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CN107208032A - 部分裂解和测定的方法 - Google Patents

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CN107208032A
CN107208032A CN201580062378.7A CN201580062378A CN107208032A CN 107208032 A CN107208032 A CN 107208032A CN 201580062378 A CN201580062378 A CN 201580062378A CN 107208032 A CN107208032 A CN 107208032A
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A.P.舒伯
S.黑希特
E.科夫曼
P.麦克莱恩
H.B.考夫曼
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Hologic Inc
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Abstract

本公开内容描述用部分裂解过程处理包含细胞的样品的方法。将细胞暴露于过程例如裂解混合物中一些细胞的珠磨。该过程产生适合于细胞形态学筛查和基因筛查的所得样品混合物。部分裂解样品的第一部分可固定在载玻片上并观察非典型细胞和细胞学异常。部分裂解样品的第二部分可筛查已知与宫颈癌风险相关的基因标志。出人意外地来自部分裂解过程的混合物中小珠的存在不干扰载玻片处理或细胞分析。所述方法对宫颈筛查特别有用，其中细胞学和基因筛查的组合呈现更加完整的宫颈健康的图画。公开的方法简化需要两种类型测定的方案的诊断过程，而不折中筛查准确度。

Description

部分裂解和测定的方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2014年9月17日提交的美国临时申请序列号62/051,672的权益和优先权，所述临时申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。
发明领域
本发明涉及用于处理样品用于细胞形态学筛选和筛查分子组分二者的方法。
背景
Papanicolaou (Pap)检验是一种广泛使用的宫颈筛查方法，其检测宫颈和子宫内膜细胞中的异常，包括癌前和癌病变。由于其简单、微创和便宜，Pap检验被广泛使用。该检验通常涉及使用采集装置自宫颈取得细胞样品，和测定细胞的某些指示人类乳头状瘤病毒(HPV)存在情况的诊断特征。宫颈异常的早期检测对有效治疗是必要的，并且自其在1955年引入以来在美国定期Pap筛查已将年度死亡数减少60%以上(National Cancer Institute(国家癌症研究所))。
为了获取宫颈样品，临床医生通常使用刷子或刮勺自宫颈和宫颈内管采集细胞。然后将试样直接涂抹在玻璃载玻片上(即，常规“Pap涂片”)，或采集至液基细胞学培养基(LBC)中。伴随LBC，将采集装置浸入保藏培养基中，例如从Hologic, Inc. (Bedford, MA)可得的ThinPrep® PreservCyt®溶液，并搅拌以释放细胞至培养基中。暴露于LBC培养基固定细胞，使它们能够评估细胞形态学。有用的LBC培养基的更大细节可见于美国专利申请号6,531,317，其通过引用以其整体结合到本文中。
当前的医护标准为固定一部分采集的细胞在载玻片上用于评估细胞形态学。载玻片可通过手工制备(“Pap涂片”)，然而优良的结果可用自动化系统获得，例如Hologic’sThinPrep® Pap检验与ThinPrep®成像系统相组合。由于改善的准确度和增加的疾病检测，该方法学优于常规Pap涂片(引用- Surveillance, Epidemiology, and End Results(SEER) Program(监测、流行病学和最终结果（SEER）计划). SEER Database: Incidence –SEER 9 Regs Public-Use, Nov. 2004 Sub (1973-2002), National Cancer Institute(国家癌症研究所)，DCCPS，Surveillance Research Program, Cancer StatisticsBranch (监测研究计划，癌症统计学分支), 2005年4月发布，基于2004年11月的提交)。一旦细胞固定，可筛查样品的非典型鳞状细胞、低级鳞状上皮内病变、高级鳞状上皮内病变、鳞状细胞癌、非典型腺细胞、腺癌和其它细胞学异常。参见，例如，Bethesda System forReporting Cervical Cytology (用于报告宫颈细胞学的Bethesda系统)。
基因筛查技术的最新进展已使得可能筛查指示癌症或感染的基因变化。例如，宫颈样品可采集并筛查用于使用基因测定例如杂交测定、多重PCR或直接测序分子诊断。样品可针对基因标志数据库筛查通过分型HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-68、HPV-73或HPV-82以鉴定妇女的宫颈癌风险。筛查可基于DNA、RNA或其一些组合。用于诊断筛查HPV的商业系统从Hologic, Inc.可得，例如，Cervista® HPV或APTIMA® HPV测定。
尽管在美国宫颈筛查的医护标准依旧为Pap检验，但美国食品药品监督管理局最近为基因检验单独用于筛查妇女宫颈癌开辟了道路。然而，团体例如American MedicalWomen’s Association (美国医学妇女协会)已对单独基因检验而没有同时进行形态学筛查将导致当那些妇女仅仅为HPV携带者并且不具有发展宫颈癌的直接风险时太多妇女接受治疗表示关心。参见“FDA approves Roche Genetic Test as an Alternative to PapSmear for Cervical Cancer Screening (FDA批准罗氏基因检验作为Pap涂片替代用于宫颈癌筛查),” Associated Press，2014年4月24日，其通过引用以其整体结合到本文中。
发明概述
本公开内容描述用部分裂解过程处理样品的方法，其产生适合于细胞形态学筛查和筛查分子组分例如核酸、病原体、蛋白质和其它疾病标志二者的所得样品混合物。在一些情况下，可将核酸测序并与疾病的基因标志比较。在优选的实施方案中，所述方法包括通过珠磨，即，与大量小珠一起摇动样品，机械剪切样品中的细胞。小珠的快速运动切碎细胞。所述方法涉及控制裂解程度，从而在样品中保留足够数目的全细胞以观察细胞形态学。在部分裂解过程之后，样品中的细胞结构由用户单独或联合自动化系统例如Thin Prep® Pap检验与ThinPrep®成像系统组合观察，并且样品还筛查基因标志例如高风险HPV类型。出人意外地，混合物中小珠的存在不干扰细胞学测量，例如ThinPrep®处理器或成像系统的功能，也不干扰载玻片的细胞呈现或可视化分析。
