CN107129536A - 一种双特异性抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：根据引物扩增出抗体的重链恒定区序列、肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的序列、免疫细胞表面抗原对应抗体的序列，其中，免疫细胞为NK细胞或T细胞，NK细胞表面抗原为CD16a，T细胞表面抗原为CD3；利用酶切、连接获得拼接序列；构建包含拼接序列的质粒，拼接序列为人源化处理后的序列；将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。本发明还公开一种上述方法制备的双特异性抗体和该抗体的应用。本发明双特异性抗体为Fc单链构型，能够同时结合免疫细胞和肝癌细胞，提高杀瘤效率。
Description
技术领域
本发明涉及免疫领域，特别是涉及一种双特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术
双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，产生导向性的效应功能，其在免疫治疗中具有广阔的应用前景。肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，死亡率较高，分为原发性和继发性两大类，目前的治疗方法有手术治疗、放射治疗等。如何提供一种用于治疗肝癌的双特异性抗体，对于肝癌治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种双特异性抗体及其制备方法和应用，双特异性抗体为Fc单链构型，能够同时结合免疫细胞和肝癌细胞，提高杀瘤效率。
为解决上述技术问题，本发明提供一种双特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：根据引物扩增出抗体的重链恒定区序列、肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的序列、免疫细胞表面抗原对应抗体的序列，其中，免疫细胞为NK细胞或T细胞，NK细胞表面抗原为CD16a，T细胞表面抗原为CD3；扩增出的重链恒定区序列的一端和GPC3对应抗体的序列具有相同的酶切位点，扩增出的重链恒定区序列的另一端和免疫细胞表面抗原对应抗体的序列具有相同的酶切位点，利用酶切、连接获得拼接序列；构建包含拼接序列的质粒，拼接序列为人源化处理后的序列；将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。
其中，扩增所需的引物为：引物1，Forword：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG，酶切位点为HindIII；引物2，Reword：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT，酶切位点为EcoRI；引物3，Forword：CCGCTCGAGCCTAGAACCATGTCACCCTGACCT，酶切位点为XhoI；引物4，Reword：CCCAAGCTTCAAGGCGCGACAGCTGCCCTAG，酶切位点为HindIII；引物5，Forword：CCGCTCGAGGTCCTGAASGAGTCTACTCCCTC，酶切位点为XhoI；引物6，Reword：CCCAAGCTTCTCTCCACAAGCACAACACGCA，酶切位点为HindIII；引物7，Forword：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG，酶切位点为EcoRI；引物8，Reword：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG，酶切位点为XbaI。
引物1、引物2用于扩增抗体的重链恒定区序列，引物3、引物4用于扩增CD3对应抗体的序列，引物5、引物6用于扩增CD16a对应抗体的序列，引物7、引物8用于扩增GPC3对应抗体的序列。
其中，拼接序列为GPC3对应抗体的序列-重链恒定区序列-CD16a对应抗体的序列或GPC3对应抗体的序列-重链恒定区序列-CD3对应抗体的序列。
其中，构建质粒的载体为pcDNA6-Myc/His B。
其中，哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
为解决上述技术问题，本发明提供一种上述制备方法制备得到的双特异性抗体。双特异性抗体为Fc单链构型。
为解决上述技术问题，本发明提供一种双特异性抗体作为杀死肝癌细胞基因工程药物的应用。具体地，将双特异性抗体体外负载免疫细胞，而后回输体内，以杀伤肝癌细胞。
本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明的双特异性抗体的制备方法包括以下步骤：根据引物扩增出抗体的重链恒定区序列、肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的序列、免疫细胞表面抗原对应抗体的序列，其中，免疫细胞为NK细胞或T细胞，NK细胞表面抗原为CD16a，T细胞表面抗原为CD3；扩增出的重链恒定区序列的一端和GPC3对应抗体的序列具有相同的酶切位点，扩增出的重链恒定区序列的另一端和免疫细胞表面抗原对应抗体的序列具有相同的酶切位点，利用酶切、连接获得拼接序列；构建包含拼接序列的质粒，拼接序列为人源化处理后的序列；将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。本发明的双特异性抗体具有以下特点：可同时识别肝癌细胞表面抗原和免疫细胞表面抗原，实现免疫细胞对肝癌细胞的靶向杀伤，同时，双特异性抗体作为桥梁连接免疫细胞和肝癌细胞，可增加免疫细胞与肝癌细胞的接触时间，有效增强免疫细胞对肝癌细胞的杀伤作用；由于同时结合两种抗原，可有效激活免疫细胞，拉近免疫细胞与肝癌细胞的距离，增加效靶比，增强免疫细胞的杀瘤能力；以人源化单抗序列为基本序列，Fc单链构型为基本构型，人源化的双特异性抗体可消除人抗鼠抗体反应，Fc单链构型可确保双特异性抗体结构稳定，同时使其分子量与普通单抗的分子量相似，且延长其在体内的半衰期。
