CN107206021A - 使用降氨疗法治疗与肝星状细胞激活相关的疾病 - Google Patents

Abstract

本文公开的是使用降氨疗法预防、治疗与肝星状细胞(HSC)相关的疾病以及延迟所述疾病的发生或进展的方法，所述与肝星状细胞(HSC)相关的疾病例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、纤维化和肝癌。

Description

使用降氨疗法治疗与肝星状细胞激活相关的疾病

相关申请

根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求于2012年8月29日提交的美国临时申请第61/694,679号的优先权，所述临时申请的全部内容以引用的方式明确纳入本文。

技术领域

本申请涉及药物化学、生物化学和医学领域。一方面涉及使用降氨疗法治疗和/或预防与肝星状细胞(HSC)激活相关的疾病。

背景技术

肝星状细胞(HSC)是肝的窦周间隙中存在的周细胞。在肝内，星状细胞在维持肝的结构完整性方面发挥重要作用并且参与纤维化和肝癌发展。在正常肝中，肝星状细胞处于休眠状态。当肝受到损伤时，HSC可变为激活状态。激活的星状细胞以增殖、收缩性和趋化性为特征。HSC的激活可导致多种疾病，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、纤维化病症和肝癌。

根据症状的严重性，目前可获得多种用于与HSC激活相关的疾病的预防、治疗和管理策略。需要用于治疗或预防那些疾病的其他疗法。

发明内容

本文公开的一些实施方案提供了治疗与肝星状细胞(HSC)激活相关的疾病的方法，其中所述方法包括对需要其的受试者进行降氨疗法。还公开了延迟与HSC激活相关的疾病的发生或进展的方法，其中所述方法包括对需要其的受试者进行降氨疗法。在一些实施方案中，进行降氨疗法包括将降氨剂给予受试者。

在一些实施方案中，所述与HSC激活相关的疾病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。例如，NAFLD可以是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或脂肪变性。

在一些实施方案中，所述与HSC激活相关的疾病是肝癌。在一些实施方案中，所述与HSC激活相关的疾病是纤维化病症。例如，所述纤维化病症可以是肝纤维化。在一些实施方案中，所述受试者患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。

一些实施方案提供了预防非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法，其中所述方法包括对需要其的受试者进行降氨疗法。例如，NAFLD可以是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或脂肪变性。在一些实施方案中，进行降氨疗法包括将降氨剂给予受试者。

在一些实施方案中，所述降氨剂是或包括磷酸镁产品(MGP)、苯丁酸甘油酯(GPB)、苯乙酸钠、苯丁酸钠(NaPBA)、谷氨酰胺、苯甲酸钠、L-阿拉伯糖、轻泻药、抗生素、鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合，或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述降氨剂是或包括鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合。

在本文公开的方法中，在一些实施方案中，将单独的鸟氨酸的药学上可接受的盐与苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种给予受试者。在一些实施方案中，将苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种作为苯乙酸钠或苯丁酸钠而给药。在一些实施方案中，将鸟氨酸作为游离单体氨基酸或其生理学上可接受的盐而给药。在一些实施方案中，将鸟氨酸和苯乙酸盐作为鸟氨酸苯乙酸盐而给药。

在一些实施方案中，所述给药是口服、静脉内、腹膜内、胃内或血管内给药。在一些实施方案中，所述给药是静脉内给药。在一些实施方案中，所述给药是口服给药。

附图说明

图1A-C示出了氨以剂量依赖的方式降低体外原代人肝星状细胞的细胞增殖和代谢。图1A示出了氨抑制DNA合成(BrdU)和代谢活性(MTS)，图1B显示实现了抑制，而不会诱导细胞死亡。图1C示出了氨以剂量依赖的方式诱导明显的形态学改变，即从肌成纤维细胞样细胞变为纺锤状成纤维细胞，如通过光学显微镜和通过中性红细胞活力测试(20×，40×)观察到的。柱状图示出了三个独立值的平均值±SD。相对于无血清培养基(SFM)的对应值，＊P＜0.05、＊＊P＜0.01和＊＊＊P＜0.001。

图2A-F示出了氨诱导细胞质应激的改变，这与细胞代谢/功能、收缩和肌动蛋白细胞骨架结构的改变一致。图2A是透射电子显微镜(TEM)图像，显示氨以剂量依赖的方式引起了的明显的形态学改变，出现了细胞质液泡(V＝液泡；N＝核)。图2B示出了富含氨的培养基耗尽之后细胞增殖的恢复。柱状图示出了三个独立值的平均值±SD。相对于SFM，＊P＜0.05和＊＊＊P＜0.001。图2C和2D描绘了胶原凝胶收缩试验的结果，表明氨诱导hHSC收缩。柱状图示出了2个独立实验的平均值(值±SD)。相对于SFM的对应值，＊P＜0.05和＊＊P＜0.01。图2E示出了氨诱导的HSC收缩与形态学的改变一致。图2F示出了氨的长时间处理(72h)以剂量依赖的方式诱导丝状肌动蛋白的再组织(re-organization)(TRITC-鬼笔环肽染色)。

图3A-C示出了氨诱导ROS产生。图3A示出了采用氨长时间处理hHSC 72小时在hHSC内诱导ROS产生。使用Image-IT^TM LIVE绿色活性氧检测试剂盒测量活性氧(ROS)的形成。在图3B中，根据细胞数目，对ROS信号的平均荧光强度(MFI)进行归一化(Hoechst 33342)，并以对照的百分比表示。柱状图示出了三个独立值的平均值±SD。相对于SFM的对应值，＊＊＊P＜0.001。图3C示出了高血氨在3和24小时时增加ROS标记物SOD2的mRNA的表达水平。柱状图示出了2个独立值的平均值±SD。相对于SFM的对应值，＊＊＊P＜0.001。图3D示出了NAC诱导的ROS清除剂在24小时时降低氨诱导的SOD2 mRNA表达。柱状图示出了2个独立值的平均值±SD。相对于SFM的对应值，＊P＜0.05、＊＊P＜0.01。

图4A-C示出了氨改变若干种促炎标记物和HSC激活标记物的mRNA表达和蛋白水平。图4A示出了氨影响α-SMA、波形蛋白、PDGF-Rβ、肌球蛋白IIa和IIb、及p-38 MAPK的蛋白表达。图4B示出了氨诱导MMP2 mRNA的上调，而TIMP1 mRNA被下调。图4C示出了白介素1β和白介素IL6的mRNA表达被上调。柱状图示出了三个独立值的平均值±SD。相对于SFM的对应值，＊P＜0.05、＊＊P＜0.01和＊＊＊P＜0.001。

图5A-B示出了高血氨处理在体内进一步增加BDL诱导的HSC标记物。图5A示出了相比于假手术的大鼠，BDL动物和AA饲喂的BDL动物中氨的血浆水平显著上调(相对于假手术的大鼠，＊P＜0.05和＊＊P＜0.01)。与BDL动物相比，OP处理在BDL-AA饲喂的动物中显著降低氨(＊＊P＜0.01)。图5B示出了与BDL诱导的纤维化相比，对BDL诱导的纤维化进行高血氨处理显示肌球蛋白IIb、I型胶原蛋白和PDGF-Rβ蛋白表达的额外的显著增加(＊＊P＜0.01和＊＊＊P＜0.001)。相反，采用OP的处理消除了AA-饲喂的BDL对所有HSC相关的激活标记物的强烈作用(＊P＜0.05、＊＊P＜0.01和＊＊＊P＜0.001)。

图6示出了用正常及高脂肪高胆固醇饮食饲喂10个月并恢复2个月的大鼠中的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白和基因的表达。

图7示出了采用缺乏甲硫氨酸-胆碱的饮食(MCD)饲喂4周并用或不用碳处理的小鼠中的OTC基因表达。

图8示出了减肥手术期间患有单纯的脂肪变性或NASH+纤维化的NAFLD人患者中的OTC基因表达。

具体实施方式

在以下详细描述中，参考形成本文的一部分的附图。在详细描述中所描述的示例性实施方案、图及权利要求并不意图进行限制。可使用其他实施方案，并作出其他改变，而不脱离本文所呈现的主题的精神或范围。易于理解的是，本公开内容的方面，如本文通常所述的，可在广泛的各种不同配置中被排列、替换、合并及设计，所有这些均被明确地考虑并构成本公开内容的一部分。

定义

本文使用的“受试者”是指作为治疗、观察或实验的目标的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物及无脊椎动物如鱼、贝、爬行动物，特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠；大鼠；兔；豚鼠；犬；猫；绵羊；山羊；牛；马；灵长类，如猴子、黑猩猩和猿，特别是人。