所述方法通常适用于细胞学和分子诊断的组合。特别地，方法可用于宫颈筛查，其中细胞学和基因筛查的组合呈现更加完整的宫颈健康的图像。例如，部分裂解样品的第一部分可固定在载玻片上并观察非典型细胞和细胞学异常。部分裂解样品的第二部分可筛查已知与宫颈癌风险相关的基因标志，例如，HPV的存在情况。
部分裂解方法可包括机械剪切、洗涤剂裂解、渗透裂解或其它本领域已知的方法，并且所选的技术适应避免基本上裂解样品中的所有细胞。鉴于细胞学技术领域的状态教导小心注意以维持样品的结构完整性，本公开内容叙述一种方法，其中同一样品，即，部分裂解的样品，适合于细胞学和分子诊断二者。该方法简化用于需要两种类型的筛查测定的方案的诊断过程，例如宫颈筛查。该方法是精简的，因为不需重复采集。仅有单点采集减少敏感检验环境中交叉污染的发生率。与其它分子诊断方案相比，本公开内容也提供其中分子样品在诊断过程中未受破坏的方法。该方法也允许同时测定来自同一细胞样品的细胞形态学和基因标志。
附图简述
图1显示用于使用部分裂解方法筛查样品的工作流程。
图2显示用于使用部分裂解方法筛查样品的工作流程。
图3显示用于从部分裂解方法前后比较细胞计数和可视化的实验设计的流程图。
图4显示各种适合用于机械剪切方法的针。
图5显示描述用于改进部分裂解珠磨方案的检验的样品表。
图6显示在不同珠磨持续时间之后的细胞浓度的表。
图7显示珠磨方法的不同检验的吸光度结果。
图8显示暴露于多个与石榴石小珠的混合时间的细胞的40X视图。
发明详述
本公开内容描述用部分裂解过程处理样品的方法，其产生适合于细胞形态学筛查和分子诊断二者的所得样品混合物。鉴于细胞学技术领域的状态教导小心注意维持样品的结构完整性，本公开内容叙述一种方法，其中将同一样品部分裂解以适合于细胞学和分子诊断二者。该方法简化用于需要细胞学和基因筛查二者用于彻底检查的方案的诊断过程，例如在宫颈筛查中。不同于教导在裂解前把样品分成部分的其它方法(参见，例如，Iftner等人，“Study comparing human papillomavirus (HPV) real-time multiplex PCR andHybrid Capture II INNO-LiPA v2 HPV genotyping PCR assays (比较人类乳头状瘤病毒(HPV)实时多重PCR和杂交捕获II INNO-LiPA v2 HPV基因分型PCR测定的研究),” J.Clin. Microbiol. 47(7):2106-13，2009年7月)，公开的方法对于细胞学分析和分子诊断二者均产生令人满意的结果，同时需要使用仅一种样品。
本发明提供用于宫颈筛查的有用方法，例如，因为部分裂解样品的第一部分可固定在载玻片上并观察非典型细胞和细胞学异常，并且部分裂解样品的第二部分可筛查分子组分，例如，已知与疾病例如宫颈癌风险相关的基因标志。分子组分可为可存在于生物样品中的任何无细胞组分，例如无细胞DNA、降解的蛋白质、病毒、真菌或其它化学标志。分子组分也可包括部分细胞或细胞亚结构，例如染色体、蛋白质或酶。在优选的实施方案中，分子组分为核酸，例如DNA或RNA，例如mRNA，或rRNA。
图1显示使用部分裂解方法筛查样品的工作流程100。第一步110包括获取样品。样品可为任何生物样品，包括细胞的或包含细胞的体液样品。样品可为宫颈样品、口腔样品、鼻腔样品、血液样品、羊水样品或其它生物材料。样品可用刷子、刮勺、棉签、注射器或本领域所知的其它器具采集。在步骤120中样品与生物样品防腐剂例如PreservCyt®溶液接触以创建保藏的生物样品。生物样品防腐剂可包括醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇；缓冲液例如Tris或PBS；溶液包括甲醛；或洗涤剂例如Tween-20或Triton X-100。生物样品防腐剂可用来固定保藏的生物样品中的细胞或另外制备它们用于基于细胞的分析。
保藏的生物样品在步骤130中经受部分裂解过程。部分裂解产生包含至少10%的完整细胞的混合物。在一些实施方案中，混合物包含至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的完整细胞。部分裂解可包括机械剪切、洗涤剂裂解、渗透裂解、化学变性、离心、超声、冻融或其它本领域已知的裂解技术。机械剪切包括注射器剪切、珠磨、其它本领域已知的技术或其任何组合。无论选择哪种裂解技术，其均适应于避免裂解保藏生物样品中基本上所有的细胞。本发明的方法涉及将裂解程度控制到预定水平，从而在混合物中保留足够数目的全细胞以用于观察细胞形态学。
在优选的实施方案中，所述方法包括通过珠磨机械剪切保藏生物样品中的细胞，即将保藏的生物样品与大量小珠，例如MO-BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad, CA)出售的小珠一起摇动。已知在液体介质中一起摇动细胞与小珠裂解细胞。小珠可由玻璃、陶瓷、金属、石榴石或其它本领域已知的材料制成。小珠直径可小于或等于0.1mm、0.15mm、0.25mm、0.5mm、0.7mm、1.4mm、2.38mm、2.8mm或更大。摇动可包括手动摇动、使用定轨振荡器、使用涡旋混合器或任何其它本领域已知的技术。摇动的持续时间可小于1秒、2秒、5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或更长。
在另一个实施方案中，所述方法包括通过注射器剪切部分裂解保藏生物样品中的细胞。将溶液中的细胞通过注射器针头抽吸，例如来自McMaster-Carr (Robbinsville,NJ)的在图4中画出的那些可重复使用的不锈钢针头。针头长度可小于10 mm、小于20 mm、小于30 mm、小于50 mm、小于80 mm、小于100 mm、小于200 mm或更长。针头孔径尺寸可为152 μm、203 μm、254 μm、406 μm、610 μm、686 μm或更大。溶液中的细胞可通过针头手动或使用通过外部电源驱动的泵电动机抽吸。注射器可用单次单向冲击（stroke）或用多次反复冲击抽吸。
部分裂解过程之后，一部分混合物在步骤140中用于基于细胞的分析，并且另一部分混合物在步骤150中测定分子组分。基于细胞的分析(步骤140)可通过临床医生将细胞固定在载玻片上并在显微镜下观察它们来进行。当筛查宫颈癌时，将细胞筛查鳞状细胞异常或腺细胞异常。混合物可替代地流经自动化成像机器例如与ThinPrep®成像系统组合的ThinPrep® Pap检验以检测异常。在其中使用珠磨部分裂解细胞的实施方案中，小珠不必在成像之前移除。出人意外地，混合物中小珠的存在不干扰ThinPrep®处理器或成像仪的功能，也不干扰载玻片的可视化分析。自一定持续时间的珠磨和注射器剪切制备的载玻片显示几乎无细胞碎片或降解，并且适合于基于细胞的分析。
