CN107164555A - 一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 - Google Patents
一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107164555A CN107164555A CN201710594522.2A CN201710594522A CN107164555A CN 107164555 A CN107164555 A CN 107164555A CN 201710594522 A CN201710594522 A CN 201710594522A CN 107164555 A CN107164555 A CN 107164555A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- gene promoter
- primer
- methylation
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020002202 Adenosylhomocysteinase Proteins 0.000 title claims abstract description 44
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 43
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 10
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 title abstract description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 55
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 22
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 22
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 20
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 18
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 16
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 14
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 12
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 10
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 102000005234 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 5
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 5
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 claims description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 3
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 3
- 108010073644 Cystathionine beta-synthase Proteins 0.000 claims 1
- -1 adenosyl homocysteines Chemical class 0.000 claims 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 67
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 26
- 206010008190 Cerebrovascular accident Diseases 0.000 description 22
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 22
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 description 6
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 4
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 102100020925 Adenosylhomocysteinase Human genes 0.000 description 3
- 101000716952 Homo sapiens Adenosylhomocysteinase Proteins 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFFHZYDWPBMWHY-UHFFFAOYSA-N L-Homocysteine Natural products OC(=O)C(N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 238000003491 array Methods 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006607 hypermethylation Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 2
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- SFSJZXMDTNDWIX-YFKPBYRVSA-N L-homomethionine Chemical compound CSCCC[C@H](N)C(O)=O SFSJZXMDTNDWIX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003200 chromosome mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000024756 faint Diseases 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- SFSJZXMDTNDWIX-UHFFFAOYSA-N homomethionine Natural products CSCCCC(N)C(O)=O SFSJZXMDTNDWIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005555 hypertensive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001631 hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 208000018316 severe headache Diseases 0.000 description 1
- 206010042772 syncope Diseases 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本发明还公开了一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度的测定方法。本发明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒采用荧光定量PCR技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法。
背景技术