具体实施方式
实施例1
本实施例双特异性抗体的制备方法如下：
A. 根据引物扩增抗体的重链恒定区序列、GPC3对应抗体的序列、CD16a对应抗体的序列。其中，GPC3为肝癌细胞表面抗原，CD16a为NK细胞表面抗原。
其中，用于扩增抗体的重链恒定区序列的引物为：Forword：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG，酶切位点为HindIII；Reword：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT，酶切位点为EcoRI。
其中，用于扩增GPC3对应抗体的序列的引物为：Forword：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG，酶切位点为EcoRI；Reword：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG，酶切位点为XbaI。
其中，用于扩增CD16a对应抗体的序列的引物为：Forword：CCGCTCGAGGTCCTGAASGAGTCTACTCCCTC，酶切位点为XhoI；Reword：CCCAAGCTTCTCTCCACAAGCACAACACGCA，酶切位点为HindIII。
其中，在扩增过程中，以人血液总RNA反转录的cDNA为模板进行扩增。
在本实施例中，GPC3即磷脂酰肌醇蛋白聚糖3。
对于扩增的序列，利用酶切、连接获得拼接序列。
其中，获得的拼接序列是GPC3对应抗体的序列-重链恒定区序列-CD16a对应抗体的序列。
构建包含拼接序列的质粒。
对获得的拼接序列进行人源化处理，并利用载体pcDNA6-Myc/His B构建质粒。
将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。
其中，使用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
在实际应用中，提取纯化双特异性抗体后，对其稳定性、亲和性进行分析，而后体外负载NK细胞，并进行细胞因子检测、杀瘤效率评估、肿瘤相关基因表达检测，当符合安全、有效性评估后，回输患者体内，实现有效性、特异性杀肝癌细胞的目的。
以上所述，本实施例制备的双特异性抗体为Fc单链构型，可作为杀死肝癌细胞的基因工程药物。
实施例2
本实施例双特异性抗体的制备方法如下：
A. 根据引物扩增抗体的重链恒定区序列、GPC3对应抗体的序列、CD3对应抗体的序列。其中，GPC3为肝癌细胞表面抗原，CD3为T细胞表面抗原。
其中，用于扩增抗体的重链恒定区序列的引物为：Forword：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG，酶切位点为HindIII；Reword：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT，酶切位点为EcoRI。
其中，用于扩增GPC3对应抗体的序列的引物为：Forword：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG，酶切位点为EcoRI；Reword：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG，酶切位点为XbaI。
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其中，在扩增过程中，以人血液总RNA反转录的cDNA为模板进行扩增。
对于扩增的序列，利用酶切、连接获得拼接序列。
其中，获得的拼接序列是GPC3对应抗体的序列-重链恒定区序列-CD3对应抗体的序列。
构建包含拼接序列的质粒。
对获得的拼接序列进行人源化处理，并利用载体pcDNA6-Myc/His B构建质粒。
将质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。
其中，使用的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
在实际应用中，提取纯化双特异性抗体后，对其稳定性、亲和性进行分析，而后体外负载CIK细胞，并进行细胞因子检测、杀瘤效率评估、肿瘤相关基因表达检测，当符合安全、有效性评估后，回输患者体内，实现有效性、特异性杀肝癌细胞的目的。
以上所述，本实施例制备的双特异性抗体为Fc单链构型，可作为杀死肝癌细胞的基因工程药物。
综上所述，本发明的双特异性抗体具有以下特点：可同时识别肝癌细胞表面抗原和免疫细胞表面抗原，实现免疫细胞对肝癌细胞的靶向杀伤，同时，双特异性抗体作为桥梁连接免疫细胞和肝癌细胞，可增加免疫细胞与肝癌细胞的接触时间，有效增强免疫细胞对肝癌细胞的杀伤作用；由于同时结合两种抗原，可有效激活免疫细胞，拉近免疫细胞与肝癌细胞的距离，增加效靶比，增强免疫细胞的杀瘤能力；以人源化单抗序列为基本序列，Fc单链构型为基本构型，人源化的双特异性抗体可消除人抗鼠抗体反应，Fc单链构型可确保双特异性抗体结构稳定，同时使其分子量与普通单抗的分子量相似，且延长其在体内的半衰期。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市拜沃思生物科技有限公司