为了使用ThinPrep®系统，用户将包含细胞的小瓶和PreservCyt®溶液，连同ThinPrep®载玻片和TransCyt®过滤器一起放置至ThinPrep®处理器中。成像仪通过旋转使混合物均匀，并且过滤器借助于轻柔的抽吸采集细胞。然后过滤器接触载玻片以转移薄层细胞至载玻片上。然后载玻片与固定剂接触，在这之后可将其染色和盖片。
对于基于细胞的分析，ThinPrep®成像仪扫描载玻片上的每一细胞和细胞簇以测量DNA含量。成像仪鉴定载玻片上最大和最暗的细胞核，突出它们用于由细胞学技术员检查，有助于集中其分析。该通过成像仪和细胞学技术员的“双重检查”筛查过程已经证明在仅手工检查之上增加疾病检测，并且将假阴性减少39%(参见How Dual Screening Works(双重筛查如何工作)，http://www.thinprep.com/hcp/imaging_system/dual_review_screening.html)。自一定持续时间的珠磨和注射器剪切制备的载玻片显示几乎无细胞碎片或降解，并且适合于观察细胞结构。
对分子组分的测定(步骤150)可包括离心所有或部分混合物。离心可在10 g、50g、100 g、200 g、300 g、600 g、1000 g、2000 g或更大的径向力下实施。离心的持续时间可为10秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟或更长。步骤150可进一步包括排出待筛查的上清液的等分试样。步骤150可进一步包括检测核酸、定量核酸、鉴定核酸、测序等。
基因筛查可通过商业系统例如来自Hologic的Cervista® HPV或APTIMA® HPV进行。Cervista® HPV使用信号放大和荧光检测检测与高风险HPV菌株有关的单个碱基对改变。Cervista® HPV使用专有的Invader™化学，其由初级反应和次级反应组成。在初级反应中，Invader™探针与病毒DNA的靶区域结合并生成重叠结构。然后该结构的瓣(flap)用专有的Cleavase®酶切割。通过该方法创建多个瓣，在次级反应中其将会与通用的荧光标记的发夹结构结合。在次级反应中，初级反应中创建的切割的瓣起探针的作用，与发夹结构的互补序列结合，也称为荧光共振能量转移(FRET)盒。次级反应利用切割的瓣和FRET盒的组合创建基于荧光的信号放大。然后荧光信号通过荧光计测量以确认高风险HPV菌株的存在(或缺失)。同时在平行反应中，当适当的DNA存在于样品中用于检验时，Cervista® HPV HR检验的独特的内部对照产生红色荧光信号。绿色荧光信号指示高风险HPV类型的存在情况。来自Hologic的APTIMA® HPV系统靶向mRNA以鉴定14种高风险HPV类型。APTIMA系统包括mRNA靶捕获、靶扩增和检测扩增产物。相似的APTIMA检验也可用于鉴定来自沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)或淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的核糖体RNA(rRNA)以帮助诊断衣原体或淋球菌泌尿生殖器感染。关于APTIMA测定的额外信息在美国专利号5,750,365、6,150,517、7,094,541和7,172,863中描述，其所有通过引用结合到本文中。
在其中方法用于宫颈筛查或其它基因筛查的实施方案中，步骤150额外地包括比较鉴定的核酸与已知标志的数据库以确定受试者是否携带已知标志。已知标志的数据库可包括用于鉴定妇女的宫颈癌风险的标志，包括HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52或HPV-68 (美国癌症协会，人类乳头状瘤病毒(HPV)，癌症、HPV检验和HPV疫苗：常被问起的问题(2013年10月22日)。可使用其它核酸生物标志，包括下文所描述的那些。下文所描述的核酸扩增、检测和测序的方法也可用于图1中所描绘方法的实施方案。
图2显示使用部分裂解方法筛查样品的工作流程200。第一步110包括采集样品。样品可为任何生物样品，包括细胞的或包含细胞的体液样品。样品可为宫颈样品、口腔样品、鼻腔样品、血液样品、羊水样品或其它生物材料。样品可用刷子、刮勺、棉签、注射器或其它本领域已知的器具采集。在步骤120中样品与生物样品防腐剂例如 PreservCyt®溶液接触以创建保藏的生物样品。生物样品防腐剂可包括醇，例如甲醇、乙醇或异丙醇；缓冲液例如Tris或PBS；或洗涤剂例如Tween-20或Triton X-100。生物样品防腐剂可有助于固定保藏生物样品中的细胞或另外制备它们用于基于细胞的分析。
保藏的生物样品在步骤130中经受部分裂解过程。部分裂解产生包含至少10%的完整细胞的混合物。在一些实施方案中，混合物包含至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的完整细胞。部分裂解可包括机械剪切、洗涤剂裂解、渗透裂解、化学变性、离心、超声、冻融或其它本领域已知的裂解技术。机械剪切包括注射器剪切、珠磨、其它本领域已知的技术或其任何组合。无论选择哪种裂解技术，其均适应于避免裂解保藏生物样品中基本上所有的细胞。本公开内容的方法涉及控制裂解程度，从而在混合物中保留足够数目的全细胞以用于观察细胞形态学。
在优选的实施方案中，所述方法包括在通过珠磨机械剪切保藏生物样品中的细胞，即将保藏的生物样品与大量小珠，例如MO-BIO Laboratories, Inc. (Carlsbad, CA)出售的小珠一起摇动。已知在液体介质中一起摇动细胞与小珠裂解细胞。小珠可由玻璃、陶瓷、金属、石榴石或其它本领域已知的材料制成。小珠的直径可小于或等于0.1mm、0.15mm、0.25mm、0.5mm、0.7mm、1.4mm、2.38mm、2.8mm或更大。摇动可包括手动摇动、使用定轨振荡器、使用涡旋混合器或任何其它本领域已知的技术。摇动的持续时间可小于1秒、2秒、5秒、10秒、15秒、20秒、30秒、45秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟或更长。
在另一个实施方案中，所述方法包括通过注射器剪切部分裂解保藏生物样品中的细胞。将溶液中的细胞通过注射器针头抽吸，例如来自McMaster-Carr (Robbinsville,NJ)的在图4中画出的那些可重复使用的不锈钢针头。针头长度可小于10 mm、小于20 mm、小于30 mm、小于50 mm、小于80 mm、小于100 mm、小于200 mm或更大。针头孔径尺寸可为152 μm、203 μm、254 μm、406 μm、610 μm、686 μm或更大。在溶液中细胞可通过针头手动或使用通过外部电源驱动的泵电动机抽吸。注射器可用单次单向冲击或用多次反复冲击抽吸。
