CN107163255B - 氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物载体领域，尤其是一类兼具氧化还原及pH双重响应的无规接枝型生物可降解聚合物药物载体及其制备方法；一类兼具氧化还原及pH双重响应的无规接枝型生物可降解聚合物药物载体，所述药物载体为聚乳酸‑聚苹果酸共聚物接枝氧化还原改性的聚乙二醇和1‑(3‑氨基丙基)咪唑的产物；本方案提供的药物载体结构新颖、设计独特、具有显著的特异性效果，同时兼具氧化还原和pH双重响应特性,可以针对肿瘤细胞内特异性环境诱导药物载体结构发生变化,进而快速将药物释放,实现高效的抗肿瘤效果的同时,降低药物的毒副作用。

Description

氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体及方法

技术领域

本发明属于药物载体领域，尤其是一种氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体及方法。

背景技术

纳米药物载体一般是指粒径大小在10-1000nm的粒子，一般由天然或合成高分子组成。聚合物胶束作为药物载体具有重要的应用价值，可有效的提高药物在肿瘤治疗中的选择性和生物利用度。生物可降解药物载体系统由于具有可降解性、无细胞毒性等优点的到了研究者的极大关注。

但是现阶段，设计和制备具有高稳定性、可官能化和敏感性的生物可降解材料用于构建具有特殊响应性的智能型纳米药物载体以提高肿瘤的治疗效果依然面临巨大挑战。

为此，有必要设计一种高稳定性的、能够利用肿瘤细胞内特殊的微环境作为刺激手段,实现高效入胞的同时,快速将药物释放到胞内,提高疗效的药物载体。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种高稳定性，同时兼具氧化还原和pH双重响应的药物载体。

本发明是这样实现的，一种氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体，所述药物载体为聚乳酸-聚苹果酸共聚物接枝双硫化聚乙二醇和1-(3-氨基丙基)咪唑的产物，其分子式分别如下所示：

其中，m＝60-110，a＝1-3，n＝22-220，b＝4-19。

本方案的另一目的在于提供一种前述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，该方法包括以下步骤：

步骤A：共聚物的制备步骤，所述共聚物制备步骤包括通过L-丙交酯与苹果酸内酯共聚形成聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物，其中所述L丙交酯与所述苹果酸内酯的加入摩尔量为5-12：1。

步骤B：接枝PEG制备步骤，所述接枝PEG制备步骤系通过mPEG与柠康酸酐反应后得mPEG-CA，所述mPEG-CA再与带双硫键的胺反应，获得氧化还原改性的PEG，其中mPEG与柠康酸酐的投料质量比为1:0.1-1；所述mPEG-CA与所述胺的投料质量比为1:0.2-0.7。

步骤C：药物载体制备步骤，所述药物载体制备步骤系将步骤A制备的聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物、步骤B制备的氧化还原改性的PEG以及1-(3-氨基丙基)咪唑进行反应获得所述药物载体，其中所述聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物、所述氧化还原改性的PEG、所述1-(3-氨基丙基)咪唑的摩尔投料比为1：1-3:4-19。

本发明的进一步改进在于，步骤A中所述苹果酸内酯由溴琥珀酸为原料制成。

本发明的进一步改进在于，所述苹果酸内酯的制备包括以下步骤，

步骤Z1:所述溴琥珀酸与三氟乙酸酐室温反应，反应温度为15-40℃，反应时间为3-6h；

步骤Z2：步骤Z1反应产物与苄醇反应，反应温度为40-50℃，反应时间为10-15h；

步骤Z3：步骤Z2反应产物中加入二氯甲烷后进行回流反应，反应温度30-50℃，反应时间3-5h的。

本发明的进一步改进在于，所述步骤A包括以下分步骤，

步骤A1：通过苹果酸内酯和L-丙交酯合成聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物，其中使用辛酸亚锡作为催化剂；

步骤A2：使用Pd/C催化体系对步骤A1获得的聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物进行保护基脱除。

