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CN107208072A - 在植物中产生轮状病毒样颗粒 - Google Patents

在植物中产生轮状病毒样颗粒 Download PDF

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CN107208072A CN201680006015.6A CN201680006015A CN107208072A CN 107208072 A CN107208072 A CN 107208072A CN 201680006015 A CN201680006015 A CN 201680006015A CN 107208072 A CN107208072 A CN 107208072A
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马克-安德烈·蒂奥斯特
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Medicago Inc
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Abstract

提供在植物中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法。该方法包括在宿主或宿主细胞(例如植物、植物的一部分或植物细胞)内表达一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含与第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可操作地(operatively)连接的一种或多种调控区，所述调控区在宿主或宿主细胞中是有活性的(active)。第一核苷酸序列编码第一轮状病毒蛋白，第二核苷酸序列编码第二轮状病毒蛋白，以及第三核苷酸序列编码第三轮状病毒蛋白。第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP2或VP6，以及VP4或VP7。在允许核酸表达的条件下孵育宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP2或VP6，以及VP4或VP7都被表达，从而产生RLP。还提供了包含RLP的宿主，包含RLP的组合物和使用该组合物的方法。

Description

在植物中产生轮状病毒样颗粒
技术领域
本发明涉及在植物中产生轮状病毒样颗粒。
背景技术
轮状病毒感染是一个全球性问题，主要影响五岁以下儿童。它导致严重胃肠炎，并且在最坏的情况下导致死亡。
轮状病毒是影响胃肠道系统和呼吸道的呼肠孤病毒科(Reoviridae)病毒的成员(轮状病毒属(genus Rotavirus))。这个名称来自于当通过负差电子显微镜观察时，像车轮一样的病毒粒子外观。轮状病毒通常为球形，并以其外壳和内壳或双壳衣壳结构命名。分别地，外层衣壳直径约70nm，内层衣壳直径约55nm。轮状病毒的双壳衣壳包围包括内蛋白壳和基因组的核心。轮状病毒的基因组由编码至少11种轮状病毒蛋白—结构病毒蛋白(VP)或非结构蛋白的双链RNA片段组成(NSP；Desselberger，Virus Res 190：75-96(2014))。
dsRNA编码六种结构蛋白(VP)和六种非结构蛋白(NSP)。结构蛋白包含VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7。通过分别组装VP2、VP6和VP7形成三个同心层，VP4在病毒结构的表面上形成“刺突”。VP4被胰蛋白酶切割成VP8*和VP5*。VP8*和VP5*是VP4的蛋白水解产物。
VP2是102kDa的蛋白，并且是病毒核心中最丰富的蛋白。它形成最里面的结构蛋白层，并提供用于正确组装病毒核心组分和转录酶的支架(Lawton，2000)。VP1是125kDa的最大病毒蛋白，作为轮状病毒的RNA依赖性聚合酶，产生核心复制中间体，并与在其二十面体顶点的VP2结合(Varani和Allain，2002；Vende等人，2002)。VP3是98kDa的蛋白，也与病毒基因组直接相关，作为向病毒mRNA添加5'帽结构的mRNA加帽酶。VP1和VP3一起形成连接到VP2衣壳层的外部5倍顶点的复合体(Angel，2007)。VP6是形成病毒核心的中间壳的42kDa蛋白，是主要的衣壳蛋白，并且占病毒粒子总蛋白量的50％以上(Gonz á lez等人，2004；Estes，1996)。它是基因转录所必需的，并且可以通过在核心中将VP1锚定到VP2来在包被轮状病毒RNA中起作用，如在呼肠孤病毒科的另一成员蓝舌病病毒(bluetongue virus)中所见。它还将轮状病毒分为五组(A至E)，A组最常影响人类(Palombo，1999)。A组轮状病毒中的VP6具有至少四个亚组(SG)，其取决于SG特异性表位(SG I、SG II、SG(I+II)和SG非(I+II))的存在或不存在。B组和C组缺乏常见的A组抗原，但也已知可感染人类，而D组仅影响动物(例如鸡和牛)(Thongprachum，2010)。
两种外层衣壳蛋白VP7(37kDa糖蛋白(G)和87kDa蛋白酶敏感性VP4(P))定义了病毒的血清型。这两种蛋白诱导中和抗体应答，并因此根据G-P抗原组合(例如，G1P[8]或G2P[4])，用于将轮状病毒血清型分类为双重命名系统(Sanchez-Padilla等人，2009，Rahman等人，J Clin Microbiol 41：2088-2095(2003))。VP4蛋白二聚化而在病毒外壳上形成直接参与宿主细胞进入的初始阶段的60个刺突。刺突蛋白在氨基酸(aa)位置248处含有切割位点。感染后，其被蛋白酶胰蛋白酶切割以产生VP5(529aa，60kDa)和VP8(246aa，28kDa)(Denisova等人，1999)。该过程增强病毒感染性(细胞附着和侵袭宿主细胞)，并稳定刺突结构(Glass，2006)。VP7糖蛋白形成病毒的第三层或外层。目前，已知27G和35P基因型(Greenberg和Estes，2009)。VP4和VP7是参与病毒中和的主要抗原，并且是疫苗开发的重要目标(Dennehy，2007)。
在受感染的细胞中合成非结构蛋白(NSP)，并在复制周期的各个部分起作用，或与一些宿主蛋白相互作用，以影响感染的发病机理或免疫应答(Greenberg和Estes，2009)。轮状病毒非结构蛋白NSP4已被证明具有多种功能，其包括从内质网释放钙(ER；Tian等人，1995)；在病毒形态发生期间破坏ER膜，并且可能在从出芽颗粒去除瞬时包膜中起重要作用(参见图1)；影响从ER到高尔基复合体的膜运输，其具有结合微管的能力(Xu等人2000)；并起着细胞内受体的作用，以有助于亚病毒颗粒出芽进入ER(Tian等人，1996)。
在受感染的哺乳动物细胞中，轮状病毒经历独特的形态发生模式以形成完整的三层VP2/6/4/7病毒颗粒(Lopez等人，2005)。三层衣壳是非常稳定的复合体，其使粪-口传播和将病毒递送到小肠中成为可能，在小肠中它感染绒毛尖端附近的非分裂分化的肠细胞(Greenberg和Estes，2009)。首先，完整病毒通过病毒表面上的60个VP4二聚体刺突附着于唾液酸非依赖性受体(Lundgren和Svensson，2001)。病毒表面上的60个VP4二聚体刺突使病毒能附着在这些细胞受体上。VP4易受胰蛋白酶的蛋白水解切割，其导致构象变化而在糖蛋白表面上暴露另外的附着位点以便与一系列共受体相互作用。
然而，多步骤附着和进入过程尚不清楚，但病毒是穿过宿主的质膜递送的。也参与进入过程的VP7外层衣壳在该过程中被去除，并且双层颗粒(DLP)被递送到囊泡的细胞质中(图1；现有技术)。DLP从囊泡中逸出，并进入非膜结合的细胞质内含体。通过VP1的基因组早期转录在所述颗粒中开始，使得dsRNA从未暴露于细胞质。RNA复制和核心形成发生在这些非膜结合的细胞质内含体中。然后将新生的(+)RNA转运到细胞质中，并作为病毒蛋白合成的模板。VP4在细胞溶质中产生，并被运送到粗糙的内质网(RER)，并且VP7被分泌到RER中。在细胞溶质中的病毒颗粒内产生并组装VP2和VP6，随后出芽到RER室中，在该过程中接受瞬时包膜(Lopez等人，2005；Tian等人，1996)。在RER中，在轮状病毒糖蛋白NSP4的关键参与下，病毒颗粒的瞬时包膜被去除，并被VP4和VP7蛋白单体所替代(Tian等人，1996；Lopez等人，2005；Gonzalez等人，2000)。NSP4在ER膜中起着细胞内受体的作用，并且与新产生的亚病毒颗粒以及也可能是刺突蛋白VP4结合(Tian等人，1996)。NSP4对人类也是有毒的，并且是腹泻的致病因子。完整成熟的颗粒随后从RER通过高尔基体转移到质膜以进行分泌(Lopez等人，2005)。
已经采取了各种不同的方法来产生适于保护人群免受轮状病毒各种血清型感染的轮状病毒疫苗。这些方法包括各种Jennerian方法，活减毒病毒的使用，病毒样颗粒的使用，核酸疫苗和作为免疫原的病毒亚单位。目前市面上有两种口服疫苗，但由于毒株的变异，这些口服疫苗具有低的功效。
美国专利第4,624,850号、第4,636,385号、第4,704,275号、第4,751,080号、第4,927,628号、第5,474,773号和第5,695,767号，各描述了各种轮状病毒疫苗和/或制备这些疫苗的方法，其中全部病毒颗粒被用于产生每种轮状病毒疫苗。
轮状病毒样颗粒的产生是一项具有挑战性的任务，因为其需要合成和组装一种或多种重组蛋白。轮状病毒包含由四种不同蛋白的1860个单体形成的衣壳。对于RLP的产生，可能需要同时表达和组装2-3种重组蛋白。例如，包含120个分子的VP2的内层，780个分子的VP6(中间层)，以及780分子的糖蛋白VP7和60个VP4二聚体的外层，以形成双层或三层的颗粒(Libersou等人，J.of Virology，2008年3月)。
Crawford等人(J Virol.1994年9月；68(9)：5945-5952)描述了杆状病毒表达系统中VP2、VP4、VP6和VP7的表达。不同组合的轮状病毒主要结构蛋白的共表达，导致稳定病毒样颗粒(VLP)的形成。VP2和VP6单独或与VP4一起的共表达，导致VP2/6 VLP或VP2/4/6 VLP的产生，其类似于双层轮状病毒颗粒。与或不与VP4一起的VP2、VP6和VP7的共表达，产生与天然感染性轮状病毒颗粒相似的三层VP2/6/7VLP或VP2/4/6/7 VLP。VLP保持天然颗粒的结构和功能特性，如通过电子显微镜检查颗粒所确定的，VP4和VP7上存在非中和表位以及中和表位，以及VP2/4/6/7VLP的红细胞凝集活性。
从不同蛋白组成的轮状病毒样颗粒产生的疫苗候选物，已显示了作为亚单位疫苗的潜力。O'Neal等人(J.Virology，1997,71(11)：8707-8717)显示了含有VP2和VP6或含有VP2、VP6和VP7的VLP，并且在加入和不加入霍乱毒素下施用于小鼠，在免疫小鼠中诱导了保护性免疫。核心样颗粒(CLP)和VLP也被用于免疫奶牛，在诱导被动免疫方面，VLP比CLP更有效(Fernandez等人，Vaccine，1998,16(5)：507-516)。
植物被越来越多地用于大规模生产重组蛋白。例如US 2003/0175303公开了在稳定转化的番茄植物中表达重组轮状病毒结构蛋白VP6、VP2、VP4或VP7。
Saldana等人(Viral Immunol.19：42-53(2006))在番茄植物的细胞质中表达VP2和VP6。电子显微镜研究表明，少部分蛋白已经组装成2/6VLP。在小鼠中检测到保护性免疫应答，这可能在一定程度上归因于未组装的VP。已经显示单个蛋白在小鼠中引起免疫应答，如在VP8和VP6的情况下(Rodriguez-Diaz等人，Biotechnol Lett.2011,33(6)：1169-75，Zhou等人，Vaccine 28：6021-6027(2010))。
Matsumura等人(Archives of Virology 147：1263-1270(2002))报道了转基因马铃薯植物中表达牛轮状病毒A VP6。VP6被表达、纯化并进行免疫原性研究。成年小鼠的免疫反应显示血清中存在VP6抗体。然而，没有提供组装的VP6蛋白的证据。可能VP6的单体或三聚体负责引发免疫应答。O'Brien等人(2000，Virol.270：10444-10453)显示了，使用马铃薯病毒X(PVX)载体在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中组装VP6。当VP6融合到PVX蛋白棒时，仅观察到VP6蛋白组装成二十面体VLP。裂解后，VP6组装成二十面体VLP。
密码子优化的人轮状病毒VP6，已经使用甜菜黑焦烧病毒(BBSV)介导的表达系统在苋色藜(Chenopodium amaranticolor)中成功表达。该蛋白被改造为BBSV外壳蛋白的替代物。用基于植物VP6蛋白进行雌性BALB/c小鼠的口服免疫，诱导高效价的抗-VP6粘膜IgA和血清IgG(Zhou等人，Vaccine 28：6021-6027(2010))。然而，没有教导VP6蛋白组装成VLP或颗粒。
轮状病毒VP7已经在马铃薯植物中表达，并且显示在小鼠中产生中和免疫应答(Yu和Langridge，2001Nature Biotechnol 19：548-552)。在转基因马铃薯植物中，VP7基因稳定50代以上，来自第50代的VP7蛋白在成年小鼠中诱导了保护性和中和抗体(Li等人，2006，Virol 356：171-178)。
Yang等人(Yang YM，Li X，Yang H等人，Science China Life Science54：82-89(2011))在烟草植物中共同表达了A组RVV(P[8]G1)的三种轮状病毒衣壳蛋白VP2、VP6和VP7，并且研究了这些蛋白的表达水平以及轮状病毒样颗粒的形成和免疫原性。从转基因烟草植物中纯化VLP，并通过电子显微镜和蛋白质印迹分析VLP。这些结果表明，植物衍生的VP2、VP6和VP7蛋白自组装成直径为60-80nm的2/6或2/6/7轮状病毒样颗粒。
WO 2013/166609描述了通过在植物中共表达轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6和VP7，并在钙的存在下纯化得到的RLP，在植物中产生轮状病毒样颗粒(RLP)。
已经从昆虫细胞(Tian等人，1996，Arch Virol.1996；Rodriguez-Diaz等人，Protein Expr.Purif.2003)和在大肠杆菌(Sharif等人，Medical Journal of theIslamic Republic of Iran 2003)中表达和纯化了轮状病毒NSP4。NSP4也在马铃薯中被表达为与霍乱毒素B(CTB)亚基一起的融合蛋白(Arakawa等人，Plant Cell Report 20：343-348(2001))。
发明概述
本发明涉及在植物中产生轮状病毒样颗粒。
本发明的目的是在植物中产生轮状病毒样颗粒。
描述了在植物、植物的一部分或植物细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的几种方法。
例如，用于在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法(A)可以包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；和
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生RLP。
在如上所述的方法(A)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
还描述了在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法(B)，该方法可以包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一和轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生RLP。
在如上所述的方法(B)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及VP2、VP7或VP4中的两种，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP7或VP4中的两种。
在如上所述的方法(A)和(B)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
在如上所述的方法(A)或(B)中，如果提供宿主或宿主细胞，其中所述一种或多种核酸包含编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列、编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列、编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区，然后所述一种或多种核酸可以包含编码所述第一轮状病毒蛋白、所述第二轮状病毒蛋白、所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；或者，所述一种或多种核酸可以包含例如两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白、所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；或者，所述一种或多种核酸可以包含例如两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；或者，所述一种或多种核酸可以包含例如三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白和所述第四轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；或者，所述一种或多种核酸可以包含例如三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；或者，所述一种或多种核酸可以包含例如四种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；和第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；或者，所述一种或多种核酸可以包含例如五种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列；和第五核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列。
如上所述的方法(A)或(B)还可以包括以下步骤：
c)收获所述宿主或宿主细胞，和
d)从所述宿主或宿主细胞中纯化所述RLP，其中所述RLP的大小范围为70-100nm。
如上所述的方法(A)或(B)的一种或多种核苷酸序列，可以可操作地连接到一种或多种表达增强子。此外，所述表达增强子可以选自：CPMV HT、CPMV 160、CPMV 160+和CPMVHT+。
本文还描述了在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法(C)，其包括：
a)将一种或多种核酸引入到所述宿主或宿主细胞中，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生RLP。
在如上所述的方法(C)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
本文还描述了在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法(D)，其包括：
a)将一种或多种核酸引入到所述宿主或宿主细胞中，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生RLP。
在如上所述的方法(D)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及轮状病毒蛋白VP2、VP7或VP4中的两种，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP7或VP4中的两种。
在如上所述的方法(C)和(D)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
如上所述的方法(C)或(D)还可以包括以下步骤：
c)收获所述宿主或宿主细胞，和
d)从所述宿主或宿主细胞中纯化所述RLP，其中所述RLP的大小范围为70-100nm。
在如上所述的方法(C)或(D)中，如果提供宿主或宿主细胞，其中所述一种或多种核酸包含编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列、编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列、编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区，然后在引入步骤(步骤a)，所述一种或多种核酸可以包含两种核酸：包含编码NSP4的第一核酸，以及编码VP2、VP4、VP6和VP7的第二核酸；引入植物、植物的一部分或植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量的比例为1:0.8至1:2。该比例也可以为1：1。可选地，所述一种或多种核酸可以包含两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第三至第五轮状病毒蛋白的所述第三至第五核苷酸序列。
在如上所述的方法(C)或(D)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白和所述第四轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；并且其中引入所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量，以及所述第三核酸的量的比例为1:1:1。
可选地，在如上所述的方法(C)或(D)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三至第五轮状病毒蛋白的所述第三至第五核苷酸序列；并且其中引入所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量，以及所述第三核酸的量的比例为1:1:1。
此外，在上述方法(C)或(D)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含四种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；和第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；其中引入所述所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量、所述第三核酸的量，以及所述第四核酸的量的比例为1:1:1:1。
在上述方法(C)或(D)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含五种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列；和第五核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；并且引入所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量、所述第三核酸的量、所述第四核酸的量，以及所述第五核酸的量的比例为1:1:1:1:1。
如上所述的方法(C)或(D)的所述一种或多种核苷酸序列，可以可操作地连接到一种或多种表达增强子。此外，所述表达增强子可以选自：CPMV HT、CPMV 160、CPMV 160+和CPMV HT+。
增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法(E)，所述方法包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比时，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
在如上所述的方法(E)中，所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
还描述了增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法(F)，所述方法包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比时，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
在如上所述的方法(F)中，所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及轮状病毒蛋白VP2、VP7或VP4中的两种，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP7或VP4中的两种。
在如上所述的方法(E)和(F)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
如上所述的方法(E)或(F)的一种或多种核苷酸序列，可以可操作地连接到一种或多种表达增强子。此外，所述表达增强子可以选自：CPMV HT、CPMV 160、CPMV 160+和CPMVHT+。
还描述了增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法(G)，所述方法包括：
a)将一种或多种核酸引入到宿主或宿主细胞中，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比时，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
在如上所述的方法(G)中，所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
还描述了增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法(H)，所述方法包括：
a)引进包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比时，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
在如上所述的方法(H)中，所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4、VP6之一以及轮状病毒蛋白VP2、VP7或VP4中的两种，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP7或VP4中的两种。
在如上所述的方法(G)和(H)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
在如上所述的方法(G)和(H)中，所述一种或多种核酸还可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列和编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
在如上所述的方法(G)或(H)中，在引入步骤(步骤a)，所述一种或多种核酸可以包含两种核酸：包含编码NSP4的第一核酸，以及编码VP2、VP4、VP6和VP7的第二核酸；引入植物、植物的一部分或植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量的比例为1:0.8至1:2。该比例也可以为1：1。可选地，所述一种或多种核酸可以包含两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第三至第五轮状病毒蛋白的所述第三至第五核苷酸序列。
在如上所述的方法(G)或(H)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白和所述第四轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；并且其中引入所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量，以及所述第三核酸的量的比例为1:1:1。
可选地，在如上所述的方法(G)或(H)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三至第五轮状病毒蛋白的所述第三至第五核苷酸序列；并且其中引入所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量，以及所述第三核酸的量的比例为1:1:1。
此外，在上述方法(G)或(H)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含四种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；和第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；其中引入所述所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量、所述第三核酸的量，以及所述第四核酸的量的比例为1:1:1:1。
在上述方法(G)或(H)中，在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含五种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列；和第五核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；并且，引入所述植物、所述植物的一部分或所述植物细胞的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量、所述第三核酸的量、所述第四核酸的量，以及所述第五核酸的量的比例为1:1:1:1:1。
如上所述的方法(G)或(H)的所述一种或多种核苷酸序列，可以可操作地连接到一种或多种表达增强子。此外，所述表达增强子可以选自：CPMV HT、CPMV 160、CPMV 160+和CPMV HT+。
如上所述的方法(G)或(H)还可以包括以下步骤：
c)收获所述宿主或宿主细胞，和
d)从所述宿主或宿主细胞中纯化所述RLP，其中RLP的大小范围为70-100nm。
在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸可以包含一种核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白、所述第二轮状病毒蛋白、所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸可以包含两种核酸：例如，第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第二至第五轮状病毒蛋白的所述第二至第五核苷酸序列。可选地，一种或多种核酸可以包含两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第三至第五轮状病毒蛋白的所述第三至第五核苷酸序列。
在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸还可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白和所述第四轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列。可选地，所述一种或多种核酸可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三至第五轮状病毒蛋白的所述第三至第五核苷酸序列。
在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸还可以包含四种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；和第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
此外，在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸还可以包含五种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列；和第五核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列。
如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)的所述一种或多种核苷酸序列，可以可操作地连接到一种或多种表达增强子。此外，所述表达增强子可以选自：CPMV HT、CPMV 160、CPMV 160+和CPMV HT+。
在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述宿主或宿主细胞可以包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物、植物的一部分或植物细胞。所述植物可以是本氏烟(Nicotianabenthamiana)。
本文还描述了通过上述方法(A)、上述方法(B)、上述方法(C)、上述方法(D)、上述方法(E)、上述方法(F)、上述方法(G)或上述方法(H)产生的RLP，其中所述RLP是包含轮状病毒蛋白的三层RLP，所述轮状病毒蛋白由VP2、VP4、VP6和VP7组成。所述RLP不包含NSP4。
还描述了包含用于在对象中诱导免疫应答的有效剂量的RLP和药学上可接受的载体的组合物，以及诱导对象中针对轮状病毒感染的免疫的方法，所述方法包括施用组合物。在诱导免疫的所述方法中，所述组合物可以经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用于对象。
本文还描述了包含通过如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)产生的RLP的植物物质。
在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸可以包含一种核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白、所述第二轮状病毒蛋白和所述第三轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列。此外，在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸包含可以两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白和所述第三轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列。此外，在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸可以包含两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列。可选地，在如上所述方法(A)、所述方法(B)、所述方法(C)、所述方法(D)、所述方法(E)、所述方法(F)、所述方法(G)或所述方法(H)中，所述一种或多种核酸可以包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列。
如本文所述，通过在宿主或宿主细胞(例如植物、植物的一部分或植物细胞)中共同表达NSP4以及VP6和VP4或VP7，当与由表达编码VP6和VP4或VP7而不编码NSP4的所述一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞(例如植物、第二植物的一部分或第二植物细胞)产生的RLP中的VP4和VP7的水平相比时，观察到包含增加的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的ALP，所述第二宿主或宿主细胞(例如第二植物、所述第二植物的一部分或所述第二植物细胞)在与所述宿主或宿主细胞(例如植物、植物的一部分或植物细胞)相同的条件下孵育或生长。
本发明的概述不一定描述本发明的所有特征。
附图说明
从以下针对附图所做的描述中，本发明的这些和其它特征将变得更加明显，其中：
图1显示轮状病毒的细胞进入和复制。当轮状病毒进入细胞时，VP4和VP7丢失，形成双层颗粒(DLP)。dsRNA的转录开始导致VP2、VP4、VP6和VP7的翻译。在病毒工厂(也称为病毒原质)中产生具有复制酶活性的子代核心。后期转录发生在这些子代核心中。在病毒工厂的外围，这些核心包被有VP6，形成出芽穿过内质网膜的不成熟的DLP，获得用ER驻留病毒糖蛋白NSP4和VP7来修饰的瞬时脂质膜；这些包膜颗粒也含有VP4。当颗粒向ER池的内部移动时，瞬时脂质膜和非结构蛋白NSP4丢失，而病毒表面蛋白VP4和VP7重新排列以形成最外层的病毒蛋白层，产生成熟的感染性三层颗粒(参见Swiss Institute of Bioinformatics(ViralZone):viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html)。
图2显示通过在碘克沙醇密度梯度上超速离心来纯化轮状病毒样颗粒。图2A显示用于纯化轮状病毒样颗粒的每层梯度的碘克沙醇的百分比和体积。离心后，将梯度从管的底部开始分级成1ml级分。由箭头指示级分1至13的近似定位。图2B显示在来自应用于表达轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7抗原的叶的粗蛋白提取物的碘克沙醇密度梯度分离中，级分1至级分10的蛋白含量的考马斯染色的SDS-PAGE分析。
图3显示轮状病毒蛋白的表达。图3A显示在NSP4存在或不存在下，在来自应用于表达VP2、VP4、VP6、VP7的叶的粗蛋白提取物的碘克沙醇密度梯度分离中，级分2和级分3的考马斯染色的SDS-PAGE分析。表达了轮状病毒结构蛋白VP2、VP6、VP7、VP4，左图，使用每种结构抗原(“单基因构建体”)的个体构建体，NSP4在单独的构建体上；中间图，两个构建体，每个构建体具有两种结构抗原(“双基因构建体”)的基因，NSP4在单独的构建体上；或右图，用于共表达四种结构抗原(四基因构建体)的单个构建体，以及用于表达NSP4的单独构建体。轮状病毒VP2和VP6抗原的位置，用箭头示出。图3B显示，使用如所规定的抗轮状病毒VP4或VP7抗体的、来自与图3A相同处理的级分F2的蛋白质印迹分析。
图4显示在表达增强子存在下的轮状病毒蛋白表达。图4A显示在来自应用于共表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的叶的粗蛋白提取物的碘克沙醇密度梯度中，级分F2和级分F3的考马斯染色的SDS-PAGE分析。由单基因构建体表达轮状病毒结构蛋白VP2、VP6、VP7、VP4，以及一个构建体表达NSP4(左图)，或者来自两个双基因构建体和一个表达NSP4的构建体(中间图和右图)。除了始终包含CPMV-HT增强子的NSP4构建体之外，每个构建体都包含表达增强子，CPMV HT(左图和中间图)或CMPV 160(右图)。比值表示用于转化的细菌悬浮液中农杆菌(Agrobacterium)菌株的比例：左图—五个单基因构建体(VP2、VP6、VP4、VP7和NSP4；比例为1:1:1:1:1)；中间图和右图—编码结构蛋白(VP6/2和VP7/4)的双基因构建体，以及编码非结构蛋白(NSP4；比例为1:1:1)的构建体。图4B显示使用规定的抗轮状病毒VP4或VP7抗体的、来自与图4A相同处理的F2的蛋白质印迹分析。比值表示用于转化的细菌悬浮液中农杆菌菌株的比例：左图—五个单基因构建体(VP2、VP6、VP4、VP7和NSP4；比例为1:1:1:1:1)；中间图和右图—编码结构蛋白(VP6/2和VP7/4)的双基因构建体，以及编码非结构蛋白(NSP4；比例为1:1:1)的构建体。
图5显示轮状病毒蛋白表达。上图显示来自在应用于共表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的叶的粗蛋白提取物的碘克沙醇密度梯度中，级分F2和级分F3的考马斯染色的SDS-PAGE分析，下图显示来自上图的相应F2级分的蛋白质印迹分析。在四基因构建体内表达了轮状病毒结构蛋白VP2、VP6、VP7和VP4，以及由不同的单基因构建体共表达非结构蛋白NSP4(泳道1和泳道2)，或在五基因构建体中表达结构蛋白VP2、VP6、VP7、VP4和非结构蛋白NSP4(泳道3)。指出了构建体的农杆菌渗入的比例。将细菌悬浮液中农杆菌菌株0.4的OD值表示为1。将细菌悬浮液中农杆菌菌株0.6的OD表示为1.5。
图6显示可用于本发明构建体的几种增强子序列的实例的一般示意图。图6A和图6B显示与目标核苷酸序列(例如编码轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或非结构蛋白NSP4)融合的CPMV HT和CPMV HT+增强子序列的一般示意图。不是图5A或5B中所示的全部元件可能在增强子序列内是必需的。可以将另外的元件包括在目标核苷酸序列的3'末端，包括编码豇豆花叶病毒3'非翻译区(CPMV 3'UTR)或质体蓝素3'UTR(3'UTR)的序列。图6C和图6D显示如本文所述的CPMVX和CPMVX+(包含CPMVX和填充片段，其在该非限制性实例中包含多克隆位点和植物kozak序列)的增强子序列的一般示意图。CPMVX和CPMVX+各自显示为在其5'端和其3'末端可操作地连接到植物调控区，按顺序排列：目标核苷酸序列(包括ATG起始位点和STOP(终止)位点)、3'UTR和终止子序列。如本文所述构建体CPMVX的实例是CPMV160。如本文所述构建体CPMVX+的实例是CPMV160+。
图7显示用于制备编号1710的构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP2(opt)/NOS)的序列组分。图7A显示IF-WA_VP2(opt).s1+3c的核苷酸序列(SEQ ID NO:19)。图7B显示IF-WA_VP2(opt).s1-4r的核苷酸序列(SEQ ID NO：20)。图7C显示来自WA株的轮状病毒A VP2的优化编码序列。图7D显示构建体1191的示意图。图7E显示构建体1191的核苷酸序列(SEQ IDNO：22)。图7F显示编号1710的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：23)。图7G显示来自轮状病毒A WA株的VP2的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。图7H显示编号1710的构建体的示意图。
图8显示用于制备编号1713的构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP6(opt)/NOS)的序列组分。图8A显示IF-WA_VP6(opt).s1+3c的核苷酸序列(SEQ ID NO：25)。图8B显示IF-WA_VP6(opt).s1-4r的核苷酸序列(SEQ ID NO：26)。图8C显示来自WA株的轮状病毒A VP6的优化编码序列(SEQ ID NO：217)。图8D显示编号1713的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：28)。图8E显示来自轮状病毒A WA株的VP6的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。图8F显示编号1713的构建体的示意图。
图9显示用于制备编号1730的构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS)的序列组分。图9A显示IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c的核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。图9B显示IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r的核苷酸序列(SEQ ID NO：31)。图9C显示来自RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的轮状病毒A VP4的优化编码序列(SEQ ID NO：32)。图9D显示编号1730的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：33)。图9E显示来自轮状病毒ARotarix株的VP4的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。图9F显示编号1730的构建体的示意图。