脑卒中(cerebral stroke)是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点，临床表现为严重头痛、昏厥、失去意识等，这也成为了中国成年人残疾的首要原因。脑卒中患者需要长期服用降压药，定期进行常规检查，控制颅内压，可见脑卒中患者给社会和家庭带来了极大的经济负担。脑卒中是一种由遗传和环境因素共同作用引起的复杂性疾病，对脑卒中发病机制的探索进而寻找出适合诊断治疗药物已然成为了现今研究的一个热点。而在脑卒中的发病机制尚未清晰阐明的情况下，对脑卒中的预防以及早期检测更是刻不容缓。
腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase，AHCY)是一种蛋白编码基因，它能够催化S-腺苷同型半胱氨酸可逆水解为腺苷和L-高半胱氨酸。该蛋白的缺乏是高蛋氨酸血症的极大风险因素，进而提高脑卒中的患病风险。腺苷高半胱氨酸酶是由位于20号染色体的腺苷高半胱氨酸酶基因(adenosylhomocysteinase gene，AHCY)(Chr20：34234840-34311976)编码而成的。现在国内外的研究已经确定同型半胱氨酸水平与脑卒中的发生有着较大的关联，但是对同型半胱氨酸水平的影响因素与其调控机制的研究较少。
目前关于腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒和测定方法。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，对指定基因启动子区域DNA甲基化水平的进行测定，是一种检测方便、普适度高、准确率高的检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，该方法检测方便、普适度高、准确率高。
为实现本发明的第一个目的本发明所采用的技术方案如下：
一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：
Primer F：5’-GGTCGTAATCGGTTGTAG-3’(SEQ ID NO.1)和
Primer R：5’-CAATTCCTATTCCCAAACTAAA-3’(SEQ ID NO.2)。
作为进一步的方案，本发明所述的检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光定量PCR反应液还包括10×PCR buffer、MgCl2、d NTPs、热启动Taq DNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光染料为2×SYBR Green I。
作为进一步的方案，本发明所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/LMgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，本发明所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
为实现本发明的第二个目的本发明所采用的技术方案如下：
一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其包括
DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即腺苷高半胱氨酸酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。
作为进一步的方案，上述测定方法中所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM PrimerR 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，上述测定方法中所述的甲基化水平测定步骤具体如下：首先将转化后的DNA样本加入到热启动Taq DNA酶中，然后加入一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物Primer F和Primer R；最后依次加入DNA模板、10×PCRbuffer、Mg Cl2、d NTPs、2×SYBR Green I以及无菌双蒸水。
作为进一步的方案，上述测定方法中所述的PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1.本发明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒采用荧光定量PCR技术，具有实时监测，特异性强，精确定量的优势，确保诊断结果的精确性；
2.本发明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒是基于血浆、唾液、尿液等体液检查的试剂盒，随时随地进行检测，并且能在较短时间内取得检测结果；
3.本发明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒检测费用低、易于为大众所接受。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为腺苷高半胱氨酸酶基因的染色体定位图。
图2为腺苷高半胱氨酸酶基因的测序图。
图3为腺苷高半胱氨酸酶基因的电泳图。
具体实施方式
本发明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：
Primer F：5’-GGTCGTAATCGGTTGTAG-3’(SEQ ID NO.1)和
Primer R：5’-CAATTCCTATTCCCAAACTAAA-3’(SEQ ID NO.2)。
作为进一步的方案，本发明所述的检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光定量PCR反应液还包括10×PCR buffer、MgCl2、d NTPs、热启动Taq DNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。
作为进一步的方案，本发明所述的荧光染料为2×SYBR Green I。
作为进一步的方案，本发明所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/LMgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，本发明所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
本发明所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其包括
DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；
利用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即腺苷高半胱氨酸酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。作为进一步的方案，上述方法中所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
作为进一步的方案，上述方法中所述的甲基化水平测定步骤具体如下：首先将转化后的DNA样本加入到热启动Taq DNA酶中，然后加入一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物Primer F和Primer R；最后依次加入DNA模板、10×PCR buffer、MgGl2、d NTPs、2×SYBR Green I以及无菌双蒸水。
作为进一步的方案，上述方法中所述的PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。
由于腺苷高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase，AHCY)是一种蛋白编码基因，它能够催化S-腺苷同型半胱氨酸可逆水解为腺苷和L-高半胱氨酸。腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区域的高甲基化水平会导致该基因的低表达甚至表达沉默，导致血氨大幅度升高，可能成为脑卒中的风险因素。因此，通过检测腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化水平作为非诊断性检测脑卒中的一种方法，为辅助诊断脑卒中提供依据。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中，除在本发明有特殊限定外，所采用的试剂、原料和设备均可以通过购买获得。