<120> 一种双特异性抗体及其制备方法和应用
<130> 2017.5.5
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccaagctta gctttctggg gcgagccgg 29
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccggaattcg acccactctg cctccctcat 30
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccgctcgagc ctagaaccat gtcaccctga cct 33
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cccaagcttc aaggcgcgac agctgcccta g 31
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgctcgagg tcctgaasga gtctactccc tc 32
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cccaagcttc tctccacaag cacaacacgc a 31
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccggaattcg ctcatatgta gtgtcgagtg cg 32
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctagtctaga gggagcagat gacctagaag cag 33
Claims (9)
1.一种双特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
根据引物扩增出抗体的重链恒定区序列、肝癌细胞表面抗原GPC3对应抗体的序列、免疫细胞表面抗原对应抗体的序列，其中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，所述NK细胞表面抗原为CD16a，所述T细胞表面抗原为CD3；
扩增出的重链恒定区序列的一端和GPC3对应抗体的序列具有相同的酶切位点，扩增出的重链恒定区序列的另一端和免疫细胞表面抗原对应抗体的序列具有相同的酶切位点，利用酶切、连接获得拼接序列；
构建包含拼接序列的质粒，所述拼接序列为人源化处理后的序列；
将所述质粒转染于哺乳动物细胞，筛选鉴定，以离子色谱法提取双特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，扩增所需的引物为：
引物1，Forword：CCCAAGCTTAGCTTTCTGGGGCGAGCCGG，酶切位点为HindIII；
引物2，Reword：CCGGAATTCGACCCACTCTGCCTCCCTCAT，酶切位点为EcoRI；
引物3，Forword：CCGCTCGAGCCTAGAACCATGTCACCCTGACCT，酶切位点为XhoI；
引物4，Reword：CCCAAGCTTCAAGGCGCGACAGCTGCCCTAG，酶切位点为HindIII；
引物5，Forword：CCGCTCGAGGTCCTGAASGAGTCTACTCCCTC，酶切位点为XhoI；
引物6，Reword：CCCAAGCTTCTCTCCACAAGCACAACACGCA，酶切位点为HindIII；
引物7，Forword：CCGGAATTCGCTCATATGTAGTGTCGAGTGCG，酶切位点为EcoRI；
引物8，Reword：CTAGTCTAGAGGGAGCAGATGACCTAGAAGCAG，酶切位点为XbaI；
其中，引物1、引物2用于扩增抗体的重链恒定区序列，引物3、引物4用于扩增CD3对应抗体的序列，引物5、引物6用于扩增CD16a对应抗体的序列，引物7、引物8用于扩增GPC3对应抗体的序列。
3.根据权利要求2所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述拼接序列为GPC3对应抗体的序列-重链恒定区序列-CD16a对应抗体的序列或GPC3对应抗体的序列-重链恒定区序列-CD3对应抗体的序列。
4.根据权利要求3所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，构建质粒的载体为pcDNA6-Myc/His B。
5.根据权利要求3所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
6.权利要求1-5任意一项所述的制备方法制备得到的双特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体为Fc单链构型。
8.权利要求6-7任意一项所述的双特异性抗体作为杀死肝癌细胞基因工程药物的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将所述双特异性抗体体外负载免疫细胞，而后回输体内，以杀伤肝癌细胞。
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