部分裂解过程之后，混合物在步骤140中用于基于细胞的分析。基于细胞的分析(步骤140)可通过临床医生将细胞固定在载玻片上并在显微镜下观察它们进行。当筛查宫颈癌时，将细胞筛查鳞状细胞异常或腺细胞异常。混合物可替代地流经自动化成像机器例如ThinPrep®成像系统以检测异常。在其中使用珠磨部分裂解细胞的实施方案中小珠不必，在成像之前移除。出人意外地，混合物中小珠的存在不干扰ThinPrep®处理器或ThinPrep®成像仪的功能，也不干扰载玻片的可视化分析。ThinPrep®系统的细节在上文列出。自一定持续时间的珠磨和注射器剪切制备的载玻片显示几乎无细胞碎片或降解，并且适合于基于细胞的分析。
细胞在步骤150中测定细胞组分。对细胞组分的测定150可包括离心混合物。离心可在10 g、50 g、100 g、200 g、300 g、600 g、1000 g、2000 g或更大的径向力下实施。离心的持续时间可为10秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟或更长。步骤150可进一步包括排出待筛查的上清液的等分试样。步骤150可进一步包括检测核酸、定量核酸、鉴定核酸、测序等。基因筛查可通过商业设备例如来自Hologic的Cervista® HPV或APTIVA®进行，其细节在上文中描述。
在其中方法用于宫颈筛查或其它基因筛查的实施方案中，步骤150额外地包括比较鉴定的核酸与已知标志的数据库以确定受试者是否携带已知标志。已知标志的数据库可包括与提高的癌症风险相关的标志，例如用于鉴定妇女的宫颈癌风险的标志，包括HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52或HPV-68(美国癌症协会，人类乳头状瘤病毒(HPV)，癌症、HPV检验和HPV疫苗：常被问起的问题(2013年10月22日))。可使用其它核酸生物标志，包括下文所描述的那些。下文所描述的核酸扩增、检测和测序的方法也可用于图2中所描绘方法的实施方案。
图3显示用于比较部分裂解方法前后细胞计数和可视化的实验设计300的流程图。实验设计300以液体介质310中的口腔细胞样品开始。液体介质可为PBS、PreservCyt®溶液或任何上述其它介质。将部分样品移除并计数或可视化320。可与公开的方法一起使用的细胞计数技术包括分光光度法、血细胞计数法、流式细胞术等。细胞可通过固定并在显微镜下或用成像系统例如ThinPrep®系统观察可视化。将残余样品部分裂解330以产生部分裂解的混合物。混合物包含裂解细胞。裂解细胞包含细胞组分和其片段。混合物还包含细胞的分子组分，其包括核酸、蛋白质、细胞器和其它亚细胞结构。分子组分也包括生物样品中存在的病原体的组分。这种病原体包括细菌、病毒、酵母等。特别地，病原体可与疾病包括衣原体、淋病、滴虫病和念珠菌病有关。部分裂解步骤330可包括任何上述部分裂解技术。将部分裂解混合物的等分试样移除，一方面用于细胞计数和可视化340，另一方面用于纯化和分子分析350。细胞计数和可视化步骤320的结果可与细胞计数和可视化步骤340的结果比较以确定部分裂解步骤330的作用。达到步骤340中细胞对于适当计数和可视化过度降解的程度，或者达到步骤350中样品未充分裂解以进行分子分析的程度，部分裂解步骤330可相应调整。在其中部分裂解步骤330包括珠磨的实施方案中，可能的调整包括改变小珠的数量、小珠的尺寸、小珠的材料、混合或涡旋的持续时间或对裂解程序的其它定量或定性的改变，如上所述。在其中部分裂解步骤330包括注射器剪切的实施方案中，可能的调整包括改变注射器的长度或直径或者改变通过注射器施加以排出细胞的压力。在其中部分裂解步骤330包括洗涤剂裂解、渗透裂解或化学变性的实施方案中，可能的调整包括改变试剂的浓度或替换试剂。
图4显示来自McMaster-Carr (Robbinsville, NJ)的适合于和机械剪切方法包括注射器剪切一起使用的各种可重复使用的不锈钢针头。针头的长度和孔径尺寸不同。针头长度可小于10 mm、小于20 mm、小于30 mm、小于50 mm、小于80 mm、小于100 mm、小于200 mm或更长。针头孔径尺寸可为152 μm、203 μm、254 μm、406 μm、610 μm、686 μm或更大。为了实现注射器剪切技术，溶液中细胞可通过针头手动或使用通过外部电源驱动的泵电动机抽吸。注射器可用单次单向冲击或用多次反复冲击抽吸。
图5显示描述用于改进部分裂解珠磨方案的检验的样品表。基于细胞系的ThinPrep®试样使用培养物CaSki细胞以100,000细胞/mL的浓度创建。将石榴石小珠(MO-BIO P/N 13123-05)加入每一20mL样品中，并将样品在涡旋器上经受不同的混合时间。也制备对照，其中无小珠加入到CaSki样品中。该表帮助用户确定用于珠磨方案的最佳混合时间。其它表可改变方案中其它条件制作以改进部分裂解方法。例如，研究者可改变小珠的材料，小珠的尺寸，小珠的浓度或小珠的体积。对于其它部分裂解方案，包括注射器剪切方案，可构建相似的表。对用于检验注射器剪切方案的表，变量可包括针头长度、孔径尺寸、泵压力和时间。
图6显示来自图5实验方法的不同珠磨持续时间后的细胞浓度的表。裂解前后将100μl等分试样从每一样品中移除，并且将细胞浓度定量。裂解前细胞计数为平均84,000细胞/mL。裂解后细胞计数在图6中示出。对于增加的裂解时间，由于增加的细胞碎片水平不能对计数细胞计数。这提示在一些条件下混合长于5分钟可能不能达到有用的结果。
图7显示来自图5实验方法的不同珠磨持续时间后的吸光度结果。将裂解后的细胞在600 g离心5分钟，并且将0.1 mL上清液移除用于吸光度读数。吸光度随着混合时间增加。这表明在一些条件下过度裂解可降低样品中结构的可见度。
核酸可通过本领域已知的方法获取。通常，核酸可通过各种技术从部分裂解样品中提取，例如Maniatis等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor，N.Y., pp. 280-281, (1982)中所描述的那些，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