实施例1
一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/Ld NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL；其中Primer F和Primer R核苷酸序列如下：
Primer F：5’-GGTCGTAATCGGTTGTAG-3’(SEQ ID NO.1)和
Primer R：5’-CAATTCCTATTCCCAAACTAAA-3’(SEQ ID NO.2)：
所述的阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
实施例2
一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其包括
DNA提取步骤：利用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪提取全血基因组DNA并利用NanoDrop2000超微量分光光度计检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线，曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即腺苷高半胱氨酸酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM PrimerF0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBRGreen I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应条件如表1：
表1
由图1可知被检测序列所在区域具体位置为Chr20：32891017-32891140，据此进行后续甲基化分析；由图2的DNA序列分析结果表明，模板DNA的亚硫酸氢盐转化成功；图3显示毛细管电泳证实扩增片段长度为124bp。
应用实施例1
选择样本：对深圳地区脑卒中病人172例作为病例组(62.00(61.00，67.00)岁)和年龄匹配且无脑卒中家族史的289名正常者作为对照组(65.00(59.00，69.00)岁)；所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测尿酸水平、甘油三酯等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml作为样本入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，备用；
DNA提取步骤：利用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪(中国厦门，致善生物科技)提取全血基因组DNA并利用NanoDrop2000超微量分光光度计(美国，Thermo FisherScientific)检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNAMethylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线，曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即腺苷高半胱氨酸酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。所述的PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBRGreen I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL；
所述的PCR扩增反应条件与实施例2的表1中相同；
甲基化率的计算结果参见表2-4：
表2：深圳地区病例组与对照组间的比较(n＝784)
注：n表示样本个数，p值是两个数组之间进行对照的结果，若其小于0.05，则表示这两个数组间具有较大的统计学差异，表述为阳性结果，用字符加粗来强调。Pa是脑卒中患者与高血压患者进行对比的结果；Pb是脑卒中患者与正常人进行对比的结果；Pc是高血压患者与正常人进行对比的结果。不符合正态分布的数据，用中位数(四分位数)来表示，其计算所得p值后加#；符合正态分布的数据，用平均数±方差来表示，其计算所得p值后加*，具有其合理性。以下下表格同。
表3：深圳地区男性高血压患者与对照组间的比较(n＝330)
| 分组 | 高血压患者 | 正常人 | P值 |
| 甲基化率 | 0.08(0，0.80) | 0.05(0，0.18) | 0.003# |
| 年龄 | 71.10±5.73 | 65.30±9.48 | 2.93E-07* |
| UA(μmol/L) | 395.79±98.26 | 385.99±87.68 | 0.040* |
| TG(mmol/L) | 1.39(0.97，1.79) | 1.49(1.06，2.06) | 0.077# |
| TC(mmol/L) | 4.92±1.10 | 4.95±1.04 | 0.460* |
| LDL(mmol/L) | 2.92±0.76 | 3.10±0.76 | 0.940* |
表4：深圳地区女性高血压患者与对照组间的比较(n＝282)
应用实施例2
选择样本：收集宁波地区脑卒中病人56例作为病例组(63.00(56.00，71.75)岁)和年龄匹配且无脑卒中家族史的137名正常者作为对照组(63.00(56.50，72.50)岁)对所有研究对象在知情同意的前提下，抽血检测尿酸水平、甘油三酯等一般生化指标，同时抽取静脉血3ml作为样本入EDTA抗凝管中，-80℃低温储存，备用；
按照上述应用实施例1的步骤进行检测、计算甲基化率并将结果与应用实施例中深圳组的结果进行对比，结果参见表5-7：
表5宁波地区病例组与对照组间的比较(n＝193)
| 分组 | 脑卒中患者 | 正常人 | P值 |
| 甲基化率 | 0.38±1.60 | 1.03±10.70 | 0.290* |
| 性别(男/女) | 35/21 | 81/56 | 0.664 |
| 年龄 | 63.00(56.00，71.75) | 63.00(56.50，72.50) | 0.867# |
| UA(μmol/L) | 288.50(239.75，348.50) | 278.00(202.00，363.00) | 0.470# |
| TG(mmol/L) | 1.56±1.18 | 1.33±1.10 | 0.326* |
| TC(mmol/L) | 4.09(3.43，4.99) | 4.49(3.71，5.38) | 0.125# |
| LDL(mmol/L) | 2.34(1.82，3.00) | 2.77(2.19，3.41) | 0.025# |
表6深圳与宁波地区病例组间的比较(n＝228)
表7深圳与宁波地区对照组间的比较(n＝426)
| 分组 | 深圳正常人 | 宁波正常人 | P值 |
| 甲基化率 | 0.04(0，0.17) | 0.06(0，0.17) | 0.689# |
| 性别(男/女) | 175/114 | 81/56 | 0.778 |
| 年龄 | 65.00(59.00，69.00) | 63.00(56.50，72.50) | 0.774# |
| UA(μmol/L) | 354.00(302.00，411.00) | 278.00(202.00，363.00) | 3.36E-12# |
| TG(mmol/L) | 1.52(1.09，2.09) | 1.10(0.79，1.57) | 5.88E-09# |
| TC(mmol/L) | 5.04(4.41，5.64) | 4.49(3.71，5.38) | 8.95E-06# |
| LDL(mmol/L) | 3.09(2.64，3.63) | 2.77(2.19，3.41) | 9.57E-05# |