本发明的进一步改进在于，所述步骤A1中反应温度为110-140℃，反应时间为22-27h。

本发明的进一步改进在于，所述步骤A1中反应在真空环境下进行。

本发明的进一步改进在于，所述步骤A2中反应温度为25-40℃，反应时间为9-12h。

本发明的进一步改进在于，步骤B包括以下分步骤：

步骤B1：以二氯甲烷为溶液，加入mPEG、吡啶和柠康酸酐，室温反应30-50h后处理得mPEG-CA；

步骤B2：将所述mPEG-CA与胱胺加入反应器，再加入DCC和DMAP混合溶液体系后反应40-50h，其中溶剂为二氯甲烷；

步骤B3：步骤B2产物过滤沉淀后得到氧化还原改性的PEG。

本发明的进一步改进在于，步骤C包括以下分步骤，

步骤C1：将步骤A制备的聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物、步骤B制备的氧化还原改性的PEG放入DMAP/DCC体系中反应20-30h，反应温度为20-30℃，以THF和二氯甲烷混合液作为溶剂；

步骤C2：补充DMAP/DCC并将1-(3-氨基丙基)咪唑加入步骤C1产物中反应40-55h，反应温度20-30℃；

步骤C3：对步骤C2反应后的产物进行过滤、沉淀、干燥处理得所述药物载体。

本发明的有益效果是：本方案提供的药物载体结构新颖、设计独特、具有显著的特异性效果，同时兼具氧化还原和pH双重敏感特性。可以针对肿瘤细胞特异性环境诱导药物载体结构发生变化，进而快速将药物释放，提高治疗效果。

将本方案的药物载体制备成胶束可对药物进行高效包载，载药胶束能快速的被细胞吞噬，且细胞对兼具氧化还原及pH双重响应的载药胶束的摄取量明显要高于对无敏感性载药胶束，同时随培养时间的增加细胞摄取量增加。体外细胞毒性结果表明空白胶束对正常细胞没有毒性，细胞的相对存活率高于90％；兼具氧化还原及pH双重响应的载药胶束相比于无敏感载药胶束对肿瘤细胞的生长得到了显著的抑制。体内实验结果显示，与无敏感性载药胶束相比，兼具氧化还原及pH双重响应的载药胶束体现出更好的体内抗肿瘤效果，能有效抑制肿瘤及肿瘤部位新生血管生长、细胞的增殖及降低药物的毒副作用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：实施例1中苹果酸内酯的合成路线图。

图2：实施例1中聚左旋乳酸-co-聚苹果酸内酯的合成。

图3：实施例1中乳酸-co-聚苹果酸内酯保护基脱除。

图4：实施例1中mPEG2000-CA的合成。

图5：实施例1中mPEG2000-SS-NH₂的合成。

图6：实施例1中PLM-g-PEG的合成。图7：实施例1中空白胶束的酸碱滴定曲线。

图8：实施例1中(A)PLLA-co-(PMA-g-mPEG-g-API),(B)PLLA-co-(PMA-g-ss-mPEG-g-API胶束在不同浓度GSH溶液中的粒径变化

图9：实施例1中体外药物释放曲线图。

图10：实施例1中空白胶束与3T3(A),4T1(B)共培养48h的毒性评价。

图11：实施例1中DOX/PLLA-co-(PMA-g-mPEG-g-API)(A),DOX/PLLA-co-(PMA-g-SS-mPEG-g-API)(B),盐酸阿霉素(C)与4T1(Ⅰ),Hela(Ⅱ)细胞共培养1h与4h后的激光共聚焦显微镜照片(1代表明场下细胞形态，2代表细胞内阿霉素荧光，3代表前两张图片的叠加，药物浓度均为10μg/mL，标尺25μm)。

图12：实施例1中载药胶束和盐酸阿霉素与4T1细胞共培养的流式细胞仪测定结果，(A)为载药胶束和盐酸阿霉素与4T1共培养0.5h,(B)为载药粒子和盐酸阿霉素与4T1共培养2h,(C)为DOX/A与4T1共培养0.5h、1h、2h，(D)为DOX/B与4T1共培养0.5h、1h、2h,n＝3.(A：DOX/PLLA-co-(PMA-g-mPEG-g-API),B：DOX/PLLA-co-(PMA-g-SS-mPEG-g-API)，药物浓度均为10μg/mL)。

图13：载药胶束与盐酸阿霉素Balb/c小鼠体内抗肿瘤效果及全身毒性评价，注射剂量均为5mg/kg，给药期间小鼠(A)体重变化(w/w₀)。

图14：载药胶束与盐酸阿霉素Balb/c小鼠体内抗肿瘤效果及全身毒性评价，注射剂量均为5mg/kg，肿瘤体积增长率(V/V₀)。

图15：载药胶束与盐酸阿霉素Balb/c小鼠体内抗肿瘤效果及全身毒性评价，注射剂量均为5mg/kg，不同治疗组24天后肿瘤质量。

图16：载药胶束与盐酸阿霉素Balb/c小鼠体内抗肿瘤效果及全身毒性评价，注射剂量均为5mg/kg，不同治疗组24天后肿瘤图(n＝5)