在其中所述方法用于宫颈筛查或其它基因筛查的实施方案中，步骤150额外地包括将鉴定的核酸与已知标志的数据库比较以确定受试者是否携带已知标志。已知标志的数据库可包括与提高癌症风险相关的标志，例如与妇女发展宫颈癌的风险有关的标志，包括HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52或HPV-68 (美国癌症协会，人类乳头状瘤病毒(HPV)，癌症、HPV检验和HPV疫苗：常被问起的问题(2013年10月22日))。与宫颈癌发展有关的生物标志也在Patel (US 7,300,765)、Pardee等人(US 7,153,700)、Kim (US 6,905,844)、Roberts等人(US 6,316,208)、Schlegel (US2008/0113340)、Kwok等人(US 2008/0044828)、Fisher等人(US 2005/0260566)、Sastry等人(US 2005/0048467)、Lai (US 2008/0311570)和Van Der Zee等人(US 2009/0023137)中显示。每一文章、专利和专利申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。与宫颈癌有关的示例性的生物标志包括：SC6、SIX1、人类宫颈癌2原癌基因(HCCR-2)、p27、病毒致癌基因E6、病毒致癌基因E7、p16INK4A、Mcm蛋白质(例如Mcm5)、Cdc蛋白质、拓扑异构酶2α、PCNA、Ki-67、细胞周期蛋白E、p-53、PAI1、DAP-激酶、ESR1、APC、TIMP-3、RAR-β、CALCA、TSLC1、TIMP-2、DcR1、CUDR、DcR2、BRCA1、p15、MSH2、Rassf1A、MLH1、MGMT、SOX1、PAX1、LMX1A、NKX6-1、WT1、ONECUT1、SPAG9和Rb (视网膜神经胶质瘤)蛋白质。
与阴道癌的发展有关的生物标志在Giordano (US 5,840,506)、Kruk (US 2008/0009005)、Hellman等人(Br J Cancer. 100(8):1303-1314, 2009)中显示。每一文章、专利和专利申请的内容通过引用以其整体结合到本文中。与阴道癌有关的示例性的生物标志包括：pRb2/p130 和Bcl-2。
本发明不限于癌症筛查。其可用于筛查各种特性的生物标志。核酸生物标志通常与核酸突变有关，其包括添加、缺失、插入、重组、倒置、转换、颠换、移码突变、无义突变、错义突变、单核苷酸多态性(SNP)和序列内两个或更多个核苷酸的置换但没有达到大的染色体序列改变的程度。SNP为当序列内单核苷酸替换另一个时发生的一种类型的基因组微序列改变。染色体数目的改变包括添加、缺失、倒置、易位、拷贝数变化和序列内染色体的置换。生物标志中的这些核酸突变也可指示癌症。
核酸生物标志可通过本领域已知用于单次多分析物筛查测定的任何方法测定或检测。本发明的方法提供在多种生物标志上进行至少一个检测测定以寻找任何一个指示上述癌症的特征。生物标志或特征的任何结合可使用同一测序平台或不同测序平台测定。相应地，一种以上检测技术可在多种生物标志上进行以寻找用于单次多分析物筛查测定的任何各种各样的特征。例如，可选择一种检测技术因为其特别地适合于检测特定生物标志并且可选择另一种检测技术因为其特别适合于检测特定特征。
适合用于本发明的探针包括由核酸形成的那些，例如RNA和/或DNA、核酸类似物、锁定的核酸、修饰的核酸和包括核酸与另一种有机组分的混合型嵌合体探针例如肽核酸。探针可为单链或双链。示例性的核苷酸类似物包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、腺苷、胞苷、鸟苷和尿苷的磷酸酯。非天然核苷酸的其它实例包括黄嘌呤或次黄嘌呤、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、脱氧肌苷或甲基化胞嘧啶，例如5-甲基胞嘧啶和N4-甲氧基脱氧胞嘧啶。也包括多核苷酸类似物的碱基，例如甲基化的核酸，例如，2'-O-甲基RNA、肽核酸、修饰的肽核酸和可基本上表现得像核苷酸或碱基的任何其它结构部分，例如，通过显示与出现在DNA或RNA中的一个或多个碱基互补。
核苷酸探针的长度并非关键性的，只要探针能够与靶核酸和核酸配体杂交。事实上，探针可为任何长度。例如，探针可仅有5个核苷酸，或多达5000个核苷酸。示例性的探针为5-mers、10-mers、15-mers、20-mers、25-mers、50-mers、100-mers、200-mers、500-mers、1000-mers、3000-mers或5000-mers。用于测定最佳探针长度的方法为本领域已知的。参见，例如，Shuber，美国专利号5,888,778，借此通过引用以其整体结合。
用于检测的探针可包括可检测的标记，例如放射标记、荧光标记或酶标记。参见例如Lancaster等人，美国专利号5,869,717，借此通过引用结合。在某些实施方案中，探针为荧光标记的。荧光标记的核苷酸可通过不同的技术生产，例如Kambara等人, Bio/Technol., 6:816-21, (1988); Smith等人, Nucl. Acid Res., 13:2399-2412, (1985)和Smith等人, Nature, 321: 674-679, (1986)中描述的那些，其每一的内容通过引用以其整体结合到本文中。荧光染料可通过易于通过化学或酶法切割的连接臂与脱氧核糖连接。存在许多用于将标记连接到核苷酸上的连接头和方法，如Oligonucleotides andAnalogues: A Practical Approach (寡核苷酸和类似物：实用方法)，IRL Press,Oxford, (1991); Zuckerman等人, Polynucleotides Res. (多核苷酸研究), 15: 5305-5321, (1987); Sharma等人, Polynucleotides Res. (多核苷酸研究), 19:3019,(1991); Giusti等人, PCR Methods and Applications (PCR方法和应用), 2:223-227,(1993); Fung等人(美国专利号4,757,141); Stabinsky (美国专利号4,739,044);Agrawal等人, Tetrahedron Letters, 31:1543-1546, (1990); Sproat等人,Polynucleotides Res. (多核苷酸研究), 15:4837, (1987); and Nelson等人,Polynucleotides Res. (多核苷酸研究), 17:7187-7194, (1989)中所示，其每一的内容通过引用以其整体结合到本文中。大量指导存在于衍生荧光团和猝灭剂分子的文献中，用于通过可加至核苷酸上的常见反应基团共价连接。也存在许多用于将荧光团部分连接到核苷酸的连接部分和方法，如Oligonucleotides and Analogues (寡核苷酸和类似物)，上述; Guisti等人，上述; Agrawal等人，上述和Sproat等人，上述中所述。
