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CN107137707A - 壳聚糖修饰的磁性异质结构及其在抑菌方面的应用 - Google Patents

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CN107137707A CN201710214285.2A CN201710214285A CN107137707A CN 107137707 A CN107137707 A CN 107137707A CN 201710214285 A CN201710214285 A CN 201710214285A CN 107137707 A CN107137707 A CN 107137707A
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伊斯拉·阿哈默德
贾星航
王琛
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Abstract

本发明提供一种壳聚糖修饰的磁性异质结构，是在层状碳结构上均匀分布有四氧化三铁纳米颗粒，构成层状碳材料‑四氧化三铁异质结构，壳聚糖包被在所述层状碳材料‑四氧化三铁异质结构上；所述层状碳材料为氧化石墨烯二维材料。本发明提出的磁性异质结构，利用壳聚糖修饰的磁性异质结构对红外光的响应，克服了传统宽带半导体光催化材料需加紫外光源的局限性；利用了层状碳材料和四氧化三铁纳米复合体的高比表面积和磁性，可以增加其和病原菌的接触面积,富集细菌，提高抑菌效果。本发明的材料对革兰氏阴性菌和阳性菌都具有较好的抑菌效果；所述壳聚糖修饰的磁性异质结构还具有较好的正常细胞生物相容性。

Description

壳聚糖修饰的磁性异质结构及其在抑菌方面的应用
技术领域
本发明属于生物医药材料领域，具体涉及一种以壳聚糖修饰的抑菌材料及其应用。
背景技术
病原微生物引起的感染性疾病对人类健康造成很大的影响。抗生素对于革兰氏阴性和阳性菌有比较好的抑菌效果，被认为是治疗细菌感染的首选药物。但抗生素的滥用导致细菌的耐药性越来越强。寻找新的潜在抗菌材料和开发先进的治疗策略变得越来越重要和迫切。无机材料抗菌剂因其合成比较方便、耐热性好、生物稳定性比较好、抑菌谱广等优点而具有广阔的发展前景。无机抗菌材料中研究较多的是宽带半导体光催化抗菌剂(如二氧化钛，氧化锌等)以及金属离子抗菌剂(如银离子、铜离子等)。
单一的二氧化钛或氧化锌的抗菌性能并不好，通常需要与其他具有抗菌性能的物质复合，且需要在紫外光照的条件下才能表现出比较好的抗菌效果，使用浓度也比较大，使其广泛应用受到一定的限制。金属离子抗菌剂成本较高，稳定性差，对人体有一定毒性。
壳聚糖是对革兰氏阴性和革兰氏阳性菌都具有良好抗菌作用的聚合物。在生物医学等领域有着广泛的应用。
二维层状材料是层内以较强的共价键或者离子键结合、而层间则是依靠较弱的范德华力堆叠在一起的一种新型材料。。二维层状碳材料比表面积大，表面有很多含氧基团，有良好的水溶性和生物相容性，且在近红外区有一定吸收，能有效地将红外光转换为热而用于光热治疗[Terentyuk et al.,J.Biomedical Optics,2009,14,021016]。基于二维层状碳材料，进行抗菌材料和治疗药剂的研究，也因而具有令人期待的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对现有技术不足之处，提供一种壳聚糖修饰的磁性异质结构。
本发明的另一目的是提出所述壳聚糖修饰的磁性异质结构的应用。
实现本发明上述目的的技术方案为：
一种壳聚糖修饰的磁性异质结构，是在层状碳结构上均匀分布有四氧化三铁纳米颗粒，构成层状碳材料-四氧化三铁异质结构，壳聚糖包被在所述层状碳材料-四氧化三铁异质结构上；所述层状碳材料为氧化石墨烯二维材料。
其中，所述磁性异质结构中，氧化石墨烯二维材料、四氧化三铁、壳聚糖的质量比为100：1～10：50～200。
进一步用地，本发明所述的壳聚糖修饰的磁性异质结构，其是通过以下方法制备而得：
1)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，制成壳聚糖溶液；
2)羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)与三价铁盐混合，在180～220℃下反应；通过磁分离收集固体产物，并将其重悬于去离子水中；
3)步骤2)所得产物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，在气体保护下活化氧化石墨烯上的羧基，活化时间为4-6小时；再加入步骤1)所制壳聚糖溶液室温反应两天。
可选地，步骤1)中，所述乙酸溶液浓度为0.01～0.1mol/L，壳聚糖与乙酸溶液的质量体积比为0.1g：10～20mL；
其中，步骤2)中，羧基化氧化石墨烯按质量体积比0.01g：0.10～2mL溶于有机溶剂中，并加入pH调节剂；所述有机溶剂为乙醇、乙二醇、正丁醇、异丁醇、丙三醇中的一种；所述pH调节剂为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、醋酸钠、醋酸中的一种或二种，羧基化氧化石墨烯与pH调节剂的质量比为0.01：0.2～0.3。
更进一步地，步骤2)加热反应后用乙醇清洗反应所得混合液，再将混合液置于8000-14000D的透析袋中透析两天，通过磁分离收集产物。
本发明所述壳聚糖修饰的磁性异质结构在抑菌方面的应用。本发明的材料对革兰氏阴性菌和阳性菌都具有较好的抑菌效果。
优选应用于对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制。
应用所述壳聚糖修饰的磁性异质结构进行抑菌的方法，其特征在于，用近红外光照射所述壳聚糖修饰的磁性异质结构。
本发明的有益效果在于：
本发明利用壳聚糖修饰的磁性异质结构材料的多功能性来达到很好的抑菌效果。本发明通过水热法成功合成了一种壳聚糖修饰的磁性异质结构。这是一种新型的多功能抑菌剂。实验发现其在近红外光照下对革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)都具有比较好的抑菌作用。
本发明提出的磁性异质结构的有益效果在于：1.利用壳聚糖修饰的磁性异质结构对红外光的响应，克服了传统宽带半导体光催化材料需加紫外光源的局限性；2.利用了层状碳材料和四氧化三铁纳米复合体的高比表面积和磁性，可以增加其和病原菌的接触面积,富集细菌，提高抑菌效果；3.本发明的材料对革兰氏阴性菌和阳性菌都具有较好的抑菌效果；4.所述壳聚糖修饰的磁性异质结构还具有较好的正常细胞生物相容性。
附图说明
图1是壳聚糖修饰的磁性异质结构的形貌和光谱图。图1a为透射电镜图、图1b为紫外-可见吸收光谱、图1c为红外光谱、图1d为X射线光电子能谱。
图2是壳聚糖修饰的磁性异质结构的的磁性测量曲线。
图3是壳聚糖修饰的磁性异质结构的不同材料在近红外光照下的光热吸收曲线。
图4是壳聚糖修饰的磁性异质结构的光热抑菌活性测定。
图5是大肠杆菌和金黄色葡萄球菌经过材料作用和红外照射后的透射电镜图。
图6是壳聚糖修饰的磁性异质结构的NIH 3T3细胞生物相容性测量。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明壳聚糖修饰的磁性异质结构材料及其诸方面的性能。
实施例中使用的原料中，
1、大肠杆菌ATCC 25922、金黄色葡萄球菌ATCC 6538购自北京中原公司。
2、固体LB培养基配方：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，高压蒸汽灭菌20min。
3、液体LB培养基配方：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，高压蒸汽灭菌20min。
下述实施例中细菌悬浮液制备法为：无菌操作，使用接种环将两种细菌接种于LB培养基中，37℃、150rpm过夜培养。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实验例1壳聚糖修饰的磁性异质结构的制备及其表征
首先是将0.1g壳聚糖溶解于14mL 0.04M的乙酸溶液中，超声分散后得壳聚糖溶液，备用。
将10mg GO-COOH溶解于0.5mL乙二醇溶液中，再加入0.2830g醋酸钠和270mg氯化铁均匀混合。接着将上述混合液转移至反应釜中，200℃条件下加热10小时。反应结束后，用乙醇进行清洗，并将混合液转移至透析袋(MWCO 8000-14000)中，缓慢透析两天。最后，通过磁分离收集固体产物，并将其重悬于去离子水中。
然后取出7mL上述合成的GO-IO，加入1mL 0.5M的EDC和1mL 0.96M的NHS，混合均匀。在氮气的保护下活化GO上的羧基，活化时间为4小时。
加入上述配置的壳聚糖溶液后，同样将上述混合液转移至透析袋(MWCO 8000-14000)中，缓慢透析两天。最后，通过磁分离收集产物。
根据产物的XPS的元素分析图，得出各自元素对应的百分比，结果为C1s:72.712％；N1s:3.643％；O 1s:22.120％；Fe 2p:1.526％.N 1s元素在异质结构中原子比为3.643％，因此可计算出壳聚糖在异质结构中的百分比为41.9％。另外，通过ICP-OES对异质结构中的铁元素含量检测，得出Fe元素的浓度为413μg/mL，进一步得出Fe3O4在异质结构中的浓度为570μg/mL。结合XPS分析结果，计算出异质结构的浓度为27.1mg/mL。因此，可以得到在1mL异质结构溶液中，有15.2mg氧化石墨烯，570μg Fe3O4和11.4mg壳聚糖，在异质结构中质量比为100：4：75。
壳聚糖修饰的磁性异质结构的透射电镜图如图1a所示，从图中可见，四氧化三铁纳米颗粒均匀地分布在层状碳材料上。通过紫外可见分光光度计对壳聚糖修饰的磁性异质结构的吸收光谱进行表征，结果如图1b所示，壳聚糖修饰的磁性异质结构在近红外区(780-1000nm)有明显光吸收。相比于GO和GO-IO而言，复合体具备更强的近红外光吸收。
用红外光谱仪对材料的红外光谱进行测量。如图1c所示，在壳聚糖修饰的磁性异质结构的红外光谱谱图中，在3431cm-1和1570cm-1处的峰对应于N-H的伸缩振动。1643cm-1处的峰对应于C＝O伸缩振动，1416cm-1的峰对应于C-H的剪切和弯曲。1070cm-1的峰是由于C-N的伸缩振动。585cm-1的高峰是Fe-O官能团的特征峰，表明四氧化三铁已经修饰在层状碳材料表面。
用X-射线光电子能谱仪对材料进行元素分析。如图1d所示，在284ev，400ev和532.7ev处的主峰分别对应于C，N和O元素，而在711.1ev和724.8ev处的两个主峰对应于Fe元素。因此，明显可以分析出复合体是由四种元素构成，分别为C，N，O和Fe。
对比例
层状碳材料：羧基化氧化石墨烯(GO-COOH)；
四氧化三铁-层状碳材料：将10mg GO-COOH溶解于0.5mL乙二醇溶液中，再加入0.2830g醋酸钠和270mg氯化铁均匀混合。接着将上述混合液转移至反应釜中，200℃条件下加热10小时。反应结束后，用乙醇进行清洗，并将混合液转移至透析袋(MWCO 8000-14000)中，缓慢透析两天。最后，通过磁分离收集产物，即为四氧化三铁-层状碳材料。
实施例2：壳聚糖修饰的磁性异质结构的磁场强度测定。
通过振动试样磁力计(Lake Shore Cryotronics VSM-7307)对壳聚糖修饰的磁性异质结构的磁性进行了分析，结果如图2所示，没有修饰壳聚糖之前，层状碳材料-四氧化三铁的饱和磁化强度为28.9emu/g。壳聚糖修饰之后，壳聚糖修饰的磁性异质结构的饱和磁化强度值为23.1emu/g。相比于没有修饰壳聚糖时，饱和磁化强度略有降低，但这并不影响壳聚糖修饰的磁性异质结构在低磁化强度下的磁响应，可在短时间内从环境中分离。壳聚糖修饰的磁性异质结构饱和磁化强度的降低是因为壳聚糖包被在层状碳材料-四氧化三铁的表面上。进一步证明壳聚糖修饰的磁性异质结构的成功制备。
实施例3：壳聚糖修饰的磁性异质结构的光热转换效率的测定。
对于磁性光热转换材料而言，凝聚状态相比于分散态而言，其能有效地吸收光源并转换出更多的热量。因此，我们在外加磁铁的作用下，对壳聚糖修饰的磁性异质结构的光热转换效率进行了测定。结果如图3所示，在近红外光谱(2W/cm2，10min)光照下，对照处理组中，PBS缓冲液(pH为7.4)的温度几乎没有显示任何改变；在层状碳材料处理组中，其温度上升了1℃；然而，壳聚糖修饰的磁性异质结构处理组中，其温度上涨幅度要比没有用壳聚糖修饰的磁性异质结构处理组大。这意味着壳聚糖修饰的磁性异质结构可以大大增加环境中的温度，并且在一定程度上，足以使细菌的酶和蛋白质变性，破坏细菌细胞膜磷脂，导致细菌死亡。
实施例4：壳聚糖修饰的磁性异质结构的光热抗菌效果。
我们研究了壳聚糖修饰的磁性异质结构的光热抗菌效果。如图4所示，仅有近红外光照射下，两种细菌存活率仍保持100％左右。这意味着近红外光源对两种菌株本身是无害的。仅壳聚糖修饰的磁性异质结构处理组中，没有光源辅助下，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的存活率依旧保持在55％。然而，一旦在壳聚糖修饰的磁性异质结构的处理组中，外加近红外光源时，两种细菌的存活率都出现了明显下降，其存活率能下降至20％以下。
外加近红外光照处理组中，相比于没有光源处理下，壳聚糖修饰的磁性异质结构的抑菌性能会更加强烈。因此，壳聚糖修饰的磁性异质结构具备优越的光热抑菌活性。
实施例5：壳聚糖修饰的磁性异质结构对细菌细胞膜的损伤情况的研究
为了进一步探讨细菌细胞膜的损伤情况，我们通过扫描电镜对细菌外形的变化进行了详细观察。结果如图5所示，在对照处理组(中，仅施加近红外光照下，两种细菌的形态保持完整，并没有出现明显形变，大肠杆菌依旧呈现出典型的杆状形状，金黄色葡萄球菌则呈现出球形分布。表明该强度下的近红外光源不会对细菌造成损伤，不影响细菌的生存。然而，经过壳聚糖修饰的磁性异质结构处理后，两种细菌的外形出现了一定程度的形变。大肠杆菌会呈现出中间凹陷，表面粗糙，以及拖尾等现象，金黄色葡萄球菌表面也出现了一些鼓包。参见“材料+光照组”，在近红外光照下，两种细菌的外形改变更加剧烈。对于大肠杆菌而言，杆菌的细胞膜出现了大面积塌陷和崩溃，细菌外形已经完全扭曲，由原来比较饱满的杆状转变为了皱缩状态，可明显感知到其细胞膜的受损及内含物的释放。对于金黄色葡萄球菌，其细胞形态也出现了类似的现象，细胞膜存在着明显的开口，以及形变。
实施例6：壳聚糖修饰的磁性异质结构的细胞毒性评价。
我们使用CCK-8试剂盒对壳聚糖修饰的磁性异质结构的细胞毒性进行了评价，结果如图6示，经壳聚糖修饰的磁性异质结构(0-100μg/mL)处理24小时，NIH 3T3细胞仍保持高于95％以上。因此，该抗菌剂不仅有效地杀死了革兰氏阴性细菌-大肠杆菌和革兰氏阳性细菌-金黄色葡萄球菌，同时也有很好的生物相容性，使其具备潜在的生物学应用。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一种壳聚糖修饰的磁性异质结构，其特征在于，是在层状碳结构上均匀分布有四氧化三铁纳米颗粒，构成层状碳材料-四氧化三铁异质结构，壳聚糖包被在所述层状碳材料-四氧化三铁异质结构上；所述层状碳材料为氧化石墨烯二维材料。
2.根据权利要求1所述的聚糖修饰的磁性异质结构，其特征在于，所述磁性异质结构中，氧化石墨烯二维材料、四氧化三铁、壳聚糖的质量比为100：1～10：50～200。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖修饰的磁性异质结构，其特征在于，是通过以下方法制备而得：
1)将壳聚糖溶解于乙酸溶液中，制成壳聚糖溶液；
2)羧基化氧化石墨烯与三价铁盐混合，在180～220℃下反应；通过磁分离收集固体产物；
3)步骤2)所得产物与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺混合，在气体保护下活化氧化石墨烯上的羧基，活化的时间3～6小时；再加入步骤1)所制壳聚糖溶液室温反应两天。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖修饰的磁性异质结构，其特征在于，步骤2)中，羧基化氧化石墨烯按质量体积比0.01g：0.10～2mL溶于有机溶剂中，并加入pH调节剂；所述有机溶剂为乙醇、乙二醇、正丁醇、异丁醇、丙三醇中的一种，所述pH调节剂为磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、醋酸钠、醋酸中的一种或二种；羧基化氧化石墨烯与pH调节剂的质量比为0.01：0.2～0.3。
5.根据权利要求3所述的壳聚糖修饰的磁性异质结构，其特征在于，步骤2)加热反应后用乙醇清洗反应所得混合液，再将混合液置于8000-14000D的透析袋中透析两天，通过磁分离收集产物。
6.权利要求1～5任一所述壳聚糖修饰的磁性异质结构在抑菌方面的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，应用于对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制。
8.应用权利要求1～5任一所述壳聚糖修饰的磁性异质结构进行抑菌的方法，其特征在于，用近红外光照射所述壳聚糖修饰的磁性异质结构。
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