具体实施方式

本发明提供一种兼具氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体及其制备方法。以下结合附图及实施例对本发明进行详细说明。

首先详细说明本实施例的合成方法。

苹果酸内酯(MABz)的合成

具体的合成路线如图1所示，首先准确称取溴琥珀酸19.86g(0.10mol)加入到150mL支口瓶中室温下抽真空6h，在氮气氛围下加入45mL干燥的四氢呋喃并搅拌溶解，在0℃条件下用注射器缓慢滴入三氟乙酸酐22mL(0.15mol)，室温反应4h，浓缩得到棕色液体。继续加入苄醇12.00g(0.11mol)，置于45℃油浴中反应12h。反应结束后向体系中加入150mL乙醚溶解产物，接着用去离子水等体积萃取两次，收集有机相，并加入一定量的无水硫酸镁与活性炭进行干燥脱色。砂芯漏斗过滤并将滤液旋蒸浓缩，干燥得到淡黄色油状液体。

将上述产物转移到500mL两口瓶中并加入40mL去离子水，在剧烈搅拌的条件下用2mol/L NaOH调节其pH值至7.4，接着向体系中加入150mL二氯甲烷，于45℃油浴中回流反应4h，整个反应过程中体系的pH值保持在7.2-7.4。反应结束后用二氯甲烷萃取水相三次，收集有机相并进行浓缩，再用去离子水与饱和氯化钠水溶液洗涤至中性，收集有机相并用无水硫酸镁进行干燥、砂芯漏斗过滤、旋蒸浓缩、干燥得到淡黄色油状液体，硅胶层析柱进行纯化，流动相为石油醚/二氯甲烷(V/V＝1:4)，得到苹果酸内酯单体。

苹果酸内酯(MABz)与L-丙交酯(L-LA)共聚物的合成

如图2所示，分别准确称取苄醇0.0291g(0.27mmol)、苹果酸内酯1.1500g(5.58mmol)与L-丙交酯2.1356g(14.82mmol)加入到10mL安瓿瓶中，加入底物质量分数1‰的辛酸亚锡甲苯溶液，抽真空2h，在高真空的条件下用丁烷气体喷灯进行烧结封端，130℃油浴搅拌反应24h。反应结束后，二氯甲烷溶解，乙醚沉淀，过滤得到白色固体，真空干燥48h至恒重。

聚左旋乳酸-co-聚苹果酸内酯保护基团的脱除

如图3所示，准确称取共聚物2.32g加入到50mL高压反应釜中，用30mL四氢呋喃将产物全部溶解，接着加入Pd/C 0.45g，拧紧反应釜螺母，充放氢气三次，最终拧紧阀门使反应釜内压强保持恒定，将反应釜置于30℃油浴中反应10h后，四氢呋喃稀释至100mL，硅藻土过滤，收集滤液，旋蒸浓缩，乙醚沉淀，过滤得到白色固体，真空干燥箱中室温干燥48h至恒重。

聚乙二醇(mPEG2000)端基羧基化反应

如图4所示，准确称取mPEG2000 1.0000g(0.50mmol)加入到50mL支口瓶中，在油浴105℃中真空除水3h，等体系冷却到室温后充入氮气保护，接着用注射器加入0.2900g(2.59mmol)柠康酸酐(CA)以及20mL二氯甲烷溶液使底物完全溶解，冰浴条件下缓慢滴入0.8mL吡啶，待使体系自然升到室温并继续反应40h后，旋蒸浓缩，乙醚沉淀，过滤得到白色固体，于真空干燥箱中室温干燥48h至恒重。

聚乙二醇接枝胱胺

如图5所示，准确称取mPEG2000-CA 0.8g与胱胺0.31g加入到50mL支口瓶中，加入8mL二氯甲烷与8mLDMF使底物全部溶解，接着分别称取1.65g DCC与0.0010g DMAP溶解于12mL二氯甲烷中，在冰浴的条件下缓慢将DCC与DMAP的混合溶液滴加到体系中，滴加完毕后待体系逐步升到室温后继续反应48h后，旋蒸浓缩并加入15mL二氯甲烷置于-20℃冰箱中静置3h，中性滤纸过滤后，旋蒸浓缩，乙醚沉淀，过滤得到白色固体，于真空干燥箱中室温干燥48h至恒重。

PLLA-co-PMA接枝功能化改性聚乙二醇(mPEG2000-CA-SS-NH₂)与1-(3-氨基丙基)咪唑(PLM-g-ss-PEG)的合成

如图6所示，准确称取PLLA-co-PMA 0.5400g、mPEG2000-CA-SS-NH₂ 0.2400g加入到100mL支口瓶中，抽真空充氮气三次，在氮气氛围下加入10mL四氢呋喃以及5mL二氯甲烷使底物完全溶解；接着称取DCC 2.9000g、DMAP 0.0020g溶解于10mL THF中，在冰浴的条件下缓慢滴加到反应体系中，滴加完毕后使其逐渐升到室温继续反应24h；接着准确称取1-(3-氨基丙基)咪唑0.0754g，用5mL四氢呋喃溶解稀释后注入反应体系中，同时称取DCC2.0000g、DMAP 0.0020g并用10mL THF将其溶解，同样在冰浴的条件下用注射器将其缓慢滴加到反应体系中，滴加完毕后使其逐渐升到室温继续反应48h。反应结束后，使用旋转蒸发仪旋蒸浓缩除去溶剂并加入15mL二氯甲烷溶解，置于-20℃冰箱中静置3h，取出后迅速使用砂芯漏斗进行过滤，收集滤液，旋蒸浓缩，乙醚沉淀，过滤得到产物，置于真空干燥箱中室温干燥48h至恒重。

通过上述6步反应获得本具体实施例的药物载体材料。

为了对本药物载体材料的性质和优点做出进一步说明，接下来介绍本方案的模拟实验。

首先将本方案的药物载体材料制备成为载药胶束。本实验中我们采用溶剂挥发法制备聚合物空白胶束，用透析法制备聚合物载药胶束。聚合物空白胶束的制备方法如下：称取5mg聚合物溶于200μL色谱纯四氢呋喃中，在高速磁力搅拌下将其缓慢滴加到10mL蒸馏水中，待四氢呋喃挥发完毕即得到空白胶束。聚合物载药胶束的制备方法如下：称取5mg聚合物与1.25mg疏水阿霉素分别溶于200μL和300μL色谱纯二甲基亚砜中，接着将两者混合并在高速磁力搅拌下将其缓慢滴加到10mL蒸馏水中搅拌过夜，然后将其转移到截透析袋，每隔4h换一次水，当透析袋中的二甲基亚砜被完全除去后将其转移到15mL的离心管中离心除去未被载入的疏水阿霉素，离心条件为3000rpm，5min，取上层液体备用。

图7是实施例1中空白胶束的酸碱滴定曲线。结果证明聚合物胶束具有一定的缓冲能力，这有利于其在低pH条件下吸收质子使胶束结构变得松散，促进胶束内部药物的释放。接枝了咪唑基团后的聚合物空白胶束滴定曲线如图所示，其中空白对照组在滴入0.01MNaOH溶液后pH值迅速上升并很快达到目标值；而接枝了咪唑基团的聚合物空白胶束由于咪唑基团具有很好的缓冲能力而缓慢上升，其在pH 5.94至pH 7.69出现了缓冲平台，表明合成的材料具有良好的pH缓冲能力。

当含有还原敏感键的聚合物胶束在到达高浓度还原环境后，其包含的双硫键将发生断裂，引起胶束结构变化，进而促进药物快速释放。图8为胶束在不同GSH浓度下的粒径变化图。图8(A)为无还原敏感聚合物胶束的粒径变化，在有还原剂及无还原剂存在条件下，聚合物胶束的粒径均没有很大的变化，说明高浓度还原环境对无敏感聚合物胶束没有影响。图8(B)为带有还原敏感键的聚合物胶束粒径变化，当不加入还原剂时，聚合物胶束的粒径在4个小时后几乎无变化，对于加入低浓度GSH(0.5mM)的聚合物胶束，粒径稍有增加，因为体系中存在的GSH使胶束中的双硫键部分断裂，使粒径增大，而当GSH浓度为10mM时，胶束的粒径增加明显，这主要是由于体系中大量双硫键被破坏，使得胶束的亲疏水发生变化，从而导致胶束聚集，粒径增大。

为研究载药胶束的药物释放行为，我们选择在PBS7.4、ABS5.0的条件下进行实验，并加入GSH用于模拟肿瘤微环境下的药物释放。图9为PLLA-co-(PMA-g-mPEG-g-API)(A材料)PLLA-co-(PMA-g-ss-mPEG-g-API)(B材料)聚合物载药胶束在不同条件下的药物释放曲线。从图中我们可以看出，在释放初期，两种载药胶束都存在着快速释放的现象，随着释放时间的增加，释放速率趋于平缓，在相同条件下，两种载药胶束的释放速度相当。在pH 7.4的弱碱性介质中，两者的总释放量都不高，释放48h后累积释放量分别为58％与63.7％；当pH值降低后，两者的释放速率与释放量明显增加，在48h的累积释放量分别为75％与79.5％，这是由于在酸性条件下，咪唑基团接收质子而产生了膨胀，使整个胶束结构变得松散，从而有利于阿霉素从内部迁移出来。而当加入还原型GSH后，PLLA-co-(PMA-g-ss-mPEG-g-API)载药胶束的释放速率与释放量达到最大，48h的累积释放量达到91.5％，72h更是高达96％，这是因为在加入还原剂后PLLA-co-(PMA-g-ss-mPEG-g-API)载药胶束的亲疏水段发生了断裂，导致阿霉素释放速率的增加。

对于纳米药物输送系统而言，细胞毒性是评价其生物相容性的重要指标，只有具备低毒性或无毒性的药物载体才有望进一步使用。本研究采用CCK8法评价空白胶束对3T3及4T1细胞的细胞毒性。如图10所示，空白胶束在50-200g/mL浓度范围对3T3及4T1细胞没有细胞毒性，即使培养48h，细胞的存活率高于90％，参照国家标准，可以评定胶束无细胞毒性，具有良好的细胞相容性。

图11为载药胶束与4T1、Hela细胞共培养1h与4h激光共聚焦图。对于两种细胞，当共培养时间为1h时，由于盐酸阿霉素主要通过扩散进入细胞，在1h时已经到达了细胞核，而两种载药胶束的细胞内荧光都比较微弱，且大部分均在细胞质中，其中兼具氧化还原和pH双重响应的胶束荧光强度略强于无敏感载药胶束。当延长培养时间(4h)，盐酸阿霉素及载药胶束在细胞中的荧光强度明显增强，但兼具氧化还原和pH双重响应的胶束的荧光强度依然强于无敏感组，且载药胶束组的荧光主要位于细胞质中，仅有少量进入到细胞核中。说明在细胞培养过程中，胶束粒子进入细胞后，由于高浓度的还原环境，胶束中双硫键断裂，阿霉素的释放速度快于无敏感载药胶束。

另外，我们通过流式细胞术来定量表征细胞对载药胶束的摄取情况。图12为与4T1共培养后的结果图，其中A为对比材料，B材料为具有还原敏感性能的材料。从A、B图中可以发现，当培养0.5h时，A、B材料用具体的名字之间的差异较小，具有还原敏感性的B材料稍强于对比材料A，由于盐酸阿霉素主要通过扩散进入细胞，因此其荧光强度比胶束组高，这与激光共聚焦的结果相吻合。在培养2h后，细胞中的荧光强度显著增加，A与B之间的差别也显现出来，B与盐酸阿霉素之间的强度比较接近，这是由于载药胶束进入细胞内，由于双硫键的断裂，使得药物从胶束核内迅速释放出来，增加了胞内的荧光强度。

从C、D图中可以看出，随着培养时间的继续增加，细胞内的荧光强度均增强，主要归因于进入细胞中载药胶束越来越多，且药物在细胞中的释放量增加引起的。相比于A材料，由于B拥有更快的释放速度，因此相对于0.5h与h，在培养2h后B材料的荧光强度增加明显。

在保证安全性的条件下，我们采用对载药胶束对荷瘤小鼠的皮下瘤进行了抗肿瘤效果的评价。

本实验所选用的为SPF级雄性Balb/c小鼠，5-6周龄，体重20±1g，购买于成都达硕实验动物有限公司。用于建立肿瘤模型的细胞为小鼠乳腺癌细胞(4T1)。

动物肿瘤模型的建立

将小鼠后腿前上方的皮毛剔除便于建立肿瘤模型以及肿瘤体积的测量。培养4T1细胞，当细胞生长状态良好并增殖达到70％时用胰酶将细胞消化收集，将收集起来的细胞转入离心管中并以1000rpm的速度离心5分钟，吸去上层清液并加入一定体积的PBS7.4缓冲溶液轻轻吹散细胞进行洗涤，按上述方法再次离心并洗涤，吸出洗涤液并加入适量PBS7.4缓冲溶液进行细胞计数，最终将其配置成浓度为每50μL有5×105个细胞的细胞悬液。将其分装到0.2mL的离心管中，每个离心管中细胞悬液的体积为50μL。

用胰岛素注射器将细胞悬液注射到小鼠后腿前上方皮下，每个小鼠接种50μL，在注射与拔出胰岛素针头前，对注射部位使用75％乙醇溶液消毒。注射完毕后每天观察肿瘤的生长情况。

体内抗肿瘤效果评价

使用游标卡尺对小鼠的肿瘤大小进行测量并计算肿瘤体积，其计算公式为V＝ab2/2(a为测量的长径，b为测量的短径)。当肿瘤体积达到到50-100mm3，开始进行药物注射。在注射之前，我们将肿瘤生长良好并符合实验条件的小鼠进行随机分组并标记，对它们的肿瘤体积与体重进行准确的测量并记录，为了保证实验结果的可靠性，我们选择同一时间段进行测量实验，且肿瘤体积的测量人员为同一人。本研究采用的是小鼠尾静脉注射，具体方法如下：取一定量的载药胶束冻干粉，按每只老鼠每次注射200μL，根据其载药量以及小鼠的体重用生理盐水将其配置成一定浓度的溶液，使用胰岛素注射器吸取200μL的载药胶束通过尾静脉进行注射，在注射与拔出胰岛素针头前，对注射部位使用75％乙醇溶液消毒。盐酸阿霉素对照组直接注射200μL一定浓度的盐酸阿霉素溶液，空白对照组注射200μL生理盐水。每只小鼠的给药量为5mg/kg，共给药四次，每次间隔2天。待给药组与对照组间的肿瘤体积存在明显差异时结束观察。将小鼠取血后断颈处死并解剖取出脏器与肿瘤组织。

图13-16为Balb/c小鼠在进行药物治疗后的肿瘤体积及全身毒性评价图。从图13中可以看出，注射生理盐水与载药胶束组小鼠体重稳步增加，最后的增长率分别为15.4％、13.1％与11.2％，而注射盐酸阿霉素组的小鼠体重在注射后体重明显下降，最大为3.8％，这是由于盐酸阿霉素的全身毒性较强，而将阿霉素通过载体进行包载后后可大大降低药物的全身毒性。

图14为给药后小鼠肿瘤体积增长率曲线。从图中可以看出，相比生理盐水空白组，给药组在给药前期肿瘤生长较慢，其抑制肿瘤生长的效果与盐酸阿霉素相当。随着给药次数的增加，载药纳米粒子具有较好的肿瘤抑制效果，但与盐酸阿霉素相比其抑瘤效果还不佳。这可能是由于盐酸阿霉素组小鼠其体内的生理器官受到破坏，且在宏观上表现为体重的下降，进而引起小鼠的精神萎靡，以至于肿瘤的营养供应受到影响从而体现出了假阳性的效果，这种效果是以巨大的毒性牺牲小鼠自身健康来获得的。而相比于非敏感性载药胶束而言，氧化还原敏感载药胶束体现出更好的抗肿瘤效果，主要是由于载药胶束更易进入到肿瘤组织，且药物可通过肿瘤细胞中高GSH引入载药胶束结构破坏进而快速的释放出来抑制肿瘤细胞的生长。

图15、16为实验24天后小鼠肿瘤重量及解剖图，其趋势与图14一致，说明我们设计的氧化还原敏感载药胶束达到了预期的目的，具有很好的抑制肿瘤生长的效果。

本方案提供的药物载体结构新颖、设计独特、具有显著的特异性效果，同时兼具氧化还原和pH双重响应特性。可以针对肿瘤细胞内特异性环境发生胶束的开闭，从而有效的将药物释放到细胞中，提高治疗效果的同时降低药物的毒副作用。