由表2和表5可见：基因启动子区域高甲基化是导致脑卒中患者发病的一个较大危险因素(Pc＝0.013)，而高血压等潜在的因素也会大大提高脑卒中患者的患病风险，他们的甲基化水平差异有着较好的统计学意义(Pa＝7.04E-05)。就深圳地区的年龄因素考虑，脑卒中患者、高血压患者与正常人之间存在着较为显著的统计学差异(Pa＝0.013，Pb＝0.006，Pc＝1.59E-10)。由于深圳地区的高血压患者和正常人之间就性别因素考量有着较大的差异，因此本研究把深圳地区的男/女性高血压患者与其对应的正常人进行比较研究，得出深圳地区男性高血压患者与正常人之间存在较好的统计学意义，而女性对比差异不明显，见表3、表4)。
据表6可知宁波地区和深圳地区的脑卒中患者的甲基化率存在显著差异，由表6和7显示宁波地区和深圳地区的正常人的诸多生化指标(如UA、TG、TC、LDL等)皆有着明显的不同(P＜0.05)，可见地域因素也是脑卒中患者发病的一个不容忽视的原因。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市南山区慢性病防治院
<120> 一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法
<130> 深圳市南山区慢性病防治院
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<400> 1
GGTCGTAAT CGGTTGTAG 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<400> 2
CAATTCCTAT TCCCAAACTA AA 22
Claims (10)
1.一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括DAN提取液、荧光定量PCR反应液、阳性对照、阴性对照和多个带盖密封管，所述荧光定量PCR反应液包括一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物：
Primer F：5’-GGTCGTAATCGGTTGTAG-3’和
Primer R：5’-CAATTCCTATTCCCAAACTAAA-3’。
2.根据权利要求1所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒还包括洗涤液和洗脱液。
3.根据权利要求2所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR反应液还包括10×PCR buffer、Mg Cl2、d NTPs、热启动TaqDNA酶、DNA模板、无菌双蒸水以及荧光染料。
4.根据权利要求3所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为2×SYBR Green I。
5.根据权利要求4所述的腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L dNTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μM Primer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
6.根据权利要求1所述的胱硫醚β-合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为正常人样本的基因组完全甲基化后所得到的完全DNA甲基化样本；所述阴性对照为无菌双蒸水。
7.一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度的测定方法，其特征在于，其包括
DNA提取步骤：提取全血基因组DNA并检测DNA的浓度；
用甲基化试剂盒对全血基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化步骤：用EZ DNA Methylation-Gold试剂盒将上述提取额全血基因组DNA与亚硫酸氢盐反应会使单链中未甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后经过上样、洗涤、洗脱等步骤得到转化后的DNA；
DNA甲基化水平测定步骤：上述转化后的DNA作为样本DNA加入含荧光定量PCR反应液进行PCR扩增反应，使基因序列进行倍数扩增，每一个样本DNA对应一个的扩增曲线；曲线与既设阈值相交的横坐标点即为CT值，并通过下述计算式计算出甲基化率：
ΔΔCt＝DNA样本(CT靶基因-CTACTB)-阳性对照(CT靶基因-CTACTB)；
其中，ΔΔCt是指甲基化率，CT靶基因是指目标基因的PCR循环数即腺苷高半胱氨酸酶基因的Ct值，CTACTB是指一种常用的内参基因即ACTB的PCR循环数。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述PCR反应液为10×PCR buffer 2μL、25mmol/L MgCl2 1.5μL、2.5mmol/L d NTPs 1.5μL、10μM Primer F 0.25μL、10μMPrimer R 0.25μL、5U/μL热启动Taq DNA酶0.2μL、DNA模板1μL、2×SYBR Green I 5μL、无菌双蒸水补足至20μL。
9.根据权利要求8所述的DNA的测定方法，其特征在于，所述甲基化水平测定步骤具体如下：首先将转化后的DNA样本加入到热启动Taq DNA酶中，然后加入一对腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化特异性扩增引物Primer F和Primer R；最后依次加入DNA模板、10×PCR buffer、Mg Cl2、d NTPs、2×SYBR Green I以及无菌双蒸水。
10.根据权利要求7-9任一项所述的测定方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件如下：预变性95℃，10min；95℃，20s，退火温度，20s，72℃，single，30s，45个循环；溶解曲线95℃，15s，60℃，60s，95℃，continuous；保温40℃，10min。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710594522.2A CN107164555A (zh) | 2017-07-19 | 2017-07-19 | 一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710594522.2A CN107164555A (zh) | 2017-07-19 | 2017-07-19 | 一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107164555A true CN107164555A (zh) | 2017-09-15 |
Family
ID=59818110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710594522.2A Pending CN107164555A (zh) | 2017-07-19 | 2017-07-19 | 一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107164555A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373209A (zh) * | 2020-03-09 | 2021-09-10 | 南京医科大学 | 血液骨架蛋白基因甲基化作为脑卒中早期诊断的潜在标志物 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0972015B1 (en) * | 1996-10-04 | 2006-06-07 | Derek Nigel John Hart | Enzyme having s-adenosyl-l-homocysteine hydrolase (ahcy) type activity |
| WO2010027935A1 (en) * | 2008-09-08 | 2010-03-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Ahcy hydrolase inhibitors for treatment of hyper homocysteinemia |