图10显示用于制备编号1734的构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP7(Opt)/NOS)的序列组分。图10A显示IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c的核苷酸序列(SEQ ID NO：35)。图10B显示IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r的核苷酸序列(SEQ ID NO：36)。图10C显示来自RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的轮状病毒A VP7的优化编码序列(SEQ ID NO：37)。图10D显示编号1734的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：38)。图10E显示来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的TrSp-VP7的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)。图10F显示编号1734的构建体的示意图。
图11显示用于制备编号1706的构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)NSP4/NOS)的序列组分。图11A显示IF-WA_NSP4.s1+3c的核苷酸序列(SEQ ID NO：40)。图11B显示IF-WA_NSP4.s1-4r的核苷酸序列(SEQ ID NO：41)。图11C显示来自WA株的轮状病毒A VP6的编码序列(SEQ ID NO：42)。图11D显示编号1706的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：43)。图11E显示来自轮状病毒A WA株的NSP4的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)。图11F显示编号1706的构建体的示意图。
图12显示用于制备编号1108的构建体(2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP2(opt)/NOS)的序列组分。图12A显示IF(C160)-WA_VP2(opt).c的核苷酸序列(SEQ ID NO：45)。图12B显示构建体1190的示意图。图12C显示构建体1190的核苷酸序列(SEQ ID NO：46)。图12D显示编号1108的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：47)。图12E显示编号1108的构建体的示意图。
图13显示用于制备编号1128的构建体(2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP6(opt)/NOS)的序列组分。图13A显示IF(C160)-WA_VP6(opt).c的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。图13B显示编号1128的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：49)。图13C显示编号1128的构建体的示意图。
图14显示用于制备编号1178的构建体(2X35S/CPMV-160/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS)的序列组分。图14A显示IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c的核苷酸序列(SEQ ID NO：50)。图14B显示编号1178的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：51)。图14C显示编号1178的构建体的示意图。
图15显示用于制备编号1199的构建体(2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx)VP7(Opt)/NOS)的序列组分。图15A显示IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c的核苷酸序列(SEQ IDNO：52)。图15B显示编号1199的表达盒的核苷酸序列(SEQ ID NO：53)。图15C显示编号1199的构建体的示意图。
图16显示编号1708的构建体(用于在CPMV-HT表达盒下表达VP6和VP2的双基因构建体)的示意图。
图17显示编号1719的构建体(用于在CPMV-HT表达盒下表达VP7和VP4的双基因构建体)的示意图。
图18显示编号2400的构建体(用于在CPMV-160表达盒下表达VP6和VP2的双基因构建体)的示意图。
图19显示编号2408的构建体(用于在CPMV-160表达盒下表达VP7和VP4的双基因构建体)的示意图。
图20显示编号1769的构建体(用于在CPMV-HT表达盒下表达VP7、VP4、VP6和VP2的四基因构建体)的示意图。
图21显示编号2441的构建体(用于在CPMV-HT表达盒下表达VP4、VP7、NSP4、VP6和VP2的五基因构建体)的示意图。
发明详述
以下描述是优选的实施方案。
本发明涉及包含一种或多种轮状病毒结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)(即轮状病毒样颗粒，轮状病毒VLP或RLP)，以及在任何宿主(特别是在植物、植物的一部分或植物细胞)中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法。其他宿主可以包括例如昆虫细胞和哺乳动物细胞。轮状病毒样颗粒(RLP)可以包含一种或多种轮状病毒结构蛋白。RLP可以是三层。可以通过在植物中共表达轮状病毒结构蛋白和轮状病毒非结构蛋白来产生RLP，然而，RLP不包含任何轮状病毒非结构蛋白。
宿主或宿主细胞可以来自包括植物、真菌、细菌、昆虫和动物的任何来源。在优选的实施方案中，宿主或宿主细胞是植物或植物细胞。
本发明部分地还提供了在宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法。该方法可以包括引入一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含在宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)中有活性的调控区，所述调控区可操作地连接到进入宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)的编码一种或多种轮状病毒结构蛋白和一种或多种轮状病毒非结构蛋白的核苷酸序列。随后在允许核酸表达的条件下，孵育宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)从而产生包含一种或多种轮状病毒结构蛋白的RLP。一种或多种轮状病毒结构蛋白可以是轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6或VP7。轮状病毒非结构蛋白可能是NSP4。RLP可以是三层的。RLP可以包含轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6和VP7，并且不包含非结构蛋白NSP4。
本发明部分地还提供了在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法，所述方法可以包括：
提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列可操作地连接到在宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列编码NSP4和轮状病毒蛋白VP2或VP6的一种或两种以及轮状病毒蛋白VP7或VP4的一种或两种；
在允许表达一种或多种核酸的条件下孵育宿主或宿主细胞，使得NSP4以及VP2、VP4和VP7，或VP2、VP6和VP7，或VP2、VP6和VP4，或VP6、VP4和VP7被表达，从而产生RLP。
此外，一种或多种核酸可以包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列。所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列可操作地连接到在宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且所述第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、或VP6、VP4或VP7和NSP4，其中从一种或多种核酸表达NSP4和VP2或VP6以及VP4或VP7。
此外，本发明部分地提供了在宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)中产生轮状病毒样颗粒(RLP)疫苗候选物的方法。该方法可以包括在宿主(如在植物或植物的一部分)中表达一种或多种核酸(R1-R5)，所述一种或多种核酸(R1-R5)包含在宿主(如在植物、植物的一部分或植物细胞)中有活性的一种或多种调控区，所述调控区可操作地连接到核苷酸序列R1-R5，其中核苷酸序列R1编码轮状病毒蛋白X1，核苷酸序列R2编码轮状病毒蛋白X2，核苷酸序列R3编码轮状病毒蛋白X3，核苷酸序列R4编码轮状病毒蛋白X4，并且核苷酸序列R5编码轮状病毒蛋白X5，以及X1-X5各自选自轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，使得VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种在宿主(如在植物、植物的一部分或植物细胞)中被表达(参见表1)。RLP可以包含轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6和VP7。RLP不包含非结构蛋白NSP4。
已经发现，通过在宿主(如植物或植物的一部分)中引入和共表达轮状病毒结构蛋白和轮状病毒非结构蛋白，可以调节产生的RLP的产量。特别地，已经发现，通过在宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)中共同表达轮状病毒结构蛋白以及轮状病毒非结构蛋白NSP4，当与在相同条件下由表达相同的轮状病毒结构蛋白但不表达轮状病毒非结构蛋白的第二宿主(如第二植物、第二植物的一部分或第二植物细胞)产生的VP4和VP7的水平相比，可以增加结构蛋白VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入到RLP中。
提供了例如增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法。该方法包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列、编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列和编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列；所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7、VP4、NSP4之一以及VP2或VP6；
b)在允许表达一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得VP7、VP4、NSP4和VP2或VP6中的每一种被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
此外，增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者在轮状病毒样颗粒(RLP)中产生的可选择的方法，该方法可以包括：
a)向植物、植物的一部分或植物细胞中引入一种或多种核酸，所述一种或多种核酸包含可操作地连接到第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列的一种或多种调控区，所述一种或多种调控区在植物、植物的一部分或植物细胞中是有活性的，所述第一核苷酸序列编码第一轮状病毒蛋白，所述第二核苷酸序列编码第二轮状病毒蛋白，所述第三核苷酸序列编码第三轮状病毒蛋白，所述第四核苷酸序列编码第四轮状病毒蛋白，以及所述第五核苷酸序列编码第五轮状病毒蛋白，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列、或所述第五核苷酸序列各自编码VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，和
b)在允许一种或多种核酸瞬时表达的条件下孵育植物、植物的一部分或植物细胞，使得VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种都被瞬时表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二植物、第二植物的一部分或第二植物细胞产生的VP4和VP7的水平相比，具有增强的VP4和VP7水平的RLP。
如果需要，该方法还可以包括以下步骤：
c)收获植物、植物的一部分或植物细胞，和
d)从植物、植物的一部分或植物细胞纯化所述RLP，其中RLP的大小范围为70-100nm。
还提供了增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者在轮状病毒样颗粒(RLP)中产生的可选择的方法，该方法包括：
a)提供包含一种或多种核酸的植物、植物的一部分或植物细胞，所述一种或多种核酸包含可操作地连接到第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列的一种或多种调控区，所述一种或多种调控区在植物、植物的一部分或植物细胞中是有活性的，所述第一核苷酸序列编码第一轮状病毒蛋白，所述第二核苷酸序列编码第二轮状病毒蛋白，所述第三核苷酸序列编码第三轮状病毒蛋白，所述第四核苷酸序列编码第四轮状病毒蛋白，以及所述第五核苷酸序列编码第五轮状病毒蛋白，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列、或所述第五核苷酸序列各自编码VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，和
b)在允许一种或多种核酸表达的条件下孵育植物、植物的一部分或植物细胞，使得VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种都被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二植物、第二植物的一部分或第二植物细胞产生的VP4和VP7的水平相比，具有增强的VP4和VP7水平的RLP。
进一步发现，在宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)中的瞬时表达期间，通过调节包含编码轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP4的核酸的构建体之间的比例，可以提高RLP产生的产量和结构蛋白VP4和VP7并入到RLP中。
不希望受理论束缚，轮状病毒非结构蛋白(例如NSP4)与一种或多种轮状病毒结构蛋白(例如VP2、VP4、VP6和/或VP7)的共表达可导致并入到RLP中的VP4和/或VP7的增加。并入到RLP中的VP4和/或VP7的这种增加，可以通过轮状病毒蛋白的表达或产生的增加，和/或由于RLP组装功效的增加，和/或在RLP组装位置的轮状病毒蛋白募集的增加而发生。
如图3A和图3B所示，当与不存在NSP4的结构蛋白VP2、VP6、VP4和VP7的表达相比时，轮状病毒非结构蛋白NSP4与轮状病毒结构蛋白VP2、VP6、VP4和VP7在植物中的共表达导致VP4和VP7并入到RLP中的增加(参见图3B)。
可以通过提供包含在两个构建体、三个构建体、四个构建体或五个构建体上的编码轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白NSP4的核酸序列的构建体，并且在将构建体引入宿主(使用农杆菌对植物、植物的一部分或植物细胞)的步骤期间改变每个构建体的量，来改变在宿主(如植物、植物的一部分或植物细胞)中瞬时表达的编码各种结构和非结构蛋白的构建体的比例。例如，可以以各种比例共同引入五个单独的构建体(每个编码一种结构蛋白和非结构蛋白)，导致在植物、植物的一部分或植物细胞内核酸以各种比例共表达。可选择地，可以以两个构建体、三个构建体或四个构建体的各种组合提供核酸序列，并且所述构建体以如下所述的各种比例共引入到植物、植物的一部分或植物细胞。
另外，可以在相同的构建体上提供核酸序列。
“轮状病毒蛋白”可以指轮状病毒结构蛋白或轮状病毒非结构蛋白。“轮状病毒结构蛋白”可以指从轮状病毒分离的轮状病毒结构蛋白的全部或一部分，存在于任何天然存在的轮状病毒株或分离株或任何天然存在的轮状病毒株或分离株的变体中。因此，术语轮状病毒结构蛋白包括天然存在的轮状病毒结构蛋白，或可以通过在病毒生命周期期间的突变产生或响应于选择性压力(例如，药物治疗、宿主细胞趋向性的扩张或感染性等)产生的轮状病毒结构蛋白的变体。如本领域技术人员所了解的，也可以使用重组技术产生这种轮状病毒结构蛋白及其变体。轮状病毒结构蛋白可以包括衣壳蛋白(例如VP2和VP6)、表面蛋白(例如VP4)或衣壳蛋白和表面蛋白的组合。结构蛋白还可以包括例如VP7。
轮状病毒“非结构蛋白”(non structural protein/nonstructural protein/non-structural protein)、“NSP”或“非结构轮状病毒蛋白”是指轮状病毒基因组编码的蛋白，但不被包装入病毒颗粒。轮状病毒非结构蛋白的非限制性实例是轮状病毒NSP4。
“共表达”是指在植物内、在植物的相同组织内和在植物中相同的细胞内，在大约同一时间表达两种或多于两种核苷酸序列。不需要在完全相同的时间表达核苷酸序列。相反，以使得编码产物有机会在期望的细胞区室内相互作用的方式表达两种或多种核苷酸序列。例如，可以优选地在表达结构蛋白之前或期间表达非结构蛋白。可以使用瞬时表达系统共表达两种或两种以上的核苷酸序列，其中在表达两种或更多种序列的条件下，在大约同时将两种或更多种序列引入植物中。两种或两种以上的序列可以存在于不同的构建体上，并且共表达需要将每个构建体引入植物、植物的一部分或植物细胞中，或者两种或两种以上的序列可以存在于一个构建体上并将该构建体引入植物、植物的一部分或植物细胞中。
术语“病毒样颗粒”(virus-like particle/virus-like particles)(VLP)或“VLPs”是指自组装并包含一种或多种结构蛋白(例如轮状病毒结构蛋白，例如但不限于VP2、VP4、VP6、VP7、或VP2、VP4、VP6、VP7结构蛋白的组合)的结构。包含轮状病毒结构蛋白的VLP，也可以称为“轮状病毒VLP”、“轮状病毒样颗粒(RVLP)”、“轮状病毒样颗粒(RLP)”、“轮状病毒样颗粒”、“RVLP”或“RLP”。VLP或RLP通常在形态学和抗原性上类似于在感染中产生的病毒粒子，但缺乏足以复制的遗传信息并因此是非感染性的。可以在包括植物宿主细胞的合适真核宿主细胞中产生VLP。在合适的条件下，从宿主细胞中提取后，并经分离以及进一步纯化，VLP可以以完整结构被重新获得。RLP可以是单层RLP、双层RLP或三层RLP。可以通过同时表达三种或更多种轮状病毒结构蛋白，并且如本文所述，与一种或多种非结构蛋白共表达获得三层RLP。例如，结构蛋白VP2、VP6、VP7、VP4和非结构蛋白NSP4的共表达导致产生三层RLP。
VP4和VP2、VP6、VP7以及所需一种或多种非结构蛋白的共表达，导致具有类似于天然轮状病毒的刺突的颗粒。可以处理或切割VP4以产生VP5和VP8。该处理可以使用内源蛋白酶，或者通过共同表达合适的蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)在宿主内进行。可选择地，可以通过在RLP提取过程的任何步骤期间或RLP纯化之后，添加合适的蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶，糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)来处理VP4以产生VP5和VP8。
轮状病毒结构蛋白中的每一种具有不同的特性和大小，并且需要不同的量用于组装成RLP。术语“轮状病毒VLP”、“轮状病毒病毒样颗粒(RVLP)”、“轮状病毒病毒样颗粒(RLP)”、“轮状病毒病毒样颗粒”、“RVLP”或“RLP”是指包含一种或多种轮状病毒结构蛋白的病毒样颗粒(VLP)。轮状病毒结构蛋白的实例，可以包括但不限于VP2、VP4(或VP5和VP8)、VP6和VP7结构蛋白。RLP可以不包含轮状病毒非结构蛋白。
本发明提供了在植物中产生RLP的方法，其中包含在植物中有活性的一种或多种调控区的一种或多种核酸(N1-N5)可操作地连接到核苷酸序列R1-R5，其中核苷酸序列R1编码轮状病毒蛋白X1，核苷酸序列R2编码轮状病毒蛋白X2，核苷酸序列R3编码轮状病毒蛋白X3，核苷酸序列R4编码轮状病毒蛋白X4，以及核苷酸序列R5编码轮状病毒蛋白X5，并且其中X1-X5选自轮状病毒组蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4各自被选择一次(参见表1)。用于转化宿主的核酸的最终集合或组合，导致该宿主内每种轮状病毒蛋白的表达，导致VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的表达以及RLP的形成。
例如，参考表1，可以使用2种核酸(N1和N2)来转化宿主(参见实施例#2.1)。在这种情况下，N1包含R1核苷酸序列，并且R1可编码VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一。核酸N2包含四种序列R2至R5，且R2至R5的每一个编码VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，而不是由R1编码的蛋白，以使得VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种在宿主内被表达，从而产生RLP。作为非限制性实例，N1可以包含可编码VP2的R1，并且N2可以包含可分别编码VP4、VP6、VP7和NSP4的R2至R5。
表1提供了不被认为是限制性的核酸(N)和核苷酸序列(R)的组合的概述，其可以在宿主内被表达或被共表达，以产生包含VP2、VP4、VP6和VP7的RLP。
表1
*对于组合1.1、2.1、2.2、3.1、3.2、4.1和5：X1、X2、X3、X4和X5各自必须是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的不同轮状病毒蛋白。
对于组合1.3、2.5和3.4：X1、X2和X3各自必须是选自VP4、VP6和NSP4，或VP7、VP6和NSP4的不同轮状病毒蛋白。
对于组合1.2、2.3、2.4、3.3和4.2：X1、X2、X3和X4各自必须是选自VP2、VP4、VP6和NSP4，VP2、VP7、VP6和NSP4，或VP4、VP7、VP6和NSP4的不同轮状病毒蛋白。
1.一个构建体
1.1五基因构建体
如本文所述，提供了在植物中产生RLP的方法，其中在植物或植物的一部分中表达核酸(N1；第一核酸)，所述核酸包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1、X2、X3、X4、X5)的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R1、R2、R3、R4、R5)(参见表1，组合#1.1)。
因此，核酸N1包含核苷酸序列R1、R2、R3、R4和R5，其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是编码每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的核苷酸被包含在核酸N1上，从而允许在转化的宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
所述核酸可以包含核苷酸序列R1(其中R1可以编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4)和核苷酸序列R2-R5(其中R2-R5编码选自VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4的轮状病毒蛋白，并且其中所述轮状病毒蛋白不由R1编码)。例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP2，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP4、VP6、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP2。在不被认为是限制性的另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP6、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP6，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP6。在不被认为是限制性的另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP7，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4，但是R2-R5不编码VP7。在不被认为是限制性的另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白NSP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7，但是R2-R5不编码NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第三核苷酸序列(R3)、编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第四核苷酸序列(R4)，以及编码第五轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP2)的第五核苷酸序列(R5)。
在另一非限制性实例中，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第三核苷酸序列(R3)、编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第四核苷酸序列(R4)，以及编码第五轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP2)的第五核苷酸序列(R5)。
在另一非限制性实例中，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第三核苷酸序列(R3)、编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP2)的第四核苷酸序列(R4)，以及编码第五轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第五核苷酸序列(R5)。
在另一非限制性实例中，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第三核苷酸序列(R3)、编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP2)的第四核苷酸序列(R4)，以及编码第五轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第五核苷酸序列(R5)。(参见图5)可以用单个核酸(N1)转化植物，所述单个核酸(N1)包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R1、R2、R3、R4、R5)，使得第一蛋白、第二蛋白、第三蛋白、第四蛋白和第五蛋白中的每一种在植物中被表达。轮状病毒蛋白选自：轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，使得VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种在植物中被表达。可以以瞬时方式或以稳定的方式将单一核酸引入植物中。
可以通过共表达编码合适蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)的核酸，以在宿主内处理或切割VP4以产生VP5和VP8。可选择地，可以通过在RLP提取过程的任何步骤期间或RLP纯化之后，添加合适的蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)来处理VP4。
1.2四基因构建体
如本文所述，提供了在植物中产生RLP的方法，其中在植物或植物的一部分中表达核酸(N1；第一核酸)，所述核酸(N1；第一核酸)包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白和第四轮状病毒蛋白(X1、X2、X3、X4)的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列(R1、R2、R3、R4)(参见表1，组合#1.2)。
因此，核酸N1可以包含核苷酸序列(R1、R2、R3、R4)，其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，以及其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是编码每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4的核苷酸序列被包含在核酸N1上，从而允许在转化的宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP2)的第三核苷酸序列(R3)，以及编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第四核苷酸序列(R4)。
相应进一步地，核酸N1可以包含核苷酸序列(R1、R2、R3、R4)，其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是编码每种轮状病毒蛋白VP2、VP7、VP6和NSP4的核苷酸序列被包含在核酸N1上，从而允许在转化的宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP7、VP6和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP2)的第三核苷酸序列(R3)，以及编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第四核苷酸序列(R4)。
相应进一步地，核酸N1可以包含核苷酸序列(R1、R2、R3、R4)，其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP7、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP7、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP7、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP7、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是编码每种轮状病毒蛋白VP7、VP4、VP6和NSP4的核苷酸序列被包含在核酸N1上，从而允许在转化的宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP7、VP4、VP6和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第三核苷酸序列(R3)，以及编码第四轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白NSP4)的第四核苷酸序列(R4)。
1.3三基因构建体
如本文所述，提供了在植物中产生RLP的方法，其中在植物或植物的一部分中表达核酸(N1；第一核酸)，所述核酸(N1；第一核酸)包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白和第三轮状病毒蛋白(X1、X2、X3)的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列(R1、R2、R3)(参见表1，组合#1.3)。
因此，核酸N1可以包含核苷酸序列(R1、R2、R3)，其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R3编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2编码不是X3的轮状病毒蛋白，结果是编码每种轮状病毒蛋白VP4、VP6和NSP4的核苷酸序列被包含在核酸N1上，从而允许在转化的宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP6和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP4)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白)的第三核苷酸序列(R3)。
相应进一步地，核酸N1可以包含核苷酸序列(R1、R2、R3)，其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中R2-R3编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2编码不是X3的轮状病毒蛋白，结果是编码每种轮状病毒蛋白VP7、VP6和NSP4的核苷酸序列被包含在核酸N1上，从而允许在转化的宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP7、VP6和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列(N1)包含：编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP6)的第一核苷酸序列(R1)、编码第二轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白VP7)的第二核苷酸序列(R2)、编码第三轮状病毒蛋白(例如轮状病毒蛋白)的第三核苷酸序列(R3)。
2.两个构建体
2.1四基因构建体+单基因构建体
本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)与包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X2-X5)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达(参见表1，组合#2.1)，使得第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R1-R5)在植物中共表达。
在这一非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1)，并且N2包含核苷酸序列(R2、R3、R4、R5)，其中以构建体N1和构建体N2的组合编码选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2，VP4，VP6，VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP2，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP4、VP6、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP2。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP6、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP6，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP6。在不被认为是限制性的另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP7，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4，但是R2-R5不编码VP7。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白NSP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7，但是R2-R5不编码NSP4。
可以在相同的步骤中将第一核酸(N1)和第二核酸(N2)引入植物中，或者依次引入植物中。
例如，不被认为是限制性的，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP7、VP4、VP6和VP2)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达(参见图5)。
在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP4、VP7、VP6和VP2)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP7、VP4、VP2和VP6)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP4、VP7、VP2和VP6)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP6、VP2、VP4和VP7)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP6、VP2、VP7和VP4)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP2、VP4、VP6和VP7)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，VP7、VP6、VP4和VP2)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如VP7)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，NSP4、VP2、VP6和VP4)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。在另一非限制性实例中，包含编码第一轮状病毒蛋白(例如VP4)的核苷酸序列(R1)的第一核苷酸序列(N1)与包含分别编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如，NSP4、VP2、VP6和VP7)的四个连续的核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)共同表达。
可以用包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X2-X5)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。此外，可以用包含编码轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第二核酸(N1)，来转化表达包含编码轮状病毒蛋白X2-X5的四个核苷酸序列(R2-R5)的第一核酸(N2)的植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列和第二核苷酸序列R1-R5。轮状病毒蛋白X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且轮状病毒蛋白X2-X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白但不是X1，使得表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。此外，可以用包含编码轮状病毒蛋白X2-X5的四个核苷酸序列(R2-R5)的第一核酸(N2)，与包含编码轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第二核酸(N1)一起同时共转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列和第二核苷酸序列R1-R5。轮状病毒蛋白X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且轮状病毒蛋白X2-X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白但不是被选为X1的蛋白，使得表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)和第二核酸(N2)引入植物中。
例如，不被认为是限制性的，可以用包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X2-X5)(例如VP7、VP4、VP6和VP2)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的植物，使得在植物中共表达NSP4、VP7、VP4、VP6和VP2。
可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的第一植物，与表达包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X2-X5)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物(第三植物)。此外，可以将表达包含编码轮状病毒蛋白X2-X5的四个核苷酸序列(R2-R5)的第一核酸(N2)的第一植物，与表达包含编码轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第二核酸(N1)的第二植物杂交，使得在子代植物中共表达核苷酸序列R1-R5。轮状病毒蛋白可以是选自轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在子代植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
可以通过共表达编码合适蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)的核酸，在宿主内处理或切割VP4以产生VP5和VP8。可选择地，可以通过在RLP提取过程的任何步骤期间或RLP纯化之后，添加合适的蛋白酶(例如胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶，糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶)来处理VP4。
2.2三基因构建体|+双基因构建体
本发明还提供在植物中产生RLP的方法，其中将包含分别编码第一轮状病毒蛋白(X1)和第二轮状病毒蛋白(X2)的两个核苷酸序列(R1和R2)的第一核酸(N1)，与包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X3-X5)的三个核苷酸序列(R3-R5)的第二核酸(N2)共表达(参见表1，组合#2.2)，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。
在非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1、R2)，并且N2包含核苷酸序列(R3、R4、R5)，其中选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的每种轮状病毒蛋白都被编码，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
因此，第一核酸(N1)可以包含核苷酸序列R1(其中R1可以编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4)和第二核苷酸序列R2(其可以编码选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何不由R1编码的轮状病毒蛋白)。第二核酸(N2)可以包含核苷酸序列R3-R5，其中R3-R5编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1或R2编码的轮状病毒蛋白。例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP2，并且核苷酸序列R2-R5可以以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP4、VP6、VP7和NSP4，但R2-R5不编码VP2。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP6、VP7和NSP4。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP6，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP7和NSP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP7，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白NSP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7。
可以用包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X3-X5)的三个核苷酸序列(R3-R5)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白和第二轮状病毒蛋白(X1+X2)的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列(R1+R2)的第一核酸(N1)的植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)和第二核酸(N2)引入植物中。
此外，可以用包含编码第四轮状病毒蛋白(X1)和第五轮状病毒蛋白(X2)的第四核苷酸序列(R1)的第二核酸(N1)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白和第三轮状病毒蛋白(X3-X5)的三个核苷酸序列(R3-R5)的第一核酸(N2)的植物，使得在植物中共表达第一核酸和第二核酸R1-R5。轮状病毒蛋白X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且轮状病毒蛋白X2-X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白但不是X1，使得表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。例如，其不被认为是限制性的，可以用包含编码第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X2)(例如VP2和NSP4)的第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R1-R2)的第二核酸(N1)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白和第三轮状病毒蛋白(X3-X5)(例如VP7、VP4和VP6)的三个核苷酸序列(R3-R5)的第一核酸(N2)的植物，使得在植物中共表达NSP4、VP7、VP4、VP6和VP2。此外，可以用包含编码第一轮状病毒蛋白和第二轮状病毒蛋白(X1+X2)的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列(R1+R2)的第一核酸(N1)，与包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X3-X5)的三个核苷酸序列(R3-R5)的第二核酸(N2)一起同时共转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)和第二核酸(N2)引入植物中。
可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)和编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第一核酸(N1)的第一植物，与表达包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X3-X5)的三个核苷酸序列(R3-R5)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物(第三植物)。此外，可以将表达包含编码轮状病毒蛋白X3-X5的三个核苷酸序列(R3-R5)的第一核酸(N2)的第一植物，与表达包含编码轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)和编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N1)的第二植物杂交，使得在子代植物中共表达核苷酸序列R1-R5。轮状病毒蛋白可以是选自轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在子代植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
2.3.三基因构建体+单基因构建体
本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的一种核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白和第四轮状病毒蛋白(X2-X4)的三种核苷酸序列(R2-R4)的第二核酸(N2)共表达，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列(参见表1，组合#2.3)。
在非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1)，并且N2包含核苷酸序列(R2、R3、R4)，其中编码选自VP2、VP4、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1)，并且N2包含核苷酸序列(R2、R3、R4)，其中编码选自VP2、VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP7、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1)，并且N2包含核苷酸序列(R2、R3、R4)，其中编码选自VP4、VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP7、VP6和NSP4。
2.4两个双基因构建体
本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白和第二轮状病毒蛋白(X1-X2)的核苷酸序列(R1-R2)的第一核酸(N1)，与包含编码第三轮状病毒蛋白和第四轮状病毒蛋白(X3-X4)的两个核苷酸序列(R3-R4)的第二核酸(N2)共表达，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列(参见表1，组合#2.4)。
在非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1、R2)，并且N2包含核苷酸序列(R3、R4)，其中编码选自VP2、VP4、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1、R2)，并且N2包含核苷酸序列(R3、R4)，其中编码选自VP2、VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4任何的轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP7、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1、R2)，并且N2包含核苷酸序列(R3、R4)，其中编码选自VP4、VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP7、VP6和NSP4。
2.5双基因构建体+单基因构建体
本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白和第二轮状病毒蛋白(X1-X2)的核苷酸序列(R1-R2)的第一核酸(N1)，与包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的核苷酸序列(R3)的第二核酸(N2)共表达，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列(参见表1，组合#2.5)。
在非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1、R2)，并且N2包含核苷酸序列(R3)，其中编码选自VP4、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R3编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R2编码不是X3的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含核苷酸序列(R1、R2)，并且N2包含核苷酸序列(R3)，其中编码选自VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R3编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R2编码不是X3的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP7、VP6和NSP4。
3.三个构建体
3.1两个双基因构建体+一个单基因构建体
本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)和编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第一核酸(N1)，与包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的的第三核苷酸序列(R3)和编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第二核酸(N2)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)共表达(参见表1，组合#3.1)，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。
在该非限制性实例中，N1包含(R1、R2)，N2包含(R3、R4)，并且N3包含(R5)，其中选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
例如，第一核酸(N1)可以包含核苷酸序列R1(其中R1可以编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4)和第二核苷酸序列R2(其可以编码不由R1编码的选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白)。第二核苷酸序列可以包含核苷酸序列R3和核苷酸序列R4，其中R3编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1或R2编码的轮状病毒蛋白，并且R4编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1、R2或R3编码的轮状病毒蛋白。第三核苷酸序列可以包含核苷酸序列R5，其中R5编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1、R2、R3或R4编码的轮状病毒蛋白，使得在宿主中表达VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4。
例如，不被认为是限制性的，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP2，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP4、VP6、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP2。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP6、VP7和NSP4。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP6，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP7和NSP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP7，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白NSP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7。
例如，不被认为是限制性的，将包含编码第一轮状病毒蛋白(例如VP6)的第一核苷酸序列(R1)和编码第二轮状病毒蛋白(例如VP2)的第二核苷酸序列(R2)的第一核酸(N1)，与包含编码第三轮状病毒蛋白(例如VP7)的第三核苷酸序列(R3)和编码第四轮状病毒蛋白(例如VP4)的第四核苷酸序列(R4)的第二核酸(N2)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(例如NSP4)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)共表达。(参见图2和图3)。
可以用包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)和编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)和第二轮状病毒蛋白(X2)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的植物。可以用包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(R3)进一步转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。此外，可以用包含编码第一轮状病毒蛋白和第二轮状病毒蛋白(X1+X2)的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列(R1+R2)的第一核酸(N1)，包含编码第三轮状病毒蛋白和第四轮状病毒蛋白(X3+X4)的第三核苷酸序列和第四核苷酸序列(R3+R4)的第二核酸(N2)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)同时转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)、第二核酸(N2)和第三核酸(N3)引入植物中。
3.2两个单基因构建体+一个三基因构建体
还提供了在植物中产生RLP的可替换的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)第二核酸(N2)，以及包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)、编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)和编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)共表达(参见表1，组合#3.2)，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。
在另一可替换的实例中，N1包含(R1)，N2包含(R2)，且N3包含(R3、R4、R5)，其中选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
例如，不被认为是限制性的，第一核酸(N1)可以包含核苷酸序列R1(其中R1可以编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4)和第二核苷酸序列R2(其可以编码不由R1编码的选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白)。第二核苷酸序列可以包含核苷酸序列R3和R4，其中R3编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1或R2轮状病毒蛋白，并且R4编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1、R2或R3编码的轮状病毒蛋白。第三核苷酸序列可以包含核苷酸序列R5，其中R5编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4，但不是由R1、R2、R3或R4编码的轮状病毒蛋白，并且其中VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4被编码一次。例如，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP2，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP4、VP6、VP7和NSP4，但是R2-R5不编码VP2。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP6、VP7和NSP4。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP6，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP7和NSP4。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP7，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。在另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白NSP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7。
可以用包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的植物。可以用包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)、编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)和编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)进一步转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。此外，可以用包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，与包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X3-X5)的第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R3-R5)的第三核酸(N3)一起同时共转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)、第二核酸(N2)和第三核酸(N3)引入植物中。
例如，可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白和第三轮状病毒蛋白(X1、X2和X3)的第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列(R1、R2和R3)的第一核酸(N1)的第一植物，与表达包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生子代植物(第三植物)。可以将第三植物与表达包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)的第四植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物。此外，可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的第一植物，与表达包含编码轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生子代植物(第三植物)。可以将第三植物与表达包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X3、X4和X5)的第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R3、R4和R5)的第三核酸(N3)的第四植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
3.3两个单基因构建体+一个双基因构建体
还提供了在植物中产生RLP的可替换的方法，其中可以将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，以及包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)和编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第三核酸(N3)共表达，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列(参见表1，组合#3.3)。
作为非限制性实例，N1包含(R1)，N2包含(R2)，并且N3包含(R3、R4)，其中选自VP2、VP4、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。
作为另一非限制性实例，N1包含(R1)，N2包含(R2)，并且N3包含(R3、R4)，其中选自VP2、VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2，VP6，VP7和NSP4。
作为另一非限制性实例，N1包含(R1)，N2包含(R2)，并且N3包含(R3、R4)，其中选自VP4、VP7、VP6和NSP4的轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP7、VP6和NSP4。
3.4三个单基因构建体
还提供了在植物中产生RLP的可替换的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，以及包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)共表达，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和第三核苷酸序列(参见表1，组合#3.4)。
作为非限制性实例，N1包含(R1)，N2包含(R2)，并且N3包含(R3)，其中选自VP4、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R3编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R2编码不是X3轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP6和NSP4。
作为另一非限制性实例，N1包含(R1)，N2包含(R2)，并且N3包含(R3)，其中选自VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码一次，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R3编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R2编码不是X3的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP7、VP6和NSP4。
4.四个构建体
4.1.三个单基因构建体+一个双重基因构建体
本文还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，以及包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)和编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第四核酸(N4)共表达(参见表1组合#4.1)，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。
在该实例中，N1包含(R1)，N2包含(R2)，N3包含(R3)，并且N4包含(R4和R5)，其中选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
可以任何顺序将四个核酸引入植物中。例如，不被认为是限制性的，可以用编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的植物。可以用包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)进一步转化该植物。然后可以用包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)和编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第四核酸(N4)进一步转化该植物，使得在该植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。此外，可以用包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，以及包含编码第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X4-X5)的第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(R4-R5)的第四核酸(N4)同时共转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)、第二核酸(N2)、第三核酸(N3)和第四核酸(N4)引入植物中。
此外，可以用包含编码第三轮状病毒蛋白(X1)的第三核苷酸序列(R1)的第二核酸(N1)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X4)的第一核苷酸序列(R4)和编码第二轮状病毒蛋白(X5)的第二核苷酸序列(R5)的第一核酸(N4)的植物。可以用包含编码第四轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R2)的第三核酸(N2)进一步转化该植物。然后可以用包含编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列(R3)和编码第五轮状病毒蛋白(X3)的第五核苷酸序列(R3)的第四核酸(N3)进一步转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N4)、第二核酸(N1)、第三核酸(N2)和第四核酸(N3)引入植物中。
可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的第一植物，与表达包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生子代植物(第三植物)。可以将第三植物与表达包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)的第四植物杂交，以产生子代植物(第五植物)。第五植物可以与表达包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)和编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第四核酸(N4)的第六植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物。
此外，可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X4)的第一核苷酸序列(R4)和编码第二轮状病毒蛋白(X5)的第二核苷酸序列(R5)的第一核酸(N4)的第一植物，与表达包含编码第三轮状病毒蛋白(X1)的第三核苷酸序列(R1)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生子代植物(第三植物)。可以将第三植物与表达包含编码第四轮状病毒蛋白(X2)的第四核苷酸序列(R2)的第三核酸(N2)的第四植物杂交，以产生子代植物(第五植物)。可以将第五植物与表达编码第五轮状病毒蛋白(X3)的第五核苷酸序列(R3)的第六植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
4.2四个单基因构建体
本文还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，以及包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸共表达，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列(参见表1，组合#4.2)。
在非限制性实例中，N1包含(R1)，N2包含(R2)，N3包含(R3)，并且N4包含(R4)，其中选自VP2，VP4，VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被表达，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含(R1)，N2包含(R2)，N3包含(R3)，并且N4包含(R4)，其中选自VP2，VP7，VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP7、VP6和NSP4。
在另一非限制性实例中，N1包含(R1)，N2包含(R2)，N3包含(R3)，并且N4包含(R4)，其中选自VP4、VP7、VP6和NSP4的每种轮状病毒蛋白被编码，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R4编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R4编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2和R4编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP4、VP7、VP6和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3编码不是X4轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP4、VP7、VP6和NSP4。
5.五个构建体
5.五个单基因构建体
本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中将包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，和包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，和包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸(N4)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第五核酸(R5)共表达(参见表1，组合#5)，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。
在该非限制性实例中，N1包含(R1)，N2包含(R2)，N3包含(R3)，N4包含(R4)，并且N5包含(R5)，其中选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的每种轮状病毒蛋白被表达，并且其中R1编码轮状病毒蛋白X1，其中X1可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R2-R5编码不是X1的轮状病毒蛋白，其中X2可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1和R3-R5编码不是X2的轮状病毒蛋白，其中X3可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1、R2、R4和R5编码不是X3的轮状病毒蛋白，其中X4可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R3和R5编码不是X4的轮状病毒蛋白，其中X5可以是选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4的任何轮状病毒蛋白，并且其中R1-R4编码不是X5的轮状病毒蛋白，结果是在宿主中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
例如，其不被认为是限制性的，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP2，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP4、VP6、VP7和NSP4，但R2-R5不编码VP2。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP6、VP7和NSP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP6，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP7和NSP4。在不被认为是限制性的另一实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白VP7，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和NSP4。在另一非限制性实例中，核苷酸序列R1可以编码轮状病毒蛋白NSP4，并且核苷酸序列R2-R5可以任何顺序编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7。
例如，不被认为是限制性的，将包含编码第一轮状病毒蛋白(例如VP2)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，与包含编码第二轮状病毒蛋白(例如VP6)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，包含编码第三轮状病毒蛋白(例如VP4)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，包含编码第四轮状病毒蛋白(例如VP7)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸(N4)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(例如NSP4)的第五核苷酸序列(R5)的第五核酸(N5)共表达(参见图3)。
可以以任何顺序将五个核酸引入植物中。例如，不被认为是限制性的，可以用包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，来转化表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的植物。可以用包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)进一步转化该植物。然后可以用包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸(N4)进一步转化该植物。然后可以用包含编码第四轮状病毒蛋白(X5)的第四核苷酸序列(R5)的第五核酸(N5)进一步转化该植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。此外，可以用包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第五核酸(N5)一起同时转化植物，使得在植物中共表达第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列。可以以瞬时方式或以稳定的方式将第一核酸(N1)、第二核酸(N2)、第三核酸(N3)、第四核酸(N4)和第五核酸(N5)引入植物中。
可以将表达包含编码第一轮状病毒蛋白(X1)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的第一植物，与表达包含编码第二轮状病毒蛋白(X2)的第二核苷酸的序列(R2)的第二核酸(N2)的第二植物杂交，以产生子代植物(第三植物)。可以将第三植物与表达包含编码第三轮状病毒蛋白(X3)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)的第四植物杂交，以产生子代植物(第五植物)。可以将第五植物与表达包含编码第四轮状病毒蛋白(X4)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸(N4)的第六植物杂交，以产生子代植物(第七植物)。可以将第七植物与表达包含编码第五轮状病毒蛋白(X5)的第五核苷酸序列(R5)的第五核酸(N5)的第八植物杂交，以产生共表达第一轮状病毒蛋白、第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(X1-X5)的子代植物。轮状病毒蛋白X1-X5可以选自VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4，其中VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4被选择一次，使得在植物中表达每种轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4。
用于转化宿主的核酸(N)的比例
可以如图5所示，在植物、植物的一部分或植物细胞中RLP积累的水平，可能受到在植物中表达的编码轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白的核酸比例的影响。例如，其不被认为是限制性的，可以通过提供用于渗入植物、植物的一部分或植物细胞的不同量的农杆菌，来改变引入植物的核酸(N)的比例，其中每个农杆菌包含如上文表1(和附带文本)中所列的核酸(N)的构建体。例如，不被认为是限制性的，含有结构蛋白的农杆菌与含有非结构蛋白的农杆菌的比例可以为：例如从约0.8:1至约2.5:1.5(结构蛋白：非结构蛋白)或其间的任何量，例如从约0.8:1、0.9:1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2:0.5、2:1、2.2:1、2.3:1、2.4:1、2.5:1、2.5:1.1、2.5:1.2、2.5:1.3、2.5:1.4、2.5:1.5(结构蛋白：非结构蛋白)或其间的任何量。例如，如下所述，例如通过将含有包含编码轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白(X)的一个或多个核苷酸序列(R)的一个或多个核酸(N)的不同比例的农杆菌，引入到宿主(例如植物、植物的一部分或植物细胞)中，可以改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例。例如，可以将细菌悬浮液中农杆菌菌株的吸光度或光密度(OD)，用作确立在含有结构蛋白的农杆菌菌株与含有非结构蛋白的农杆菌菌株之间的比例的量度。例如，其不被认为是限制性的，OD的范围可以为例如从约0.2:0.4至约1:0.6(在细菌悬浮液中，含有结构蛋白的农杆菌菌株:含有非结构蛋白的农杆菌菌株)或其间的任何量，例如从约0.2:0.4、0.3:0.4、0.4:0.4、0.5:0.4、0.6:0.4、0.7:0.4、0.8:0.4、0.9:0.4、1:0.4、0.2:0.5、0.3:0.5、0.4:0.5、0.5:0.5、0.6:0.5、0.7:0.5、0.8:0.5、0.9:0.5、1:05、0.2:0.6、0.3:0.6、0.4:0.6、0.5:0.6、0.6:0.6、0.7:0.6、0.8:0.6、0.9:0.6、1:06、0.3:0.4、0.3:0.5、0.3:0.6、0.4:0.4、0.4:0.5、0.4:0.6、0.5:0.4、0.5:0.5、0.5:0.6、0.6:0.4、0.6:0.5、0.6:0.6、0.7:0.4、0.7:0.5、0.7:0.6、0.8:0.4、0.8:0.5、0.8:0.6、0.9:0.4、0.9:0.5、0.9:0.6、1:0.4、1:0.5、1:0.6(在细菌悬浮液中，含有结构蛋白的农杆菌菌株：含有非结构蛋白的农杆菌菌株)或其间的任何量。例如，不被认为是限制性的，可以将在细菌悬浮液中OD为0.4的农杆菌菌株的指定为参考值1。因此，可以通过使用在细菌悬浮液中OD为0.6的含有结构蛋白的农杆菌菌株，相对于OD为0.4的含有非结构蛋白的农杆菌菌株，来实现结构蛋白与非结构蛋白的1.5:1的比例。
例如通过将含有包含编码轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白(X)的一个或多个核苷酸序列(R)的一个或多个核酸(N)的不同比例的农杆菌引入到植物、植物的一部分或植物细胞中，可以改变结构轮状病毒蛋白与非结构蛋白的比例。可选择地，如果轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白存在于相同的构建体上，并且因此使用一种农杆菌将其引入植物、植物的一部分或植物细胞中，则可以使用合适的启动子来使它们在植物、植物的一部分或植物细胞内差异表达，从而获得期望比例的轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白。
因此，如本文所述，提供了通过调节包含编码轮状病毒结构蛋白(X)的一个或多个核苷酸序列(R)的一个或多个核酸(N)，与包含编码轮状病毒非结构蛋白(X)的一个或多个核苷酸序列(R)的一个或多个核酸(N)之间的比例，来增加RLP产量、增加VP4和VP7产量、或增加RLP以及VP4和VP7产量的方法。
例如，含有轮状病毒非结构蛋白的农杆菌，占用于渗入植物、植物的一部分或植物细胞的农杆菌总量的百分比，可以是20％至60％之间或其间的任何量。例如，含有轮状病毒非结构蛋白的农杆菌，占用于渗入植物、植物的一部分或植物细胞的总农杆菌的百分比，可以是20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％，或其间的任何量。类似地，在被渗入的农杆菌总量中含有结构蛋白的农杆菌，占用于渗入植物、植物的一部分或植物细胞的总农杆菌的百分比，可以是80％、79％、78％、77％、76％、75％、74％、73％、72％、71％、70％、69％、68％、67％、66％、65％、64％、63％、62％、61％、60％、59％、58％、57％、56％、55％、54％、53％、52％、51％、50％、49％、48％、47％、46％、45％、44％、43％、42％、41％或40％或其间的任何量。
例如，含有轮状病毒结构蛋白的农杆菌与含有非结构蛋白的农杆菌的百分比，可以是70％:30％、60％:40％、50％:50％、40％:60％或其间的任何百分比量。例如，含有结构蛋白的农杆菌和含有非结构蛋白的农杆菌之间的百分比，可以是50％:50％、51％:49％、52％:48％、53％:47％、54％:46％、55％:45％、56％:44％、57％:43％、58％:42％、59％:41％、60％:40％或其间的任何百分比。
如下所述，例如通过差异表达轮状病毒结构蛋白和轮状病毒非结构蛋白，还可以改变轮状病毒结构蛋白与轮状病毒非结构蛋白的比例。可以通过调节例如轮状病毒结构蛋白、轮状病毒非结构蛋白、或轮状病毒结构蛋白和轮状病毒非结构蛋白二者的复制、转录、翻译或其组合来改变表达。除了改变如上所述渗入的含有轮状病毒结构蛋白的农杆菌与含有轮状病毒非结构蛋白的农杆菌的比例之外，可以使用不同的调控元件，包括启动子、扩增元件、增强子或其组合。可以将调控元件的第一组或组合用于调节包含编码轮状病毒结构蛋白的一个或多个核苷酸序列的一个或多个核酸的复制、转录或其组合，并且可以将调节元件第二组或组合用于调节编码轮状病毒非结构蛋白的一个或多个核苷酸序列的复制、转录或其组合。调控元件的第一组或组合与调控元件的第二组或组合不同，并且允许包含编码轮状病毒结构蛋白的一个或多个核苷酸序列的一个或多个核酸以及包含编码轮状病毒非结构蛋白的一个或多个核苷酸序列的一个或多个核酸的差异表达，以允许调节体内轮状病毒结构蛋白：轮状病毒非结构蛋白的比例。
例如，其不被认为是限制性的，调控元件(例如第一组)的一组或组合可以包括增强子元件，例如从CPMV获得的元件，诸如CPMV HT或CPMV 160(参见图6)。在US 61/971,274(其通过引用并入本文)中描述了CMPV HT，并且在US 61/925,852(其通过引用并入本文)中描述了CPMV 160。增强子元件，例如从CPMV获得的那些，例如CPMV HT或CPMV 160(参见图6；分别在US 61/971,274和US 61/925,852中)，可以在调控元件的另一组(例如第二组)或组合中不存在。可选择地，第二组可以包括增强子元件(例如从CPMV获得的元件(例如CPMV HT或CPMV 160))，而扩增元件(例如从CPMV获得的元件(例如CPMV HT或CPMV 160))可以在调控元件的第一组或组合中不存在。以类似的方式，在调控元件的第一组和第二组或组合之间启动子的强度可以不同，或者一个启动子可以是诱导型的，而另一个是组成型的，使得在体内实现轮状病毒结构蛋白相对于轮状病毒非结构蛋白之间的差异表达。
例如，通过引入不同比例的含有包含编码第一轮状病毒蛋白(例如轮状病毒非结构蛋白NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的农杆菌，与含有包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如以任何顺序的轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6和VP7)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)的农杆菌，可以改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例。例如，含有包含编码轮状病毒非结构蛋白NSP4的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)的农杆菌，与含有包含编码轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6和VP7的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)的农杆菌的比例是0.8:1和1:2(含有N1的农杆菌比含有N2的农杆菌)或其中的任何量，例如1:1.5(含有N1的农杆菌比含有N2的农杆菌)。
此外，可以通过在植物、植物的一部分或植物细胞中使用增强子元件差异表达轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白，来改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例。例如，可以按如下来改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例，例如通过在植物、植物的一部分或植物细胞内共表达包含编码第一轮状病毒蛋白(例如非结构蛋白NSP4)的核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)与包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白(例如以任何顺序的轮状病毒结构蛋白VP2、VP4、VP6和VP7)的四个核苷酸序列(R2-R5)的第二核酸(N2)，其中第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列分别可操作地连接到如下所述的增强子序列(例如CPMV HT、CPM 160、CPMV160+和CPMV HT+(分别在US 61/971,274和US 61/925,852中描述，其通过引用并入本文))。在另一实例中，可以按如下来改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例，例如通过在植物、植物的一部分或植物细胞内共表达包含编码第一轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP6或VP7)的第一核苷酸序列(R1)和编码第二轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP2或VP4)的第二核苷酸序列(R2)第一核酸(N1)，包含编码第三轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP7或VP6)的第三核苷酸序列(R3)和编码第四轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP4或VP2)的第四核苷酸序列(R4)的第二核酸(N2)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(例如非结构蛋白NSP4)的第五核苷酸序列(R5)的第三核酸(N3)，其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列可操作地连接到如下所述增强子序列(例如CPMV HT、CPMV 160、C PMV 160+和CPMV HT+)。
在另一实例中，可以按如下来改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例，例如通过在植物，植物的一部分或植物细胞内共表达包含编码第一轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP6或VP7)的第一核苷酸序列(R1)，和编码第二轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP2或VP4)的第二核苷酸序列(R2)，编码第三轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP7或VP6)的第三核苷酸序列(R3)，和编码第四轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP4或VP2)的第四核苷酸序列(R4)，以及编码第五轮状病毒蛋白(例如非结构蛋白NSP4)的第五核苷酸序列(R5)的一个或多个核酸，其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列可操作地连接到如下所述的增强子序列(例如CPM 160、CPMV 160+和CPMV HT+)，并且第五核苷酸序列可操作地连接到如下所述的CPMV HT。
在另一实例中，可以按如下来改变轮状病毒结构蛋白与非结构蛋白的比例，例如通过在植物，植物的一部分或植物细胞内共表达包含编码第一轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP6或VP7)的第一核苷酸序列(R1)的第一核酸(N1)，包含编码第二轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP2或VP4)的第二核苷酸序列(R2)的第二核酸(N2)，包含第三轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP7或VP6)的第三核苷酸序列(R3)的第三核酸(N3)，包含编码第四轮状病毒蛋白(例如结构蛋白VP4或VP2)的第四核苷酸序列(R4)的第四核酸(N4)，以及包含编码第五轮状病毒蛋白(例如非结构蛋白NSP4)的第五核苷酸序列(R5)第五核酸(N5)，其中第一核苷酸序列、第二核苷酸序列、第三核苷酸序列和第四核苷酸序列可操作地连接到如下所述述增强子序列(例如CPMV HT、CPMV 160、CPMV 160+和CPMV HT+)。
扩增元件和增强子元件/调控元件
可以在包含基于病毒DNA或RNA的表达系统中表达轮状病毒蛋白或多肽，所述表达系统例如但不限于，基于豇豆花叶病毒的表达盒和基于双粒病毒的扩增元件。
增强子元件可用于实现轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白的高水平瞬时表达。增强子元件可以基于RNA植物病毒，包括豇豆花叶病毒，诸如豇豆花叶病毒(Cowpea mosaicvirus)(CPMV；参见例如WO2007/135480；WO2009/087391；US 2010/0287670，Sainsbury F.等人，2008，Plant Physiology；148：121-1218；Sainsbury F.等人，2008，PlantBiotechnology Journal；6：82-92；Sainsbury F.等人，2009，Plant BiotechnologyJournal；7：682-693；Sainsbury F.等人，2009，Methods in Molecular Biology，Recombinant Proteins From Plants，vol.483：25-39)。
CPMV 160(CPMVX)和CPMV 160+(CPMVX+)
在一实施方案中，增强子元件是“CPMVX”(也称为“CPMV 160”)和/或“CPMVX+”(也称为“CPMV 160+”)，并描述于US 61/925,852(其通过引用并入本文)。
表达增强子“CPMVX”包含豇豆花叶病毒(CPMV)5'非翻译区(UTR)。来自CPMV RNA-2序列(SEQ ID NO：1)的1-160位核苷酸的5'UTR，从转录起始位点开始到第一个框内的起始密码子(在位置161处)，其作为用于产生由野生型豇豆花叶病毒基因组片段编码的两个羧基共终端蛋白中较长那个的起始位点。此外，也可以对CPMV RNA-2基因组序列中在(或对应于)位置115处的“第三”起始位点进行突变、删除或其它改变。已经表明当与不完全M蛋白结合时，除了去除AUG161之外，还去除AUG115增强了表达(Sainsbury和Lomonossoff，2008，Plant Physiology；148：1212-1218；WO 2009/087391；其通过引用并入本文)。
CPMVX包含SEQ ID NO：1的X个核苷酸(其中SEQ ID NO：1的X＝160、155、150或114)，或包含含有与CPMVX具有80％至100％序列相似性的序列(其中SEQ ID NO：93的X＝160、155、150或114)。该表达增强子通常被称为CPMVX(参见图6c)。
表达增强子CPMVX(其中X＝160)，由SEQ ID NO：1的核苷酸1-160组成：
还可以将CPMVX增强子序列与填充序列融合，其中CMPVX包含SEQ ID NO：1的X个核苷酸(其中SEQ ID NO：1的X＝160、155、150或114)，或包含含有与CPMVX具有80％至100％序列相似性的序列(其中SEQ ID NO：1的X＝160、155、150或114)，并且填充序列包含与CMPVX序列的3'末端融合的1-100个核苷酸。例如，填充序列可以包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸，或其间的任意数目的核苷酸。
如果CMPVX序列包含填充片段，则该表达增强子可被称为CPMVX+(参见图6d)，其中SEQ ID NO：1的X＝160、155、150、114，其也可以称为包含填充序列的CMPVX，或者当分别为X为160、155、150或114时，其可以称为CPMV160+、CPMV155+、CPMV150+、CPMV114+。包含不含有填充序列的CPMVX的构建体可以被称为CPMVX+，其中SEQ ID NO：1的X＝160、155、150、114，并且其中填充序列的长度为0个核苷酸。
可以通过对位于3'端至160位核苷酸的天然CMPV5'UTR序列进行截短、删除或替换来修改填充序列。当与5'UTR相关的初始或未修改(即天然的)的填充序列比较时，该修改填充序列可被删除、替换、截短或缩短(如Sainsbury F.和Lomonossoff GP，2008，PlantPhysiol.148：1212-1218中所述)。填充序列可以包含一个或多个限制性位点(多接头、多克隆位点、一个或多个克隆位点)、一个或多个植物kozak序列、一个或多个接头序列、一个或多个重组位点或其组合。例如，其不被认为是限制性的，填充序列可以按顺序包含与植物kozak序列融合的期望长度的多克隆位点。填充序列不包含来自天然5'UTR序列的位于天然CPMV 5'UTR的3'至160位核苷酸的核苷酸序列，例如Sainsbury F和Lomonossoff GP(2008，Plant Physiol.148：第1212-1218页；其通过引用并入本文)的图1所示的161-512位核苷酸，或现有技术CPMV HT序列的161-509位核苷酸。也就是说，在本发明中，从5'UTR中除去现有技术的CPMV HT序列(图1；Sainsbury F.和Lomonossoff G.P.的，2008)中存在的不完全M蛋白。
植物Kozak共有序列是本领域已知的(参见例如Rangan等人，Mol.Biotechnol.，2008，Jul.39(3)，pp.207-213)。天然存在的Kozak序列和合成的Kozak序列都可以用于表达增强子中，或者可以与本文所述的目的核苷酸序列融合。
植物kozak序列可以是任何已知的植物kozak序列(参见例如L.Rangan等人，Mol.Biotechnol.2008)，包括但不限于以下植物共有序列：
caA(A/C)a(SEQ ID NO:2；植物界)
aaA(A/C)a(SEQ ID NO:3；双子叶植物)
aa(A/G)(A/C)a(SEQ ID NO:4；拟南芥)
植物kozak序列还可以选自：
AGAAA(SEQ ID NO:5)
AGACA(SEQ ID NO:6)
AGGAA(SEQ ID NO:7)
AAAAA(SEQ ID NO:8)
AAACA(SEQ ID NO:9)
AAGCA(SEQ ID NO:10)
AAGAA(SEQ ID NO:11)
AAAGAA(SEQ ID NO:12)
AAAGAA(SEQ ID NO:13)
(A/-)A(A/G)(A/G)(A/C)A.(SEQ ID NO:14；共有序列)
可以在增强子序列的5'端将表达增强子CPMVX或CPMVX+可操作地连接到在植物中有活性的调控区，并且在表达增强子的3'端可操作地连接到目的核苷酸序列(图6c)，以驱动植物宿主内目的核苷酸序列的表达。
CPMV HT+、CPMV HT+[WT115]、CPMV HT+[511]
在另一实施方案中，增强子元件是在US 61/971,274(其通过引用并入本文)中描述的“CPMV HT+”。表达增强子“CPMV HT+”(参见图6b)包含豇豆花叶病毒5'非翻译区(UTR)和修改的、延长的或截短的填充序列。
还提供了植物表达系统，其包含含有与本文所述的一种或多种表达增强子(例如CPMV HT+、CPMV HT+[WT115]、CPMV HT+[511])可操作地连接的调控区的第一核酸序列，以及编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列。此外，描述了这样的核酸，其包含启动子(调控区)序列、含有豇豆花叶病毒5'UTR和具有植物kozak序列的填充序列的表达增强子(例如CPMV HT+或CPMV HT+[WT115])，所述植物kozak序列与编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的一个或多个核酸序列融合。所述核酸还可以包含这样的序列，其包含豇豆花叶病毒3'非翻译区(UTR)(例如质体蓝素3'UTR或在植物中有活性的其它3'UTR)和终止子序列(例如NOS终止子)并且可操作地连接到编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列(称为图6a中目的核苷酸)的3'末端，使得编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列插入到豇豆花叶病毒3'非翻译区(UTR)、质体蓝素3'UTR或其他3'UTR序列的上游。
SEQ ID NO：15包含现有技术中已知的“CPMV HT”表达增强子(例如Sainsbury和Lomonossoff 2008，Plant Physiol.148：第1212-1218页的图1；其通过引用并入本文)。CPMV HT包括来自SEQ ID NO：15的1-160位核苷酸且在115位(cgt)具有修改的核苷酸的5'UTR序列，和在162位(acg)具有修改的核苷酸的不完全M蛋白，并且缺少植物kozak序列(5'UTR：1-160位核苷酸；加下划线的不完全M蛋白：161-509位核苷酸)。SEQ ID NO：15还包括现有技术CPMV HT序列中不存在的多克隆位点(斜体，510-528位核苷酸)：
具有植物kozak共有序列的CPMV HT+被提供于SEQ ID NO：16(1-160位核苷酸，5'UTR，包括在位置115处(GTG)的修改的ATG)小写粗斜体；填充片段包含：加下划线的不完整M蛋白，161-509位核苷酸，具有在162位修改的核苷酸(ACG)；多克隆位点，斜体，510-528位核苷酸；和共有植物kozak序列，大写粗体，529-534位核苷酸)。
SEQ ID NO：17(“CPMV HT+511”)包含来自1-154位核苷酸的CPMV RNA 2基因组的天然序列的片段。来自SEQ ID NO：17的1-511位核苷酸的5'UTR序列包含在位置115处(“g”代替“a”；斜粗体)和162处(“c”代替“t”；斜粗体)的修改的“atg”序列和来自161-511位核苷酸的不完全M蛋白(加下划线)。CPVV HT+511包含天然M蛋白kozak共有序列(508-511位核苷酸；粗体)：
由SEQ ID NO：18(CPMV HT+[WT115])的序列提供CPMV HT+增强子序列的另一非限制性实例。包含CPMV HT+并包括与SEQ ID NO：18的表达增强子序列可操作连接的植物调控区以及与编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列融合的3'端转录起始位点(ATG)的表达盒或载体，也是本发明的一部分。
SEQ ID NO：18(CPMV HT+[WT115])1-160位核苷酸，5'UTR，具有在位置115-117处的ATG，小写粗体；填充片段包含：加下划线的不完全M蛋白，161-509位核苷酸；具有在161-153处修改的ATG，小写粗体并加下划线，多克隆位点，斜体，510-528位核苷酸；和植物kozak序列，大写粗体，529-534位核苷酸)。
SEQ ID NO：18的植物kozak序列可以是任何植物kozak序列，包括但不限于SEQ IDNO：2-14的序列之一。
还提供了植物表达系统，其包含含有与本文所述的一种或多种表达增强子(例如CPMV HT+、CPMV HT+[WT115]、CPMV HT+[511])可操作地连接的调控区的第一核酸序列，以及编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列。此外，描述了这样的核酸，其包含启动子(调控区)序列、含有豇豆花叶病毒5'UTR和具有植物kozak序列的填充序列的表达增强子(例如CPMV HT+或CPMV HT+[WT115])，所述植物kozak序列与编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的一个或多个核酸序列融合。核酸还可以包含这样的序列，其包含豇豆花叶病毒3'非翻译区(UTR)(例如质体蓝素3'UTR或在植物中有活性的其它3'UTR)和终止子序列(例如NOS终止子)并且可操作地连接到编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列(称为图6a中目的核苷酸)的3'末端，使得编码轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白的核苷酸序列插入到豇豆花叶病毒3'非翻译区(UTR)、质体蓝素3'UTR或其他3'UTR序列的上游。
可以使用任何合适的方法(例如密度梯度离心或尺寸排阻色谱法)，来检测使用本文所述方法产生的RLP的出现。可以例如通过电子显微镜、尺寸排阻色谱法或本领域技术人员显而易见的其它技术来评估RLP的结构和尺寸。
对于尺寸排阻色谱法，可以通过在提取缓冲液中均质(Polytron)冷冻压碎的植物材料样品，并通过离心除去不溶性物质，从植物组织中提取总可溶性蛋白。用冰冷的丙酮或PEG沉淀也可能是有益的。可溶性蛋白被定量，并且使提取物通过Sephacryl TM柱(例如Sephacryl TM S500柱)。蓝色葡聚糖2000可以用作校准用标准。色谱法分离后，可通过免疫印迹进一步分析级分以测定该级分的蛋白补体。
分离的级分可以是例如上清液(如果离心、沉积或沉淀)或滤液(如果过滤)，并富集蛋白或外壳构造蛋白，并且包括更高分子量的颗粒(如单层(sl)RLP、双层(dl)RLP或三层(t1)RLP)。
可通过例如另外的离心步骤、沉淀、色谱步骤(例如尺寸排阻、离子交换、亲和色谱法)、正切流动过滤或其组合，进一步处理分离的级分以将蛋白、外壳构造蛋白或高级颗粒进行分离、纯化、浓缩或其组合。可以通过例如天然或SDS-PAGE、使用合适检测抗体的Western分析、毛细管电泳、电子显微镜、或对于本领域技术人员来说将是显而易见的任何其它方法，来确认纯化的蛋白、外壳构造蛋白或高级粒子(如RLP)的存在。
可以使用本领域技术人员已知的方法，将根据本发明产生的RLP从植物、植物的一部分或植物物质中纯化、部分纯化，或者可以作为口服疫苗施用。
RLP纯化可以包括梯度离心，例如蔗糖、碘克沙醇、OptiPrep TM或氯化铯(CsCl)密度梯度，可用于从转化的植物生物质中纯化或部分纯化RLP。例如如图4所示，可以使用碘克沙醇步骤梯度或碘克沙醇连续梯度来纯化RLP和/或表达的轮状病毒结构蛋白。
已经显示钙(Ca2+)浓度对于三层颗粒(TLP)到双层粒子(DLP)的转化是重要的，并且是毒株依赖性的(参见例如Martin等人，Journal of Virology，2002年1月，其通过引用并入本文)。来自TLP的外壳蛋白的完全丧失(TLP脱壳作用)，发生在[Ca2+]的纳摩尔范围内。因此，可以在钙的存在下进行RLP的提取和/或纯化，并且可以在钙存在下(例如在CaCl2存在下)进行梯度离心的步骤。CaCl2的浓度可以在例如1mM和1000mM之间，或其间的任何量，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、50、600、650、700、750、800、850、900、950mM或其间的任何量。
可以最低限度地处理植物或植物碎片。术语“最小处理”是指部分纯化包含目的蛋白和/或RLP的植物物质(例如，植物或其部分)，以产生植物提取物、匀浆、植物匀浆级分等(即最低限度处理)。部分纯化可以包括但不限于破坏植物细胞结构，从而产生包含可溶性植物成分和可以通过例如但不限于离心分离、过滤或其组合分离的不溶性植物成分的组合物。在这方面，使用真空提取或离心提取可以容易地获得在叶或其他组织的细胞外空间内分泌的蛋白，或者可以通过在压力下经过滚轴或研磨等来提取组织以从细胞外空间内挤压或释放游离蛋白。最小处理也可能包括制备可溶性蛋白的粗提取物，因为这些制备物具有来自二次植物产品的可忽略的污染。此外，最小处理可能涉及从叶子中水浸提可溶性蛋白，然后用任何合适的盐进行沉淀。其他方法可以包括大规模浸渍和果汁提取，以允许直接使用提取物。可以使用任何合适的方法(例如机械提取或生物化学提取)来纯化或提取RLP。
可以以每千克植物鲜重合成高达2g量的一种或多种轮状病毒结构蛋白。例如，合成的结构蛋白的量可以为1-2g/每千克鲜重之间，或其间的任何量，诸如每千克鲜重1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2g或其间的任何量。例如，可以以每千克植物鲜重合成高达1.54g量的结构蛋白。
可以例如通过动态光散射(DLS)或电子显微镜(EM)技术来测量上述定义的RLP的尺寸(即直径)，通常在50-110nm之间或其间的任何尺寸。例如，完整RLP结构的尺寸可以在从约70nm至约110nm的范围，或其间的任何尺寸，例如75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm或其间的任何尺寸。
核苷酸序列
本发明还提供了包含可操作地连接到在植物中有活性的调控区的编码一种或多种轮状病毒结构蛋白的核苷酸序列的核酸。可以优化所述核苷酸序列，例如用于人密码子使用或植物密码子使用。此外，可以将一种或多种轮状病毒结构蛋白可操作地连接到一个或多个扩增元件。此外，可以将一种或多种轮状病毒结构蛋白可操作地连接到一个或多个区室靶向序列。由所述核苷酸序列编码的一种或多种轮状病毒结构蛋白可以是例如VP2、VP4、VP6或VP7。此外，由所述核苷酸序列编码的一种或多种轮状病毒结构蛋白可以是例如来自任何轮状病毒A组至G组，但更优选来自轮状病毒A组。此外，由所述核苷酸序列编码的一种或多种轮状病毒结构蛋白可以是来自具有从G1到G27和从P1到P34，更优选从G1到G19和从P1到P27的任何G型和P型的任何组合的基因型的任何轮状病毒株，包括但不限于G1P[8]、G2P[4]、G2P[8]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[6]、G9P[8]、轮状病毒A WA株、轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株或轮状病毒SA11株。
在严格杂交条件下，如果核酸序列杂交到一个或多个核苷酸序列或如本文定义的核酸序列的补体，则本发明中提及的核酸序列可以与该序列或该序列的补体是“基本上同源”、“基本上类似”或“基本上相同”。当在限定长度的核苷酸序列上至少约70％，或70％至100％之间或其间的任何量(例如70％、72％、74％、76％、78％、80％、82％、84％、86％、88％、90％、92％、94％、96％、98％、100％或其间任何量)的核苷酸匹配，所述序列是“基本上同源”、“基本上类似”或“基本上相同”的，条件是这样的同源序列展现出所述序列的一种或多种特性或如本文所述的编码产物。
例如，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含编码一种或多种轮状病毒蛋白(例如结构轮状病毒蛋白或非结构轮状病毒蛋白)的核苷酸序列，其与例如在SEQ ID NO:21、27、32、37或42中定义的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量的相同。所述多核苷酸可以是通过本领域已知的任何方法优化的人密码子。所述核苷酸序列可以编码例如与SEQ ID NO：24、29、34、39或44的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量相同的轮状病毒蛋白。
此外，本发明提供RLP，其包含例如由与例如在SEQ ID NO:21、27、32、37或42中定义的序列具有至少60％、65％、70％、75％、80、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％或其间任何量相同的核酸所编码的轮状病毒结构蛋白。
可以使用诸如DNASIS内提供的核苷酸序列比较程序(使用，例如但不限于以下参数：GAP罚分5，顶对角线的数量5，固定GAP罚分10，k元组大小(k tuple)2，浮动间隙10，以及窗口大小5)，来确定这样的序列相似性或同一性。然而，比对用于比较的序列的其他方法在本领域是公知的，例如Smith&Waterman的算法(1981，Adv.Appl.Math.2：482)，Needleman&Wunsch的算法(J.Mol.Biol.48：443,1970)，Pearson&Lipman的算法(1988，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444)，并且通过这些算法的计算机化实施(GAP，BESTFIT，FASTA和BLAST，可通过NIH获得)，或通过手动比对和目视检查(参见，例如Current Protocols inMolecular Biology，Ausubel等人编辑，1995增补)，或者在严格条件下使用Southern杂交或Northern杂交(参见Maniatis等人，在Molecular Cloning(实验手册)中，Cold SpringHarbor Laboratory，1982)。优选地，基本上同源的序列在分子的限定长度上展现出至少约80％，并且最优选至少约90％的序列相似性。
这样的严格杂交条件的一个实例可以是：在65℃于4X SSC中过夜(约16-20小时)杂交，然后65℃于0.1X SSC中洗涤1小时；或在65℃于0.1X SSC中洗涤2次，每次20或30分钟。可选择地，示例性的严格杂交条件可以是：在42℃于50％甲酰胺、4X SSC中过夜(16-20小时)，然后在65℃于0.1X SSC中洗涤1小时；或在65℃于0.1X SSC中洗涤2次，每次20或30分钟，或过夜(16-20小时)；或在65℃于Church磷酸盐水溶液缓冲液(7％SDS；0.5M NaPO4缓冲液pH7.2；10mM EDTA)中杂交，在50℃于0.1X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次20或30分钟；或在65℃下于2X SSC、0.1％SDS中洗涤2次，每次20或30分钟，用于独特的序列区。
可以将编码轮状病毒结构多肽的核酸描述为“轮状病毒核酸”、“轮状病毒核苷酸序列”、“轮状病毒核酸”或“轮状病毒核苷酸序列”。例如，其不被认为是限制性的，可以将包含一种或多种轮状病毒结构蛋白或轮状病毒结构多肽的病毒样颗粒描述为“轮状病毒VLP”、“RVLP”或“RLP”。
许多生物体显示使用特定密码子来编码在生长的肽链中插入特定的氨基酸的偏倚。密码子偏好或密码子偏倚，生物体之间密码子使用的差异，是由遗传密码的简并性提供的，并且在许多生物体中有据可查。密码子偏倚通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，反过来信使RNA(mRNA)的翻译效率被认为尤其依赖于所翻译的密码子的性质和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。在细胞中所选择的tRNA的优势，通常是肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，基于密码子优化，可以针对在给定生物体中进行最佳基因表达来定制基因。优化编码异源表达的蛋白的核苷酸序列的过程，可能是提高表达产量的重要步骤。优化要求可以包括提高宿主产生外源蛋白的能力的步骤。
“密码子优化”定义为，通过用可能更频繁地或最频繁地在另一生物体或物种中使用的基因的密码子替代至少一个、多于一个或相当数量的天然序列的密码子，来修改目的细胞中的核酸序列以增强表达。各种物种对特定氨基酸的某些密码子展现出特定的偏倚。
本发明包括经密码子优化的合成多核苷酸序列，例如已针对人密码子使用或植物密码子的使用而优化了的序列。然后可以在植物中表达密码子优化的多核苷酸序列。更具体地，可以在植物中表达针对人密码子使用或植物密码子使用优化的序列。不希望被理论束缚，据信针对人类密码子优化的序列增加了序列的鸟嘌呤-胞嘧啶含量(GC含量)，并提高了在植物中的表达产量。
本领域已知有不同的密码子优化技术，用于改善翻译低效的蛋白编码区的翻译动力学。这些技术主要依靠鉴定某一宿主生物体的密码子使用。如果某一基因或序列应该在该生物体中表达，则这些基因和序列的编码序列将被修改，以便人们用宿主生物体的更频繁使用的密码子来替代目的序列的密码子。
氨基酸序列
轮状病毒结构蛋白的非限制性实例是：轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6和VP7，以及VP2、VP4、VP6和VP7的片段。根据本发明可以使用的VP2、VP4、VP6和VP7，或VP2、VP4、VP6和VP7蛋白的片段的非限制性实例包括来自以下病毒株的那些VP2、VP4、VP6和VP7蛋白：轮状病毒株G9P[6]、轮状病毒A WA株、轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株和轮状病毒SA11株。例如但不限于，Rotarix-A41CB052A：VP4(登录号#JN849113)、VP7:(登录号#JN849114)；轮状病毒A WA株：VP2(登录号#X14942)、VP4:(登录号#L34161)、VP6(登录号#K02086)、VP7:(登录号#GU723327)、NSP4(登录号#K02032)；轮状病毒SA11株：VP2(登录号#NC_011506)、VP4(登录号#NC_011510)、VP6(登录号#NC_011509)、VP7(登录号#NC_011503)和NSP4(登录号#NC_011504)。
不被认为是限制性实例的VP2结构蛋白，如SEQ ID NO：24的氨基酸序列所示。此外，VP2结构蛋白可以包含如SEQ ID NO：24所示的序列，或与其具有至少约90％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列。此外，VP2结构蛋白可以由如SEQ IDNO：21所示的核苷酸序列或与其具有至少约80-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列编码。
不被认为是限制性实例的VP4结构蛋白，如SEQ ID NO：34的氨基酸序列所示。此外，VP4结构蛋白可以包含SEQ ID NO：34所示的序列，或与其具有至少约90％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列。此外，VP4结构蛋白可以由如SEQ ID NO：32所示的核苷酸序列或与其具有至少约80％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列编码。
不被认为是限制性实例的VP6结构蛋白，如SEQ ID NO：29的氨基酸序列所示。此外，VP6结构蛋白可以包含SEQ ID NO：29所示的序列，或与其具有至少约90％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列。此外，VP6结构蛋白可以由如SEQ ID NO：27所示的核苷酸序列或与其具有至少约80％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列编码。
不被认为是限制性实例的VP7结构蛋白，如SEQ ID NO：39的氨基酸序列所示。此外，VP7结构蛋白可以包含SEQ ID NO：39所示的序列，或与其具有至少约90％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列。此外，VP7结构蛋白可以由如SEQ ID NO：37所示的核苷酸序列或与其具有至少约80％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列编码。
不被认为是限制性实例的NSP4结构蛋白，如SEQ ID NO：44的氨基酸序列所示。此外，NSP4非结构蛋白可以包含SEQ ID NO：44所示的序列，或与其具有至少约90％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列。此外，NSP4非结构蛋白可以由如SEQ IDNO：42所示的核苷酸序列或与其具有至少约80％-100％序列相似性(包括在这些范围内的任何百分比相似性，诸如与其具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列相似性)的序列编码。
可以通过使用采用BLAST(基本局部比对检索工具)2.0算法的BLASTP和TBLASTN程序，来计算氨基酸序列相似性或同一性。用于计算氨基酸序列相似性或同一性的技术是本领域技术人员公知的，并且BLAST算法的使用描述于ALTSCHUL等人(1990，J Mol.Biol.215：403-410)和ALTSCHUL等人(1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)中。
不希望受理论束缚，不同轮状病毒结构蛋白的蛋白浓度和比例，对于RLP的组装效率可能是重要的。因此，感染的多重性和时间对于操纵植物中的蛋白浓度和RLP的整体组装效率可能是重要的。
本发明的构建体可以在植物或植物的一部分中瞬时表达。依赖于植物、植物的一部分或植物细胞中的重组根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的外染色体(epichromosomal)表达的瞬时表达系统，可用于表达靶向各种细胞区室或亚区室的轮状病毒结构蛋白。瞬时表达系统允许高生产速度。此外，在植物中重组农杆菌渗入后几天内可以获得大量的蛋白(Rybicki，2010；Fischer等人，1999)。还可能表达长基因序列，并且在同一细胞中同时表达多于一个基因，允许多聚体蛋白的有效组装(Lombardi等人，2009)。
可以使用1个、2个、3个、4个或5个转化的根癌土壤杆菌菌株，将编码轮状病毒结构蛋白和非结构蛋白的核苷酸序列转移到植物宿主中(如表1和所附文本中所述)。
在瞬时表达期间，转录后基因沉默可能限制异源蛋白在植物中的表达。沉默抑制因子(例如但不限于来自番茄斑点枯萎病毒的Nss)的共表达，可用于抵消转基因mRNA的特异性降解(Brigneti等人，1998)。可选择的沉默抑制因子是本领域公知的，并且可以如本文所述使用(Chiba等人，2006，Virology 346：7-14；其通过引用并入本文)，例如但不限于：HcPro、TEV-p1/HC-Pro(烟草蚀纹病毒p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的p19(TBSVp19)、番茄皱缩病毒的衣壳蛋白(TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯病毒X的p25(PVX-p25)、马铃薯病毒M的p11(PVM-p11)、马铃薯病毒S的p11(PVS-p11)、蓝莓枯黄病毒的p16(BScV-p16)、柑橘衰退病毒的p23(CTV-p23)、葡萄卷叶伴随病毒-2的p24(GLRaV-2p24)、葡萄病毒A的p10(GVB-p10)、葡萄病毒B的p14(GVB-p14)、独活潜伏病毒的p10(HLV-p10)、或大蒜普通潜伏病毒的p16(GCLV-p16)。因此，可以将沉默抑制因子(例如HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10)与一种或多种轮状病毒结构蛋白或非结构蛋白或其组合(例如VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4)共表达，以进一步确保在植物或植物的一部分内产生高水平的蛋白。
本发明还提供了如上所述的方法，其中在植物中表达另外的(第二、第三、第四、第五或第六)核苷酸序列，编码沉默抑制因子的另外的(第二、第三、第四、第五或第六)核苷酸序列与在植物中有活性的另外的(第二、第三、第四、第五或第六)调控区可操作地连接。编码沉默抑制因子的核苷酸序列可以是，例如Nss、HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSVp19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10。
如下所述，瞬时表达方法可用于表达本发明的构建体(参见Liu和Lomonossoff，2002，Journal of Virological Methods，105：343-348；其通过引用并入本文)。可选择地，可以使用如Kapila等人(1997，其通过引用并入本文)描述的基于真空的瞬时表达方法。这些方法可以包括例如但不限于：农杆菌接种(Agro-inoculation)或农杆菌渗入(Agro-infiltration)、注射器渗入的方法，然而，也可以如上所述使用其它瞬时方法。通过农杆菌接种、农杆菌渗入或注射器渗入，包含期望核酸的农杆菌混合物进入组织(例如叶、植物的地上部分(包括茎、叶和花)、植物的其他部分(茎、根、花)或整株植物)的细胞间隙。在穿过表皮后，农杆菌感染并将t-DNA拷贝转移到细胞中。t-DNA被附加转录并且mRNA被翻译，导致在感染细胞中产生目的蛋白，然而，在细胞核内t-DNA的传代是短暂的。
为了帮助鉴定转化的植物细胞，可以进一步操作本发明的构建体以包括植物选择标记。有用的选择性标记包括提供抗化学物质(如抗生素，例如庆大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草剂，例如草丁膦(phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等)的酶。类似地，可以使用提供产生可通过颜色变化来识别的化合物(如GUS(β-葡萄糖醛酸酶))或发光(如荧光素酶或GFP)的酶。
本发明的一部分还包括含有本文所述构建体的转基因植物、植物细胞或种子。从植物细胞再生整株植物的方法也是本领域已知的。通常，将转化的植物细胞培养在合适的培养基中，所述培养基可以含有选择性试剂(如抗生素)，其中选择性标记用于帮助转化的植物细胞的鉴定。一旦愈伤组织形成，可以依照已知方法，通过使用合适的植物激素来促进芽形成，并且将芽转移到生根培养基中用于再生植物。然后可以将植物用于建立来自种子或使用无性繁殖技术的重复代。也可以在不使用组织培养物的情况下产生转基因植物。
在本申请中使用术语“调控区”、“调控元件”或“启动子”意在反映通常但不总是在基因的蛋白质编码区上游的一部分核酸，其可以由DNA或RNA，或DNA和RNA两者组成。当调控区是有活性的，并且与目的基因可操作地结合或可操作地连接时，这可能导致目的基因的表达。调控元件可能能够介导器官特异性或控制发育或时序基因激活。“调控区”可以包括启动子元件、表现出基本启动子活性的核心启动子元件、可响应于外部刺激的诱导型元件、介导启动子活性的元件(如负调控元件或转录增强子)。如本文所用，“调控区”还可以包括在转录后有活性的元件，例如调节基因表达的调控元件，诸如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏物、上游激活序列和mRNA不稳定性决定簇。这些后者元件中的几个，可以位于编码区域的近端。
在本公开的上下文中，术语“调控元件”或“调控区”通常是指DNA序列，通常但不总是位于结构基因的编码序列上游(5')，其通过提供对RNA聚合酶和/或转录所需的其它因子的识别以在特定位点开始来控制编码区的表达。然而，应当理解，位于内含子内的其它核苷酸序列或序列的3'也可有助于调控目的编码区的表达。提供对RNA聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点开始的调控元件的实例是启动子元件。大多数但不是全部的真核生物启动子元件含有TATA盒，由腺苷和胸苷核苷酸碱基对组成的保守核酸序列，通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处。启动子元件包含负责转录起始的基本启动子元件，以及修饰基因表达的其它调控元件(如上所列)。
调控区有几种类型，包括发育调控的、诱导型或组成型的那些调控区。在器官或组织发育期间的特定时间，在某些器官或器官的组织内激活发育调控或控制其控制下的基因差异表达的调控区。然而，一些发育调控的调控区，可能在特定发育阶段优先在某些器官或组织内是有活性的，它们也可能是以发育调控的方式有活性，或在植物内其他器官或组织也是基础水平。组织特异性调控区的实例，例如参见特异性调控区，包括napin启动子和十字花科启动子(Rask等人，1998，J.Plant Physiol.152：595-599；Bilodeau等人，1994，Plant Cell 14：125-130)。叶特异性启动子的实例包括质体蓝素启动子(参见US 7,125,978，其通过引用并入本文)。
诱导型调控区是能够直接或间接激活响应于诱导物的一个或多个DNA序列或基因转录的调控区。在诱导物不存在下，DNA序列或基因将不被转录。通常，与诱导型调控区特异性结合以激活转录的蛋白因子，可以以非活性形式存在，然后由诱导物直接或间接转变为活性形式。然而，蛋白因子也可能不存在。诱导剂可以是化学剂(如蛋白、代谢物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物)，或由热、冷、盐或有毒元素直接施加的生理压力，或通过诸如病毒的病原体或病原的作用间接施加的生理压力。可以通过对细胞或植物进行外部应用(如通过喷雾、浇水、加热或类似方法)，将含有诱导型调控区的植物细胞暴露于诱导物。诱导型调控元件可以衍生自植物或非植物基因(例如，Gatz，C.和Lenk，LR.P.，1998，Trends PlantSci.3,352-358；其通过引用并入本文)。潜在的诱导型启动子的实例，包括但不限于四环素诱导型启动子(Gatz，C.，1997，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.BioI.48,89-108；其通过引用并入)、类固醇诱导型启动子(Aoyama T.和Chua，NH，1997，Plant.1,2,397-404；其通过引用并入本文)和乙醇诱导型启动子(Salter，MG等人，1998，Nature Biotech.16,177-180，其通过引用并入本文)、细胞分裂素诱导型启动子IB6和CKI 1基因(Brandstatter,I.和K.ieber,1.1.,1998,Plant Cell 10,1009-1019；Kakimoto,T.,1996,Science274,982-985；其通过引用并入本文)和生长素诱导型元件DR5(Ulmasov,T.等人，1997,Plant Cell9,1963-1971；其通过引用并入本文)。
组成型调控区引导基因在植物的各个部位表达和在整个植物发育过程中持续表达。已知的组成型调控元件的实例，包括与以下相关的启动子：CaMV 35S转录物(Odell等，1985，Nature，313：810-812)、水稻肌动蛋白1(Zhang等人，1991，Plant Cell，3：1155-1165)、肌动蛋白2(An等人，1996，Plant J.，10：107-121)或tms 2(US5,428,147，其通过引用并入本文)和磷酸丙糖异构酶1(Xu等人，1994，Plant Physiol.106：459-467)基因，玉米泛素1基因(Cornejo等人，1993，Plant Mol.BioI.29：637-646)、拟南芥泛素1和6基因(Holtorf等人，1995，Plant Mol.BioI.29：637-646)和烟草翻译起始因子4A基因(Mandel等人，1995，Plant Mol.BioI.29：995-1004)。
本文所用的术语“组成型”，不一定表示在组成调控区控制下的基因在所有细胞类型中以相同的水平表达，虽然经常观察到丰度的变化，但是该基因在广泛的细胞类型中表达。组成型调控元件可以与其他序列结合，以进一步增强与其可操作连接的核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CPMV-HT系统来源于豇豆花叶病毒(CPMV)的非翻译区域，并显示相关编码序列的增强翻译。“天然”是指核酸或氨基酸序列是天然存在的，或“野生型”。“可操作地连接”，是指特定的序列，例如调控元件和目的编码区域直接或间接地相互作用以实现预期的功能(如基因表达的介导或调节)。可操作地连接的序列的相互作用，可以例如由与其可操作地连接的序列相互作用的蛋白介导。
在植物内产生的RLP，可产生包含植物特异性N-聚糖的轮状病毒VP7结构蛋白。因此，本发明还提供了包含具有植物特异性N-聚糖的VP7的RLP。
此外，植物中N-聚糖的修饰是已知的(参见例如U.S.60/944,344；其通过引用并入本文)，并且可以制备具有修饰的N-聚糖的VP7。可以获得包含修饰的糖基化模式(例如具有降低的岩藻糖基化的、木糖基化的(xylosylated)、或岩藻糖基化和木糖基化两者的N-聚糖)的VP7；或者可以获得具有修饰的糖基化模式的VP7，其中所述蛋白缺乏岩藻糖基化、木糖基化或两者，并且包含增加的半乳糖基化。此外，与表达VP7的野生型植物相比，翻译后修饰的调节(例如加入末端半乳糖)可能导致表达的VP7的岩藻糖基化和木糖基化的降低。
例如，其不被认为是限制性的，具有修饰的糖基化模式的VP7的合成，可以通过共表达VP7以及编码β-1.4半乳糖基转移酶(GalT)(例如但不是限于哺乳动物GalT或人GalT，但也可以使用来自其他来源的GalT)的核苷酸序列而实现。也可以将GalT的催化结构域融合到N-乙酰葡糖胺转移酶(GNT1)的CTS结构域(即细胞质尾，跨膜结构域，茎区)以产生GNT1-GalT杂合酶，并且杂合酶可以是与VP7共表达的。还可以将VP7与编码N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)(例如但不限于哺乳动物GnT-III或人GnT-III，也可以使用来自其他来源的GnT-III)的核苷酸序列共表达。此外，还可以使用包含与GnT-III融合的GNT1的CTS的GNT1-GnT-III杂合酶。
因此，本发明还提供了包含具有修饰的N-聚糖的VP7的RLP。
不希望受理论束缚，VP7上植物N-聚糖的存在可以通过由抗原呈递细胞促进的VP7的结合来刺激免疫应答。Saint-Jore-Dupas等人(2007年)已经提出使用植物N聚糖刺激免疫应答。
表2列出了在本发明的各种实施方案中提供的序列。
表2：
将在以下实施例中进一步说明本发明。
实施例
实施例1.材料和方法
表3：构建体
1.2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP2(opt)/NOS(编号1710的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A WA株的VP2的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S-CPMV-HT-NOS表达系统中。使用引物IF-WA_VP2(opt).s1+3c(图7a，SEQ ID NO：19)和IF-WA_VP2(opt).s1-4r(图7B，SEQ IDNO：20)，采用优化的VP2基因序列(图7C，SEQ ID NO：21)作为模板，扩增含有VP2编码序列的片段。对于序列优化，将VP2蛋白序列(Genbank登录号CAA33074)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，Mountain View，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-H/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1191的构建体(图7D)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1191的构建体是用于在基于CPMV-HT的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图7E(SEQ ID NO：22)中显示从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1710(图7F，SEQ ID NO：23)。在图7G中显示来自轮状病毒A WA株的VP2的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。在图7H中显示质粒1710的示意图。
2.2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP6(opt)/NOS(编号1713的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A WA株的VP6的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S-CPMV-HT-NOS表达系统中。使用引物IF-WA_VP6(opt).s1+3c(图8A，SEQ ID NO：25)和IF-WA_VP6(opt).s1-4r(图8B，SEQ IDNO：26)，采用优化的VP6基因序列(图8C，SEQ ID NO：27)作为模板，扩增含有VP6编码序列的片段。对于序列优化，将VP6蛋白序列(Genbank登录号AAA47311)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，Mountain View，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-HT/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1191的构建体(图7D)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1191的构建体是用于在基于CPMV-HT的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图7E(SEQ ID NO：22)中显示了从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1713(图8D，SEQ ID NO：28)。在图8E中显示来自轮状病毒AWA株的VP6的氨基酸序列(SEQ ID NO：29)。在图8F中显示质粒1713的示意图。
3.2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS(编号1730的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP4的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S/CPMV-HT/NOS中。使用引物IF-Rtx_VP4(opt).s1+3c(图9A，SEQ ID NO：30)和IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r(图9B，SEQ ID NO：31)，采用优化的VP4基因序列(图9C，SEQ IDNO：32)作为模板，扩增含有VP4编码序列的片段。对于序列优化，将VP4蛋白序列(Genbank登录号AEX30660)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，Mountain View，CA)将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-HT/NOS表达盒中。用SacII和StuI限制酶消化编号1191的构建体(图7D)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1191的构建体是用于在基于CPMV-HT的表达盒中进行目的基因的“InFusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图7E(SEQ ID NO：22)中显示从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1730(图9D，SEQID NO：33)。在图9E中显示来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]的VP4的氨基酸序列(SEQ ID NO：34)。在图9F中显示质粒1730的示意图。
4.2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS(编号1734的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短形式的天然信号肽的VP7的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S-CPMV-HT-NOS表达系统中。使用引物IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).s1+3c(图10A，SEQ ID NO：35)和IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r(图10B，SEQ IDNO：36)，采用优化的VP7基因序列(对应于图10C的nt 88-891，SEQ ID NO：37)作为模板，扩增含有VP7编码序列的片段。对于序列优化，将VP7蛋白序列(Genbank登录号AEX30682)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，Mountain View，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-HT/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1191的构建体(图7D)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1191的构建体是用于在基于CPMV-HT的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图7E(SEQ ID NO：22)中显示了从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1734(图10D，SEQ ID NO：38)。在图10E中显示来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短的信号肽的VP7的氨基酸序列(SEQ ID NO：39)。在图10F中显示质粒1734的示意图。
5.2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)NSP4/NOS(编号1706的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A WA株的NSP4的序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S-CPMV-HT-NOS表达系统中。使用引物IF-WA_NSP4.s1+3c(图11A，SEQ ID NO：40)和IF-WA_NSP4.s1-4r(图11B，SEQ ID NO：41)，采用合成的NSP4基因(对应于GenBank登录号K02032的nt 42-569)(图11C，SEQ ID NO：42)作为模板，扩增含有NSP4编码序列的片段。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，MountainView，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-HT/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1191的构建体(图7D)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1191的构建体是用于在基于CPMV-HT的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图7E(SEQ ID NO：22)中显示了从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1706(图11D，SEQ ID NO：43)。在图11E中显示来自轮状病毒A WA的NSP4的氨基酸序列(SEQ ID NO：44)。在图11F中显示质粒1706的示意图。
6.2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP2(opt)/NOS(编号1108的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A WA株的VP2的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。使用引物IF(C160)-WA_VP2(opt).c(图12A，SEQ ID NO：45)和IF-WA_VP2(opt).s1-4r(图7B，SEQ ID NO：20)，采用优化的VP2基因序列(图7C，SEQ ID NO：21)作为模板，扩增含有VP2编码序列的片段。对于序列优化，将VP2蛋白序列(Genbank登录号CAA33074)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，MountainView，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1190的构建体(图12B)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1190的构建体是用于在基于CPMV-160的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图12C(SEQ ID NO：46)中显示了从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的结构体定为编号1108(图12D，SEQ ID NO：47)。在图7G中显示来自轮状病毒A WA株的VP2的氨基酸序列(SEQ ID NO：24)。在图12E中显示质粒1108的示意图。
7.-2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP6(opt)/NOS(编号1128的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将来自轮状病毒A WA株的VP6的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。使用引物IF(C160)-WA_VP6(opt).c(图13A，SEQ ID NO：48)和IF-WA_VP6(opt).s1-4r(图8B，SEQID NO：26)，采用优化的VP6基因序列(图8C，SEQ ID NO：27)作为模板，扩增含有VP6编码序列的片段。对于序列优化，将VP6蛋白序列(Genbank登录号AAA47311)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，MountainView，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1190的构建体(图11B，SEQ ID NO：40)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1190的构建体是用于在基于CPMV-160的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图11C(SEQ ID NO：41)中显示从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1128(图13B，SEQ ID NO：49)。在图8E中显示来自轮状病毒A WA株的VP6的氨基酸序列(SEQ ID NO：28)。在图13C中显示质粒1128的示意图。
8.X35S/CPMV-160/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS(编号1178的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP4的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S/CPMV-160/NOS中。使用引物IF(C160)-Rtx_VP4(opt).c(图14A，SEQ ID NO：50)和IF-Rtx_VP4(opt).s1-4r(图9B，SEQ ID NO：30)，采用优化的VP4基因序列(图9C，SEQ ID NO：31)作为模板，扩增含有VP4编码序列的片段。对于序列优化，将VP4蛋白序列(Genbank登录号AEX30660)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，Mountain View，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1190的构建体(图11B，SEQ ID NO：40)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1190的构建体是用于在基于CPMV-160的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图11C(SEQ ID NO：41)中显示从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1178(图H2，SEQ ID NO：H2)。在图9E中显示来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]的VP4的氨基酸序列(SEQ ID NO：33)。在图14C中显示质粒1178的示意图。
9.2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS(编号1199的构建体)
使用以下基于PCR的方法，将编码来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短形式的天然信号肽的VP7的优化序列，克隆到含有Plasto_pro/P19/Plasto_ter表达盒的质粒内的2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。使用引物IF(C160)-TrSP+Rtx_VP7(opt).c(图15A，SEQ ID NO：52)和IF-Rtx_VP7(opt).s1-4r(图10B，SEQ ID NO：35)，采用优化的VP7基因序列(对应于图10C中的nt 88-891，SEQ ID NO：36)作为模板，扩增含有VP7编码序列的片段。对于序列优化，将VP7蛋白序列(Genbank登录号AEX30682)反向翻译，并针对人密码子使用、GC含量和mRNA结构进行优化。使用In-Fusion克隆系统(Clontech，Mountain View，CA)，将PCR产物克隆到2X35S/CPMV-160/NOS表达系统中。用SacII和StuI限制酶消化编号1190的构建体(图11B，SEQ ID NO：40)，并将线性化质粒用于In-Fusion组装反应。编号1190的构建体是用于在基于CPMV-160的表达盒中进行目的基因的“In Fusion”克隆的受体质粒。它还并入了用于在苜蓿质体蓝素基因启动子和终止子下共表达TBSV P19沉默抑制因子的基因构建体。骨架是pCAMBIA二元质粒，并且在图11C(SEQ ID NO：41)中显示从左t-DNA边界到右t-DNA边界的序列。得到的构建体定为编号1199(图15B，SEQ ID NO：53)。在图10E中显示来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短的信号肽的VP7的氨基酸序列(SEQ ID NO：38)。在图15C中显示质粒1199的示意图。
10.用于在CPMV-HT表达盒下表达VP6和VP2的双基因构建体(编号1708的构建体)
使用以下基于限制酶/连接酶的方法，组装用于在CPMV-HT表达系统控制下共表达来自轮状病毒A WA株的VP6和来自轮状病毒AWA株的VP2的单一载体。使用AvrII限制酶(位于2X35S启动子之前)和AscI限制酶(位于NOS终止子之后)，消化供体质粒DNA(编号1710的构建体；2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP2(opt)/NOS)(图7F，SEQ ID NO：23)，并且将对应于2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP2(opt)/NOS表达盒的片段进行凝胶纯化。然后将该片段插入使用XbaI限制酶和AscI限制酶(两个位点均位于VP6表达盒的NOS终止子之后)线性化的编号1713的受体构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(WA)VP6(opt)/NOS)(图8D，SEQ ID NO：28)中。得到的构建体定为编号1708。在图16中显示质粒1708的示意图。
11.用于在CPMV-HT表达盒下表达VP7和VP4的双基因构建体(编号1719的构建体)
使用以下基于限制酶/连接酶的方法，组装用于在CPMV-HT表达系统控制下共表达来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短形式的天然信号肽的VP7和来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP4的单一载体。使用AvrII限制酶(位于2X35S启动子之前)和AscI限制酶(位于NOS终止子之后)，消化供体质粒DNA(编号1730的构建体；2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS)(图9D，SEQ IDNO:32)，并且将对应于2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS表达盒的片段进行凝胶纯化。然后将该片段插入使用XbaI限制酶和AscI限制酶(两个位点均位于VP7表达盒的NOS终止子之后)线性化的编号1734的受体构建体(2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS)(图10D，SEQ ID NO：37)中。得到的构建体定为编号1719。在图17中显示质粒1719的示意图。
12.用于在CPMV-160表达盒下表达VP6和VP2的双基因构建体(编号2400的构建体)
使用以下基于限制酶/连接酶的方法，组装用于在CPMV-160表达系统控制下共表达来自轮状病毒A WA株的VP6和来自轮状病毒AWA株的VP2的单一载体。使用AvrII限制酶(位于2X35S启动子之前)和AscI限制酶(位于NOS终止子之后)，消化供体质粒DNA(编号1108的构建体；2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP2(opt)/NOS)(图12D，SEQ ID NO：47)，并且将对应于2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP2(opt)/NOS表达盒的片段进行凝胶纯化。然后将该片段插入使用XbaI限制酶和AscI限制酶(两个位点均位于VP6表达盒的NOS终止子之后)线性化的编号1128的受体构建体(2X35S/CPMV-160/RVA(WA)VP6(opt)/NOS)(图13B，SEQ ID NO：49)。得到的构建体定为编号2400。在图18显示质粒2400的示意图。
13.用于在CPMV-160表达盒下表达VP7和VP4的双基因构建体(编号2400的构建体)
使用以下基于限制酶/连接酶的方法，组装用于在CPMV-160表达系统控制下共表达来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短形式的天然信号肽的VP7和来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP4的单一载体。使用AvrII限制酶(位于2X35S启动子之前)和AscI限制酶(位于NOS终止子之后)，消化供体质粒DNA(编号1178的构建体；2X35S/CPMV-160/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS)(图14B，SEQID NO：51)，并且将对应于2X35S/CPMV-160/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS表达盒的片段进行凝胶纯化。然后将该片段插入使用XbaI限制酶和AscI限制酶(两个位点均位于VP7表达盒的NOS终止子之后)线性化的编号1199的受体构建体(2X35S/CPMV-160/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS)(图15B，SEQ ID NO：53)中。得到的构建体定为编号2408。在图19中显示质粒2408的示意图。
14.用于在CPMV-HT表达盒下表达VP7、VP4、VP6和VP2的四基因构建体(编号1769的构建体)
使用以下基于限制酶/连接酶的方法，组装用于在CPMV-HT表达系统控制下共表达来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短形式的天然信号肽的VP7、来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP4、来自轮状病毒A WA株的VP6和来自轮状病毒A WA株的VP2的单一载体。使用AvrII限制酶(位于2X35S启动子之前)和AscI限制酶(位于NOS终止子之后)，消化供体质粒DNA(编号1730的构建体；2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS)(图9D，SEQ ID NO：32)，并且将对应于2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS表达盒的片段进行凝胶纯化。然后将该片段插入使用XbaI限制酶和AscI限制酶(两个位点均位于VP7表达盒的NOS终止子之后)线性化的编号1734的受体构建体(2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS)(图10D，SEQ ID NO：37)中。由AvrII和XbaI产生的粘性末端的连接破坏了原限制位点，由此产生了在第二表达盒(从左T-DNA到右T-DNA)的NOS终止子末端具有相同的唯一XbaI限制酶位点和AscI限制酶位点的临时受体载体。然后使用相同的消化策略，将在CPMV-HT表达系统下表达的VP6(编号1713的构建体；图8D，SEQ ID NO：28)和VP2(编号1710的构建体；图7F，SEQ ID NO：23)，顺序插入所得临时受体载体中，以给出最终的VP7/VP4/VP6/VP2构建体。得到的构建体定为编号1769。在图20中显示质粒1769的示意图。
15.用于在CPMV-HT表达盒下表达VP4、VP7、NSP4、VP6和VP2的五基因构建体(编号2441的构建体)
使用以下基于限制酶/连接酶的方法，组装用于在CPMV-HT表达系统控制下共表达来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP4、来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的具有截短形式的天然信号肽的VP7、来自轮状病毒A WA株的NSP4、来自轮状病毒A WA株的VP6和来自轮状病毒A WA株的VP2的单一载体。使用AvrII限制酶(位于2X35S启动子之前)和AscI限制酶(位于NOS终止子之后)，消化供体质粒DNA(编号1734的构建体；2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS)(图10D，SEQID NO：37)，并且将对应于2X35S/CPMV-HT/TrSp-RVA(Rtx)VP7(opt)/NOS表达盒的片段进行凝胶纯化。然后将该片段插入使用XbaI限制酶和AscI限制酶(两个位点均位于VP4表达盒的NOS终止子之后)线性化的编号1730的受体构建体(2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx)VP4(opt)/NOS)(图9D，SEQ ID NO：32)中。由AvrII和XbaI产生的粘性末端的连接破坏了原限制位点，由此产生了在第二表达盒(从左T-DNA到右T-DNA)的NOS终止子末端具有相同的唯一XbaI限制酶位点和AscI限制酶位点的临时受体载体。然后使用相同的消化策略，将在CPMV-HT表达系统下表达的NSP4(编号1706的构建体；图11D，SEQ ID NO：42)、VP6(编号1713的构建体；图8D，SEQ ID NO：28)和VP2(编号1710的构建体；图7F，SEQ ID NO：23)，顺序插入所得临时受体载体中，以给出最终的VP4/VP7/NSP4/VP6/VP2构建体。得到的构建体定为编号2441。在图21中显示质粒2441的示意图。
实施例2.NSP4的共表达增加了VP4和VP4并入RLP
如实施例1所述，使用农杆菌渗入法，在NSP4表达构建体存在或不存在下，将轮状病毒VP2、VP4、VP6和VP7结构抗原在本氏烟(Nicotiana benthamiana)植物中瞬时共表达。来自产生RLP的植物的粗蛋白提取物，含有大量在考马斯染色的SDS-PAGE中的条带图案所示的宿主蛋白(图2B，负载)。通过在碘克沙醇密度梯度上超速离心，可以将轮状病毒样颗粒从植物蛋白中分离。离心后，来自碘克沙醇密度梯度的级分分析显示，RLP迁移至35％的碘克沙醇级分(图2B中的F2和F3)，而大多数宿主蛋白质保留在25％-30％的碘克沙醇级分中(图2B中的F4-F10)。在碘克沙醇密度梯度上纯化来自共表达轮状病毒结构抗原的植物的RLP，含有级分(F2和F3)的RLP的分析显示可以有效地产生RLP，而与如图3A所示的单基因构建体、双基因构建体和四基因构建体的每个构建体的基因数目无关。获得的结果还显示，NSP4的共表达降低了RLP表达(图3A中的-NSP4和+NSP4下的比较级分)。注意，将等体积的每种级分加载到凝胶上，以比较每体积的RLP含量。
通过蛋白质印迹分析来自相同实验的含有RLP的级分2，以评估NSP4共表达对VP4和VP7并入的影响。为了进行比较，在凝胶上加载等量的RLP。获得的蛋白质印迹结果显示，在NSP4存在下产生的RLP上的VP4和VP7的信号更强(图3B，在-NSP4和+NSP4下比较泳道)。这些结果清楚地表明，NSP4的共表达增加了VP4和VP7并入RLP表面。
将编码四种轮状病毒抗原和非结构蛋白NSP4的基因，克隆到CPMV-HT和CPMV160中用于比较表达。共表达研究后，通过碘离子浓度梯度的超速离心进行提取和纯化显示，两种表达都有效产生RLP，如梯度的级分2和级分3中VP6的量(图4A)和来自相同处理的级分2中VP4和VP7的量(图4B)所证明。该研究还表明，当使用CPMV-HT系统表达轮状病毒蛋白时，单基因构建体产生与双基因构建体一样多的RLP(图4A，左图相对于中间图)，并且导致了类似的表面抗原(VP4和VP7)覆盖(图4B，左图相对于中间图)。
已经针对四种结构抗原与NSP4的共表达，评估了五基因构建体(在相同质粒上含有5个基因)。如图5所示，五基因构建体的使用导致与在单独的质粒上使用具有NSP4基因的四基因构建体类似的RLP产生水平(图5，顶部图)，以及相当水平的VP4和VP7的并入(图5，下图)。
农杆菌转化
通过电穿孔(Mattanovich等人，1989，Nucleic Acid Res.17：6747)，可选择地可以使用采用CaCl2制备的感受态细胞的热休克(XU等人，2008，Plant Methods 4)，将所有质粒用于转化根癌农杆菌(AGL1；ATCC，Manassas，VA 20108，USA)。通过限制性酶切作图来证实在根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株中产生的质粒的完整性。
植物生物质、接种物的制备，农杆菌渗入法和收获
本氏烟植物生长自在填充有商购泥炭苔基质的平板中的种子。允许植物在温室中于16/8光周期和25℃白天/20℃黑夜的温度状况下生长。播种三周后，挑选出单个体小植株，移植到盆中，并在相同环境条件下放置在温室中再生长三周。
用每种构建体转染的农杆菌，在植物来源并补充有10mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)和50μg/ml卡那霉素，pH5.6的LB培养基中生长，直到它们达到OD600在0.6和2.5之间。将农杆菌悬浮液混合以达到每种构建体的适当比例，并用渗入培养基(10mM MgCl2和10mMMES pH 5.6)使其至2.5×OD 600。将根癌农杆菌悬浮液在4℃下储存过夜。渗入当天，用渗入培养基稀释分批培养物，并在使用前允许温热。将本氏烟的整株植物于20-40托的真空下，在密封的不锈钢罐内的细菌悬浮液中倒置放置2分钟。渗入后，将植物返回温室进行9天的孵育期直到收获。将收获的生物质保持冷冻(-80℃)直到用于纯化颗粒。
通过超速离心轮状病毒样颗粒进行提取和筛选
通过在具有2体积的提取缓冲液(TNC：10mM Tris pH 7.4,140mM NaCl，10mMCaCl2)的混合器中机械提取，从冷冻生物质中提取蛋白质。将匀浆通过大孔尼龙过滤器过滤以除去大碎片，并在4℃下以5000g离心5分钟。收集上清液，再次以5000g离心30分钟(4℃)以除去另外的碎片。然后将上清液加载到不连续的碘克沙醇密度梯度上。
按如下进行分析型密度梯度离心。制备在TNC缓冲液中含有不连续的碘克沙醇密度梯度的38ml试管(在45％的碘克沙醇，1.2ml；在35％的碘克沙醇，2ml；在30％的碘克沙醇，5ml；和在25％的碘克沙醇，5ml)，并用25ml含有轮状病毒样颗粒的提取物覆盖。将梯度在120,000g下离心4小时(4℃)。离心后，从底部至顶部收集1ml级分，并通过SDS-PAGE结合蛋白质染色或Western印迹来分析级分2和3(对应于35％的碘克沙醇)。
SDS-PAGE和免疫印迹
通过BCA蛋白分析(Pierce Biochemicals，Rockport，IL)测定蛋白浓度。使用CriterionTM TGX Stain-FreeTM预制凝胶(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在还原条件下通过SDS-PAGE分离蛋白质，并用Gel DocTM EZ成像系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)显现蛋白。
对于免疫印迹，将经电泳的蛋白电转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(RocheDiagnostics Corporation，Indianapolis，IN)上。在免疫印迹之前，于4℃用在Tris缓冲盐水(TBS-T)中的5％脱脂牛奶和0.1％Tween-20，封闭膜16-18h。
通过在0.1％的TBS-Tween 20中的2％脱脂牛奶中，与合适的抗体(表4)孵育进行免疫印迹。用于化学发光检测的二级抗体如表4所示，如在0.1％的TBS-Tween 20中2％脱脂牛奶所示稀释。使用鲁米诺(发光氨)(Roche Diagnostics Corporation，Indianapolis，IN)作为底物，通过化学发光检测免疫反应性复合物。
表4：用于轮状病毒抗原的免疫印迹的电泳条件、抗体和稀释。
通过引用将所有引文并入本文。
本发明已经描述了一个或多个实施方案。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求所限定的本发明范围的情况下，可以进行多种变化和修改。
序列表
<110> 莫迪卡戈公司
<120> 在植物中产生轮状病毒样颗粒
<130> 17C81708CN
<150> US 62/106,941
<151> 2015-01-15
<160> 53
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达增强子 CPMVX
<400> 1
tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60
ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120
gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca 160
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<222> (4)..(4)
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<400> 2
caana 5
<210> 3
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<212> DNA
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<220>
<223> 双子叶植物kozak序列
<220>
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<222> (4)..(4)
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aaana 5
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<212> DNA
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<223> 拟南芥kozak序列
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<222> (3)..(3)
<223> A或G
<220>
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<222> (4)..(4)
<223> A或C
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 植物kozak序列
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agaca 5
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<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 植物kozak序列
<400> 7
aggaa 5
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<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 植物kozak序列
<400> 8
aaaaa 5
<210> 9
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 植物kozak序列
<400> 9
aaaca 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 植物kozak序列
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<211> 5
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aagaa 5
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<212> DNA
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aaagaa 6
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<212> DNA
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<223> 共有序列
<220>
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<222> (5)..(5)
<223> A或C
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nannna 6
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<212> DNA
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<220>
<223> CPMV HT表达增强子
<400> 15
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ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120
gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180
gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240
ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300
atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360
gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420
atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480
taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggccc 517
<210> 16
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有植物kozak共有序列的CPMV HT+
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> A或不存在
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(4)
<223> A或G
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> A或C
<220>
<221> misc_feature
<222> (529)..(529)
<223> n是a、c、g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (531)..(533)
<223> n是a、c、g或t
<400> 16
tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60
ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120
gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180
gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240
ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300
atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360
gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420
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<210> 17
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CPMV HT+ 511
<400> 17
tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa ccaaaccttc 60
ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcgtgagc 120
gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180
gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240
ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300
atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360
gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420
atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480
taagcttctg tatattctgc ccaaatttga a 511
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<212> DNA
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<220>
<223> CPMV HT+WT 115
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ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc ttgcatgagc 120
gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc 180
gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg tgtacttgtc 240
ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct gttcagcccc 300
atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct acttctgctt 360
gacgaggtat tgttgcctgt acttctttct tcttcttctt gctgattggt tctataagaa 420
atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga gaaagattgt 480
taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt tcgggcccaa taccgcggag aaaa 534
<210> 19
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF WA VP2 opt s1+3c
<400> 19
aaatttgtcg ggcccatggc ataccggaag agaggagcaa agcgcgaa 48
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF WA VP2 opt s1至 4r
<400> 20
actaaagaaa ataggccttt aaagctcgtt cattattcgc atattgtcga 50
<210> 21
<211> 2673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自WA株的轮状病毒A VP2的优化编码序列
<400> 21
atggcatacc ggaagagagg agcaaagcgc gaaaacctgc cgcaacagaa cgagagactg 60
caagaaaaag agatagagaa agatgtcgac gtaacaatgg aaaacaagaa taacaatagg 120
aaacaacagc tgtccgacaa agttctgtcc cagaaggagg aaattatcac tgacgcccag 180
gacgatatta aaattgccgg agaaataaag aagagctcga aagaagaatc taaacagctg 240
ctcgaaattc tgaaaacaaa agaagaccat cagaaagaga ttcaatatga aattttgcaa 300
aaaacaatac ctacatttga gtccaaagaa agtatcctca agaagcttga agacataaga 360
ccggagcagg caaaaaaaca gatgaaactc tttcgcattt tcgagccaaa acagctccct 420
atatatcgcg ccaatggcga gaaggagcta cgcaaccggt ggtactggaa gttgaaaaaa 480
gacaccctgc cagatggaga ttatgacgtc cgggagtatt tcctcaatct ctatgatcag 540
atcctcatcg aaatgccgga ctatctgctc ctcaaggaca tggccgtgga gaacaaaaat 600
agcagagacg ccggcaaagt tgtcgactct gagactgcca atatttgtga tgccatcttc 660
caggatgagg agaccgaggg agtcgtccgt agattcatcg ctgatatgcg gcaacaggtc 720
caggctgatc gtaacattgt caattaccct tccatccttc accctattga tcatgcattc 780
aatgagtatt ttcttaacca ccagttggtg gagccgctga acaatgagat aatcttcaat 840
tacataccag agaggataag gaatgacgtg aattacatcc tgaacatgga tatgaatctg 900
ccatctacag ccaggtatat caggccaaac ttgttgcagg atagactgaa tcttcacgat 960
aattttgagt ccctgtggga taccatcaca acatccaact acattctggc caggtccgtc 1020
gttcccgatt tgaaggagaa ggagctggtc tccaccgaag cacagatcca gaaaatgagc 1080
caggacctgc agctggaggc cctcactatt cagagcgaga cacagttttt agccgggatt 1140
aacagtcagg ctgccaatga ttgtttcaag accctcatag ccgccatgct gtctcaaaga 1200
accatgtctt tggactttgt gaccacgaac tatatgagcc taatctccgg aatgtggcta 1260
cttacagtga ttcccaacga tatgttcctc cgggagtcac tagtggcctg tgagctggcg 1320
atcatcaaca ccatcgtgta tccagcattc ggaatgcaga gaatgcatta ccggaatggc 1380
gaccctcaga cacccttcca gatcgcagaa cagcagatcc agaatttcca ggtggcgaac 1440
tggctccatt ttattaacaa taacagattc aggcaagttg tgattgatgg agttctgaat 1500
cagactctga acgacaatat acggaatgga caggtcatca accagctgat ggaagcattg 1560
atgcaactca gcagacagca gttccccacg atgcctgtgg attacaaacg gagcatccaa 1620
cggggcattc tgcttctctc caataggctg gggcagcttg tcgacttaac ccgactggtc 1680
tcctataact acgagacgct aatggcttgt gtgaccatga acatgcagca cgtgcaaacc 1740
ctgacaactg agaagttgca gctcacttct gtgacttcgc tttgtatgtt aattggtaac 1800
acaaccgtga ttccgtcccc acagacactg ttccactact acaacatcaa cgtgaatttc 1860
cactccaatt ataatgagcg gatcaacgac gccgtcgcca taattaccgc agcaaatagg 1920
ctgaatcttt atcagaaaaa aatgaagtcc atagtggaag actttctgaa acggctccag 1980
attttcgacg taccacgagt gcctgacgac caaatgtaca ggctgaggga tcgccttcgg 2040
ctcttacccg ttgaacggag acggcttgac atattcaact tgatcctgat gaatatggag 2100
cagatcgaac gcgcttctga taagattgct cagggggtta tcatcgcata ccgagatatg 2160
cagctggaac gcgacgagat gtacggatat gttaatattg cacggaatct tgatggctac 2220
cagcaaatta acttggagga actcatgcgc accggtgatt acggacaaat tacgaacatg 2280
cttctcaaca atcaacccgt tgcccttgtg ggtgcattgc ccttcgttac ggactcatcc 2340
gtgatcagtc taatcgccaa gctcgacgca accgtcttcg ctcagatagt gaagctcagg 2400
aaagttgaca cactgaagcc catactgtac aaaataaact cggattccaa tgacttttac 2460
cttgtggcca actacgactg gatccccaca agtacaacta aggtctacaa acaggtgcca 2520
caaccattcg actttagagc cagcatgcac atgctgactt ctaaccttac gtttaccgtc 2580
tactctgacc tactgtcatt tgtttcagcg gacacggtag agcccattaa cgcagtcgca 2640
ttcgacaata tgcgaataat gaacgagctt taa 2673
<210> 22
<211> 4903
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体1191
<400> 22
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
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aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
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cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220
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cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460
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cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640
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tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940
ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000
ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt 3060
tcactgaagc gaaatcaaag atctctttgt ggacacgtag tgcggcgcca ttaaataacg 3120
tgtacttgtc ctattcttgt cggtgtggtc ttgggaaaag aaagcttgct ggaggctgct 3180
gttcagcccc atacattact tgttacgatt ctgctgactt tcggcgggtg caatatctct 3240
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tctataagaa atctagtatt ttctttgaaa cagagttttc ccgtggtttt cgaacttgga 3360
gaaagattgt taagcttctg tatattctgc ccaaatttgt cgggcccgcg gatggcgaaa 3420
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gcctgcaggc tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactgg cccctggatc 3540
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gccagtgaca gtgacctgga actctggatc cctgtccagc ggtgtgcaca ccttcccagc 3660
tgtcctgcag tctgacctct acactctgag cagctcagtg actgtcccct ccagcacctg 3720
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gaaaattgtg cccagggatt gtggttgtaa gccttgcata tgtacagtcc cagaagtatc 3840
atctgtcttc atcttccccc caaagcccaa ggatgtgctc accattactc tgactcctaa 3900
ggtcacgtgt gttgtggtag acatcagcaa ggatgatccc gaggtccagt tcagctggtt 3960
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cactttccgc tcagtcagtg aacttcccat catgcaccag gactggctca atggcaagga 4080
gcgatcgctc accatcacca tcaccatcac catcaccatt aaaggcctat tttctttagt 4140
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agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca ggtcgtccct 4260
tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa agaccgggaa 4320
ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 4380
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gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 4560
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cgcccacgtg actagtggca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 4680
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 4740
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatgctaga 4800
gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttca gtttaaacta tcagtgtttg 4860
acaggatata ttggcgggta aacctaagag aaaagagcgt tta 4903
<210> 23
<211> 4413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码1710的表达盒
<400> 23
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
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tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
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tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
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gctgctcgaa attctgaaaa caaaagaaga ccatcagaaa gagattcaat atgaaatttt 1560
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cttccaggat gaggagaccg agggagtcgt ccgtagattc atcgctgata tgcggcaaca 1980
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caattacata ccagagagga taaggaatga cgtgaattac atcctgaaca tggatatgaa 2160
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cgataatttt gagtccctgt gggataccat cacaacatcc aactacattc tggccaggtc 2280
cgtcgttccc gatttgaagg agaaggagct ggtctccacc gaagcacaga tccagaaaat 2340
gagccaggac ctgcagctgg aggccctcac tattcagagc gagacacagt ttttagccgg 2400
gattaacagt caggctgcca atgattgttt caagaccctc atagccgcca tgctgtctca 2460
aagaaccatg tctttggact ttgtgaccac gaactatatg agcctaatct ccggaatgtg 2520
gctacttaca gtgattccca acgatatgtt cctccgggag tcactagtgg cctgtgagct 2580
ggcgatcatc aacaccatcg tgtatccagc attcggaatg cagagaatgc attaccggaa 2640
tggcgaccct cagacaccct tccagatcgc agaacagcag atccagaatt tccaggtggc 2700
gaactggctc cattttatta acaataacag attcaggcaa gttgtgattg atggagttct 2760
gaatcagact ctgaacgaca atatacggaa tggacaggtc atcaaccagc tgatggaagc 2820
attgatgcaa ctcagcagac agcagttccc cacgatgcct gtggattaca aacggagcat 2880
ccaacggggc attctgcttc tctccaatag gctggggcag cttgtcgact taacccgact 2940
ggtctcctat aactacgaga cgctaatggc ttgtgtgacc atgaacatgc agcacgtgca 3000
aaccctgaca actgagaagt tgcagctcac ttctgtgact tcgctttgta tgttaattgg 3060
taacacaacc gtgattccgt ccccacagac actgttccac tactacaaca tcaacgtgaa 3120
tttccactcc aattataatg agcggatcaa cgacgccgtc gccataatta ccgcagcaaa 3180
taggctgaat ctttatcaga aaaaaatgaa gtccatagtg gaagactttc tgaaacggct 3240
ccagattttc gacgtaccac gagtgcctga cgaccaaatg tacaggctga gggatcgcct 3300
tcggctctta cccgttgaac ggagacggct tgacatattc aacttgatcc tgatgaatat 3360
ggagcagatc gaacgcgctt ctgataagat tgctcagggg gttatcatcg cataccgaga 3420
tatgcagctg gaacgcgacg agatgtacgg atatgttaat attgcacgga atcttgatgg 3480
ctaccagcaa attaacttgg aggaactcat gcgcaccggt gattacggac aaattacgaa 3540
catgcttctc aacaatcaac ccgttgccct tgtgggtgca ttgcccttcg ttacggactc 3600
atccgtgatc agtctaatcg ccaagctcga cgcaaccgtc ttcgctcaga tagtgaagct 3660
caggaaagtt gacacactga agcccatact gtacaaaata aactcggatt ccaatgactt 3720
ttaccttgtg gccaactacg actggatccc cacaagtaca actaaggtct acaaacaggt 3780
gccacaacca ttcgacttta gagccagcat gcacatgctg acttctaacc ttacgtttac 3840
cgtctactct gacctactgt catttgtttc agcggacacg gtagagccca ttaacgcagt 3900
cgcattcgac aatatgcgaa taatgaacga gctttaaagg cctattttct ttagtttgaa 3960
tttactgtta ttcggtgtgc atttctatgt ttggtgagcg gttttctgtg ctcagagtgt 4020
gtttatttta tgtaatttaa tttctttgtg agctcctgtt tagcaggtcg tcccttcagc 4080
aaggacacaa aaagatttta attttattaa aaaaaaaaaa aaaaaagacc gggaattcga 4140
tatcaagctt atcgacctgc agatcgttca aacatttggc aataaagttt cttaagattg 4200
aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc tgttgaatta cgttaagcat 4260
gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat gggtttttat gattagagtc 4320
ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat agcgcgcaaa ctaggataaa 4380
ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gat 4413
<210> 24
<211> 890
<212> PRT
<213> 轮状病毒
<400> 24
Met Ala Tyr Arg Lys Arg Gly Ala Lys Arg Glu Asn Leu Pro Gln Gln
1 5 10 15
Asn Glu Arg Leu Gln Glu Lys Glu Ile Glu Lys Asp Val Asp Val Thr
20 25 30
Met Glu Asn Lys Asn Asn Asn Arg Lys Gln Gln Leu Ser Asp Lys Val
35 40 45
Leu Ser Gln Lys Glu Glu Ile Ile Thr Asp Ala Gln Asp Asp Ile Lys
50 55 60
Ile Ala Gly Glu Ile Lys Lys Ser Ser Lys Glu Glu Ser Lys Gln Leu
65 70 75 80
Leu Glu Ile Leu Lys Thr Lys Glu Asp His Gln Lys Glu Ile Gln Tyr
85 90 95
Glu Ile Leu Gln Lys Thr Ile Pro Thr Phe Glu Ser Lys Glu Ser Ile
100 105 110
Leu Lys Lys Leu Glu Asp Ile Arg Pro Glu Gln Ala Lys Lys Gln Met
115 120 125
Lys Leu Phe Arg Ile Phe Glu Pro Lys Gln Leu Pro Ile Tyr Arg Ala
130 135 140
Asn Gly Glu Lys Glu Leu Arg Asn Arg Trp Tyr Trp Lys Leu Lys Lys
145 150 155 160
Asp Thr Leu Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Val Arg Glu Tyr Phe Leu Asn
165 170 175
Leu Tyr Asp Gln Ile Leu Ile Glu Met Pro Asp Tyr Leu Leu Leu Lys
180 185 190
Asp Met Ala Val Glu Asn Lys Asn Ser Arg Asp Ala Gly Lys Val Val
195 200 205
Asp Ser Glu Thr Ala Asn Ile Cys Asp Ala Ile Phe Gln Asp Glu Glu
210 215 220
Thr Glu Gly Val Val Arg Arg Phe Ile Ala Asp Met Arg Gln Gln Val
225 230 235 240
Gln Ala Asp Arg Asn Ile Val Asn Tyr Pro Ser Ile Leu His Pro Ile
245 250 255
Asp His Ala Phe Asn Glu Tyr Phe Leu Asn His Gln Leu Val Glu Pro
260 265 270
Leu Asn Asn Glu Ile Ile Phe Asn Tyr Ile Pro Glu Arg Ile Arg Asn
275 280 285
Asp Val Asn Tyr Ile Leu Asn Met Asp Met Asn Leu Pro Ser Thr Ala
290 295 300
Arg Tyr Ile Arg Pro Asn Leu Leu Gln Asp Arg Leu Asn Leu His Asp
305 310 315 320
Asn Phe Glu Ser Leu Trp Asp Thr Ile Thr Thr Ser Asn Tyr Ile Leu
325 330 335
Ala Arg Ser Val Val Pro Asp Leu Lys Glu Lys Glu Leu Val Ser Thr
340 345 350
Glu Ala Gln Ile Gln Lys Met Ser Gln Asp Leu Gln Leu Glu Ala Leu
355 360 365
Thr Ile Gln Ser Glu Thr Gln Phe Leu Ala Gly Ile Asn Ser Gln Ala
370 375 380
Ala Asn Asp Cys Phe Lys Thr Leu Ile Ala Ala Met Leu Ser Gln Arg
385 390 395 400
Thr Met Ser Leu Asp Phe Val Thr Thr Asn Tyr Met Ser Leu Ile Ser
405 410 415
Gly Met Trp Leu Leu Thr Val Ile Pro Asn Asp Met Phe Leu Arg Glu
420 425 430
Ser Leu Val Ala Cys Glu Leu Ala Ile Ile Asn Thr Ile Val Tyr Pro
435 440 445
Ala Phe Gly Met Gln Arg Met His Tyr Arg Asn Gly Asp Pro Gln Thr
450 455 460
Pro Phe Gln Ile Ala Glu Gln Gln Ile Gln Asn Phe Gln Val Ala Asn
465 470 475 480
Trp Leu His Phe Ile Asn Asn Asn Arg Phe Arg Gln Val Val Ile Asp
485 490 495
Gly Val Leu Asn Gln Thr Leu Asn Asp Asn Ile Arg Asn Gly Gln Val
500 505 510
Ile Asn Gln Leu Met Glu Ala Leu Met Gln Leu Ser Arg Gln Gln Phe
515 520 525
Pro Thr Met Pro Val Asp Tyr Lys Arg Ser Ile Gln Arg Gly Ile Leu
530 535 540
Leu Leu Ser Asn Arg Leu Gly Gln Leu Val Asp Leu Thr Arg Leu Val
545 550 555 560
Ser Tyr Asn Tyr Glu Thr Leu Met Ala Cys Val Thr Met Asn Met Gln
565 570 575
His Val Gln Thr Leu Thr Thr Glu Lys Leu Gln Leu Thr Ser Val Thr
580 585 590
Ser Leu Cys Met Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Ile Pro Ser Pro Gln
595 600 605
Thr Leu Phe His Tyr Tyr Asn Ile Asn Val Asn Phe His Ser Asn Tyr
610 615 620
Asn Glu Arg Ile Asn Asp Ala Val Ala Ile Ile Thr Ala Ala Asn Arg
625 630 635 640
Leu Asn Leu Tyr Gln Lys Lys Met Lys Ser Ile Val Glu Asp Phe Leu
645 650 655
Lys Arg Leu Gln Ile Phe Asp Val Pro Arg Val Pro Asp Asp Gln Met
660 665 670
Tyr Arg Leu Arg Asp Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Glu Arg Arg Arg
675 680 685
Leu Asp Ile Phe Asn Leu Ile Leu Met Asn Met Glu Gln Ile Glu Arg
690 695 700
Ala Ser Asp Lys Ile Ala Gln Gly Val Ile Ile Ala Tyr Arg Asp Met
705 710 715 720
Gln Leu Glu Arg Asp Glu Met Tyr Gly Tyr Val Asn Ile Ala Arg Asn
725 730 735
Leu Asp Gly Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Glu Glu Leu Met Arg Thr Gly
740 745 750
Asp Tyr Gly Gln Ile Thr Asn Met Leu Leu Asn Asn Gln Pro Val Ala
755 760 765
Leu Val Gly Ala Leu Pro Phe Val Thr Asp Ser Ser Val Ile Ser Leu
770 775 780
Ile Ala Lys Leu Asp Ala Thr Val Phe Ala Gln Ile Val Lys Leu Arg
785 790 795 800
Lys Val Asp Thr Leu Lys Pro Ile Leu Tyr Lys Ile Asn Ser Asp Ser
805 810 815
Asn Asp Phe Tyr Leu Val Ala Asn Tyr Asp Trp Ile Pro Thr Ser Thr
820 825 830
Thr Lys Val Tyr Lys Gln Val Pro Gln Pro Phe Asp Phe Arg Ala Ser
835 840 845
Met His Met Leu Thr Ser Asn Leu Thr Phe Thr Val Tyr Ser Asp Leu
850 855 860
Leu Ser Phe Val Ser Ala Asp Thr Val Glu Pro Ile Asn Ala Val Ala
865 870 875 880
Phe Asp Asn Met Arg Ile Met Asn Glu Leu
885 890
<210> 25
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF WA VP6 opt s1+3c
<400> 25
aaatttgtcg ggcccatgga ggtcctttat agtctctcca aaacgctga 49
<210> 26
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF WA VP6 opt s1至4r
<400> 26
actaaagaaa ataggcctct acttgatcaa catactccgg atagaggcca ca 52
<210> 27
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自WA株的轮状病毒A VP6的优化编码序列
<400> 27
atggaggtcc tttatagtct ctccaaaacg ctgaaggacg ctagggacaa gatcgtggag 60
ggtacacttt atagcaatgt cagcgaccta atacagcagt ttaatcaaat gatcgttaca 120
atgaatggga atgatttcca aactggcggt attggtaatc tgcccgtgag gaactggaca 180
ttcgatttcg gcctgctggg cacgactctc cttaatctcg atgcaaatta tgtagaaaac 240
gccagaacga ttatcgagta ctttatcgat ttcattgata acgtttgtat ggatgagatg 300
gcccgcgagt cacaacggaa cggagttgct ccacagtccg aggcccttcg gaaactcgcc 360
ggcattaagt tcaagcgtat taatttcgac aactcctccg aatatataga gaactggaac 420
ttgcagaatc gtcgacagag aaccggcttc gtgttccata aacctaatat ctttccgtat 480
agcgcctcat tcaccctgaa taggagtcag cccatgcacg acaacctcat gggtacaatg 540
tggctgaatg cggggagtga aatacaggtc gccgggttcg attactcctg tgccattaat 600
gcacccgcaa acatccagca gttcgaacat atcgtgcaac taagacgggc tctcacgacc 660
gcgacaatta cactcctgcc cgacgccgag cgcttctcct ttccccgcgt aatcaactca 720
gctgatggcg ccaccacttg gttcttcaac cctgttatat tgcgccctaa caacgtagag 780
gtggagtttc tcttaaacgg acagatcatc aatacctacc aagccaggtt cggcacgatt 840
attgcaagaa atttcgacgc tatcaggctg ctcttccaac tgatgaggcc ccccaatatg 900
actcccgctg tgaacgcttt gtttccgcag gctcagcctt tccagcacca cgccaccgtc 960
ggcttgactc ttcgaataga gagcgcggtc tgcgaatcag tgctggcaga cgccaacgag 1020
acgctgctgg caaacgttac cgccgtgcgg caagagtatg ccatcccagt agggcctgtg 1080
tttccacccg gcatgaactg gactgaacta attactaact atagcccatc cagagaagac 1140
aacttgcagc gggtcttcac tgtggcctct atccggagta tgttgatcaa gtag 1194
<210> 28
<211> 2934
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1713的表达盒
<400> 28
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggag gtcctttata gtctctccaa aacgctgaag gacgctaggg acaagatcgt 1320
ggagggtaca ctttatagca atgtcagcga cctaatacag cagtttaatc aaatgatcgt 1380
tacaatgaat gggaatgatt tccaaactgg cggtattggt aatctgcccg tgaggaactg 1440
gacattcgat ttcggcctgc tgggcacgac tctccttaat ctcgatgcaa attatgtaga 1500
aaacgccaga acgattatcg agtactttat cgatttcatt gataacgttt gtatggatga 1560
gatggcccgc gagtcacaac ggaacggagt tgctccacag tccgaggccc ttcggaaact 1620
cgccggcatt aagttcaagc gtattaattt cgacaactcc tccgaatata tagagaactg 1680
gaacttgcag aatcgtcgac agagaaccgg cttcgtgttc cataaaccta atatctttcc 1740
gtatagcgcc tcattcaccc tgaataggag tcagcccatg cacgacaacc tcatgggtac 1800
aatgtggctg aatgcgggga gtgaaataca ggtcgccggg ttcgattact cctgtgccat 1860
taatgcaccc gcaaacatcc agcagttcga acatatcgtg caactaagac gggctctcac 1920
gaccgcgaca attacactcc tgcccgacgc cgagcgcttc tcctttcccc gcgtaatcaa 1980
ctcagctgat ggcgccacca cttggttctt caaccctgtt atattgcgcc ctaacaacgt 2040
agaggtggag tttctcttaa acggacagat catcaatacc taccaagcca ggttcggcac 2100
gattattgca agaaatttcg acgctatcag gctgctcttc caactgatga ggccccccaa 2160
tatgactccc gctgtgaacg ctttgtttcc gcaggctcag cctttccagc accacgccac 2220
cgtcggcttg actcttcgaa tagagagcgc ggtctgcgaa tcagtgctgg cagacgccaa 2280
cgagacgctg ctggcaaacg ttaccgccgt gcggcaagag tatgccatcc cagtagggcc 2340
tgtgtttcca cccggcatga actggactga actaattact aactatagcc catccagaga 2400
agacaacttg cagcgggtct tcactgtggc ctctatccgg agtatgttga tcaagtagag 2460
gcctattttc tttagtttga atttactgtt attcggtgtg catttctatg tttggtgagc 2520
ggttttctgt gctcagagtg tgtttatttt atgtaattta atttctttgt gagctcctgt 2580
ttagcaggtc gtcccttcag caaggacaca aaaagatttt aattttatta aaaaaaaaaa 2640
aaaaaaagac cgggaattcg atatcaagct tatcgacctg cagatcgttc aaacatttgg 2700
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2760
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2820
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2880
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agat 2934
<210> 29
<211> 397
<212> PRT
<213> 轮状病毒
<400> 29
Met Glu Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp
1 5 10 15
Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln
20 25 30
Gln Phe Asn Gln Met Ile Val Thr Met Asn Gly Asn Asp Phe Gln Thr
35 40 45
Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Val Arg Asn Trp Thr Phe Asp Phe Gly
50 55 60
Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Asn
65 70 75 80
Ala Arg Thr Ile Ile Glu Tyr Phe Ile Asp Phe Ile Asp Asn Val Cys
85 90 95
Met Asp Glu Met Ala Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Val Ala Pro Gln
100 105 110
Ser Glu Ala Leu Arg Lys Leu Ala Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn
115 120 125
Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg
130 135 140
Arg Gln Arg Thr Gly Phe Val Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr
145 150 155 160
Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Met His Asp Asn Leu
165 170 175
Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly
180 185 190
Phe Asp Tyr Ser Cys Ala Ile Asn Ala Pro Ala Asn Ile Gln Gln Phe
195 200 205
Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Ala Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr
210 215 220
Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser
225 230 235 240
Ala Asp Gly Ala Thr Thr Trp Phe Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro
245 250 255
Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr
260 265 270
Tyr Gln Ala Arg Phe Gly Thr Ile Ile Ala Arg Asn Phe Asp Ala Ile
275 280 285
Arg Leu Leu Phe Gln Leu Met Arg Pro Pro Asn Met Thr Pro Ala Val
290 295 300
Asn Ala Leu Phe Pro Gln Ala Gln Pro Phe Gln His His Ala Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Val Cys Glu Ser Val Leu Ala
325 330 335
Asp Ala Asn Glu Thr Leu Leu Ala Asn Val Thr Ala Val Arg Gln Glu
340 345 350
Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr
355 360 365
Glu Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg
370 375 380
Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Ile Lys
385 390 395
<210> 30
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF Rtx VP4 opt s1+3c
<400> 30
aaatttgtcg ggcccatggc tagcctgatc tacagacaac tcttgaccaa ttc 53
<210> 31
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF Rtx VP4 opt s1至4r
<400> 31
actaaagaaa ataggccttc agagtttaca ttgcaggatt aattgctcaa tccta 55
<210> 32
<211> 2328
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轮状病毒A VP4的优化编码序列
<400> 32
atggctagcc tgatctacag acaactcttg accaattcat attctgtgga tcttcatgac 60
gaaatcgagc agattgggtc cgagaagacc cagaacgtga ccatcaaccc tggacctttt 120
gctcagaccc gctatgcccc tgtgaattgg gatcacggag aaatcaacga cagtacgacc 180
gtcgaaccca ttctggacgg gccataccaa cccaccacct tcaccccacc taatgattat 240
tggattttaa tcaactccaa cacaaacgga gtggtctacg agtccactaa taactccgat 300
ttttggaccg ccgttgtagc catcgagcca cacgtcaatc ctgtcgatcg ccagtatatg 360
atattcggcg agtccaaaca gtttaacgtt tccaatgaca gcaacaaatg gaagtttctg 420
gagatgtttc gcagctcctc tcagaacgaa ttctataata gacggaccct tacctccgat 480
acacgactcg tgggtatttt taagtacggc ggcagggtgt ggacatttca cggtgaaacc 540
cctcgagcaa ccactgactc cagtagcact gcaaacctga acaatatatc tattaccatc 600
cacagcgaat tctacataat cccaagatct caggaaagta agtgtaacga atatatcaac 660
aacggactcc ccccaattca gaatacacgg aacgtggtgc ctctcccact cagttctcgg 720
tctatccagt ataagagagc acaagtgaat gaggacatta ttgtgagcaa gactagcctt 780
tggaaagaaa tgcagtacaa cagagacatt atcatccggt ttaagtttgg gaactctatc 840
gtgaagatgg gcggcctggg gtacaaatgg tcagaaatct catataaagc cgccaactat 900
cagtataact acttgagaga cggcgagcag gtaaccgccc acacaacatg ctctgtcaac 960
ggcgttaata actttagcta caacggaggc ttccttccca ccgacttcgg tatcagccgg 1020
tatgaagtca tcaaggaaaa ttcttatgtg tacgtagatt actgggatga tagcaaagcg 1080
ttccgcaaca tggtgtatgt taggagcctg gctgctaatc tcaattctgt gaagtgtact 1140
ggtggatcat attatttctc aattcccgtg ggggcttggc cagtcatgaa tggcggggca 1200
gtctccctcc attttgctgg cgtgacgttg agcactcagt ttaccgattt cgtgtctctg 1260
aactccctga ggttccggtt ttcccttact gtcgacgagc ccccattcag cattctgcgt 1320
acaagaactg tcaacctcta cgggttacct gccgcgaatc caaacaacgg caatgaatac 1380
tatgaaattt cgggccgctt ctctttgata agtctggtac caactaatga cgactatcag 1440
acacccatca tgaacagcgt gactgtcaga caggacctgg aaagacaact tacagatctg 1500
cgggaagaat tcaattctct cagtcaggag attgcaatgg cccaattgat agatcttgcc 1560
ctactgcctc tcgatatgtt tagtatgttc tccggcatca aatcaactat agatctgaca 1620
aagagcatgg ctacttctgt gatgaagaag ttcaggaaat caaaacttgc cacgagcata 1680
tcagaaatga cgaactctct gagtgatgca gcatcatcag cgtcacgcaa cgtttccatt 1740
cggtcgaatc tcagcgccat cagcaactgg acaaacgtgt ccaacgacgt cagcaacgtg 1800
accaactcct tgaacgatat ttctacccag acgtcaacga tcagtaagaa actccgcttg 1860
aaagaaatga tcacccagac tgagggaatg tctttcgacg acatttccgc cgccgtgcta 1920
aaaaccaaaa tcgatatgtc tactcagatc ggcaagaaca ctctgccgga tatcgtaacc 1980
gaagcctccg aaaagtttat ccctaagcgc agctacagaa tattgaaaga tgacgaggtc 2040
atggagatca acacagaagg gaagttcttc gcttataaga tcaacacctt tgacgaggtt 2100
ccgtttgacg tcaataagtt tgcagagctc gtgacagata gtccagtgat ttctgccatc 2160
attgacttta agactttgaa gaacctgaac gacaactatg gaataacacg gaccgaagcg 2220
ttgaacctca ttaagtccaa tcccaatatg ttgcgcaatt tcattaacca gaacaatcca 2280
atcataagaa ataggattga gcaattaatc ctgcaatgta aactctga 2328
<210> 33
<211> 4068
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1730的表达盒
<400> 33
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggct agcctgatct acagacaact cttgaccaat tcatattctg tggatcttca 1320
tgacgaaatc gagcagattg ggtccgagaa gacccagaac gtgaccatca accctggacc 1380
ttttgctcag acccgctatg cccctgtgaa ttgggatcac ggagaaatca acgacagtac 1440
gaccgtcgaa cccattctgg acgggccata ccaacccacc accttcaccc cacctaatga 1500
ttattggatt ttaatcaact ccaacacaaa cggagtggtc tacgagtcca ctaataactc 1560
cgatttttgg accgccgttg tagccatcga gccacacgtc aatcctgtcg atcgccagta 1620
tatgatattc ggcgagtcca aacagtttaa cgtttccaat gacagcaaca aatggaagtt 1680
tctggagatg tttcgcagct cctctcagaa cgaattctat aatagacgga cccttacctc 1740
cgatacacga ctcgtgggta tttttaagta cggcggcagg gtgtggacat ttcacggtga 1800
aacccctcga gcaaccactg actccagtag cactgcaaac ctgaacaata tatctattac 1860
catccacagc gaattctaca taatcccaag atctcaggaa agtaagtgta acgaatatat 1920
caacaacgga ctccccccaa ttcagaatac acggaacgtg gtgcctctcc cactcagttc 1980
tcggtctatc cagtataaga gagcacaagt gaatgaggac attattgtga gcaagactag 2040
cctttggaaa gaaatgcagt acaacagaga cattatcatc cggtttaagt ttgggaactc 2100
tatcgtgaag atgggcggcc tggggtacaa atggtcagaa atctcatata aagccgccaa 2160
ctatcagtat aactacttga gagacggcga gcaggtaacc gcccacacaa catgctctgt 2220
caacggcgtt aataacttta gctacaacgg aggcttcctt cccaccgact tcggtatcag 2280
ccggtatgaa gtcatcaagg aaaattctta tgtgtacgta gattactggg atgatagcaa 2340
agcgttccgc aacatggtgt atgttaggag cctggctgct aatctcaatt ctgtgaagtg 2400
tactggtgga tcatattatt tctcaattcc cgtgggggct tggccagtca tgaatggcgg 2460
ggcagtctcc ctccattttg ctggcgtgac gttgagcact cagtttaccg atttcgtgtc 2520
tctgaactcc ctgaggttcc ggttttccct tactgtcgac gagcccccat tcagcattct 2580
gcgtacaaga actgtcaacc tctacgggtt acctgccgcg aatccaaaca acggcaatga 2640
atactatgaa atttcgggcc gcttctcttt gataagtctg gtaccaacta atgacgacta 2700
tcagacaccc atcatgaaca gcgtgactgt cagacaggac ctggaaagac aacttacaga 2760
tctgcgggaa gaattcaatt ctctcagtca ggagattgca atggcccaat tgatagatct 2820
tgccctactg cctctcgata tgtttagtat gttctccggc atcaaatcaa ctatagatct 2880
gacaaagagc atggctactt ctgtgatgaa gaagttcagg aaatcaaaac ttgccacgag 2940
catatcagaa atgacgaact ctctgagtga tgcagcatca tcagcgtcac gcaacgtttc 3000
cattcggtcg aatctcagcg ccatcagcaa ctggacaaac gtgtccaacg acgtcagcaa 3060
cgtgaccaac tccttgaacg atatttctac ccagacgtca acgatcagta agaaactccg 3120
cttgaaagaa atgatcaccc agactgaggg aatgtctttc gacgacattt ccgccgccgt 3180
gctaaaaacc aaaatcgata tgtctactca gatcggcaag aacactctgc cggatatcgt 3240
aaccgaagcc tccgaaaagt ttatccctaa gcgcagctac agaatattga aagatgacga 3300
ggtcatggag atcaacacag aagggaagtt cttcgcttat aagatcaaca cctttgacga 3360
ggttccgttt gacgtcaata agtttgcaga gctcgtgaca gatagtccag tgatttctgc 3420
catcattgac tttaagactt tgaagaacct gaacgacaac tatggaataa cacggaccga 3480
agcgttgaac ctcattaagt ccaatcccaa tatgttgcgc aatttcatta accagaacaa 3540
tccaatcata agaaatagga ttgagcaatt aatcctgcaa tgtaaactct gaaggcctat 3600
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 3660
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 3720
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 3780
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 3840
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 3900
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 3960
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 4020
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 4068
<210> 34
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自轮状病毒A Rotarix株的VP4的氨基酸序列
<400> 34
Met Ala Ser Leu Ile Tyr Arg Gln Leu Leu Thr Asn Ser Tyr Ser Val
1 5 10 15
Asp Leu His Asp Glu Ile Glu Gln Ile Gly Ser Glu Lys Thr Gln Asn
20 25 30
Val Thr Ile Asn Pro Gly Pro Phe Ala Gln Thr Arg Tyr Ala Pro Val
35 40 45
Asn Trp Asp His Gly Glu Ile Asn Asp Ser Thr Thr Val Glu Pro Ile
50 55 60
Leu Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Thr Thr Phe Thr Pro Pro Asn Asp Tyr
65 70 75 80
Trp Ile Leu Ile Asn Ser Asn Thr Asn Gly Val Val Tyr Glu Ser Thr
85 90 95
Asn Asn Ser Asp Phe Trp Thr Ala Val Val Ala Ile Glu Pro His Val
100 105 110
Asn Pro Val Asp Arg Gln Tyr Met Ile Phe Gly Glu Ser Lys Gln Phe
115 120 125
Asn Val Ser Asn Asp Ser Asn Lys Trp Lys Phe Leu Glu Met Phe Arg
130 135 140
Ser Ser Ser Gln Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Arg Thr Leu Thr Ser Asp
145 150 155 160
Thr Arg Leu Val Gly Ile Phe Lys Tyr Gly Gly Arg Val Trp Thr Phe
165 170 175
His Gly Glu Thr Pro Arg Ala Thr Thr Asp Ser Ser Ser Thr Ala Asn
180 185 190
Leu Asn Asn Ile Ser Ile Thr Ile His Ser Glu Phe Tyr Ile Ile Pro
195 200 205
Arg Ser Gln Glu Ser Lys Cys Asn Glu Tyr Ile Asn Asn Gly Leu Pro
210 215 220
Pro Ile Gln Asn Thr Arg Asn Val Val Pro Leu Pro Leu Ser Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ile Gln Tyr Lys Arg Ala Gln Val Asn Glu Asp Ile Ile Val Ser
245 250 255
Lys Thr Ser Leu Trp Lys Glu Met Gln Tyr Asn Arg Asp Ile Ile Ile
260 265 270
Arg Phe Lys Phe Gly Asn Ser Ile Val Lys Met Gly Gly Leu Gly Tyr
275 280 285
Lys Trp Ser Glu Ile Ser Tyr Lys Ala Ala Asn Tyr Gln Tyr Asn Tyr
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Glu Gln Val Thr Ala His Thr Thr Cys Ser Val Asn
305 310 315 320
Gly Val Asn Asn Phe Ser Tyr Asn Gly Gly Phe Leu Pro Thr Asp Phe
325 330 335
Gly Ile Ser Arg Tyr Glu Val Ile Lys Glu Asn Ser Tyr Val Tyr Val
340 345 350
Asp Tyr Trp Asp Asp Ser Lys Ala Phe Arg Asn Met Val Tyr Val Arg
355 360 365
Ser Leu Ala Ala Asn Leu Asn Ser Val Lys Cys Thr Gly Gly Ser Tyr
370 375 380
Tyr Phe Ser Ile Pro Val Gly Ala Trp Pro Val Met Asn Gly Gly Ala
385 390 395 400
Val Ser Leu His Phe Ala Gly Val Thr Leu Ser Thr Gln Phe Thr Asp
405 410 415
Phe Val Ser Leu Asn Ser Leu Arg Phe Arg Phe Ser Leu Thr Val Asp
420 425 430
Glu Pro Pro Phe Ser Ile Leu Arg Thr Arg Thr Val Asn Leu Tyr Gly
435 440 445
Leu Pro Ala Ala Asn Pro Asn Asn Gly Asn Glu Tyr Tyr Glu Ile Ser
450 455 460
Gly Arg Phe Ser Leu Ile Ser Leu Val Pro Thr Asn Asp Asp Tyr Gln
465 470 475 480
Thr Pro Ile Met Asn Ser Val Thr Val Arg Gln Asp Leu Glu Arg Gln
485 490 495
Leu Thr Asp Leu Arg Glu Glu Phe Asn Ser Leu Ser Gln Glu Ile Ala
500 505 510
Met Ala Gln Leu Ile Asp Leu Ala Leu Leu Pro Leu Asp Met Phe Ser
515 520 525
Met Phe Ser Gly Ile Lys Ser Thr Ile Asp Leu Thr Lys Ser Met Ala
530 535 540
Thr Ser Val Met Lys Lys Phe Arg Lys Ser Lys Leu Ala Thr Ser Ile
545 550 555 560
Ser Glu Met Thr Asn Ser Leu Ser Asp Ala Ala Ser Ser Ala Ser Arg
565 570 575
Asn Val Ser Ile Arg Ser Asn Leu Ser Ala Ile Ser Asn Trp Thr Asn
580 585 590
Val Ser Asn Asp Val Ser Asn Val Thr Asn Ser Leu Asn Asp Ile Ser
595 600 605
Thr Gln Thr Ser Thr Ile Ser Lys Lys Leu Arg Leu Lys Glu Met Ile
610 615 620
Thr Gln Thr Glu Gly Met Ser Phe Asp Asp Ile Ser Ala Ala Val Leu
625 630 635 640
Lys Thr Lys Ile Asp Met Ser Thr Gln Ile Gly Lys Asn Thr Leu Pro
645 650 655
Asp Ile Val Thr Glu Ala Ser Glu Lys Phe Ile Pro Lys Arg Ser Tyr
660 665 670
Arg Ile Leu Lys Asp Asp Glu Val Met Glu Ile Asn Thr Glu Gly Lys
675 680 685
Phe Phe Ala Tyr Lys Ile Asn Thr Phe Asp Glu Val Pro Phe Asp Val
690 695 700
Asn Lys Phe Ala Glu Leu Val Thr Asp Ser Pro Val Ile Ser Ala Ile
705 710 715 720
Ile Asp Phe Lys Thr Leu Lys Asn Leu Asn Asp Asn Tyr Gly Ile Thr
725 730 735
Arg Thr Glu Ala Leu Asn Leu Ile Lys Ser Asn Pro Asn Met Leu Arg
740 745 750
Asn Phe Ile Asn Gln Asn Asn Pro Ile Ile Arg Asn Arg Ile Glu Gln
755 760 765
Leu Ile Leu Gln Cys Lys Leu
770 775
<210> 35
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF TrSP+Rtx VP7j opt s1+3c
<400> 35
aaatttgtcg ggcccatgga ttatattatc tatcgtagcc tcctcatcta 50
<210> 36
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF Rtx VP7 opt s1至4r
<400> 36
actaaagaaa ataggcctct aaacgcgata atagaaggct gctgagttca ggga 54
<210> 37
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 轮状病毒A VP7的优化编码序列
<400> 37
atgtacggca tcgagtatac aacaatttta attttcctga tttccatcat tctgttaaac 60
tacatcctta agtccgtgac cagaattatg gattatatta tctatcgtag cctcctcatc 120
tacgtggccc tttttgccct gaccagggcc cagaactatg gcctgaactt accaatcacc 180
ggttcaatgg ataccgttta cgctaattcc actcaagagg ggatatttct gacaagtacc 240
ctgtgcctgt attatccaac agaagcctct acccagatca atgatgggga gtggaaggat 300
agtctctcac agatgttcct aaccaagggc tggcccaccg gttccgtcta cttcaaggaa 360
tactctagta ttgtcgactt ctcagttgac ccccagcttt attgcgacta caacctggta 420
cttatgaaat acgaccagaa cctggagctg gatatgtccg agctggctga cctgatcctc 480
aatgagtggc tgtgcaaccc catggacatc acattatatt actaccagca gtctggagaa 540
tccaacaagt ggatcagtat gggctcaagt tgcaccgtga aggtgtgtcc cttgaacacc 600
caaatgctgg gcattggttg tcagacaact aatgtggatt cgtttgaaat ggtagccgaa 660
aacgagaagc tggctatagt ggacgtagtc gatgggatta accacaagat caatctgact 720
accaccactt gtaccatcag aaactgtaaa aagctcggcc cccgggagaa cgtcgccgtg 780
atccaggtgg gggggagcaa tgtgctcgac attactgccg accctaccac caatccacag 840
acggaacgga tgatgagagt caactggaag aaatggtggc aggtctttta taccattgtg 900
gactacatta accagattgt gcaagtcatg agtaaacggt ccagatccct gaactcagca 960
gccttctatt atcgcgttta g 981
<210> 38
<211> 2634
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1734的表达盒
<400> 38
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggat tatattatct atcgtagcct cctcatctac gtggcccttt ttgccctgac 1320
cagggcccag aactatggcc tgaacttacc aatcaccggt tcaatggata ccgtttacgc 1380
taattccact caagagggga tatttctgac aagtaccctg tgcctgtatt atccaacaga 1440
agcctctacc cagatcaatg atggggagtg gaaggatagt ctctcacaga tgttcctaac 1500
caagggctgg cccaccggtt ccgtctactt caaggaatac tctagtattg tcgacttctc 1560
agttgacccc cagctttatt gcgactacaa cctggtactt atgaaatacg accagaacct 1620
ggagctggat atgtccgagc tggctgacct gatcctcaat gagtggctgt gcaaccccat 1680
ggacatcaca ttatattact accagcagtc tggagaatcc aacaagtgga tcagtatggg 1740
ctcaagttgc accgtgaagg tgtgtccctt gaacacccaa atgctgggca ttggttgtca 1800
gacaactaat gtggattcgt ttgaaatggt agccgaaaac gagaagctgg ctatagtgga 1860
cgtagtcgat gggattaacc acaagatcaa tctgactacc accacttgta ccatcagaaa 1920
ctgtaaaaag ctcggccccc gggagaacgt cgccgtgatc caggtggggg ggagcaatgt 1980
gctcgacatt actgccgacc ctaccaccaa tccacagacg gaacggatga tgagagtcaa 2040
ctggaagaaa tggtggcagg tcttttatac cattgtggac tacattaacc agattgtgca 2100
agtcatgagt aaacggtcca gatccctgaa ctcagcagcc ttctattatc gcgtttagag 2160
gcctattttc tttagtttga atttactgtt attcggtgtg catttctatg tttggtgagc 2220
ggttttctgt gctcagagtg tgtttatttt atgtaattta atttctttgt gagctcctgt 2280
ttagcaggtc gtcccttcag caaggacaca aaaagatttt aattttatta aaaaaaaaaa 2340
aaaaaaagac cgggaattcg atatcaagct tatcgacctg cagatcgttc aaacatttgg 2400
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt 2460
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga 2520
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata 2580
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agat 2634
<210> 39
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TrSp-VP7的氨基酸序列
<400> 39
Met Asp Tyr Ile Ile Tyr Arg Ser Leu Leu Ile Tyr Val Ala Leu Phe
1 5 10 15
Ala Leu Thr Arg Ala Gln Asn Tyr Gly Leu Asn Leu Pro Ile Thr Gly
20 25 30
Ser Met Asp Thr Val Tyr Ala Asn Ser Thr Gln Glu Gly Ile Phe Leu
35 40 45
Thr Ser Thr Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile
50 55 60
Asn Asp Gly Glu Trp Lys Asp Ser Leu Ser Gln Met Phe Leu Thr Lys
65 70 75 80
Gly Trp Pro Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Ser Ser Ile Val
85 90 95
Asp Phe Ser Val Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Leu Val Leu
100 105 110
Met Lys Tyr Asp Gln Asn Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp
115 120 125
Leu Ile Leu Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr
130 135 140
Tyr Tyr Gln Gln Ser Gly Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Ser
145 150 155 160
Ser Cys Thr Val Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Met Leu Gly Ile
165 170 175
Gly Cys Gln Thr Thr Asn Val Asp Ser Phe Glu Met Val Ala Glu Asn
180 185 190
Glu Lys Leu Ala Ile Val Asp Val Val Asp Gly Ile Asn His Lys Ile
195 200 205
Asn Leu Thr Thr Thr Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly
210 215 220
Pro Arg Glu Asn Val Ala Val Ile Gln Val Gly Gly Ser Asn Val Leu
225 230 235 240
Asp Ile Thr Ala Asp Pro Thr Thr Asn Pro Gln Thr Glu Arg Met Met
245 250 255
Arg Val Asn Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Ile Val Asp
260 265 270
Tyr Ile Asn Gln Ile Val Gln Val Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu
275 280 285
Asn Ser Ala Ala Phe Tyr Tyr Arg Val
290 295
<210> 40
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF WA NSP4 S1+3C
<400> 40
aaatttgtcg ggcccatgga taagcttgcc gacctcaact acacattgag tg 52
<210> 41
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF WA NSP4 S1至 4r
<400> 41
actaaagaaa ataggccttc acatggatgc agtcacttct gacggttcat atgga 55
<210> 42
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自WA株的轮状病毒A NSP4的编码序列
<400> 42
atggataagc ttgccgacct caactacaca ttgagtgtaa tcacttcaat gaatgacaca 60
ttgcattcta taattcaaga tcctggaatg gcgtattttc tatatattgc atctgttcta 120
acagttttgt tcacattaca taaagcttca attccaacca tgaaaatagc attgaaaaca 180
tcaaaatgtt catataaagt gattaaatat tgtatagtca cgatcattaa tactctttta 240
aaattggctg gatataaaga gcaggttact acaaaagacg aaattgagca acagatggac 300
agaattgtga aagagatgag acgtcagctg gagatgattg ataaactaac tactcgtgaa 360
attgaacagg ttgaattgct taaacgtata catgacaacc tgataactag accagttgac 420
gttatagata tgtcgaagga attcaatcag aaaaacatca aaacgctaga tgaatgggag 480
agtggaaaaa atccatatga accgtcagaa gtgactgcat ccatgtga 528
<210> 43
<211> 2268
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1706的表达盒
<400> 43
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaacg ttttctttca ctgaagcgaa atcaaagatc tctttgtgga cacgtagtgc 960
ggcgccatta aataacgtgt acttgtccta ttcttgtcgg tgtggtcttg ggaaaagaaa 1020
gcttgctgga ggctgctgtt cagccccata cattacttgt tacgattctg ctgactttcg 1080
gcgggtgcaa tatctctact tctgcttgac gaggtattgt tgcctgtact tctttcttct 1140
tcttcttgct gattggttct ataagaaatc tagtattttc tttgaaacag agttttcccg 1200
tggttttcga acttggagaa agattgttaa gcttctgtat attctgccca aatttgtcgg 1260
gcccatggat aagcttgccg acctcaacta cacattgagt gtaatcactt caatgaatga 1320
cacattgcat tctataattc aagatcctgg aatggcgtat tttctatata ttgcatctgt 1380
tctaacagtt ttgttcacat tacataaagc ttcaattcca accatgaaaa tagcattgaa 1440
aacatcaaaa tgttcatata aagtgattaa atattgtata gtcacgatca ttaatactct 1500
tttaaaattg gctggatata aagagcaggt tactacaaaa gacgaaattg agcaacagat 1560
ggacagaatt gtgaaagaga tgagacgtca gctggagatg attgataaac taactactcg 1620
tgaaattgaa caggttgaat tgcttaaacg tatacatgac aacctgataa ctagaccagt 1680
tgacgttata gatatgtcga aggaattcaa tcagaaaaac atcaaaacgc tagatgaatg 1740
ggagagtgga aaaaatccat atgaaccgtc agaagtgact gcatccatgt gaaggcctat 1800
tttctttagt ttgaatttac tgttattcgg tgtgcatttc tatgtttggt gagcggtttt 1860
ctgtgctcag agtgtgttta ttttatgtaa tttaatttct ttgtgagctc ctgtttagca 1920
ggtcgtccct tcagcaagga cacaaaaaga ttttaatttt attaaaaaaa aaaaaaaaaa 1980
agaccgggaa ttcgatatca agcttatcga cctgcagatc gttcaaacat ttggcaataa 2040
agtttcttaa gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg 2100
aattacgtta agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt 2160
tttatgatta gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc 2220
gcaaactagg ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagat 2268
<210> 44
<211> 175
<212> PRT
<213> 轮状病毒
<400> 44
Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser Val Ile Thr Ser
1 5 10 15
Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro Gly Met Ala Tyr
20 25 30
Phe Leu Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe Thr Leu His Lys
35 40 45
Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Lys Thr Ser Lys Cys Ser
50 55 60
Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Ile Val Thr Ile Ile Asn Thr Leu Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys Asp Glu Ile Glu
85 90 95
Gln Gln Met Asp Arg Ile Val Lys Glu Met Arg Arg Gln Leu Glu Met
100 105 110
Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val Glu Leu Leu Lys
115 120 125
Arg Ile His Asp Asn Leu Ile Thr Arg Pro Val Asp Val Ile Asp Met
130 135 140
Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn Ile Lys Thr Leu Asp Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr Ala Ser Met
165 170 175
<210> 45
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF C160 WA VP2 opt c
<400> 45
tcgtgcttcg gcaccagtac aatggcatac cggaagagag gagcaaagcg cgaa 54
<210> 46
<211> 4540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 构建体1190
<400> 46
tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg 60
gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga atcccgggct ggtatattta tatgttgtca 120
aataactcaa aaaccataaa agtttaagtt agcaagtgtg tacattttta cttgaacaaa 180
aatattcacc tactactgtt ataaatcatt attaaacatt agagtaaaga aatatggatg 240
ataagaacaa gagtagtgat attttgacaa caattttgtt gcaacatttg agaaaatttt 300
gttgttctct cttttcattg gtcaaaaaca atagagagag aaaaaggaag agggagaata 360
aaaacataat gtgagtatga gagagaaagt tgtacaaaag ttgtaccaaa atagttgtac 420
aaatatcatt gaggaatttg acaaaagcta cacaaataag ggttaattgc tgtaaataaa 480
taaggatgac gcattagaga gatgtaccat tagagaattt ttggcaagtc attaaaaaga 540
aagaataaat tatttttaaa attaaaagtt gagtcatttg attaaacatg tgattattta 600
atgaattgat gaaagagttg gattaaagtt gtattagtaa ttagaatttg gtgtcaaatt 660
taatttgaca tttgatcttt tcctatatat tgccccatag agtcagttaa ctcattttta 720
tatttcatag atcaaataag agaaataacg gtatattaat ccctccaaaa aaaaaaaacg 780
gtatatttac taaaaaatct aagccacgta ggaggataac aggatccccg taggaggata 840
acatccaatc caaccaatca caacaatcct gatgagataa cccactttaa gcccacgcat 900
ctgtggcaca tctacattat ctaaatcaca cattcttcca cacatctgag ccacacaaaa 960
accaatccac atctttatca cccattctat aaaaaatcac actttgtgag tctacacttt 1020
gattcccttc aaacacatac aaagagaaga gactaattaa ttaattaatc atcttgagag 1080
aaaatggaac gagctataca aggaaacgac gctagggaac aagctaacag tgaacgttgg 1140
gatggaggat caggaggtac cacttctccc ttcaaacttc ctgacgaaag tccgagttgg 1200
actgagtggc ggctacataa cgatgagacg aattcgaatc aagataatcc ccttggtttc 1260
aaggaaagct ggggtttcgg gaaagttgta tttaagagat atctcagata cgacaggacg 1320
gaagcttcac tgcacagagt ccttggatct tggacgggag attcggttaa ctatgcagca 1380
tctcgatttt tcggtttcga ccagatcgga tgtacctata gtattcggtt tcgaggagtt 1440
agtatcaccg tttctggagg gtcgcgaact cttcagcatc tctgtgagat ggcaattcgg 1500
tctaagcaag aactgctaca gcttgcccca atcgaagtgg aaagtaatgt atcaagagga 1560
tgccctgaag gtactcaaac cttcgaaaaa gaaagcgagt aagttaaaat gcttcttcgt 1620
ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa 1680
tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta attcatttac 1740
ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga agacctgccg 1800
cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac aactttataa 1860
gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt 1920
tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat atcatcccct 1980
ttgataaatg atagtacacc aattaggaag gagcatgctc gcctaggaga ttgtcgtttc 2040
ccgccttcag tttgcaagct gctctagccg tgtagccaat acgcaaaccg cctctccccg 2100
cgcgttggga attactagcg cgtgtcgaca agcttgcatg ccggtcaaca tggtggagca 2160
cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 2220
tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 2280
ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 2340
cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 2400
cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 2460
ggattgatgt gataacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga 2520
tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 2580
cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 2640
aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 2700
tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 2760
cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 2820
tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca 2880
tttggagagg tattaaaatc ttaataggtt ttgataaaag cgaacgtggg gaaacccgaa 2940
ccaaaccttc ttctaaactc tctctcatct ctcttaaagc aaacttctct cttgtctttc 3000
ttgcgtgagc gatcttcaac gttgtcagat cgtgcttcgg caccgcggat ggcgaaaaac 3060
gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgcc 3120
tgcaggctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat ccactggccc ctggatctgc 3180
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aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt 3840
gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca 3900
gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc 3960
gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 4020
tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 4080
atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 4140
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ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 4380
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<210> 47
<211> 4056
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1108的表达盒
<400> 47
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
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ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
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tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
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atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
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acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gcataccgga agagaggagc aaagcgcgaa aacctgccgc aacagaacga 960
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tttgcaaaaa acaataccta catttgagtc caaagaaagt atcctcaaga agcttgaaga 1260
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gctccctata tatcgcgcca atggcgagaa ggagctacgc aaccggtggt actggaagtt 1380
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caaaaatagc agagacgccg gcaaagttgt cgactctgag actgccaata tttgtgatgc 1560
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cttcaattac ataccagaga ggataaggaa tgacgtgaat tacatcctga acatggatat 1800
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tcacgataat tttgagtccc tgtgggatac catcacaaca tccaactaca ttctggccag 1920
gtccgtcgtt cccgatttga aggagaagga gctggtctcc accgaagcac agatccagaa 1980
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gctggcgatc atcaacacca tcgtgtatcc agcattcgga atgcagagaa tgcattaccg 2280
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agcattgatg caactcagca gacagcagtt ccccacgatg cctgtggatt acaaacggag 2520
catccaacgg ggcattctgc ttctctccaa taggctgggg cagcttgtcg acttaacccg 2580
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gctcaggaaa gttgacacac tgaagcccat actgtacaaa ataaactcgg attccaatga 3360
cttttacctt gtggccaact acgactggat ccccacaagt acaactaagg tctacaaaca 3420
ggtgccacaa ccattcgact ttagagccag catgcacatg ctgacttcta accttacgtt 3480
taccgtctac tctgacctac tgtcatttgt ttcagcggac acggtagagc ccattaacgc 3540
agtcgcattc gacaatatgc gaataatgaa cgagctttaa aggcctattt tctttagttt 3600
gaatttactg ttattcggtg tgcatttcta tgtttggtga gcggttttct gtgctcagag 3660
tgtgtttatt ttatgtaatt taatttcttt gtgagctcct gtttagcagg tcgtcccttc 3720
agcaaggaca caaaaagatt ttaattttat taaaaaaaaa aaaaaaaaag accgggaatt 3780
cgatatcaag cttatcgacc tgcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga 3840
ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag 3900
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gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat 4020
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<210> 48
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF C160 WA VP6 opt c
<400> 48
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<210> 49
<211> 2577
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1128的表达盒
<400> 49
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
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aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
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taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
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agcggttttc tgtgctcaga gtgtgtttat tttatgtaat ttaatttctt tgtgagctcc 2220
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<210> 50
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF C160 Rtx VP4 opt c
<400> 50
tcgtgcttcg gcaccagtac aatggctagc ctgatctaca gacaactctt gaccaattc 59
<210> 51
<211> 3711
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1178的表达盒
<400> 51
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gctagcctga tctacagaca actcttgacc aattcatatt ctgtggatct 960
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accttttgct cagacccgct atgcccctgt gaattgggat cacggagaaa tcaacgacag 1080
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ttctcggtct atccagtata agagagcaca agtgaatgag gacattattg tgagcaagac 1680
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cagccggtat gaagtcatca aggaaaattc ttatgtgtac gtagattact gggatgatag 1980
caaagcgttc cgcaacatgg tgtatgttag gagcctggct gctaatctca attctgtgaa 2040
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agatctgcgg gaagaattca attctctcag tcaggagatt gcaatggccc aattgataga 2460
tcttgcccta ctgcctctcg atatgtttag tatgttctcc ggcatcaaat caactataga 2520
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gagcatatca gaaatgacga actctctgag tgatgcagca tcatcagcgt cacgcaacgt 2640
ttccattcgg tcgaatctca gcgccatcag caactggaca aacgtgtcca acgacgtcag 2700
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cgtaaccgaa gcctccgaaa agtttatccc taagcgcagc tacagaatat tgaaagatga 2940
cgaggtcatg gagatcaaca cagaagggaa gttcttcgct tataagatca acacctttga 3000
cgaggttccg tttgacgtca ataagtttgc agagctcgtg acagatagtc cagtgatttc 3060
tgccatcatt gactttaaga ctttgaagaa cctgaacgac aactatggaa taacacggac 3120
cgaagcgttg aacctcatta agtccaatcc caatatgttg cgcaatttca ttaaccagaa 3180
caatccaatc ataagaaata ggattgagca attaatcctg caatgtaaac tctgaaggcc 3240
tattttcttt agtttgaatt tactgttatt cggtgtgcat ttctatgttt ggtgagcggt 3300
tttctgtgct cagagtgtgt ttattttatg taatttaatt tctttgtgag ctcctgttta 3360
gcaggtcgtc ccttcagcaa ggacacaaaa agattttaat tttattaaaa aaaaaaaaaa 3420
aaaagaccgg gaattcgata tcaagcttat cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa 3480
taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 3540
ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 3600
gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 3660
cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga t 3711
<210> 52
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IF C160 TrSP+ Rtx VP7 opt c
<400> 52
tcgtgcttcg gcaccagtac aatggattat attatctatc gtagcctcct catcta 56
<210> 53
<211> 2277
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编号1199的表达盒
<400> 53
gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca 60
gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga 120
ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc 180
tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt 240
ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc 300
acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg agcacgacac acttgtctac 360
tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg caattgagac ttttcaacaa 420
agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg 480
aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc 540
atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc 600
atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatatc 660
tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt cgcaagaccc ttcctctata 720
taaggaagtt catttcattt ggagaggtat taaaatctta ataggttttg ataaaagcga 780
acgtggggaa acccgaacca aaccttcttc taaactctct ctcatctctc ttaaagcaaa 840
cttctctctt gtctttcttg cgtgagcgat cttcaacgtt gtcagatcgt gcttcggcac 900
cagtacaatg gattatatta tctatcgtag cctcctcatc tacgtggccc tttttgccct 960
gaccagggcc cagaactatg gcctgaactt accaatcacc ggttcaatgg ataccgttta 1020
cgctaattcc actcaagagg ggatatttct gacaagtacc ctgtgcctgt attatccaac 1080
agaagcctct acccagatca atgatgggga gtggaaggat agtctctcac agatgttcct 1140
aaccaagggc tggcccaccg gttccgtcta cttcaaggaa tactctagta ttgtcgactt 1200
ctcagttgac ccccagcttt attgcgacta caacctggta cttatgaaat acgaccagaa 1260
cctggagctg gatatgtccg agctggctga cctgatcctc aatgagtggc tgtgcaaccc 1320
catggacatc acattatatt actaccagca gtctggagaa tccaacaagt ggatcagtat 1380
gggctcaagt tgcaccgtga aggtgtgtcc cttgaacacc caaatgctgg gcattggttg 1440
tcagacaact aatgtggatt cgtttgaaat ggtagccgaa aacgagaagc tggctatagt 1500
ggacgtagtc gatgggatta accacaagat caatctgact accaccactt gtaccatcag 1560
aaactgtaaa aagctcggcc cccgggagaa cgtcgccgtg atccaggtgg gggggagcaa 1620
tgtgctcgac attactgccg accctaccac caatccacag acggaacgga tgatgagagt 1680
caactggaag aaatggtggc aggtctttta taccattgtg gactacatta accagattgt 1740
gcaagtcatg agtaaacggt ccagatccct gaactcagca gccttctatt atcgcgttta 1800
gaggcctatt ttctttagtt tgaatttact gttattcggt gtgcatttct atgtttggtg 1860
agcggttttc tgtgctcaga gtgtgtttat tttatgtaat ttaatttctt tgtgagctcc 1920
tgtttagcag gtcgtccctt cagcaaggac acaaaaagat tttaatttta ttaaaaaaaa 1980
aaaaaaaaaa gaccgggaat tcgatatcaa gcttatcgac ctgcagatcg ttcaaacatt 2040
tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 2100
tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 2160
agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 2220
atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagat 2277

Claims (38)

1.在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法，其包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生RLP。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种核酸还包含编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含一种核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白、所述第二轮状病毒蛋白、所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白、所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含两种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
7.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白和所述第四轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含三种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
9.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含四种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；和第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列。
10.如权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种核酸包含五种核酸：第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列；和第五核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述宿主或宿主细胞包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物、植物的一部分或植物细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述宿主或宿主细胞由植物、植物的一部分或植物细胞组成。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述植物是本氏烟(Nicotiana benthamiana)。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸序列可操作地连接到一种或多种表达增强子。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述表达增强子选自：CPMV HT、CPMV 160、CPMV160+和CPMV HT+。
16.如权利要求1、2或3中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：
c)收获所述宿主或宿主细胞，和
d)从所述宿主或宿主细胞中纯化所述RLP，其中所述RLP的大小范围为70-100nm。
17.在宿主或宿主细胞中产生轮状病毒样颗粒(RLP)的方法，其包括：
a)将一种或多种核酸引入到所述宿主或宿主细胞中，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生RLP。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述一种或多种核酸还包含编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
20.如权利要求19所述的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含两种核酸：
i)第一核酸，其包含编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码第二轮状病毒蛋白、第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列、第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列；或者
ii)第一核酸，其包含编码第一轮状病毒蛋白和第二轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列；和第二核酸，其包含编码第三轮状病毒蛋白、第四轮状病毒蛋白和第五轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列、第四核苷酸序列和第五核苷酸序列；并且
其中引入到所述宿主或宿主细胞中的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量的比例为1:0.8至1:2。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一轮状病毒蛋白是NSP4，以及所述第二轮状病毒蛋白、所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白是VP2、VP4、VP6和VP7。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述比例为1:1。
23.如权利要求19所述的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含三种核酸：
i)第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白和所述第二轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白和所述第四轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；或者
ii)第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列；和第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白、所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；
其中引入到所述宿主或宿主细胞中的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量，以及所述第三核酸的量的比例为1:1:1。
24.如权利要求19所述的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含四种核酸：
第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；和第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白和所述第五轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列；
其中引入到所述宿主或宿主细胞中的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量、所述第三核酸的量，以及所述第四核酸的量的比例为1:1:1:1。
25.如权利要求19所述的方法，其中在引入步骤(步骤a)中，所述一种或多种核酸包含五种核酸：
第一核酸，其包含编码所述第一轮状病毒蛋白的所述第一核苷酸序列；第二核酸，其包含编码所述第二轮状病毒蛋白的所述第二核苷酸序列；第三核酸，其包含编码所述第三轮状病毒蛋白的所述第三核苷酸序列；第四核酸，其包含编码所述第四轮状病毒蛋白的所述第四核苷酸序列；和第五核酸，其包含编码所述第五轮状病毒蛋白的所述第五核苷酸序列；并且
引入到所述宿主或宿主细胞中的所述第一核酸的量与所述第二核酸的量、所述第三核酸的量、所述第四核酸的量，以及所述第五核酸的量的比例为1:1:1:1:1。
26.通过权利要求3或19所述的方法产生的RLP，其中所述RLP是包含轮状病毒蛋白的三层RLP，所述轮状病毒蛋白由VP2、VP4、VP6和VP7组成。
27.组合物，其包含用于在对象中诱导免疫应答的有效剂量的权利要求26所述的RLP，以及药学上可接受的载体。
28.诱导对象中针对轮状病毒感染的免疫的方法，其包括将权利要求27所述的组合物施用于对象。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述组合物经口、皮内、鼻内、肌内、腹腔内、静脉内或皮下施用于对象。
30.植物物质，其包含通过权利要求1、2或3所述的方法产生的RLP。
31.植物物质，其包含通过权利要求17、18或19所述的方法产生的RLP。
32.增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法，其包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比时，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
33.增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法，其包括：
a)将一种或多种核酸引入到宿主或宿主细胞中，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列和编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列和所述第三核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7或VP4之一；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得NSP4、VP6中的每一种以及VP7或VP4被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比时，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述一种或多种核酸还包含编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列编码轮状病毒蛋白NSP4，所述第二核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP6，以及所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4或VP7，并且其中从所述一种或多种核酸表达NSP4、VP6中的每一种以及VP2、VP4和VP7中的两种。
35.如权利要求32或33所述的方法，其中所述一种或多种核酸还包含编码第五轮状病毒蛋白的第五核苷酸序列，所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列、所述第四核苷酸序列和所述第五核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP2、VP4、VP6、VP7或NSP4之一，并且其中从所述一种或多种核酸表达VP2、VP4、VP6、VP7和NSP4中的每一种。
36.如权利要求32、33、34或35所述的方法，其还包括以下步骤：
c)收获所述宿主或宿主细胞，和
d)从所述宿主或宿主细胞中纯化所述RLP，其中所述RLP的大小范围为70-100nm。
37.NSP4用于增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入在昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物、植物的一部分或植物细胞中产生的轮状病毒样颗粒(RLP)的表面上的用途。
38.增加VP4、VP7、或VP4和VP7两者并入轮状病毒样颗粒(RLP)中的方法，其包括：
a)提供包含一种或多种核酸的宿主或宿主细胞，所述一种或多种核酸包含：
编码第一轮状病毒蛋白的第一核苷酸序列、编码第二轮状病毒蛋白的第二核苷酸序列、编码第三轮状病毒蛋白的第三核苷酸序列和编码第四轮状病毒蛋白的第四核苷酸序列；所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和第四核苷酸序列可操作地连接到在所述宿主或宿主细胞中有活性的一种或多种调控区；并且
所述第一核苷酸序列、所述第二核苷酸序列、所述第三核苷酸序列和所述第四核苷酸序列编码轮状病毒蛋白VP7、VP4、NSP4之一以及VP2或VP6；
b)在允许表达所述一种或多种核酸的条件下孵育所述宿主或宿主细胞，使得VP7、VP4、NSP4中的每一种以及VP2或VP6被表达，从而产生当与在相同条件下由表达不含NSP4的一种或多种核酸的第二宿主或宿主细胞产生的VP4或VP7的水平相比，具有增强的VP4、VP7、或VP4和VP7两者的水平的RLP。
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