将本方案的药物载体制备成胶束后发现载药胶束能快速的被细胞吞噬，且细胞对兼具氧化还原和pH双重响应的载药胶束的摄取量明显要高于对无敏感性载药胶束，且随培养时间的增加细胞摄取量增加。体外细胞毒性结果表明空白胶束对正常细胞没有毒性，细胞的相对存活率高于90％；兼具氧化还原和pH双重响应的载药胶束相比于无敏感载药胶束对肿瘤细胞的生长能显著的抑制。体内实验结果显示，与无敏感性载药胶束相比，兼具氧化还原和pH双重响应的载药胶束具有更好的体内抗肿瘤效果，能有效抑制肿瘤及肿瘤部位新生血管生长、细胞的增殖及降低药物的毒副作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体，其特征在于：所述药物载体为聚乳酸-聚苹果酸共聚物接枝氧化还原改性的聚乙二醇和1-(3-氨基丙基)咪唑的产物，其分子式分别如下所示：

其中，m＝60-110，a＝1-3，n＝22-220，b＝4-19。

2.一种权利要求1中所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤A：共聚物的制备步骤，所述共聚物制备步骤包括通过L-丙交酯与苹果酸内酯共聚形成聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物，其中所述L丙交酯与所述苹果酸内酯的加入摩尔量为5-12：1；

步骤B：接枝PEG制备步骤，所述接枝PEG制备步骤系通过mPEG与柠康酸酐反应后得mPEG-CA，所述mPEG-CA再与带双硫键的胺反应，获得氧化还原改性的PEG，其中mPEG与柠康酸酐的投料质量比为1:0.1-1；所述mPEG-CA与所述胺的投料质量比为1:0.2-0.7；

步骤C：药物载体制备步骤，所述药物载体制备步骤系将步骤A制备的聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物、步骤B制备的氧化还原改性的PEG以及1-(3-氨基丙基)咪唑进行反应获得所述药物载体，其中所述聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物、所述氧化还原改性的PEG、所述1-(3-氨基丙基)咪唑的摩尔投料比为1：1-3:4-19。

3.根据权利要求2所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤A中所述苹果酸内酯由溴琥珀酸为原料制成。

4.根据权利要求3所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于：所述苹果酸内酯的制备包括以下步骤，

步骤Z1:所述溴琥珀酸与三氟乙酸酐室温反应，反应温度为15-40℃，反应时间为3-6h；

步骤Z2：步骤Z1反应产物与苄醇反应，反应温度为40-50℃，反应时间为10-15h；

步骤Z3：步骤Z2反应产物中加入二氯甲烷后进行回流反应，反应温度30-50℃，反应时间3-5h的。

5.根据权利要求2所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤A包括以下分步骤，

步骤A1：通过苹果酸内酯和L-丙交酯合成聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物，其中使用辛酸亚锡作为催化剂；

步骤A2：使用Pd/C催化体系对步骤A1获得的聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物进行脱除保护基。

6.根据权利要求5所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于，所述步骤A1中反应温度为110-140℃，反应时间为22-27h。

7.根据权利要求5所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤A1中反应在真空环境下进行。

8.根据权利要求5所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于：所述步骤A2中反应温度为25-40℃，反应时间为9-12h。

9.根据权利要求2所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于：步骤B包括以下分步骤：

步骤B1：以二氯甲烷为溶液，加入mPEG、吡啶和柠康酸酐，室温反应30-50h后处理得mPEG-CA；

步骤B2：将所述mPEG-CA与胱胺加入反应器，再加入DCC和DMAP混合溶液体系后反应40-50h，其中溶剂为二氯甲烷；

步骤B3：步骤B2产物过滤沉淀后得氧化还原改性的PEG。

10.根据权利要求2所述的氧化还原和pH双重响应的无规-接枝型药物载体的制备方法，其特征在于，步骤C包括以下分步骤，

步骤C1：将步骤A制备的聚乳酸-co-聚苹果酸共聚物、步骤B制备的氧化还原改性的PEG放入DMAP/DCC体系中反应20-30h，反应温度为20-30℃，以THF和二氯甲烷混合液作为溶剂；

步骤C2：补充DMAP/DCC并将1-(3-氨基丙基)咪唑加入步骤C1产物中反应40-55h，反应温度20-30℃；

步骤C3：对步骤C2反应后的产物进行过滤、沉淀、干燥处理得所述药物载体。

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