本文使用的“患者”是指由医学专业人员如医师(即对抗医学的医生或骨科医学的医生)或兽医学的医生对其进行治疗以试图治愈或至少减轻特定疾病或病症的影响或首先预防所述疾病或病症发生的受试者。

本文使用的“给药”或“给予”是指向脊椎动物给予一定剂量的药物活性成分的方法。

本文使用的“单位剂量”是指以单一剂量给予患者的治疗剂的量。

本文使用的“日剂量”是指一天中给予患者的治疗剂的总量。

本文使用的“治疗有效量”或“药学有效量”是指具有治疗作用的治疗剂的量。在治疗中有用的药物活性成分的剂量是治疗有效量。因此，本文使用的治疗有效量意指通过临床试验结果和/或模型动物研究所判断的产生所需治疗作用的治疗剂的那些量。

本文使用的“治疗作用”在一定程度上减轻疾病或病症的一种或更多种症状。例如，治疗作用可通过受试者告知的主观不适减轻(例如在自填的患者调查问卷中记载的减轻的不适)而观察到。

本文使用的“治疗”是指以预防和/或治疗为目的而给予受试者化合物或药物组合物。术语“预防性治疗”是指治疗尚未显示出疾病或病症的症状但易患或处于患特定疾病或病症的风险中的受试者，由此所述治疗降低患者发展所述疾病或病症的可能性。术语“治疗性治疗”是指向已经患有疾病或病症的受试者给予治疗。

缩写

BDL＝胆管结扎

OP＝鸟氨酸、苯乙酸盐

OTC＝鸟氨酸转氨甲酰酶

GS＝谷氨酰胺合成酶

HSC＝肝星状细胞

降氨疗法

本文公开了可用于降低受试者中的氨水平的各种降氨疗法。例如，可在所述疗法中使用一种或更多种降氨剂来降低受试者中的氨水平。本文使用的术语“降氨剂”是指可用于降低受试者中的氨水平的物质。降氨剂降低氨水平的机制可有多种。例如，降氨剂可通过降低受试者中氨的产生、或通过吸收受试者中的氨、或将氨引入结肠并通过轻泻作用去除氨，或它们的任何组合来降低受试者中的氨水平。在一些实施方案中，受试者中的氨水平可以是受试者的血液(例如血浆)中的氨的水平。在一些实施方案中，所述降氨疗法包括给予受试者一种或更多种降氨剂。

降氨剂的非限制性实例包括磷酸镁产品(MGP)、苯丁酸甘油酯(GPB)、苯乙酸钠、苯丁酸钠(NaPBA)、谷氨酰胺、苯甲酸钠、叶绿素、L-阿拉伯糖、轻泻药、抗生素、鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合，或它们的任何组合。降氨剂可存在于例如药物组合物、营养组合物、益生素组合物，或它们的任何组合物中。轻泻药是能够使粪便通畅并增进肠蠕动的物质。轻泻药可用于降低受试者胃肠道中的氨水平，例如通过改变受试者胃肠道中的细菌群落并使得几乎不存在产生氨的生物体。轻泻药的实例包括但不限于乳果糖。

降氨剂可以是或包括一种或更多种抗生素。例如，降氨剂可通过口服途径给药以允许抗生素在胃肠道中发挥作用。不受任何特定理论的束缚，认为抗生素能够减少肠内的产氨细菌以降低受试者中的氨水平。抗生素的非限制性实例包括新霉素、万古霉素和利福昔明(Xifaxan)。

在一些实施方案中，组合使用不同的降氨剂以降低受试者中的氨水平。例如，可将一种或更多种轻泻药及一种或更多种抗生素给予患者以降低受试者中的氨水平。

作为另一个非限制性实例，降氨疗法可以是或包括调节受试者中的肠道菌群的组成。在一些实施方案中，调节受试者的肠道菌群的组成包括细菌移植，例如排泄物移植。在一些实施方案中，调节受试者中的肠道菌群的组成包括增加受试者的肠道菌群中缺乏或具有低脲酶活性的一种或更多种细菌菌种的水平。在一些实施方案中，调节受试者中的肠道菌群的组成包括采用具有高水平的一种或更多种缺乏或具有低脲酶活性的细菌菌种的组合物替代受试者的天然肠道菌群。在一些实施方案中，调节受试者中的肠道菌群的组成包括给予受试者一种包含一种或更多种缺乏或具有低脲酶活性的细菌菌种的组合物。缺乏或具有低脲酶活性的细菌的实例包括但不限于Parabacteroides、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、真细菌属(Eubacterium)、Mucispirillum、乳杆菌属(Lactobacillus)和梭菌属(Clostridium)。在一些实施方案中，缺乏或具有较低脲酶活性的细菌是梭状芽胞杆菌(Clostridia)、Mucispirillumschaedleri、Parabacteroides、乳酸杆菌，或它们的任何组合。在一些实施方案中，降氨疗法包括将Schaedler flora(ASF)——由8种于20世纪70年代被组装并于1978年被美国国家癌症研究所标准化的鼠科肠道共生细菌菌株(Dewhirst et al.，Appl.EnvironMicrobiol.1999；65(8)：3287-3292)组成——移植到受试者中。不受任何特定理论的限制，认为细菌的脲酶将来自宿主的尿素转化为氨和二氧化碳，造成高血氨症，没有脲酶活性或具有降低的脲酶活性的肠道菌群能够降低氨产生并因此降低受试者中的氨水平。

此外，降氨疗法可以是或包括基因疗法，以纠正造成受试者中的高血氨症的基因缺陷。例如，高血氨症可由编码参与尿素循环的酶的基因中的缺陷引起，所述基因包括但不限于鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)基因、氨甲酰磷酸合成酶(CPS1)基因、精氨琥珀酸合成酶(AAS)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和精氨酸酶(AG)。高血氨症也可由胱硫醚β-合成酶(CBS)基因和谷氨酰胺合成酶基因中的缺陷引起。基因疗法可通过本领域已知的方法进行。例如，重组病毒载体(例如腺相关病毒载体和杆状病毒载体)可用于将丢失的基因递送(例如靶向递送至干细胞)至受试者以降低受试者中的氨水平。例如参见Torres-Vega et al.GeneTherapy(2015)22，58-64(其全部内容以引用的方式纳入本文)。在一些实施方案中，将包含完整的OTC基因的AAV载体给予需要其的受试者以降低受试者中的氨水平。在一些实施方案中，将包含完整的谷氨酰胺合成酶基因的AAV载体给予需要其的受试者以降低受试者中的氨水平。

与HSC激活相关的疾病的治疗和预防

肝星状细胞(HSC)是肝特有的间充质细胞，其在肝生理机能和纤维发生中以及在维持肝的结构完整性方面发挥重要作用。HSC通常位于窦周间隙内并维持与肝窦内皮细胞和肝上皮细胞的紧密相互作用。HSC在肝中协调许多重要功能并且它们的功能紊乱与多种病理病症相关。HSC可以在肝发育和再生过程中影响其他肝细胞类型的分化、增殖和形态发生。

在正常肝中，HSC处于休眠状态。当肝受到损伤时，HSC可变为激活状态。例如，随着急性或慢性肝损伤，HSC经历从“休眠的”(非增殖性及非收缩性)向“激活的”(促有丝分裂型、促纤维发生性和促炎性肌成纤维细胞样)细胞的表型转变。此外，在激活的过程中，HSC变得高度收缩并具有必要的机制来收缩或松弛以响应许多血管活性物质/刺激物。激活的HSC可产生多种细胞因子和趋化因子，它们可直接增强肝祖细胞和肝细胞的增殖。HSC参与例如纤维化和肝癌发展。HSC激活可导致多种疾病、病症和症状，包括但不限于非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、纤维化病症(例如肝纤维化)、肝癌，及它们的任何组合。肝癌的非限制性实例包括肝细胞性肝癌(HCC)和肝母细胞瘤。在一些实施方案中，治疗和/或预防与HSC激活相关的疾病的方法包括鉴定患有或有发展为与HSC激活相关的疾病的风险的受试者。在一些实施方案中，所述与HSC激活相关的疾病可以是NAFLD、肝纤维化、肝癌，或它们的任何组合。

NAFLD是指一组病症，其中在很少饮酒或不饮酒的人的肝中有过量脂肪的积累。NFALD是发达国家中常见的肝病。NAFLD的最常见形式是称为脂肪肝的非严重的病症。当脂肪在肝中沉积(脂肪变性)时，发生NAFLD。尽管肝中存在脂肪不是正常的，但其本身可能不会损害肝。NAFLD是纤维化的常见原因。有时怀疑在血常规测试过程中发现或在放射学检查如腹部超声或CT扫描上偶然检测到在肝测试中有轻微的升高的超重或肥胖的人患有NAFLD。