连接到探针上的可检测的标记可直接或间接可检测。在某些实施方案中，确切的标记可至少部分基于所使用检测方法的特定类型选择。示例性的检测方法包括放射性检测；光学吸光度检测，例如，UV-可见吸光度检测，光学发射检测，例如，荧光、磷光或化学发光，拉曼散射。优选的标记包括光学-可检测标记，例如荧光标记。荧光标记的实例包括，但不限于，4-乙酰氨基-4'-异硫氰基二苯乙烯-2,2'二磺酸；吖啶及衍生物：吖啶、吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3,5二磺酸盐；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；alexa；荧光素；共轭多染料；亮黄；香豆素及衍生物：香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran151)；青色素染料；四溴四氯荧光素钠；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'5''-二溴代连苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙基氨基-3-(4'-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸盐；4,4'-二异硫氰基二氢-二苯乙烯-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基二苯乙烯-2,2'二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红及衍生物：曙红、曙红异硫氰酸酯；赤藓红及衍生物：赤藓红B、赤藓红、异硫氰酸酯；乙非啶；荧光素及衍生物：5-羧基荧光素(FAM)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、QFITC、(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及衍生物：芘、芘丁酸盐、琥珀酰亚胺1-芘；丁酸盐量子点；活性红4(Cibacron.TM.亮红3B-A)；若丹明及衍生物：6-羧基-X-若丹明(ROX)、6-羧基若丹明(R6G)、丽丝胺若丹明B磺酰基氯若丹明(Rhod)、若丹明B、若丹明123、若丹明X异硫氰酸酯、磺酸基若丹明B、磺酸基若丹明101、磺酸基若丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)、N,N,N',N'四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、四甲基若丹明、四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素、玫红酸、铽螯合衍生物；Atto染料；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；IRD 700；IRD 800；La Jolta蓝；酞菁和萘酞菁。本发明考虑非荧光标记的标记，包括其它光学-可检测的标记。
在某些实施方案中，核酸使用测序检测。通过合成测序为下一代程序中使用的常见技术并且与本发明一起良好工作。然而，可使用其它测序方法，包括通过连接测序、通过杂交测序、基于凝胶的技术和其它。一般而言，测序涉及杂交引物与模板以形成模板/引物双链体、在允许聚合酶以模板依赖的方式将核苷酸添加到引物上的条件下在可检测地-标记的核苷酸存在下使双链体与聚合酶接触。来自可检测标记的信号然后用于鉴定引入的碱基并且连续重复步骤以测定模板中核苷酸的线性次序。示例性的可检测标记包括放射标记、荧光标记、酶标记等。在具体的实施方案中，可检测的标记可为光学可检测的标记，例如荧光标记。示例性的荧光标记包括青色素、若丹明、荧光素、香豆素、BODIPY、alexa或多共轭染料。对于检测序列，许多技术为已知的，并且一些在下文中例示。然而，用于检测和编译序列数据的确切方法不影响本文所述发明的功能。
在一个优选的实施方案中，核酸使用单分子测序检测。可用于所提供的本发明方法的测序技术的一个实例为Illumina测序。Illumina测序基于使用折回PCR和锚定引物扩增固体表面上的DNA。将基因组DNA片段化，并将连接头加到片段的5'和3'端。将连接到流动池(flow cell)通道表面的DNA片段延伸并桥式扩增。片段成为双链，并将双链分子变性。固相扩增随后变性的多次循环可在流动池的每一通道中创建同一模板的单链DNA分子的大约1,000个拷贝的几百万的集群。引物、DNA聚合酶和四种荧光团标记的可逆终止核苷酸用于进行连续测序。核苷酸引入后，使用激光激发荧光团，捕获图像并记录第一个碱基的身份。移除来自每一引入碱基的3'终止剂和荧光团并重复引入、检测和鉴定步骤。
适合用于所提供的本发明方法的单分子测序技术的另一个实例为离子激流测序(美国专利申请号2009/0026082、2009/0127589、2010/0035252、2010/0137143、2010/0188073、2010/0197507、2010/0282617、2010/0300559)、2010/0300895、2010/0301398和2010/0304982)，其每一的内容通过引用以其整体结合到本文中。在离子激流测序中，将DNA剪切成大约300-800碱基对的片段，并且片段平端化。然后将寡核苷酸连接头连接到片段的末端。连接头用作引物用于扩增和测序片段。片段可连接到表面并且以使得片段为个体可分解的分辨率连接。一个或多个核苷酸的添加释放质子(H+)，该信号在测序仪器上检测并记录。信号强度与引入的核苷酸的数目成比例。用户指南详细地描述适合用于本发明方法的离子激流方案，例如题为“Ion Sequencing Kit for User Guide v. 2.0 (离子测序试剂盒用户指南2.0版)”用于和其测序平台Personal Genome MachineTM (PCG)一起使用的Life Technologies的文献。
可用于所提供的本发明方法的DNA测序技术的另一个实例为454测序(Roche)(Margulies, M等人 2005, Nature, 437, 376-380)。454测序涉及两个步骤。在第一个步骤中，将DNA剪切成大约300-800碱基对的片段，并且将片段平端化。然后将寡核苷酸连接头连接到片段的末端。连接头用作引物用于扩增和测序片段。片段可使用例如，包含5'-生物素标签的连接头B，连接到DNA捕获小珠，例如，链霉亲和素包覆的小珠。将连接到小珠的片段在油水乳液的液滴内PCR扩增。结果为在每一小珠上无性扩增的DNA片段的多个拷贝。在第二个步骤中，将小珠捕获在孔(皮升大小的)中。在每一DNA片段上并行进行焦磷酸测序。一个或多个核苷酸的添加产生光信号，其由测序仪器中的CCD照相机记录。信号强度与引入核苷酸的数目成比例。焦磷酸测序利用在核苷酸添加时释放的焦磷酸盐(PPi)。PPi通过ATP硫酸化酶在腺苷5'磷酰硫酸存在下转化为ATP。荧光素酶使用ATP以转化荧光素为氧化荧光素，该反应产生检测和分析的光。
可用于所提供的本发明方法的DNA测序技术的另一个实例为SOLiD技术(AppliedBiosystems)。在SOLiD测序中，将基因组DNA剪切成片段，并将连接头连接到片段的5'和3'端以产生片段文库。或者，可通过将连接头连接到片段的5'和3'端、使片段环化、消化环化的片段以产生内部连接头和将连接头连接到所得片段的5'和3'端以产生配对（mate-paired）文库引入内部连接头。然后，无性小珠群在包含小珠、引物、模板和PCR组分的微反应器中制备。PCR之后，将模板变性并富集小珠以将小珠与延伸的模板分离。使所选磁珠上的模板经受3'修饰，其允许与玻璃载玻片结合。序列可通过连续杂交和部分随机寡核苷酸与通过特定的荧光团鉴定的中央确定的碱基(或碱基对)的连接测定。在颜色记录后，将连接的寡核苷酸切割和移除，然后重复过程。
可用于所提供的本发明方法的测序技术的另一个实例包括Pacific Biosciences的单分子实时(SMRT)技术。在SMRT中，将四种DNA碱基的每一与四种不同荧光染料的其中之一连接。这些染料为磷酸连接的。将单个DNA聚合酶与单分子的模板单链DNA固定在零模式波导(ZMW)的底部。ZMW为限制结构，其使得能够相对于迅速扩散入和扩散出ZMW (以微秒计)的荧光核苷酸的背景观察通过DNA聚合酶的单核苷酸引入。将核苷酸引入增长的链中耗费几毫秒。在该时间期间，荧光标记被激发并生成荧光信号，并且荧光标签被切去。检测染料的相应荧光指示引入哪一碱基。将该过程重复。
可用于所提供的本发明方法的测序技术的另一个实例为纳米孔测序(Soni G V和Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001)。纳米孔为直径1纳米级的小孔。，将纳米孔浸入到导电液体中并将横跨其施加电势导致因通过纳米孔的离子传导所致的微弱电流。流过的电流量对纳米孔的尺寸敏感。随着DNA分子穿过纳米孔，DNA分子上的每一核苷酸在不同程度上妨碍纳米孔。因此，随着DNA分子穿过纳米孔，穿过纳米孔的电流的变化代表DNA序列的读出。
在没有足够的DNA用于复杂测定，例如下一代测序的实例中，用于增加样品中核酸量的常见技术为在样品上进行PCR，然后进行检测样品中核酸的测定。PCR指用于在不需要克隆或纯化的情况下增加基因组DNA混合物中靶序列段的浓度的K. B. Mullis (美国专利号4,683,195和4,683,202，借此通过引用结合)的方法。用于扩增靶核酸序列和核酸配体的方法包括引入过量的结合核酸和核酸配体的寡核苷酸引物，随后为在DNA聚合酶的存在下精确的热循环序列。引物与其各自的靶核酸和核酸配体的链互补。PCR过程扩增样品中的DNA并产生足以通过本领域已知的标准测定例如DNA印记或测序检测的量的DNA。PCR的其它变化包括巢式聚合酶链反应、聚合酶链反应-单链构象多态性、连接酶链反应、链置换扩增和限制性片段长度多态性。
采用PCR，将基因组DNA中单拷贝的特定靶序列扩增至可通过几种不同的方法学(例如，染色、与标记探针杂交、引入生物素化引物接着亲和素-酶缀合检测、引入32P-标记的脱氧核苷酸三磷酸，例如dCTP或dATP到扩增段中)检测的水平是可能的。在发明的一个实施方案中，靶核酸和核酸配体可使用可检测的标记探针检测。核酸探针设计和合成寡核苷酸探针的方法为本领域已知的。参见例如，Sambrook等人, DNA microarray: A MolecularCloning Manual (DNA微阵列：分子克隆手册), Cold Spring Harbor, N.Y., (2003)或Maniatis等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册),Cold Spring Harbor, N.Y., (1982)，其每一的内容通过在此引用以其整体结合到本文中。Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册)(第二版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)或F. Ausubel等人,Current Protocols In Molecular Biology (分子生物学现代方法), GreenePublishing and Wiley-Interscience, New York (1987)，其每一的内容通过引用以其整体结合到本文中。用于合成寡核苷酸探针的合适方法也在Caruthers, Science, 230:281-285, (1985)中描述，其内容通过引用结合。
在一个实施方案中，将核酸模板分子连接到基质上(本文也称为表面)并经受如本文所述的单分子测序分析。将核酸模板分子连接到表面以致模板/引物双链体为各个光学可解析的。用于本发明的基质可为二或三维的并且可包括平面表面(例如，玻璃载玻片)或可为经塑形的。基质可包括玻璃(例如，可控孔度玻璃(CPG))、石英、塑料(例如聚苯乙烯(低交联和高交联聚苯乙烯)、聚碳酸酯、聚丙烯和聚(甲基丙烯酸甲酯)、丙烯酸共聚物、聚酰胺、硅、金属(例如，烷基硫醇衍生的金)、纤维素、尼龙、乳胶、葡聚糖、凝胶基质(例如，硅胶)、聚丙烯醛或复合材料。
合适的三维基质包括，例如，球体、微粒、小珠、膜、载玻片、平板、微型机械芯片、管(例如，毛细管)、微孔、微流体装置、通道、过滤器或任何其它适于锚定核酸的结构。基质可包括能够具有包含模板核酸或引物群的区域的平面阵列或矩阵。实例包括核苷衍生的CPG和聚苯乙烯载玻片、衍生的磁性载玻片、接枝聚乙二醇的聚苯乙烯等。
基质优选包覆以允许最佳的光学过程和核酸连接。用于本发明的基质也可经处理以减少背景。示例性的涂层包括环氧化合物和衍生的环氧化合物(例如，用结合分子，例如寡核苷酸或链霉亲和素)。
不同方法可用于将核酸分子锚定或固定到基质表面。固定可通过直接或间接结合到表面达到。结合可通过共价连接。参见，Joos等人, Analytical Biochemistry (分析生物化学) 247:96-101, 1997; Oroskar等人, Clin. Chem. 42:1547-1555, 1996; 和Khandjian, Mol. Bio. Rep. 11:107-115, 1986。优选的连接为模板的末端核苷酸或引物的5'端与表面上集成的环氧化合物直接胺结合。结合也可通过非共价连接。例如，生物素-链霉亲和素(Taylor等人, J. Phys. D. Appl. Phys. 24:1443, 1991)和地高辛与抗地高辛(Smith等人, Science 253:1122, 1992)为用于锚定核酸到表面或相似物的常见工具。或者，连接可通过将疏水链锚定至脂质单层或双层达到。本领域已知的用于将核酸分子连接到基质的其它方法也可使用。
在一些实施方案中，将待测序的多个核酸分子结合到固体载体上。为了将核酸固定在固体载体上，捕获序列/通用引发位点可添加在模板的3'和/或5'端。核酸可通过杂交捕获序列与共价连接到固体载体的互补序列结合到固体载体上。捕获序列(也称为通用捕获序列)为与连接到固体载体上的序列互补的核酸序列，其可双重地用作通用引物。在一些实施方案中，捕获序列为polyNn，其中N为U、A、T、G或C，例如，20-70、40-60，例如约50。例如，捕获序列可为polyT40-50或其互补物。作为捕获序列的备选，可将耦合对的成员(例如，抗体/抗原、受体/配体或亲和素-生物素对，如例如，美国专利申请号2006/0252077中所述的)连接到待捕获在用耦合对各自的第二成员包覆的表面的每一片段。
在一些实施方案中，将条码序列连接到核酸上。参见例如，Steinman等人(PCT国际申请号PCT/US09/64001)，其内容通过引用以其整体结合到本文中。
实施例
图8显示暴露于与石榴石小珠不同混合时间的细胞的40X视图。细胞为珠磨方案的实施方案的检验的产物。基于细胞系的ThinPrep®试样使用培养的CaSki细胞(包含HPV-16和与HPV-18相关的序列的细胞系)以100,000细胞/mL的浓度创建。将石榴石小珠(MO-BIOP/N 13123-05)加入到每一20mL样品中，并使样品在平台涡旋器上经受不同混合时间。
制备载玻片，并将细胞使用包括细胞核染色、漂洗溶液、橙色G溶液、复染溶液和蓝染溶液的ThinPrep染色集染色。然后将载玻片盖片并在ThinPrep®5000处理器上处理。
出人意外地，石榴石小珠的存在并不干扰机器上的载玻片处理，也不抑制观察和分析处理的载玻片。有和没有小珠的样品各自产生相似的处理度量（metric），意味着小珠不干扰处理器的功能。有和没有小珠的样品也具有相似的载玻片细胞结构和细胞呈现。
经受较长混合时间的样品确实经历较高程度的过滤器阻塞和达到过滤器流速的靶减少所需的减小的脉冲抽吸数目，其触发处理器停止将样品吸到过滤器上。该作用也导致具有减少的细胞结构的载玻片。该作用仅在混合时间5分钟或更长时显著。
图8的图像仅代表细胞呈现，并非全部载玻片细胞结构，因为检查者选择载玻片的细胞区域以拍照。细胞呈现显示，由于混合时间或石榴石小珠的存在，无显著的细胞形态学作用。细胞核界定和染色质量在所有对照和检验参数之间相似。由于增加的混合，载玻片上的细胞碎片中仅有小量增加。
实验结果显示增加裂解时间导致较低的细胞计数、样品中细胞碎片的视觉证据、较高的样品浊度、增加的裂解物吸光度和增加的ThinPrep®过滤器阻塞。然而裂解似乎不影响细胞转移或ThinPrep®载玻片上细胞呈现的质量。
通过引用结合
对其它文献，例如专利、专利申请、专利出版、期刊、书籍、论文、网页内容的参考和引用贯穿本公开内容做出。对于所有目的，所有这些文献借此通过引用以其整体结合到本文中。
相等物
除了本文显示和描述的那些外，本发明的不同修饰及其许多进一步的实施方案将会从该文档的全部内容，包括对本文所引用的科学和专利文献的参考，对本领域技术人员显而易见。本文的主题包含可适应在其不同的实施方案中实践本发明的重要信息、例证和指导，及其相等物。

Claims (30)

1.一种评估包含细胞的生物样品的方法，所述方法包括：
从受试者获取生物样品；
使所述生物样品与生物样品防腐剂接触以创建保藏的生物样品；
部分裂解保藏的生物样品以创建包含裂解细胞、全细胞和分子组分的混合物；
使用基于细胞的分析表征所述混合物的第一部分；和
测定混合物的第二部分的分子组分。
2.权利要求1的方法，其中部分裂解包括暴露整个保藏的生物样品于裂解过程。
3.权利要求1的方法，其中小于50%的细胞裂解。
4.权利要求1的方法，其中部分裂解进行至预定的裂解水平。
5.权利要求1的方法，其中部分裂解包括机械剪切、洗涤剂裂解、渗透裂解、化学变性、离心、超声、冻融或其组合。
6.权利要求5的方法，其中机械剪切包括注射器剪切、珠磨或其组合。
7.权利要求1的方法，其中所述分子组分包括存在于生物样品中的病原体的组分。
8.权利要求7的方法，其中所述病原体与选自衣原体、淋病、滴虫病和念珠菌病的疾病有关。
9.权利要求1的方法，其中测定包括检测核酸、定量核酸、鉴定核酸或测序。
10.权利要求9的方法，进一步包括比较鉴定的核酸与已知标志的数据库以确定受试者是否携带已知标志。
11.权利要求10的方法，其中所述已知标志与癌症风险相关。
12.权利要求10的方法，其中所述已知标志为HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-68、HPV-73或HPV-82。
13.权利要求1的方法，其中基于细胞的分析包括观察所述混合物中的全细胞。
14.权利要求1的方法，其中基于细胞的分析包括将全细胞固定在载玻片上。
15.权利要求1的方法，其中所述基于细胞的分析包括筛查鳞状细胞异常或腺细胞异常。
16.一种评估包含细胞的生物样品的方法，所述方法包括：
从受试者获取包含细胞的生物样品；
使包含细胞的所述生物样品与生物样品防腐剂接触以创建保藏的生物样品；
在容器中容纳所述保藏的生物样品；
将所述容器中全部的保藏生物样品暴露于裂解过程以创建混合物；
使用基于细胞的分析表征混合物；和
测定所述混合物的分子组分。
17.权利要求16的方法，其中小于50%的细胞裂解。
18.权利要求16的方法，其中所述部分裂解进行至预定的裂解水平。
19.权利要求16的方法，其中所述裂解过程包括机械剪切、洗涤剂裂解、渗透裂解、化学变性、离心、超声、冻融或其组合。
20.权利要求19的方法，其中机械剪切包括注射器剪切、珠磨或其组合。
21.权利要求16的方法，其中所述混合物包括全细胞、裂解细胞和分子组分。
22.权利要求21的方法，其中所述分子组分包括存在于生物样品中的病原体的组分。
23.权利要求22的方法，其中所述病原体与选自衣原体、淋病、滴虫病和念珠菌病的疾病有关。
24.权利要求16的方法，其中测定包括检测核酸、定量核酸、鉴定核酸或测序。
25.权利要求16的方法，进一步包括比较鉴定的核酸与已知标志的数据库以确定受试者是否携带已知标志。
26.权利要求25的方法，其中所述已知标志与癌症风险相关。
27.权利要求26的方法，其中所述已知标志为HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33、HPV-35、HPV-39、HPV-45、HPV-51、HPV-52、HPV-56、HPV-58、HPV-68、HPV-73或HPV-82。
28.权利要求16的方法，其中基于细胞的分析包括观察混合物中的全细胞。
29.权利要求16的方法，其中基于细胞的分析包括将全细胞固定在载玻片上。
30.权利要求16的方法，其中所述基于细胞的分析包括筛查鳞状细胞异常或腺细胞异常。
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