CN107173817A

CN107173817A - sir2蛋白在制备抗氧化的食品或药品中的应用

Info

Publication number: CN107173817A
Application number: CN201710358682.7A
Authority: CN
Inventors: 孙晗笑; 郭晴; 利时雨; 刘梦鸽; 贺凯; 陈露平; 黄金群
Original assignee: Guangzhou Hong Kong Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Hong Kong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明公开了sir2蛋白在制备抗氧化的食品或药品中的应用。本发明经实验发现，sir2蛋白可以正向调控细胞内NADH氧化酶和NADH过氧化物酶的活性，还可正向调控细胞内抗氧化酶的水平，实现清除ROS的作用，因此本发明sir2蛋白可用于制备抗氧化的食品或药品，具有广泛的应用前景。

Description

sir2蛋白在制备抗氧化的食品或药品中的应用

技术领域

本发明属蛋白研究和应用机制领域，更具体地说，本发明涉及一种具有抗氧化作用的sir2蛋白在相关食品或药品中的应用。

背景技术

Sir2(silence information regulator)基因是一类从细菌到高等真核生物都高度保守的NAD+依赖的组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶。Sir2家族基因所编码的Sir2相关蛋白统一命名为Sirtuin。Sir2蛋白对细胞的存活、凋亡、衰老等生理活动的调节具有重要作用。

蛋白质乙酰化能够调节各种细胞功能，包括通过蛋白质识别DNA，蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质稳定性。在蛋白质的翻译后修饰中，可逆的蛋白乙酰化是调节组蛋白和非组蛋白功能的重要翻译后的修饰，这种修饰由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)来分别催化蛋白质赖氨酸残基乙酰化和去乙酰化。HDACs基于与酵母转录抑制剂同源将其分为三类。I类和II类的催化核心相似，且分别与酵母去乙酰化酶Rpd3p和Hda1p同源。第III类与酵母转录阻遏物Sir2p同源，其序列与I和II类没有相似性,这类酶也统一命名为Sirtuin。第III类HDACs中第一个被发现的是酿酒酵母Sir2p，它参与了酵母端粒的沉默，核糖体DNA重复序列的沉默和交配型基因沉默，还参与了DNA双链的损伤修复，细胞周期和染色体稳定性的调控。

在Sirtuin蛋白的保守催化区域约有250个氨基酸残基，这些氨基酸在所有的生物体中都十分保守。通过X—ray观察Sirtuin家族蛋白晶体结构，Sirtuin的结构由两个特征结构域组成。较大的结构域采用经典的吡啶二核苷酸结合折叠，或Rossman折叠构象，其通常存在于结合NAD+/NADH或NADP+/NADPH的蛋白质中。小结构域由两条插入Rossmann折叠内的氨基酸残基组成，其中一条包含锌结合位点，该锌原子与四个固定半胱氨酸等距，另一条包含一个柔性区域的螺旋结构。在大结构域和小结构域之间会形成一个裂隙，该裂隙是乙酰化的赖氨酸残基，NAD+的烟酰胺核糖环和一些小分子结合区域。因为与两个结构域之间的裂隙结合的底物不同，因此，大结构域和小结构域的相对位置会随着结合物的结构不同发生变化。

近来几年来，大量的研究集中于Sirtuin在细胞生理功能上的研究。包括细胞衰老与寿命以及氧化应激等。首次发现Sirtuin家族与衰老有关是Kaeberlein和他的同事发现酵母Sir2p，Sir3p和Sir4p组成的复合物能够调节生命周期。这些基因的缺失会导致酵母的寿命缩短。其中，Sir2的异位表达增加了酵母约25％的寿命。此外，Lin和他的同事发现酵母SIR2基因对于热量限制(CR)引起的寿命延长至关重要。在这些初步发现之后，Sirtuin基因在长寿中的作用陆续在其他物种中被揭示。秀丽隐杆线虫基因组包含四个sirtuin基因，sir2.1-sir2.4。sir2.1与酵母Sir2p最相似，过表达能延长线虫寿命。飞行黑腹果蝇有五种sirtuin同源基因，其中dSir2过表达能延长果蝇寿命。

哺乳动物Sirtuins密切参与氧化应激，其与线粒体ROS生成有关。SIRT1在细胞中是重要的上游调节剂。p53的赖氨酸残基被CBP/p300乙酰转移酶乙酰化，包括在羧基末端区域的Lys 370，372，382和386。然后活化的p53通过线粒体功能障碍和/或参与氧化还原调节的基因表达增加ROS产生。有趣的是，p53通过p21间接激活抗氧化反应中的核转录因子2(Nrf2)。Nrf2结合抗氧化反应元件2(在启动子中发现的顺式作用增强子)，通过增加的抗氧化基因表达，抵抗氧化应激。哺乳动物中有四种FOXO转录因子，其中FOXO1，FOXO3a和FOXO4参与氧化还原调控。SIRT2能够对FOXO1a和FOXO3a去乙酰化，从而增加FOXO依赖的抗氧化酶活性，降低细胞内ROS水平。SIRT3阻止心肌肥厚是通过激活FOXO3a依赖的抗氧化基因，如锰超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，从而降低细胞水平的活性氧。线粒体去乙酰化酶SIRT3能够结合SOD₂并对其乙酰化从而激活SOD₂。SIRT6作为NRF2的辅助激活因子调节人间充质干细胞的氧化还原稳态。

近年来，有研究发现大肠杆菌，沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的Sir2蛋白通过对乙酰辅酶A合成酶去乙酰化从而对自身代谢发挥重要作用。长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌也有Sir2基因(Gene ID:BL1528和Gene ID:LBA0117)。但两种基因的功能还未研究。

发明内容

本发明的目的在于：进一步对sir2蛋白进行研究，确定其作用靶点和作用机制，使其在疾病治疗或相关食品、保健品中发挥作用。

为了实现上述发明目的，本发明根据实验发现，sir2蛋白可用于制备抗氧化的食品或药品。

优选地，所述sir2蛋白来源于长双歧杆菌或嗜酸乳酸杆菌(菌种来源请参见201510323614.8，该申请的第一发明人与本申请第一个发明人一致)。

优选地，本发明所述抗氧化的食品或药品为抗细胞氧化的食品或药品。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗氧化食品，其包括有效剂量的作为活性成分的sir2蛋白、sir2蛋白衍生物、或sir2的活性肽段。

为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种抗氧化药品，其包括有效剂量的作为活性成分的sir2蛋白、sir2蛋白衍生物、sir2蛋白的药用盐，或sir2的活性肽段，以及药学上可接受的载体。

相对于现有技术，本发明经实验发现，sir2蛋白可以正向调控细胞内NADH氧化酶和NADH过氧化物酶的活性，还可正向调控细胞内抗氧化酶的水平，实现清除ROS的作用，因此本发明sir2蛋白可用于制备抗氧化的食品或药品，具有广泛的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式，对本发明及有益效果进行详细说明。

图1为目地基因PCR扩增结果，其中1：双歧杆菌上游同源臂sir2-up；2：kan抗性基因；3：双歧杆菌下游同源臂sir2-down；4：嗜酸乳杆菌上游同源臂sir2-up；5：kan抗性基因；6：嗜酸乳杆菌下游同源臂sir2-down。

图2为长双歧杆菌pUC18△sir2双酶切鉴定结果，其中，1：pUC18△sir2质粒EcoRI/KpnI双酶切；2：pUC18△sir2质粒KpnI/BamHI双酶切；3：pUC18△sir2质粒BamHI/HindIII双酶切；4：pUC18△sir2质粒EcoRI/HindIII双酶切；5：pUC18△sir2。

图3嗜酸乳杆菌pUC18△sir2双酶切鉴定结果，其中，1：pUC18△sir2质粒EcoRI/KpnI双酶切；2：pUC18△sir2质粒KpnI/BamHI双酶切；3：pUC18△sir2质粒BamHI/HindIII双酶切；4：pUC18△sir2质粒EcoRI/HindIII双酶切；5：pUC18△sir2。

图4长双歧杆菌氧胁迫生长曲线。P*<0.05,P**<0.01。

图5嗜酸乳杆菌氧胁迫生长曲线。P*<0.05,P**<0.01。

图6长双歧杆菌NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活性的测定。P*<0.05,P**<0.01。

图7嗜酸乳杆菌NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活性的测定。P*<0.05,P**<0.01。

图8长双歧杆菌赖氨酸乙酰化蛋白分析。

图9长双歧杆菌赖氨酸乙酰化蛋白功能分类。

图10BL-sir2蛋白底物的筛选。

图11蛋白表达结果。

图12HKE293T细胞内抗氧化酶活性测定。P*<0.05,P**<0.01。

图13HKE293T细胞内ROS水平测定。P*<0.05,P**<0.01。

图14RNA-seq分析差异基因。

图15RT-PCR验证差异基因。P*<0.05,P**<0.01。

图16免疫共沉淀结果。

图17FOXO3a乙酰化水平分析。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

实施例1益生菌Sir2缺失突变株的构建及抗氧化作用分析实验

将过夜培养的上述长双歧杆菌或嗜酸乳酸杆菌以1％接种量接种于含100mL预热MRS培养基的注射瓶中，在37℃厌氧条件下生长(注射N²)，当培养至OD_600mm为0.5时，将MRS培养基加入200ml无菌的注射瓶。

长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌各六份样品进行氧胁迫处理，每个菌株分别生长在利用用注射器注入终浓度为0，5，10，15，和21％的氧气，37℃培养24小时。将注射瓶置于摇床中，37℃ 100rpm缓慢振荡培养。在不同时间点收集样品。每份样品处理三次。

长双歧杆菌基因和嗜酸乳杆菌组DNA的提取根据试剂盒具体操作进行。

引物kan F和kan R以pEASY-T1质粒为模板，通过PCR扩增卡那抗性基因kan片段。根据GeneBank中公布的长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌sir2序列，选取sir2基因上游600bp，下游500bp分别作为sir2基因上游同源臂和下游同源臂，命名为sir2-up和sir2-down。分别以sir2-up和sir2-down为模板设计引物序列。引物由上海生工公司合成。

将sir2-up，kan和sir2-down三个基因片段连接，以保证三个基因片段之间无其他序列，从而避免因其他基因的引入造成目的基因表达异常。

表1引物序列

PCR扩增kan抗性基因，sir2-up和sir2-down片段

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环，取5μL PCR扩增产物待经2％琼脂糖凝胶电泳分析。

凝胶电泳：制备2％琼脂糖凝胶,按试剂盒操作进行。

PCR产物回收利用DNA凝胶回收试剂盒对目的片段进行回收、纯化。

将琼脂糖凝胶纯化回收的PCR产物连接到载体上。

sir2-up-kan-sir2-down片段连接反应体系：

大肠杆菌DH5α感受态细胞制备具体按照试剂盒操作进行。

重组质粒的转化：

(1)取适量DH5α感受态细胞,向其中加入9μl连接反应物后的产物,混匀,冰浴30min；

(2)放入42℃水浴，热休克2min；立即转移到冰水浴中冷却1min；

(3)冷却后向其中加入400μl LB液体培养液，37℃,180rpm,震荡培养1h，使其活化

(4)取50ul涂布于含kan和Amp的LB固体培养基上，37℃过夜培养。

(5)挑取单菌落，接种于5ml含kan和Amp的LB液体培养基上，210rpm,37℃过夜培养。

PCR验证转化子：挑取LB平板上长势较好的单菌落，置于含有20μl PCR反应体系中。反应体系如下：

PCR扩增条件：94℃5min，94℃0.5min，54℃0.5min，72℃1.5min，72℃5min，30个循环，反应结束后经2％琼脂糖凝胶电泳分析。

重组质粒的提取：取2ml含有pU18△sir2质粒的大肠杆菌受体菌菌液，具体实验操作按照试剂盒操作进行。

重组质粒酶切鉴定：

(1)将提到得到的重组质粒分别用EcoRI和HindIII进得双酶切鉴定。反应体系如下：

连接反应：

双歧杆菌感受态细胞制备和电转化双歧杆菌具体按照试剂盒操作进行。

NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活性测定：

细胞测定前处理：

(1)将细菌细胞静置在含有70ml培养基的l00ml锥形瓶中，在4℃下离心8000rpm10min。

(2)细胞用盐水洗涤两次，以1:10(v/v)体积的盐水(相对于培养基的体积)悬浮，并通过声波振荡，去除细胞碎片。

(3)在4℃下20,000rpm离心20min，得到无细胞的提取物。

(4)通过的使用邻苯三酚红测定无细胞提取物的蛋白质含量。

NADH-氧化酶活性的测定是将NADH加入到无细胞提取物中时产生的氧的量来测定的：

(1)将0.2ml无细胞提取物，1.5ml磷酸盐或McIlvaine缓冲液(pH 3.5-7.5)和0.8ml水组成的混合物置于Warburg比色杯中。

(2)在比色杯的侧面和副隔室中分别加入5ml 100mM NADH和0.2ml 20％KOH溶液。

(3)在37℃下平衡后，加入NADH溶液，测定氧吸收长达10分钟。从梯度估计的值获得回归线。

NADH-过氧化物酶活性测定：

通过测量在无氧条件下向无细胞提取物中加入NADH时发生的过氧化氢还原速度来测定NADH-过氧化物酶活性。

(1)使用用于过氧化氢测定的装置测定该活性。

(2)在反应容器中混合1毫升McIlvaine缓冲液，pH 4.0-7.0,2.2ml无细胞提取物，2.ml过氧化氢(10ppm)和0.5ml水。

结果：

BL-sir2和LA-sir2已完成测序(参考NCBI序列：NC_004307.2和NC_006814.3)，表2中，LA-sir2蛋白与哺乳动物sirtuin家族蛋白序列进行BLAST分析LA-sir2蛋白与哺乳动物Sirt1-Sirt7蛋白具有相似性。表3中，BL-sir2蛋白和哺乳动物Sirt1-Sirt7蛋白具有相似性。

表2长双歧杆菌BL-Sir2与哺乳动物Sirtuin家族同源分析

表3嗜酸乳杆菌BL-Sir2与哺乳动物Sirtuin家族同源分析

根据NCBI中长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌sir2基因序列，分别设计长双歧杆菌sir2基因上游同源臂引物BL-sir2-up F，BL-sir2-up R和下游同源臂引物BL-sir2-down F，BL-sir2-down R；嗜酸乳杆菌sir2基因上游同源臂引物LA-sir2-up F，LA-sir2-up R和下游同源臂引物BL-sir2-down F。通过琼脂糖凝胶电泳分析，图1显示在左右扩增出目的条带，与预期值一致，说明BL-sir2和LA-sir2上下游同源臂扩增成功。根据pEASY-T1质粒上的kan抗性基因，设计kan一对引物kan F和kan R。通过琼脂糖凝胶电泳分析，图显示在左右扩增出目的条带，与预期值一致，成功获得kan基因片段。

敲除载体pUC△sir2用EcoR I和Hind III双酶切鉴定，结果如图2和图3，可看到在500bp和750bp右有条带，酶切后的片段大小与所插入的目的基因片段大小相符，说明重组质粒上的目的基因片段的插入方向正确，敲除载体构建成功。

根据文献建立的长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌氧胁迫处理条件，当两种菌生长至OD600为0.5时，分别加入0，5，10，15，和21％的氧气进行胁迫，第隔两小时测量两种菌株的OD值，我们观察到长双歧杆菌(图4)和嗜酸乳杆菌(图5)分别在5％和10％的氧浓度条件下生长曲线与厌氧条件下的生长曲线相似。因此选择5％和10％的氧浓度分别为长双歧杆菌和嗜酸乳杆菌最适氧胁迫条件。

如图6所示，5％的氧胁迫条件，长双歧杆菌NADH氧化酶和NADH过氧化物酶的活性降低，在5％的氧胁迫条件下敲出除BL-sir2后，两种抗氧化酶的活性显著性降低，将BL-sir2再转入BL-sir2缺失的长双歧杆菌，两种抗氧化酶的活性显著性地升高。同样地，如图7所示，嗜酸乳杆菌在10％的氧胁迫条件，NADH氧化酶和NADH过氧化物酶的活性降低，在10％的氧胁迫条件下敲出除LA-sir2后，两种抗氧化酶的活性显著性降低，将LA-sir2再转入LA-sir2缺失的嗜酸乳杆菌，两种抗氧化酶的活性显著性地升高。从图中可以看出，长双歧杆菌较嗜酸乳杆菌两种抗氧化酶的差异更明显，因此，选择长双歧杆菌作为下一步研究对象。

实施例2益生菌Sir2蛋白对自身抗氧化作用机制研究

实验方法：长双歧杆菌全蛋白质提取具体操作按试剂盒操作进行：Westernblotting：

取长双歧杆菌40μg蛋白质样品，按试剂盒操作进行实验。一抗为乙酰化赖氨酸单克隆抗体，二抗为小鼠IgG

胰蛋白酶消化水解：

(1)将丙酮沉淀的5mg蛋白，重悬于50mM NH ₄HCO₃(pH8.5)，并加入胰蛋白酶(酶：底物＝1：50)消化水解16h。

(2)胰蛋白酶酶解后的肽段用5mM DTT在下在50℃条件还原30min。

(3)再用15mM碘乙酰胺(IAA)在黑暗中环境下室温烷基化30min。

(4)用15mM半胱氨酸室温下30min终止反应。

(5)为了确保完全消化，向肽混合物中加入胰蛋白酶(酶：底物＝1:100)，室温4h。

(6)酶解后的肽段置于-80℃保存备用。

赖氨酸乙酰化肽段免疫富集：

(1)将肽段用NETN缓冲液重悬后，固定在填有乙酰赖氨酸抗体的Agarose(4-6mg/ml)柱中，4℃下孵育4h。

(2)除去上清液，用NETN缓冲液洗涤三次。

(3)将肽与20μl抗乙酰赖氨酸抗体蛋白A固定的琼脂糖珠在4℃下温和摇动孵育6h进行亲和纯化。

(4)用1ml NETN缓冲液洗涤三次，用ETN洗涤两次。

(5)用50μ0.1％三氟乙酸(TFA)洗脱三次，将结合的乙酰化肽段洗脱下来。将洗脱液在SpeedVac中干燥。

(6)洗脱后的肽段用C18ZipTips，脱盐然后用nano-HPLC/质谱分析

质谱分析及数据库检索：

将富集的乙酰化肽段交由北京百泰派生物公司进行质谱分析与鉴定。串联质谱数据搜索的数据库为NCBI Bifidobacterium longum NCC2705蛋白数据库。

生物信息学分析：

筛选出来的乙酰化基因应用基因本体数据库GO(http://www.geneontology.org)进行分析

结果：用带有赖氨酸乙酰化抗体利用Western blotting分析了长双歧杆菌中所有的赖氨酸乙酰化蛋白，图中显示了长双歧杆菌有一个高水平的赖氨酸乙酰化(图8)。

通过长双歧杆菌赖氨酸乙酰化蛋白的富集，质谱的分析与鉴定，共有65赖氨酸乙酰化蛋白和120个赖氨酸乙酰化位点。

根据蛋白功能分类，将筛选到的65个赖氨酸乙酰化蛋白分为七类(图9)，碳水化合物代谢(Carbohydrate metabolism)、翻译(Trascription)、转录(Transcription)、氨基酸代谢(Amino acid metabolism)、压力应答(StressResponse)、分子伴侣(Chaperones)、核苷酸代谢(Nucleotide Metabolism)。

从实施例1结果可知，BL-sir2能够正向调控长双歧杆菌氧胁迫应答，因此，为了过一步了解BL-sir2调控机制，找出BL-sir2调控氧胁迫应答的底物，将BL-sir2与压力应答蛋白，NAD+，赖氨酸乙酰化抗体共孵育，发现压力应答蛋白不是BL-sir2的底物。因此，BL-sir2可能通过转录因子调控抗氧化酶的活性，将BL-sir2与转录因子，NAD+，赖氨酸乙酰化抗体共孵育，结果显示sigH为BL-sir2底物。随后发现，BL-sir2缺失时，长双歧杆菌胞内sigH的乙酰化水平要高于野生型长双歧杆菌，当BL-sir2缺失株再转入BL-sir2基因后，sigH的乙酰化水平显著性降低。

实施例3益生菌Sir2蛋白真核表达载体的构建

实验方法：

BL-sir2引物的设计与合成：

BL-sir2-F:SEQ ID NO:13，BL-sir2-R:SEQ ID NO:14。

利用引物BL-sir2-F和BL-sir2-R扩增BL-sir2目的基因，并纯化回收PCR产物。具体操作步骤如下：

PCR反应体系如下：

PCR反应条件：94℃5min，94℃0.5min，55℃1min，72℃1min，72℃10min，30个循环，取5μL PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。

目的片段和克隆载体的体外重组:

(1)以sir2-F和sir2-R为上下游引物，进行PCR，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收纯化DNA。

(2)将sir2回收的PCR产物分别进行SaLⅠ和BamHⅠ双酶切，在回收产物。

(3)同时，SaLⅠ和BamHⅠ双酶切pEGFP-N1空质粒，制备载体。

(4)将sir2双酶切后回收产物与pEGFP载体大片段混合，在T4DNA连接酶的作用下，获得sir2表达质粒pEGFP-N1-BL-Sir2.

脂质体转染:根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒操作。

结果：由于BL-sir2蛋白目前没有特异性的抗体。因此，构建了带有EGFP标签的BL-sir2的质粒pEGFP-N1-BL-sir2，以BL-sir2真核表达质粒pEGFP-N1-BL-sir2转染HEK293T细胞后的裂解液作为上样样品，经过Westernblotting分析，在anti-EGFP特异性抗体检测下，发现在有目的条带(图11)。因此鉴定了质粒pEGFP-N1-BL-sir2可以在HEK293T细胞内正常表达。

实施例4益生菌Sir2蛋白对哺乳动物细胞抗氧化作用研究

实验方法：过氧化氢构建细胞氧化损伤模型:

(1)将293T细胞按9×10⁴个/ml的密度接种于六孔板，用含10％FBs的高糖DMEM培养基于5％CO₂、37℃培养箱中培养24h。

(2)细胞贴壁后，用PBS清洗3次，去掉培养液。

(3)用无血清无双抗的DMEM配制不同浓度(0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L、500μMmol/L、1000μMmol/L)的H2O2。

(4)每孔中加入100μl不同浓度的H2O2，放入培养箱培养1h。

(5)吸去H₂O₂，PBS清洗3次去掉培养液，取细胞培养板每孔加入20μl MTT溶液，放入培养箱培养4h。

(6)吸弃各孔MTT溶液，每孔加入150μl DMSO，低速震荡10min。

(7)在490nm波长处，用酶标仪检测吸光值,以OD_测定组/OD_对照组×100％计算细胞存活率。

胞内SOD，CAT，GSH-Px活性检测:

实验结束后，用PBS清洗3次，去掉培养液，收集细胞，在4℃条件下8000rpm离心5min，弃上清。再用PBS清洗，在4℃条件下8000rpm离心5min。加入1ml 1％的Triton X-100,充分混匀后，4℃条件下8000rpm离心10min，收集上清。分别按照试剂盒的说明测量不同处理组上清液中SOD，CAT，GSH-Px活性。

胞内ROS含量检测:用CM-H2DCFDA探针检测胞内ROS，具体操作按试剂盒说明进行。

细胞总RNA提取:将单层的HEK293T细胞弃去原培养基，PBS清洗2遍，每孔接种100μl，37℃，5％的CO₂细胞培养箱中，培养24h，以备总RNA的提取。细胞总RNA的提取利用提取试剂盒进行。

RNA测序:

比较转染BL-sir2对宿主HEK293T细胞的差异表达基因，以转录水平变化均大于或者等于2的基因作为差异表达基因的标准。按照实验分组对差异基因的标准化后信号值进行聚类分析，通过对差异表达基因的表达值的相似性聚类分析可以将基因表达趋势相似性高(correlation＞0.99)的基因归纳为一类基因。选择上调基因作为本实验的重要研究基因。全基因组表达谱基因芯片的主要操作流程包括：cDNA样品反转录合成和标记、标记效率质量的检测、高通量测序、图像采集和数据处理。具体的操作流程委托上海康成生物科技有限公司完成。

GO本体分析:对差异表达基因分别应用基因本体数据库GO(http://www.geneontology.org)

RT-qPCR:

(1)2μg RNA于PCR管中，如下配置反应溶液：

将上述溶液均匀吹打，置于65℃水浴箱中保温10min，使RNA变性。随后立即转移冰上致冷5min，防止RNA复性。

(2)配置如下cDNA合成体系：

(3)将上述8.5μl mix加入变性后冰浴的RNA中，充分混匀，放入离心机中离心。

(4)PCR：42℃反应60min；80℃保温10min；4℃反应5min。

RT-PCR检测基因表达:

对提取的不同处理组293T细胞总RNA样品进行反转录，获得cDNA后进行RT-PCR，对FOXO3a下游7个靶基因进行验证，委托TaKaRa公司设计6对定量PCR引物，以18S基因为内参对照。

表4引物序列

反应体系：

PCR反应条件：95℃5min，95℃15s，60℃15s，72℃32s，40个循环。

每个样品重复3次，采用相对定量法，取3个Ct值得平均数用于计算基因表达量。

目的基因表达量＝2^-△△Ct；△△Ct＝(待测目的基因Ct-内参基因Ct)-(参照目的基因Ct-内参基因Ct)

免疫共沉淀具体操作按试剂盒说明进行实验所用抗体为Anti-flag，anti-FOXO3a结果：

将空质粒pEGFP-N1和pEGFP-N1-BL-sir2转染氧化损伤293T细胞，以正常293T细胞作为空白对照组，检测胞内抗氧化物酶的活性发现(图12)，氧化损伤的293T细胞四种抗氧化酶活性降低，转染BL-sir2后，细胞内的四种抗氧化酶的活性显著升高。

将空质粒pEGFP-N1和pEGFP-N1-BL-sir2转染氧化损伤293T细胞，利用CM-H2DCFDA探针通过细胞流式检测胞内ROS水平，如图13所示，BL-sir2过表达的293T细胞ROS水平明显低于氧化受损的293T细胞。RNA-seq测序检测pEGFP-N1和pEGFP-N1-BL-sir2转染氧化损伤的293T细胞间差异表达的基因，通过实验组与对照组对比，共筛选出67个显著差异基因，其中48个基因显著上调，18个基因显著下调(图14)(差异倍数≥2，p<0.01)。

对67差异表达基因进行GO本体生物过程(biological process)分析，结果显示(表5)，生物过程主要集中在氧化应答(Oxidative respone)。因此，由GO本体生物过程分析可知，BL-sir2在氧化损伤的293T细胞中主参与氧化应答的生物过程。

表5上调的差异基因Gene ontology(GO)分类

在生物过程中的氧化应答过程中有9个差异基因上调，其中有7个差异基因均是FOXO3a下游调控基因。FOXO3a是一类氧化应激转录因子，因此，将FOXO3a下游7个靶基因利用RT-PCR进行反向验证。结果显示(图15)，7个差异表达基因的表达水平与RNA-seq测序的结果一致。

GO本体的生物过程中的氧化应答过程中SOD2不仅是FOXO3a的靶基因，还是Nf-kB和C-Jun的靶基因，因此，为了确定BL-sir2的底物，将这三个基因分别与BL-sir2蛋白进行免疫共沉淀。实验结果显示，只有FOXO3a能够与BL-sir2蛋白发生共沉淀，Nf-kB和C-Jun均未与BL-sir2蛋白产生共沉淀(图16)。因此，可以初步推断FOXO3a是BL-sir2蛋白在293T细胞内发挥抗氧化作用的一个靶点。

为了进一步确定BL-sir2蛋白与FOXO3a的作用方式，通过加入赖氨酸乙酰化抗体检测FOXO3a的乙酰化水平，如图17所示，过表达BL-sir2基因时，FOXO3a的乙酰化水平明显降低，加入乙酰化激活剂TSA后，FOXO3乙酰化升高，BL-sir2的过表达能够使FOXO3a保持较低的乙酰化水平。

SEQ ID NO:1 BL-sir2-upF

ATAAAAGAATTCATGAGCGTTTACGACATCG

SEQ ID NO:2 BL-sir2-upR

GCGAAACGATCTACTTGTTCTC

SEQ ID NO:3 BL-sir2-downF

GTTCTTCTGAATGAGCGTTTAC

SEQ ID NO:4 BL-sir2-downR

ATAAAAAAGCTTCTACTTGTTCTCCGCAATCG

SEQ ID NO:5 BL-sir2-kanF

GAGAACAAGTAGATCGTTTCGC

SEQ ID NO:6 BL-sir2-kanR

GTAAACGCTCATTCAGAAGAAC

SEQ ID NO:7 LA-sir2-upF

ATAAAAGAATTCATGAGAGTAAATATTATGAAGCC

SEQ ID NO:8 LA-sir2-upR

ATGCGAAACGATTTAATTCAATTG

SEQ ID NO:9 LA-sir2-downF

GAGTTCTTCTGAATGAGAGTAAAT

SEQ ID NO:10 LA-sir2-downR

ATAAAAAAGCTTTTAATTCAATTGCTTAAATAC

SEQ ID NO:11 LA-sir2-kanF

CAATTGAATTAAATCGTTTCGCAT

SEQ ID NO:12 LA-sir2-kanR

ATTTACTCTCATTCAGAAGAACTC

SEQ ID NO:13 BL-sir2-F

GTCGACACATCATGGCCCGTTTGGATGGATCC

SEQ ID NO:14 BL-sir2-R

GTCGACGCAACGCCTCACCGAAATACGGATCC

SEQ ID NO:15 SOD2-F

gctccggttttggggtatctg

SEQ ID NO:16 SOD2-R

gcgttgatgtgaggttccag

SEQ ID NO:17 Catalase-F

gctgtgtaactttgggcaagttatt

SEQ ID NO:18 Catalase-R

cctcccaacaaccctatgagttag

SEQ ID NO:19 Prx3-F

acagaagccggaagtctctacct

SEQ ID NO:20 Prx3-R

tcccactgttttgttaaccttgtg

SEQ ID NO:21 Prx5-F

gcaagacggtgcagtgaag

SEQ ID NO:22 Prx5-R

atggcatctcccaccttgatt

SEQ ID NO:23 Trx2-F

gcaaaatccaaaaccacggg

SEQ ID NO:24 Trx2-R

ccctagaggagggaccggaag

SEQ ID NO:25 TrxR2-F

cggcttcgaccagcaaatg

SEQ ID NO:26 TrxR2-R

acaggacggtgtcaaaggtg

SEQ ID NO:27 UCP2-F

ccccgaagcctcgacaatgg

SEQ ID NO:28 UCP2-R

ctgagcttggaatcggacctt

Claims

1.sir2蛋白在制备抗氧化的食品或药品中的应用。

2.根据权利要求1所述sir2蛋白的应用，其特征在于，所述sir2蛋白来源于长双歧杆菌或嗜酸乳酸杆菌。

3.根据权利要求1所述sir2蛋白的应用，其特征在于，所述抗氧化的食品或药品为抗细胞氧化的食品或药品。

4.一种抗氧化食品，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的sir2蛋白、sir2蛋白衍生物、或sir2的活性肽段。

5.一种抗氧化药品，其特征在于，包括有效剂量的作为活性成分的sir2蛋白、sir2蛋白衍生物、sir2蛋白的药用盐，或sir2的活性肽段，以及药学上可接受的载体。