| CN102138071A (zh) * | 2008-08-04 | 2011-07-27 | 辛米德研究有限公司 | 表征，特别是定量，由从组织再循环到血液循环系统中的血液巨噬细胞从组织中摄取到细胞内的分子标志物的方法，以及用于实施所述方法的分析设备 |
| CN103025890A (zh) * | 2010-04-06 | 2013-04-03 | 卡里斯生命科学卢森堡控股 | 疾病的循环生物标志物 |
| US20170095497A1 (en) * | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Legacy Emanuel Hospital & Health Center | Transient inhibition of adenosine kinase as an anti-epileptogenesis treatment |
-
2017
- 2017-07-19 CN CN201710594522.2A patent/CN107164555A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0972015B1 (en) * | 1996-10-04 | 2006-06-07 | Derek Nigel John Hart | Enzyme having s-adenosyl-l-homocysteine hydrolase (ahcy) type activity |
| CN102138071A (zh) * | 2008-08-04 | 2011-07-27 | 辛米德研究有限公司 | 表征，特别是定量，由从组织再循环到血液循环系统中的血液巨噬细胞从组织中摄取到细胞内的分子标志物的方法，以及用于实施所述方法的分析设备 |
| WO2010027935A1 (en) * | 2008-09-08 | 2010-03-11 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Ahcy hydrolase inhibitors for treatment of hyper homocysteinemia |
| CN103025890A (zh) * | 2010-04-06 | 2013-04-03 | 卡里斯生命科学卢森堡控股 | 疾病的循环生物标志物 |
| US20170095497A1 (en) * | 2015-10-01 | 2017-04-06 | Legacy Emanuel Hospital & Health Center | Transient inhibition of adenosine kinase as an anti-epileptogenesis treatment |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| ANTJE MOTZEK等: ""Abnormal Hypermethylation at Imprinting Control Regions in Patients with S-Adenosylhomocysteine Hydrolase (AHCY) Deficiency"", 《PLOS ONE》 * |
| BIN LI等: ""CCL2 promoter hypomethylation is associated with gout risk in Chinese Han male population"", 《IMMUNOLOGY LETTERS》 * |
| LEI ZHAO等: ""DNA methylation of AHCY may increase the risk of ischemic stroke"", 《BOSNIAN JOURNAL OF BASIC MEDICAL SCIENCES》 * |
| QINGXIAO HONG等: ""Association between the methylation status of the MGMT promoter in bone marrow specimens and chemotherapy outcomes of patients with acute myeloid leukemia"", 《ONCOLOGY LETTERS》 * |
| 陈欢等: ""白虎加桂枝汤对热痹模型大鼠特征性甲基化基因表达的影响"", 《中国中药杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113373209A (zh) * | 2020-03-09 | 2021-09-10 | 南京医科大学 | 血液骨架蛋白基因甲基化作为脑卒中早期诊断的潜在标志物 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104120080B (zh) | 一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用 | |
| CN112662776B (zh) | 检测环状rna和/或所述环状rna表达量的制剂在制备结直肠癌辅助诊断试剂中的应用 | |
| CN104164474A (zh) | 一种检测尿液中pca3基因和psa基因表达量的荧光定量pcr法及其诊断试剂盒 | |
| CN104480106A (zh) | 检测轻度认知障碍患者血清/血浆微小rna标志物及其应用 | |
| CN118755838B (zh) | 一种用于检测宫颈癌及宫颈高级别病变的组合物、试剂盒及用途 | |
| CN103173448A (zh) | 早期肺腺癌miRNA特异表达谱及其反转录引物和用途 | |
| CN112609002B (zh) | 一种外周血miRNA结肠癌诊断标志物组合及其检测试剂盒 | |
| CN110229904A (zh) | 用于恶性黑素瘤诊断的标志物及其试剂盒 | |
| CN106119347A (zh) | 基于血清exosomal microRNAs的结直肠癌转移检测的引物和试剂盒 | |
| CN111808963A (zh) | 一种用于早期肺癌无创筛查的组合物、应用与试剂盒及样本处理方法 | |
| CN110042161B (zh) | 一种用于筛查急性高原反应易感者的microRNA分子标志物及其应用 | |
| CN105039554A (zh) | 一种肺癌检测试剂盒及其用途 | |
| CN111424101A (zh) | 一种用于定量检测耶氏肺孢子菌的试剂盒和方法 | |
| CN107164510A (zh) | 一种辅助诊断脑卒中的检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN107164555A (zh) | 一种腺苷高半胱氨酸酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 | |
| CN103146826A (zh) | 一种定量测定血液循环dna的方法 | |
| CN113817831A (zh) | 肺腺癌诊断检测的引物、试剂盒及甲基化区域的检测方法 | |
| CN107841549A (zh) | 一种丝氨酸羟甲基转移酶基因启动子区甲基化程度检测试剂盒及测定方法 | |
| CN107326078A (zh) | 一种胱硫醚β‑合酶基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒及测定方法 | |
| CN104450702B (zh) | 一种血清miRNA生物标志物组合物与应用 | |
| WO2020134950A1 (zh) | 用于肺结节良恶性鉴别的基因突变/融合组合及试剂盒 | |
| CN108165546A (zh) | 一种miRNA生物标志物、组合物及其用途 | |
| CN118813799A (zh) | 用于基因甲基化评估宫颈病变风险的标志物组合、试剂盒及系统 | |
| CN205313553U (zh) | 一种xrcc1基因多态性扩增检测试剂盒 | |
| CN105087758A (zh) | 一种肺癌预后预测miRNA检测试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170915 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |