1-6亚烷基-C(O)NR1R3或-C1-6亚烷基-OH；
R6是卤素、-OC(O)CF3或OC(O)R1；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-L-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-L-NR1R1、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3、-NR1C(O)N(R1)R3或-N3；
Rd各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-苄基或-杂环基。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物具有式IIA：
或其盐或前药，
其中，Z、W和R2各自如权利要求1所定义。
5.如权利要求4所述的方法，其中，
Z是-CN、-C(O)O-C1-6烷基、-C(O)NH-C1-6烷基或-杂芳基，可选地，-杂芳基取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-NR1RA、-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1RA；
其中，n是等于0、1、2或3的整数
并且其中，当R1和R3连接到氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、-C(O)R4、可选地在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基的-C1-6亚烷基-杂芳基、可选地取代有一个或多个RA或R4的-C1-6亚烷基-杂环基、或可选地在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基的-C1-6亚烷基-芳基；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基或-全氟化C1-5，其中，烷基、烯基、炔基、全氟化烷基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-杂环基、-芳基、-杂芳基或-苄基，
其中，烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-L-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-L-NR1R1、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3、-NR1C(O)N(R1)R3或-N3；
Rd各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C2-6烯基、-C2-6炔基、-C3-7环烷基、-C3-7环烯基、-全氟化C1-5、-苄基或-杂环基。
6.如权利要求5所述的方法，其中：
Z是CO2Me或2-甲基-2H-四唑-5-基；
R2是苄基或H；且
W是NH-L-N(R1)R3，其中，L是C2-4亚烷基或C3-7亚环烷基，且R1和R3是C1-4烷基或H；或者R1和R3与它们所连接的氮原子结合在一起形成3～7元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，可选地，所述环取代有被一个或多个RA或R4。
7.如权利要求6所述的方法，其中，W是
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物具有式IIA
或其盐，
其中，
Z是-C(O)O-C1-4烷基或-杂芳基，优选包含2～4个选自N和O的杂原子的5元环杂芳基，可选地，杂芳基取代有一个或多个RA或R4取代基，
W是-N(R1)R3、-NR1-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-O-C1-6亚烷基-N(R1)R3、-S-C1-6亚烷基-N(R1)R3或-NR1-C1-6亚烷基-(NR1-C1-6亚烷基)n-NR1R3，其中，n是等于0、1、2或3的整数，并且其中，当R1和R3连接到相同的氮原子时，可选地，它们与氮原子一起形成5～6元环，可选地，所述环包括一个或多个选自N和O的其他杂原子，可选地，所述环取代有一个或多个RA或R4；
R1各自独立地是-H、-C1-6烷基、-C3-7环烷基或-杂环基，
其中，烷基、环烷基、杂环基各自独立地、可选地取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R2是-H、-C1-6烷基、可选地在亚烷基或杂芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基的-C1-6亚烷基-杂芳基；或可选地在亚烷基或芳基上取代有一个或多个RA或R4取代基的-C1-6亚烷基-芳基；
R3各自独立地是-H、-C1-6烷基，其中，可选地，烷基取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
R4各自独立地是H、-C1-6烷基，其中，可选地，烷基取代有1、2或3个RA或Rd取代基；
RA各自独立地是-卤素、-CF3、-OR1、-OCF3、-SR1、-CN、-NO2、-NR1R3、-C(O)OR1、S(O)2R4、-C(O)N(R1)R3、-NR1C(O)R1、-NR1C(O)OR1、-OC(O)N(R1)R3、-OC(O)R1、-C(O)R4、-NHC(O)N(R1)R3或-NR1C(O)N(R1)R3，且
Rd各自独立地是-H或-C1-6烷基。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述化合物是
或者它们的盐。
10.如权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述细胞包括干细胞和/或祖细胞。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述干细胞包括原始造血细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述原始造血细胞源自脐带血、骨髓或外周血。
13.如权利要求1～12中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是整合缺陷型病毒载体。
14.如权利要求1～13中任一项所述的方法，其中，所述病毒载体是慢病毒载体。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述慢病毒载体是假型慢病毒载体。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述慢病毒载体被水泡性口炎病毒G-蛋白质(VSV-G)或RAD114包膜蛋白假型化。
17.如权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述细胞在所述转导之前与所述化合物接触。
18.如权利要求1～16中任一项所述的方法，其中，所述细胞在所述转导之前和在所述转导期间与所述化合物接触。
19.如权利要求1～18中任一项所述的方法，其中，所述细胞与所述化合物接触约2小时～约22小时的时间。
20.一种组合物，其包含：(i)如权利要求1和10～12中任一项所定义的细胞，(ii)至少一种如权利要求1～9中任一项所定义的化合物；和(iii)如权利要求1和13～16中任一项所定义的病毒载体。
21.如权利要求20所述的组合物，其进一步包含(iv)适于细胞扩增的培养基。
22.如权利要求20或21所述的组合物，其中，所述细胞包括干细胞。
23.如权利要求22所述的组合物，其中，所述干细胞包括原始造血细胞。
24.如权利要求23所述的组合物，其中，所述原始造血细胞源自脐带血、骨髓或外周血。
25.通过如权利要求1～19中任一项所述的方法获得的转导细胞的群体。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求25所述的转导细胞的群体。
27.一种治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的方法，所述方法包括对所述受试者施用有效量的如权利要求25所述的转导细胞的群体或如权利要求26所述的药物组合物。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述方法包括：(i)在权利要求1～9中任一项所定义的通式I化合物的存在下将病毒载体转导入来自所述受试者的细胞中，由此获得包含转导细胞的群体；和(ii)对所述受试者施用有效量的(i)中获得的包含转导细胞的群体、或含有所述包含转导细胞的群体的药物组合物。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述细胞如权利要求22～24中任一项所定义。
30.如权利要求27～29中任一项所述的方法，其中，所述受试者患有血液学或溶酶体贮积疾病。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述血液学疾病或溶酶体贮积疾病是威斯科特-奥尔德里奇综合症(WAS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、白细胞粘附缺陷、X连锁CGD、范可尼贫血、肾上腺脑白质营养不良、粘多糖病IIIA、严重联合免疫缺陷(SCID)或腺苷脱氨酶(ADA)缺乏。
32.权利要求25所述的转导细胞的群体或权利要求26所述的药物组合物用于治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的用途。
33.权利要求25所述的转导细胞的群体或权利要求26所述的药物组合物在制备用于治疗需要用细胞基因疗法进行治疗的受试者的药物中的用途。
34.如权利要求32或33所述的用途，所述受试者患有血液学或溶酶体贮积疾病。
35.如权利要求34所述的用途，其中，所述血液学疾病或溶酶体贮积疾病是威斯科特-奥尔德里奇综合症(WAS)、异染性脑白质营养不良(MLD)、白细胞粘附缺陷、X连锁CGD、范可尼贫血、肾上腺脑白质营养不良、粘多糖病IIIA、严重联合免疫缺陷(SCID)或腺苷脱氨酶(ADA)缺乏。
36.一种在细胞中表达感兴趣的基因的方法，所述方法包括用权利要求1～9中任一项所定义的通式I化合物与所述细胞接触；和用包含编码所述感兴趣的基因的核酸的病毒载体转导所述细胞。
37.如权利要求36所述的方法，其中，所述病毒载体如权利要求1和13～16所定义。
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GR01 Patent grant
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