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的更严重的形式。在NASH中，脂肪积累与肝细胞炎症和不同程度的瘢痕形成有关。NASH是潜在的严重病症，它可导致严重的肝瘢痕形成和肝硬化。不受任何特定理论的束缚，认为NASH与人和啮齿动物中降低的鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC，也称为鸟氨酸氨甲酰基转移酶)的表达和功能有关。例如，在实验性NASH中，线粒体尿素循环酶鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的基因和蛋白表达被显著降低，导致体内尿素生成能力的功能降低，这导致高血氨症。在经活组织检查证明患有NASH的患者中，血浆氨水平比在患有单纯的脂肪变性的患者中增加得更加显著。在哺乳动物中，OTC酶是尿素循环的一部分。在缺乏OTC的哺乳动物中，氨水平会升高，这可导致高血氨症和随后的神经问题。

本公开内容首次公开了在人HSC中以及在结扎了胆管的大鼠体内，氨产生显著的形态学和功能改变(例如氧化应激、增加的细胞因子、激活标记物的表达、基质蛋白分泌的改变及严重的形态学破坏)。不受任何特定理论的束缚，认为高血氨可在体内和体外激活HSC，这可能有利于NAFLD(例如NASH)和纤维化的进展。如本文所述的，受试者中氨水平的降低能够防止受试者中HSC的激活并减轻例如与HSC激活相关的疾病。

本文所述的一些实施方案提供了通过对有需要的受试者进行降氨疗法来治疗所述受试者中与HSC激活相关的疾病的方法。本文所述的一些实施方案提供了通过对有需要的受试者进行降氨疗法来延迟受试者中与HSC激活相关的疾病的发生或进展的方法。在一些实施方案中，进行降氨疗法包括给予受试者降氨剂。在一些实施方案中，降氨剂是或包括磷酸镁产品(MGP)、苯丁酸甘油酯(GPB)、苯乙酸钠、苯丁酸钠(NaPBA)、谷氨酰胺、苯甲酸钠、L-阿拉伯糖、轻泻药、抗生素、鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合，或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述方法包括将鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合共同给予受试者。在一些实施方案中，与HSC激活相关的疾病是NAFLD，例如NASH或脂肪变性。在一些实施方案中，与HSC激活相关的疾病是肝癌，例如HCC或肝母细胞瘤。在一些实施方案中，与HSC激活相关的疾病是纤维化病症，例如肝纤维化。在一些实施方案中，患有肝癌和/或纤维化病症的患者也可能患有NAFLD。在一些实施方案中，将两种或更多种降氨剂共同给予受试者。在一些实施方案中，将一种或更多种降氨剂与另一种药物活性成分共同给予受试者。在一些实施方案中，调节受试者中肠道菌群的组成以治疗与HSC激活相关的疾病。在一些实施方案中，基因疗法被用作降氨疗法以治疗与HSC激活相关的疾病。

本文还公开了通过对需要其的受试者进行降氨疗法来预防NAFLD的方法。在一些实施方案中，进行降氨疗法包括给予受试者降氨剂。本文所公开的任何降氨剂均可用于所述方法中，所述降氨剂包括但不限于磷酸镁产品(MGP)、苯丁酸甘油酯(GPB)、苯乙酸钠、苯丁酸钠(NaPBA)、谷氨酰胺、苯甲酸钠、L-阿拉伯糖、轻泻药、抗生素、鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合，或它们的任何组合。在一些实施方案中，所述方法包括将鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合共同给予受试者。在一些实施方案中，调节受试者中肠道菌群的组成以预防NAFLD。在一些实施方案中，基因疗法被用作降氨疗法以预防NAFLD。

本文所述的一些实施方案提供了通过对需要其的受试者进行降氨疗法来治疗纤维化病症的方法。在一些实施方案中，降氨疗法可包括将降氨剂如鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合共同给予需要其的受试者。一些这样的实施方案包括治疗性治疗。其他实施方案包括预防性治疗。本文使用的“纤维化病症”是指具有以下特征的病症、疾病或障碍：成纤维细胞的失调性增殖或活性和/或纤连蛋白的异常累积和/或胶原组织的病理性累积或过量累积。通常，任何这样的疾病、障碍或病症都可通过给予具有抗纤维化活性的化合物来治疗。纤维化障碍包括但不限于肝纤维化(例如与慢性活动性肝炎相关的肝纤维化)。因此，一些实施方案包括通过将鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合共同给予需要其的受试者来治疗肝纤维化的方法。一些实施方案包括在给予鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合之前，鉴定受试者患有或有发展为纤维化病症(例如肝纤维化)的风险。

“共同给药”意指两种或更多种药剂可在同时存在于患者的血流中，而不管它们实际上是何时给予或如何给予的。在一些实施方案中，同时给予所述药剂。在一个这样的实施方案中，通过将所述药剂组合在单一剂型中来实现联合给药。在一些实施方案中，依序给予所述药剂。在一些实施方案中，将所述药剂通过相同的途径如口服而给予。在一些实施方案中，将所述药剂通过不同的途径而给予，如一种通过口服给药而另一种通过静脉注射给药。

如本文所述，NASH与人和啮齿动物中尿素循环酶——鸟氨酸转氨甲酰酶的降低的表达和功能水平——这导致高血氨症——相关。不受任何特定理论的束缚，认为在NAFLD中氨升高并且参与NAFLD和肝癌的进展。此外，降氨剂(例如OP)可用于在患有高血氨症(例如与NASH相关的高血氨症)的受试者中降低血氨水平，并因此防止、限制或减缓NAFLD的进展、NASH中的纤维化进展以及肝癌(例如HCC)的发展。在一些实施方案中，降氨剂可用于降低血氨水平，这治疗并延迟NASH的发生或进展。

一些实施方案包括通过对有需要的受试者进行降氨疗法来治疗纤维化病症(例如肝纤维化)。例如，降氨疗法可包括向有需要的受试者给予降氨剂，例如鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合。一些这样的实施方案包括治疗性治疗。一些实施方案包括预防性治疗。一些实施方案包括在给予降氨剂之前，鉴定受试者患有或有发展为纤维化病症(例如肝纤维化)的风险。

一些实施方案包括通过对有需要的受试者进行降氨疗法来治疗肝癌的方法。例如，降氨疗法可包括将降氨剂(例如鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合)共同给予需要其的受试者。一些这样的实施方案包括治疗性治疗。一些实施方案包括预防性治疗。一些实施方案包括在给予降氨剂之前，鉴定受试者患有或有发展为肝癌的风险。一些实施方案包括通过将鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合(例如鸟氨酸苯乙酸盐)给予受试者来治疗肝癌。肝癌可以是例如HCC或肝母细胞瘤。

受试者中的氨水平可通过多种常规方法来测定。例如，在来自静脉(或动脉)血液样品的血浆中常规地测量氨。也可在全血、红细胞、唾液、汗液和尿液中测量氨。氨测量可用于诊断高血氨症。可通过间接或直接的方法测量氨。例如，可通过氨指示剂的颜色改变来测量氨，例如利用溴酚蓝的(Ortho Diagnostic Ltd.)氨测量法。又例如，通常基于抗生素无活菌素(nonatin)和单活菌素(monoactin)的混合物的NH4⁺-选择性膜也可用于测量氨水平。在一些实施方案中，本文所公开的方法包括在给予降氨剂之前和/或之后，测定受试者中的氨水平。在一些实施方案中，在受试者接受降氨剂治疗的整个期间监测受试者中的氨水平。体内氨水平的下降可减少炎症(NFκB)、氧化应激和αSMA表达，并增加一氧化氮合酶(eNOS)活性和功能。

盐

在一些实施方案中，将降氨剂(如鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合)作为药学上可接受的盐而给药。术语“药学上可接受的盐”是指保持化合物的生物学功效和特性的盐，其不是生物学上或原本不期望用于药物中的盐。在许多情况下，由于存在氨基和/或羧基或类似基团，本文所公开的降氨剂能够形成酸式盐和/或碱式盐。可与无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸加成盐。可形成盐的无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可形成盐的有机酸包括例如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。也可使用无机和有机碱形成药学上可接受的盐。可形成盐的无机碱包括例如含有钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰、铝等的碱；特别优选的是氨盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。在一些实施方案中，采用无机碱处理本文所公开的化合物导致化合物失去不稳定的氢以形成含有如Li⁺、Na⁺、K⁺、Mg²⁺和Ca²⁺等的无机阳离子的盐。可形成盐的有机碱包括例如伯胺、仲胺和叔胺；取代的胺，包括天然存在的取代的胺；环胺；碱性离子交换树脂等；特别地例如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。本领域已知许多这样的盐，如Johnston等人在WO87/05297(公开于1987年9月11日，以引用的方式全文纳入本文)中所述。

在一些实施方案中，鸟氨酸作为鸟氨酸盐酸盐而给药。在一些实施方案中，苯乙酸盐或苯丁酸盐作为它们的钠盐而给药。在一些实施方案中，鸟氨酸和苯乙酸盐或苯丁酸盐作为彼此的盐而给药(例如鸟氨酸苯乙酸盐)。

药物组合物及给药途径

可将降氨剂(如鸟氨酸与苯乙酸盐和/或苯丁酸盐的组合)与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制以便于给药。在一些实施方案中，可将降氨剂与药学领域中常规的标准的药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制为药物。制剂的确切性质将取决于若干因素，包括所需的给药途径。例如，可将降氨剂(例如鸟氨酸和苯乙酸盐和/或苯丁酸盐)配制为用于口服、静脉内、胃内、血管内或腹膜内给药。可使用标准的药物制剂技术，如Remington′sThe Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins(2005)(以引用的方式全文纳入本文)中公开的那些。

可将鸟氨酸(例如L-鸟氨酸)和苯乙酸盐或苯丁酸盐单独给药或在单一剂型中给药。在一些实施方案中，将组合作为鸟氨酸苯乙酸盐或作为鸟氨酸苯乙酸盐的溶液而给药。

鸟氨酸与苯乙酸盐(或乙酸苯酯盐)和苯丁酸盐中至少一种的组合物的不同形式记载于美国专利公开第US2008/0119554和US2010/0280119号(在此以引用的方式全文纳入)中。在一些实施方案中，鸟氨酸和苯乙酸盐作为鸟氨酸乙酸苯酯或其生理学上可接受的盐而存在和/或给药。在一些实施方案中，鸟氨酸作为游离单体氨基酸或其生理学上可接受的盐而存在和/或给药。在一些实施方案中，苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种作为苯乙酸钠或苯丁酸钠而存在和/或给药。在一些实施方案中，将鸟氨酸的生理学上可接受的盐以及苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种的生理学上可接受的盐给予受试者。

如本文所述，可将鸟氨酸和苯乙酸盐和/或苯丁酸盐配制在药物组合物中以用于给药，所述药物组合物包括生理学上可接受的表面活性剂、载体、稀释剂、赋形剂、润滑剂、悬浮剂、成膜物质、包衣助剂，或它们的组合。在一些实施方案中，可将鸟氨酸和苯乙酸盐和/或苯丁酸盐与药学上可接受的载体或稀释剂一起配制以用于给药。可将鸟氨酸和苯乙酸盐和/或苯丁酸盐与药学领域中常规的标准的药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制为药物。制剂的确切性质将取决于若干因素，包括所需的给药途径。通常，可将鸟氨酸和苯乙酸盐和/或苯丁酸盐配制为用于口服、静脉内、胃内、血管内或腹膜内给药。可使用标准的药物制剂技术，例如Remington′s The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Lippincott Williams&Wilkins(2005)(以引用的方式全文纳入本文)中公开的那些。

术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这类用于药物活性物质的介质和试剂的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物中。此外，可包括多种助剂，例如本领域中常规使用的助剂。在药物组合物中包含多种成分的注意事项记载于例如Gilman等人(编者)(1990)；Goodman andGilman’s：The Pharmacological Basis of Therapeutics，第8版，Pergamon Press(以引用的方式全文纳入本文)中。

可充当药学上可接受的载体的物质或其组分的一些实例是糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠；粉末状的黄芪胶；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，例如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，例如花生油、棉花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可属的油；多元醇，例如丙二醇、丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；藻酸；乳化剂，例如吐温；润湿剂，例如十二烷基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原的水；等渗盐水；及磷酸盐缓冲溶液。

与主题化合物一起使用的药学上可接受的载体的选择主要取决于化合物的给药方式。

本文所述的组合物优选在单位剂型中提供。本文使用的“单位剂型”是含有一定量化合物的组合物，所述量根据医疗管理规范适合以单一剂量而给予动物，优选哺乳动物受试者。但是，单一或单位剂型的制备并不表示所述剂型是每天给药一次或每个疗程给药一次。考虑将这样的剂型每天给药一次、两次、三次或更多次，并可作为输液剂在一段时间(例如约30分钟至约2-6小时)内给药、或持续输注给药，并且可在一个疗程期间给予多于一次，尽管不特别排除单次给药。技术人员将认识到，制剂并不特别地试图用于整个治疗过程，这样的决定权在于治疗领域的人员而非制剂领域的技术人员。

如上所述的可用的组合物可以是多种合适形式中的任一种以用于多种给药途径，例如用于口服、经鼻、经直肠、局部(包括透皮)、经眼、脑内、颅内、囊内、动脉内、静脉内、肌内、或其他肠胃外给药途径。技术人员将了解，口服和经鼻组合物包括通过吸入给药并利用可获得的方法而制备的组合物。根据所需的具体给药途径，可使用本领域公知的多种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括例如固体或液体填充剂、稀释剂、助溶剂、表面活性剂和包封物质。可包括基本不干扰化合物的抑制活性的任选的药物活性材料。与化合物一起使用的载体的量足以提供实际量的材料用于每单位剂量的化合物的给药。用于制备可用于本文所述方法的剂型的技术和组合物记载于以下文献(全部都以引用的方式纳入本文)中：Modern Pharmaceutics，第4版，第9和10章(Banker&Rhodes，editors，2002)；Liebermanet al.，Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets(1989)；和Ansel，Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms第8版(2004)。

可使用多种口服剂型，包括固体形式如片剂、胶囊剂和颗粒剂。片剂可以是压制的、模印片、肠溶包衣的、糖包衣的、涂膜的、或多层压制的，包含合适的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂、着色剂、调味剂、引流剂和熔化剂。液体口服剂型包括水溶液、乳剂、悬浮剂、由非泡腾颗粒复原的溶液剂和/或悬浮剂以及由泡腾颗粒复原的泡腾制剂，包含合适的溶剂、防腐剂、乳化剂、悬浮剂、稀释剂、甜味剂、熔化剂、着色剂和调味剂。

适于制备经口给药的单位剂型的药学上可接受的载体是本领域公知的。片剂通常包含常规的药学上相容的助剂如惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂例如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂例如淀粉、藻酸和交联羧甲基纤维素；润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。助流剂例如二氧化硅可用于改善粉末混合物的流动特性。为了改善外观可添加着色剂，例如FD&C染料。对于咀嚼片，甜味剂和调味剂例如阿斯巴甜、糖精、薄荷醇、薄荷和水果香料是有用的助剂。胶囊剂通常包含上文所公开的一种或更多种固体稀释剂。载体成分的选择取决于次要的考虑例如味道、成本和货架稳定性，这些不是关键的，并且可由本领域技术人员容易地决定。

经口组合物还包括液体溶液、乳剂、悬浮剂等。适合用于制备这类组合物的药学上可接受的载体是本领域公知的。用于糖浆剂、酏剂、乳剂和悬浮剂的载体的典型成分包括乙醇、丙三醇、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨醇和水。对于悬浮液，典型的助悬剂包括羧甲基纤维素钠、AVICEL RC-591、黄芪胶和海藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚山梨醇酯80；典型的防腐剂包括苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。经口液体组合物也可包含上文公开的一种或更多种成分例如甜味剂、调味剂和着色剂。

可用于实现主题化合物的全身递送的其他组合物包括经舌下、经口腔和经鼻剂型。这样的组合物通常包含一种或更多种可溶性填充物质例如蔗糖、山梨醇和甘露醇；以及粘合剂例如阿拉伯树胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素。也可包括上文公开的助流剂、润滑剂、甜味剂、着色剂、抗氧化剂和调味剂。

对于局部使用，使用含有本文所公开的化合物的乳膏剂、软膏剂、凝胶剂、溶液剂或悬浮剂等。局部制剂通常可由药物载体、共溶剂、乳化剂、渗透促进剂、防腐剂体系及润肤剂组成。

对于静脉内给药，可将本文所述的化合物和组合物溶解或分散于药学上可接受的稀释剂例如盐溶液或右旋糖溶液中。可包含合适的赋形剂以达到所需的pH，所述赋形剂包括但不限于NaOH、碳酸钠、乙酸钠、HCl和柠檬酸。在多个实施方案中，最终组合物的pH为2至8，或优选4至7。抗氧化剂赋形剂可包括亚硫酸氢钠、丙酮合亚硫酸氢钠、甲醛合次硫酸氢钠、硫脲和EDTA。最终静脉内组合物中存在的合适的赋形剂的其他非限制性实例可包括磷酸钠或磷酸钾、柠檬酸、酒石酸、明胶和碳水化合物例如右旋糖、甘露醇和右旋糖酐。其他可接受的赋形剂记载于Powell，et al.，Compendium of Excipients for ParenteralFormulations，PDA J Pharm Sci and Tech 1998，52 238-311和Nema et al.，Excipientsand Their Role in Approved Injectable Products：Current Usage and FutureDirections，PDA J Pharm Sci and Tech 2011，65 287-332中，它们以引用的方式全文纳入本文。也可包含抗微生物剂以得到抗细菌溶液或抗真菌溶液，所述抗微生物剂包括但不限于硝酸苯汞、硫柳汞、苄索氯铵、苯扎氯铵、苯酚、甲酚和三氯叔丁醇。

可向医护人员以一种或更多种固体的形式提供用于静脉内给药的组合物，其在即将给药前用合适的稀释剂如无菌水、盐水或右旋糖水复原。在其他实施方案中，以已准备好经肠胃外给药的溶液的形式提供组合物。在其他实施方案中，以给药前进一步稀释的溶液的形式提供组合物。在包括给予本文所述的化合物与另一种药剂的组合的实施方案中，可将所述组合作为混合物而提供给医护人员，或医护人员可在给药前将所述两种药剂混合，或可将两种药剂分开给药。

在非人动物的研究中，潜在产品的施用以较高的剂量水平开始，剂量逐渐降低直至不再实现所需效果或不良副作用消失。剂量可在较宽的范围内变化，这取决于所需效果和治疗适应症。通常，剂量可在约0.1mg/kg体重和4000mg/kg体重之间，例如约1mg/kg体重和1600mg/kg体重之间。或者，剂量可基于患者的体表面积来计算，如本领域技术人员所理解的。

根据待治疗的病症的严重性和响应性，剂量也可以是缓释组合物的单次给药，使疗程从数天持续至数周或直至实现治愈或实现疾病状态的减轻。当然，待给予的组合物的量将取决于许多因素，包括被治疗的受试者、病痛的严重性、给药的方式、开处方的医师的判断。本文公开的化合物或化合物的组合可以以每天0.1mg/kg至4000mg/kg患者体重的剂量经口服或注射给药。成人的剂量范围通常为1g至100g/天。在独立单位中提供的片剂或其他给药形式可便利地包含一定量的本文公开的化合物或化合物的组合，其在所述剂量或多倍所述剂量下是有效的，例如含有1g至60g(例如约5g至20g、约10g至50g、约20g至40g、或约25g至35g)的单位。给予患者的化合物的精确的量由随诊医师负责。然而，所用的剂量将取决于许多因素，包括患者的年龄和性别、被治疗的确切病症及其严重性。同样地，给药途径可随病症及其严重性的不同而变化。根据这样的参数，降氨剂(例如，鸟氨酸、或苯乙酸盐或苯丁酸盐)的典型剂量可以是0.02g至1.25g/kg体重，例如0.1g至0.5g/kg体重。在一些实施方案中，降氨剂的剂量可以是1g至100g，例如10g至80g、15g至60g、20g至40g、或25g至35g。在一些实施方案中，鸟氨酸和苯乙酸盐/苯丁酸盐可以以10∶1至1∶10，例如5∶1至1∶5、4∶1至1∶4、3∶1至1∶3、2∶1至1∶2、或约1∶1的重量比给药。对于任何特定的受试者，医师将能够决定所需要的降氨剂(例如鸟氨酸以及苯乙酸盐或苯丁酸盐)的剂量。

本文公开的化合物的药物组合物或化合物组合的药物组合物的确切配方、给药途径和剂量可由各个医师根据患者的情况来选择(例如参见Fingl et al.1975，″ThePharmacological Basis of Therapeutics，″在此以引用的方式将其纳入本文，特别引用第1章)。通常，给予患者的组合物的剂量范围可以是约0.1至约4000mg/kg患者体重。根据患者的需要，剂量可以是在一天或多天的过程中给予的单次剂量或连续的两次或更多次剂量。在已对至少一些病症确定了化合物的人用剂量的情况中，本公开内容将使用那些相同的剂量，或为已确定的人用剂量的约0.1％至约5000％、更优选约25％至约1000％的剂量。如果没有确定人用剂量，如在新发现的药物化合物的情况下，可从ED₅₀或ID₅₀值或从体外或体内研究得出的其他合适的值(如通过动物中的毒性研究或药效研究证实的)推导出合适的人用剂量。

应注意，主治医师知晓如何及何时根据毒性或器官功能紊乱来终止、中断或调整治疗。相反地，主治医师还知晓如果临床响应不足(排除毒性)应将治疗调整至较高水平。在目标病症的管理中，给药剂量的大小随待治疗病症的严重性及给药途径的不同而变化。病症的严重性可例如部分地通过标准预后评估方法来评估。此外，剂量以及也许给药频率还将根据个体患者的年龄、体重和响应而变化。与上文讨论的方案相当的方案可用于兽医学。

尽管确切的剂量将基于具体药物而确定，在大多数情况下，可对剂量进行一些概括。在给予药学上可接受的盐的情况下，可以以游离碱计算剂量。在一些实施方案中，组合物每天给药1至4次。或者，可通过持续的静脉输注而给予本文公开的化合物的组合物或化合物组合的组合物，优选以每种活性成分最多达100g/天的剂量给药。本领域技术人员将理解，在某些情况下，有必要将本文公开的化合物以超过、或远超过以上所述的优选剂量范围的量来给药，以有效地且积极地治疗特别有攻击性的疾病或感染。在一些实施方案中，可将本文公开的化合物或化合物的组合在持续治疗的期间给药，例如一周或更长、或数月或数年。

在一些实施方案中，本文公开的化合物或化合物的组合的给药方案是在一段时间内给药，所述时间段可以是例如至少约1周至至少约4周、至少约4周至至少约8周、至少约4周至至少约12周、至少约4周至至少约16周、或更长。本文公开的化合物或化合物的组合的给药方案可以是每天给药三次、每天两次、每天一次、隔天一次、每周三次、隔周一次、每月三次、每月一次，基本连续地或连续地给药。

实施例

在以下实施例中更详细地公开本申请的实施方案的一些方面，所述实施例不意图以任何方式限制本公开内容的范围。

实施例1

对原代人HSC的体外作用

培养原代人肝星状细胞(hHSC)。研究了NH₄Cl攻击(challenge)(0.1-10mM，24-72小时)对hHSC增殖(BrdU)、代谢活性(MTS测定)、活力(中性红)、超微结构改变(TE-M)和基因/蛋白表达(q-PCR/蛋白印迹法)的作用。为测试恢复，在经氨处理的细胞中添加谷氨酰胺并在单独的实验中，采用L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSO-GS抑制剂)预处理以测定谷氨酰胺合成酶(GS)的重要性。

原代hHSC中的高血氨诱导增殖和代谢活性以时间依赖的方式减少，同时甚至在50-100μmol/L的浓度下诱导细胞肿胀和肌成纤维细胞样表型。在超微结构上，经氨处理的hHSC具有剂量依赖的细胞内ER增大，并且这可通过向培养物中添加L-谷氨酰胺而逆转。hHSC增殖的NH₃抑制取决于GS活性，因为MSO和高血氨诱导细胞脱离并防止恢复，这表明谷氨酰胺对hHSC的存活很重要。

这些结果表明，高血氨改变hHSC并赋予肿胀的肌成纤维细胞表型，这随氨降低而逆转。因此，预期所述降低氨的疗法能够令人惊奇地预防和逆转肝纤维化。

实施例2

在BDL大鼠中的体内作用

将结扎了胆管(BDL)28天的大鼠用盐水或鸟氨酸苯乙酸盐处理5天。终止时测量门脉压力并收集组织用于研究。患有高血氨症的BDL大鼠具有增加的促纤维发生的hHSC相关基因(α-SMA、PDGFb-R、Myosin IIA/IIB和Coll1)的肝表达、低的eNOS活性和DDAH-1、及高的门脉压力，所有这些都通过用鸟氨酸苯乙酸盐治疗而得到纠正。

这些结果证明，在体内采用鸟氨酸苯乙酸盐进行的降氨疗法降低了促纤维发生的和激活的HSC基因和蛋白的表达。该数据支持鸟氨酸苯乙酸盐在肝纤维化和肝癌(星状细胞激活可导致肝癌)的治疗(包括预防)中的用途。

实施例3

氨调节人HSC激活

本实施例证明，氨对HSC产生有害的形态学和功能影响，使用降氨剂OP可逆转氨诱导的HSC功能紊乱。

方法

在本实施例中，分离并培养原代人HSC(hHSC)。评估增殖(BrdU)、代谢活性(MTS)、形态学(TEM，光和免疫荧光显微术)、HSC激活标记物、收缩能力、和氧化状态的改变(ROS)以鉴定氨攻击(50μM、100μM、300μM)在24-72小时内的影响。在高血氨的BDL动物中，在OP处理之后，对血浆氨水平、HSC激活标记物、门脉压力和肝eNOS活性的改变进行定量。

人HSC中的体外研究

在得到在Royal Free医院接受手术的患者的知情同意(EC01.14-RF)后，从获自患者的肝组织的楔形部分中分离原代hHSC。根据Mederacke等人(Nature Protocols 2015，10：305-315)分离细胞，如Rombouts K，Carloni V.Determination and characterizationof tetraspanin-associated phosphoinositide-4 kinases in primary andneoplastic liver cells中所述对人肝脏进行改性。在Waugh MG，编者，Lipid SignalingProtocols，第2版，纽约：Springer Science+Business Media；2015，203-212页中。简言之，采用0.01％胶原酶、0.05％链霉蛋白酶和0.001％DNA酶I消化10g总人肝组织而不进行灌注。通过100μm细胞过滤器过滤匀浆，并将流出物在4℃下以50×g离心2分钟。洗涤上清后，使用11.5％Optiprep梯度在4℃下以1400×g进行梯度离心17分钟。最后，收集分界面并洗涤。通过检测CD140b(PDGFRbeta)、CD29(整合素β1)和细胞球蛋白(CYGB)来确定hHSC的纯度。

将所获得的HSC在补充有20％胎牛血清(FBS)、GLUTAMAX、非必需氨基酸1X、1.0mM丙酮酸钠、1X抗生素-抗真菌剂(均来自Life Technologies)的RPMI(下文称为完全HSC培养基)中培养。本研究中所描述的实验在第3代至第8代之间的至少三份独立的细胞制剂的hHSC上进行。

将细胞在富含基础血清的条件(CM完全培养基)下接种(密度26×10³/cm²)24小时，然后在缺乏血清的条件下再培养24小时(SFM)。从培养基中除去外源的谷氨酰胺以避免不可控的氨生成。在实验期间每天采用NH₄Cl处理替换特定处理。

动物模型

所有动物实验都是经伦敦大学学院动物护理伦理委员会批准的，并根据英国1986年动物科学程序法中的内政部指导方针进行。本研究在体重为220-250g雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River UK，Margate，英国)中进行。

在一个实验模型中，给予大鼠高蛋白/氨生成饮食(AA)5天。此外，所有大鼠经历BDL以诱导肝硬化或假手术，如之前所述。

研究设计。(i)在第一组方案中，进一步在体内研究对HSC细胞生物学的氨诱导作用的先前体外观察。在本实验方案中，对动物进行BDL手术并给予其4周时间以发展肝损伤。在第4周期间，将BDL动物随机分为3组：一组包含BDL大鼠，它们接受富含氨基酸(AA)的饮食，此外腹膜内(i.p.)注射盐溶液(n＝4)；第二组接受AA饮食，并每天两次(共5天)采用腹膜内注射降氨剂鸟氨酸苯乙酸盐(OP)0.3g/kg来治疗(n＝4)；第三组由BDL大鼠组成，它们接受盐溶液(i.p.)(n＝4)。除BDL动物外，另一组假手术大鼠也接受盐溶液(i.p.)(n＝4)。在治疗的第5天处死动物。

(ii)在第二个方案中，研究降氨剂OP对氨诱导的门静脉高压的影响。BDL或假手术后四周，将大鼠随机分为三组：假手术大鼠在5天的实验期中每天两次接受盐水(i.p.)(n＝18)；BDL大鼠(n＝20)每天两次(共5天)腹膜内给予盐水；另一组BDL大鼠(n＝11)每天两次(共5天)接受腹膜内注射OP 0.3g/kg。在第4周和第5周之间，麻醉(2％异氟醚)后，通过分离右颈动脉并插管而评估各组大鼠的平均动脉压。此外，通过对门静脉主干的直接插管来测量门静脉压。将所有测量转换为连接至Chart v5.0.1软件的Powerlab(4SP)。记录每隔一分钟采集的三次读数的平均值。收集肝组织并迅速冷冻，储存在-80℃下直至分析。

统计学分析

结果表示为平均值±SEM，并使用单因素方差分析和随后的Dunnet或Tukey多重比较事后检验(如果合适)进行比较。P值≤0.05被认为是显著的。

体内实验数据通过t检验和Mann-Whitney U检验(如果合适)进行分析；P＜0.05被认为是统计学上显著的。使用GraphPad Prism软件(GraphPad，La Jolla，加拿大)将结果表示为平均值±SEM。

结果

氨以剂量依赖的方式降低体外人肝星状细胞(hHSC)中的细胞增殖和代谢。采用不同浓度的氨处理72小时的hHSC显示出细胞增殖(BrdU测定)和代谢活性(MTS测定)的显著抑制(图1A)。此外，采用氨长时间地处理细胞没有导致hHSC中的细胞死亡，如通过进行细胞死亡检测ELISA而评估的(图1B)。此外，这些氨诱导的作用以剂量依赖的方式与细胞形态方面的显著变化一致，如通过光学显微镜所观察到的(图1C)。hHSC，被称为肌成纤维细胞样细胞的，如在完全培养基和缺乏血清的培养基中所显示的，显著地将它们的形态改变为纺锤状成纤维细胞表型，当采用氨处理时出现内溶酶体区室的失调迹象，如通过中性红(被溶酶体滞留的染料)所评估的(图1C)。发现hHSC在mRNA和蛋白水平上表达谷氨酰胺合成酶(GS)。采用L-甲硫氨酸亚砜亚胺(MSO，GS的生物化学抑制剂)预处理细胞，然后暴露于氨，与仅采用MSO的治疗相比，不进一步抑制增殖和代谢活性。

氨诱导细胞质应激的改变，这与细胞代谢/功能和肌动蛋白细胞骨架结构的变化一致。通过光学显微镜观察到的形态学变化通过进行超微结构研究而进一步表征。氨引起细胞溶胶中显著的剂量依赖性变化，并表明存在透明液泡。未观察到线粒体改变和自噬结构(由双层膜表征)的存在(图2A)。注意到，当除去富含氨的培养基并采用完全培养基补充细胞时，细胞增殖和代谢活性恢复(图2B)，从而支持所观察到的氨的作用是短暂的。此外，与对照相比，在胶原凝胶上培养的经氨处理的hHSC显示出显著的收缩能力(图2C、2D)，并且这在3小时后发生并在氨处理24小时后持续，这与先前观察到的形态学变化一致(图2E)。此外，当使用TRICT-鬼笔环肽染色时，氨的长时间处理(72小时)诱导细胞骨架中丝状肌动蛋白的剂量依赖性破坏。F-肌动蛋白网络的再组织与以剂量依赖的方式而存在的透明液泡一致(图2F)。

高血氨导致hHSC中的ROS产生。采用氨长时间处理细胞最长达72小时显示ROS的持续发展，如通过细胞溶胶羧基-DCF的存在所检测到的(图3A)。如Mookerjee等人(Gastroenterology，2007，132：2533-2541)所描述的，进一步定量测量氨诱导的ROS产生的发展，并证实采用氨处理的原代hHSC产生显著的活性氧(ROS)(图3B)。接下来，不同时间点的采用氨处理的细胞在3小时后显示出超氧化物歧化酶2(SOD2)的mRNA表达的明显增加，这持续到氨处理24小时时(图3C)。此外，采用N-乙酰半胱氨酸(NAC)——一种已知的ROS清除剂——进行预处理对先前所观察到的氨处理3小时后SOD2 mRNA表达的增加没有显示出影响。相比之下，采用NAC预处理，然后氨处理24小时，几乎完全消除了氨诱导的SOD2 mRNA表达。

氨改变hHSC中的促纤维发生/促炎性能。如图4A所示，表明氨显著增加α-SMA蛋白表达。在300μM的氨下，波形蛋白(一种重要的中间丝状体)合成增加。通过增加氨的浓度而使肌球蛋白IIa(在HSC收缩中起重要作用)和肌球蛋白IIb(参与HSC激活)都被显著地调节。在P-38 MAPK表达中也观察到对氨的剂量依赖性响应。此外，PDGFR-β——其在HSC细胞增殖中的重要的——在氨的影响下显示出显著的上调，而I型胶原蛋白显示出被氨增加的趋势，尽管这些作用不是统计学上显著的(图4A)。此外，氨诱导MMP2 mRNA表达的强烈和显著的上调，而TIMP1的mRNA表达下调(图4B)。此外，当hHSC采用氨300μM处理72小时(图4C)时，促炎白细胞介素-1β mRNA表达被显著诱导，而50μM和100μM剂量的氨显著上调白细胞介素6mRNA的表达水平。相比之下，氨不改变HSC中白细胞介素8 mRNA的表达(图4C)。这些数据显示，氨诱导的ROS形成导致HSC相关的激活标记物和促炎基因的改变。

胆管结扎和氨治疗在体内改变HSC细胞生物学。研究了高氨血症对整个肝组织中HSC相关信号传导通路的影响。与假手术大鼠相比，在BDL大鼠血浆中氨浓度显著升高(149.3μmol/L±51.1对107.4μmol/L±23.2，P＜0.05)。当饲喂动物富含氨基酸(AA)的饮食并结合BDL手术时，血浆氨水平进一步增加(199.1μmol/L±43.6对149.3μmol/L±51.1，P＜0.05)(图5A)。更重要的是，当采用OP治疗BDL-AA饲喂的动物时，血浆氨水平显著降低(123.9μmol/L±16.1对199.1μmol/L μM±43.6，P＜0.001)(图5A)。

发现OP治疗导致HSC相关的激活标记物的蛋白表达显著降低(图5B)。更具体地，与BDL相比，BDL结合高血氨(AA饮食)显示出肌球蛋白IIb、I型胶原蛋白和PDGF-Rβ蛋白表达的显著增加。相比之下，采用OP的治疗消除了高血氨对与所测试的所有HSC相关的激活标记物相关的BDL大鼠肝脏的强烈作用(图5B)。

该实施例显示，病理生理学氨浓度在体外引起细胞增殖、代谢活性和hHSC激活标记物的显著的且可逆的变化。氨还诱导细胞形态学的显著改变，其特征在于细胞质液泡化、ROS产生、hHSC收缩和促炎基因表达的变化以及HSC相关的激活标记物如α-SMA、肌球蛋白IIa、IIb和PDGF-Rβ的变化。采用氨还原剂OP治疗显著降低血浆氨(BDL 199.1μmol/L±43.65对BDL+OP 149.27μmol/L±51.1，P＜0.05)，这与增加的eNOS活性和HSC激活标记物的消除相关。

实施例4

OTC基因表达和肝尿素氮处理在NAFLD动物中降低，并通过饮食调节和减少细菌移 位而得以恢复

本实施例显示，在NASH的动物模型中鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)的基因和蛋白表达改变，并且这种改变随着动物的恢复(通过恢复饮食和减少细菌移位)而逆转。本实施例还显示，在NAFLD患者中OTC的基因表达改变。

研究了NASH的两种动物模型：a)给Wistar大鼠饲喂高脂肪、高胆固醇饮食(HFHC)10个月，然后以标准饮食恢复2个月，b)给小鼠饲喂缺乏甲硫氨酸-胆碱的饮食(MCD)4周，并采用Yaq-001(Yaqrit Ltd.)(一种已证明可减少细菌移位的纳米多孔碳)处理。此外，在减肥手术中获得来自16名NAFLD人患者的肝活检组织，并测量那些肝活检组织中OTC基因的表达。

在两种NASH动物模型中，OTC的基因和蛋白表达显著降低，并且这种降低通过膳食调节或细菌移位的减少而得以恢复。例如，在HFHC大鼠中，通过将饮食改变为正常食物来逆转NASH，这恢复了OTC基因表达(0.53(CI 0.41-0.68)对0.32(CI 0.28-0.37)，P＜0.05；对照1.00(CI 0.85-1.17))和OTC蛋白表达(5.33±0.21对3.06±0.20，P＜0.01；对照7.41±0.68)(图6)。在MCD小鼠中，细菌移位的减少阻止NASH的发展，恢复OTC基因的表达(0.89(CI0.13-0.16)对0.35(CI 0.08-0.09)，P＜0.01；对照1.00(CI 0.12-0.17))，表明NASH中的炎症有助于OTC基因表达(图7)。

在NAFLD患者中，NASH和纤维化患者比单纯的脂肪变性患者具有显著更低的OTC基因表达(0.82±0.37对1.15±0.24，P＝0.05)(图8)。

如本实施例所示，实验的和人的NASH导致尿素循环酶OTC的基因表达降低，从而危害氮体内平衡。在NASH的动物模型中，随着饮食干预以及通过减少细菌移位，可以将这些变化逆转。本文所示的结果表明NASH、基因表达减少和OTC的功能以及细菌移位之间的联系。此外，氨引起HSC的形态学变化和激活，并且OTC减少可导致高氨血症以及肝损伤和纤维化的进展。本实施例支持将氨和细菌移位用作针对NASH的治疗。

实施例5

高氨血症导致疾病进展，并且给予降氨剂可降低NASH和纤维化的进展

本实施例中研究两种动物模型：(i)Sprague Dawley大鼠被进一步分组，并饲喂富含高脂肪和高胆固醇的饮食(HFHC饮食)或不含高脂肪和胆固醇含量的标准饮食(标准饮食)，最长达16周；和(ii)给大鼠饲喂补充有果糖的高脂肪饮食(HFD+F饮食)，最长达16周。

干预研究：(i)预防治疗——同时给予大鼠OP和补充有脂肪的饮食；

(ii)在饮食诱导的NASH后8周开始干预疗法，以模拟已建立的NASH大鼠模型的治疗性干预。亚组给予OP(0.3g/kg，每天两次，口服)或安慰剂。总共研究了6个实验组：1)标准饮食+盐水；2)标准饮食+OP(1-16周)；3)标准饮食+OP(8-16周)；4)HFHC饮食+盐水；5)HFHC饮食+OP(1-16周)——预防性治疗；和6)HFHC饮食+OP(8-16周)——干预疗法。

(iii)过高的高血氨：另外一组接受富含氨基酸(AA)饮食以诱导高氨血症的大鼠组作为阳性对照。

处死所有动物，并收集组织以研究联系OTC功能紊乱与NASH发展的机制以及高氨血症的药理学调节。

这些实验的主要终点是确定所研究的各组中NASH和纤维化的严重程度。对于NASH和纤维化评分，由不知道动物接受的治疗类型的有经验的肝病理学家来进行组织学研究并使用NASH CRN评分系统(TVL；APD)。在苏木精-伊红染色切片中分析NASH中常见的变量：1)大/小囊泡脂肪变性，2)小叶炎症，3)肝细胞气胀，4)凋亡小体。使用经Sirius Red染色的切片评估纤维化/胶原蛋白累积。此外，进行油红O染色以研究脂质累积的变化并进行Filipin染色以观察胆固醇的变化。

对于次要终点：1)血液样品：使用配有适当试剂盒的Cobas Integra 400多重分析仪(Roche Diagnostics，Burgess Hill，West Sussex，英国)进行血浆生物化学分析(血清ALT、AST、尿素、氨、白蛋白、胆固醇-LDL、胆固醇-HDL胆固醇和甘油三酯)。2)使用qPCR和蛋白印迹分析进行OTC酶活性的测量和OTC(以及其他尿素循环相关酶)的评估。使用免疫组织化学评估OTC定位/分区的变化。3)检测促纤维发生、激活相关的HSC标记物。4)检测促炎细胞因子/趋化因子和巨噬细胞标记物。5)检测细胞凋亡相关标记物。

对于功效(power)计算和统计学分析，进行实验以证明在研究的不同条件之间存在显著差异，功效为80％、p值＜0.05(对选定的组间比较进行ANOVA)。以前的研究表明，各组中n＝12只动物足以证明显著变化。

预期(1)模拟卡路里和脂肪密集型西方饮食的NASH的动物模型具有高氨血症和降低的OTC表达和功能；和(2)采用降氨剂(如OP)治疗可降低肝损伤的生物化学、炎症和组织学指标，并逆转OTC功能紊乱和高氨血症。

实施例6

降氨剂治疗肝癌

在本实施例中，使用大鼠纤维化/HCC模型来确定降氨剂OP是否可以降低HCC发展的风险。

研究动物最长达16周，并检查HCC的发展。将动物(6-8只/组)用二乙基亚硝胺(DEN)/亚硝基吗啉(NMOR)处理以诱导纤维化/HCC，如之前所述(Mohamed et al.，LiverInternational 2015，35(3)：1063-1076)。用于研究的六个动物组列于表1中。

表1.动物组

1.假手术+盐水	4.DEN+盐水
		2.假手术+OP(1-14周)——预防	5.DEN+OP(1-14周)——预防
3.假手术+OP(7-14周)——治疗	6.DEN+OP(7-14周)——治疗

实施例7

氨水平的降低减缓NAFLD的进展

通过采用液体高脂肪饮食(HFD)(71％的kcal脂肪)饲喂雄性大鼠最长达16周而在大鼠中诱导NAFLD。提供了肥胖Zucker大鼠——大鼠中最常用的NAFLD模型之一。将鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合(例如OP)给予HFD大鼠和肥胖Zucker大鼠。预期给予鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合(其降低HFD大鼠和肥胖Zucker大鼠中的氨浓度)可有效减少饮食诱导的NAFLD大鼠模型以及遗传的NAFLD大鼠模型中NAFLD的进展。

实施例8

高血氨使NAFLD和纤维化的进展恶化

通过采用液体高脂肪饮食(HFD)(71％的kcal脂肪)饲喂雄性大鼠三周而在大鼠中诱导NAFLD。提供了肥胖Zucker大鼠——大鼠中最常用的NAFLD模型之一。通过使大鼠缺乏鸟氨酸转氨基甲酰酶(OTC缺陷)，而在饮食诱导的和遗传的NAFLD大鼠模型中产生自发性高血氨。通过在大鼠中突变或删除OTC基因来制备OTC缺陷型大鼠。通过给大鼠饲喂高蛋白饮食，在饮食诱导的和遗传的NAFLD大鼠模型中均产生诱导的高血氨。预期自发性和诱导型高血氨都会使NAFLD和纤维化的进展恶化。

实施例9

重量减轻减缓NAFLD的进展

通过采用液体高脂肪饮食(HFD)(71％的kcal脂肪)饲喂雄性大鼠三周而在大鼠中诱导NAFLD。提供了肥胖Zucker大鼠——大鼠中最常用的NAFLD模型之一。对HFD大鼠和肥胖大鼠进行减重手术。预期减重手术可减缓饮食诱导的NAFLD大鼠模型以及遗传的NAFLD大鼠模型中NAFLD的进展。还预期重量减轻可改善NAFLD大鼠模型中的肝脏氮处理、OTC基因/蛋白表达和功能。

尽管已经参考实施方案和实施例描述了本公开内容，但应理解，在不脱离本公开内容的精神的情况下，可以进行许多和各种修改。因此，本公开内容仅受以下权利要求的限制。

本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文引用的参考文献在其尚未被引用的程度上，以引用的方式全文纳入本文。如果一篇或多篇纳入的文献和类似的材料与本申请(包括但不限于所定义的术语，术语用法，所描述的技术等)不同或相矛盾，以本申请为准。

在至少一些先前描述的实施方案中，一个实施方案中使用的一个或更多个要素可互换地用在另一个实施方案中，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解，在不脱离所要求保护的主题的范围的情况下，可以对上述方法和结构进行各种其他的省略、添加和修改。所有这些修改和改变都旨在落入由所附权利要求所限定的主题的范围内。

对于本文中所使用的大体上任何复数和/或单数术语，如果适用于上下文和/或本申请，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为清楚起见，本文可以明确地阐述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般而言，本文使用的术语，特别是在所附权利要求书(例如，所附权利要求书的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包括”应当解释为“包括但不限于”，术语“具有”应被解释为“至少具有”，术语“包括”应解释为“包括但不限于”等)。本领域技术人员将进一步理解，如果所引入的权利要求叙述中的具体数目是有意图的，则在权利要求中将明确地叙述这种意图，在没有这种叙述时，则不存在这样的意图。例如，为了帮助理解，以下所附的权利要求可包含引导性短语“至少一个”和“一个或更多个”的使用来引入权利要求叙述。然而，这种短语的使用不应解释为意味着通过不定冠词“一”或“一个”而引入的权利要求叙述将含有这种引入的权利要求叙述的特定权利要求限定为仅包含一个这种叙述的实施方案，即使同一权利要求包括引导性短语“一个或更多个”或“至少一个”和不定冠词如“一”或“一个”(例如，“一”和/或“一个”应解释为“至少一个”或“一个或更多个”)；对于用于引入权利要求叙述的定冠词的使用也是如此。此外，即使明确地叙述了所引入的权利要求叙述的特定数目，本领域技术人员将认识到，这种叙述应该解释为意指至少所述的数目(例如，仅叙述“两个叙述”而无其他修饰语，意指至少两个叙述，或两个或更多个叙述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯用法的情况下，通常这种解释意指本领域技术人员将理解的意义上的惯用法(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C等)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯用法的情况下，通常这种解释意指本领域技术人员将理解的意义上的惯用法(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”将包括但不限于仅具有A、仅具有B、仅具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C等)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，任何呈现两个或更多个替代术语的分离的单词和/或短语(不论在说明书、权利要求书或附图中)都应理解为考虑到包括术语之一、任何一个术语、或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

此外，在本公开内容的特征或方面以马库什组的方式进行描述时，本领域技术人员将认识到，本公开内容也因此以马库什组成员的任何个体成员或亚组的方式进行描述。

如本领域技术人员将理解的，对于任何和所有目的，例如在提供书面说明书方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可容易地被认为充分地描述并使同一范围被分成至少相等的两份，三份，四份，五份，十份等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可容易地被分为下三分之一，中间三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解所有用语，例如“最长达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所述的数字，并且是指可以随后被分为如上所述的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个制品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，诸如此类。

本文已经公开了多个方面和实施方案，而其他方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。本文公开的多个方面和实施例是为了说明的目的，而不是限制性的，其真实范围和精神由以下权利要求书指出。

本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书等，以及本文引用的参考文献在其尚未被引用的程度上，以引用的方式全文纳入本文。如果一篇或多篇纳入的文献和类似的材料与本申请(包括但不限于所定义的术语，术语用法，所描述的技术等)不同或相矛盾，以本申请为准。

Claims (32)

1.一种治疗与肝星状细胞(HSC)激活相关的疾病的方法，所述方法包括对需要其的受试者进行降氨疗法。

2.一种延迟与肝星状细胞(HSC)激活相关的疾病的发生或进展的方法，所述方法包括对需要其的受试者进行降氨疗法。

3.权利要求1或2的方法，其中进行降氨疗法包括将降氨剂给予所述受试者。

4.权利要求3的方法，其中所述降氨剂包括磷酸镁产品(MGP)、苯丁酸甘油酯(GPB)、苯乙酸钠、苯丁酸钠(NaPBA)、谷氨酰胺、苯甲酸钠、L-阿拉伯糖、轻泻药、抗生素、鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合，或它们的任何组合。

5.权利要求3的方法，其中所述降氨剂包括鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合。

6.权利要求5的方法，其中将将鸟氨酸的药学上可接受的盐以及苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种单独地给予所述受试者。

7.权利要求6的方法，其中将苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种作为苯乙酸钠或苯丁酸钠而给药。

8.权利要求5的方法，其中将鸟氨酸作为游离单体氨基酸或其生理学上可接受的盐而给药。

9.权利要求5的方法，其中将鸟氨酸和苯乙酸盐作为鸟氨酸苯乙酸盐而给药。

10.权利要求3-9中任一项的方法，其中所述给药是口服、静脉内、腹膜内、胃内或血管内给药。

11.权利要求10的方法，其中所述给药是静脉内给药。

12.权利要求10的方法，其中所述给药是口服给药。

13.权利要求1-12的方法，其中所述与HSC激活相关的疾病是非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。

14.权利要求13的方法，其中所述NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

15.权利要求13的方法，其中所述NAFLD是脂肪变性。

16.权利要求1-12的方法，其中所述与HSC激活相关的疾病是肝癌。

17.权利要求1-12的方法，其中所述与HSC激活相关的疾病是纤维化病症。

18.权利要求17的方法，其中所述纤维化病症是肝纤维化。

19.权利要求16-18中任一项的方法，其中所述受试者患有非酒精性脂肪肝病(NAFLD)。

20.一种预防非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的方法，所述方法包括对需要其的受试者进行降氨疗法。

21.权利要求20的方法，其中进行降氨疗法包括将降氨剂给予所述受试者。

22.权利要求20或21的方法，其中所述NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

23.权利要求20或21的方法，其中所述NAFLD是脂肪变性。

24.权利要求21-23中任一项的方法，其中所述降氨剂包括磷酸镁产品(MGP)、苯丁酸甘油酯(GPB)、苯乙酸钠、苯丁酸钠(NaPBA)、谷氨酰胺、苯甲酸钠、L-阿拉伯糖、轻泻药、抗生素、鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合，或它们的任何组合。

25.权利要求24的方法，其中所述降氨剂包括鸟氨酸与苯乙酸盐和苯丁酸盐中至少一种的组合。

26.权利要求25的方法，其中将鸟氨酸的药学上可接受的盐以及苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种单独地给予所述受试者。

27.权利要求26的方法，其中将苯乙酸盐和苯丁酸盐中的至少一种作为苯乙酸钠或苯丁酸钠而给药。

28.权利要求25的方法，其中将鸟氨酸作为游离单体氨基酸或其生理学上可接受的盐而给药。

29.权利要求25的方法，其中将鸟氨酸和苯乙酸盐作为鸟氨酸苯乙酸盐而给药。

30.权利要求21-29中任一项的方法，其中所述给药是口服、静脉内、腹膜内、胃内或血管内给药。

31.权利要求30的方法，其中所述给药是静脉内给药。

32.权利要求30的方法，其中所述给药是口服给药。