CN107102079A - 检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱‑串联质谱方法及临床药动学研究的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阿托伐他汀及代谢物的液相色谱‑串联质谱方法及临床药动学研究的应用。本发明提供了检测血浆中阿托伐他汀及代谢物浓度的方法，通过LC‑MS/MS对血浆中阿托伐他汀及代谢物浓度进行分析。本发明方法优选采用盐析辅助液‑液提取的蛋白沉淀预处理方法，以氘代阿托伐他汀及代谢物为内标，采用采用Kinetex XB C18柱洗脱，电喷雾电离源(ESI)串联质谱检测。使本发明方法的血浆样本提取回收率大于80％，未受基质效应影响，其专一性选择性强、灵敏度高、检测快速、用量小，满足简单、可靠、高通量、条件可控的临床大批量样品分析需求。本发明方法的特异性、稳定性等均进行了验证，已成功用于评价阿托伐他汀及其代谢物各剂型的生物等效性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法及其应用。
背景技术
阿托伐他汀(Atorvastatin，AT)结构式如图1、图2、图3所示，是羟甲戊二酰辅酶A选择性抑制剂，可以有效降低血脂水平。AT在人体内主要由细胞色素P450酶代谢为邻羟基阿托伐他汀(ortho-hydroxyatorvastatin，o-OAT)和对羟基阿托伐他汀(para-hydroxyatorvastatin，p-OAT)。o-OAT和p-OAT占总体抑制活性的70％。同其他他汀类化合物一样，AT、o-OAT和p-OAT结构中含有羟基羧酸结构，无论在体内和体外均能脱水关环形成内酯，并且，该体内内酯代谢物在体外也易于水解转化为羟基羧酸，因而，羟基羧酸浓度测定易受影响不准确。
现有技术测定阿托伐他汀及其代谢物，对准确度和灵敏度均有要求。为了减弱上述羟基羧酸结构与内酯间相互转化，一般需要在生物分析各个步骤控制温度和pH值，且样品预处理步骤越少，越有利于防止羟基羧酸型代谢物和内酯型代谢物相互转化。由于阿托伐他汀钙人体常用剂量较低，一般仅10mg。服药后血浆中阿托伐他汀的浓度很低，药物达峰浓度为10ng/mL左右。其活性代谢物p-OAT浓度更小，通常低于1ng/mL。因此，为了同时监测阿托伐他汀及其代谢物浓度，对检测方法的灵敏度要求很高。
目前，提取血浆中药物的方法主要有蛋白沉淀法、液-液提取法和固相萃取法。蛋白沉淀预处理法操作较简单，也已有报道将蛋白沉淀预处理用于测定AT及其代谢物。但实际操作过程中，蛋白沉淀提取后的样品中含有内源性基质，容易造成基质效应等问题。当仪器检测的灵敏度无法达到研究目的时，常常需要浓缩大量血浆，因为往往引入更多的基质。为防止基质在色谱柱上蓄积，一般采用长时间梯度洗脱来避免基质蓄积，这无疑极大地降低了分析通量。鉴于蛋白沉淀法的以上缺点，已报道的测定阿托伐他汀及其代谢物方法中，样品预处理方法多为液-液提取法和固相萃取法。然而两种方法的预处理步骤比较繁琐、费时、温度和pH不易控制，易导致阿托伐他汀及其代谢物的测定结果不准确。由于上述不足，出现了盐析辅助液-液提取方法，该法操作简单、成本低、样品纯净，近年来受到广泛关注。盐析是一种结晶蛋白的常用方法。基于电解质-非电解质相互作用理论。当电解质浓度升高时，非电解质在水溶液中的溶解度降低。在水溶液中增加电解质的浓度即可降低亲脂性物质在水中的溶解度，将待测物提取到有机试剂层中，与水溶性内源基质分离。但该法普遍存在灵敏度低和血浆用量大的缺点。
现有血浆药物浓度的仪器检测方法有液相色谱-紫外法、液相色谱串联质谱法等。液相色谱-紫外法是药物浓度检测的金标准，但该检测技术具有选择性差、灵敏度低等特点，限制了该技术在生物样品检测领域的应用。液相色谱-串联质谱技术，兼容了色谱的分离能力与质谱的高选择性，已经成为生物分析领域的最重要的工具。尽管液相色谱-串联质谱技术极大地增强了定量分析能力，但该技术也同样存在一些缺点，面临着一些挑战。如质谱中待测物离子化的过程常被样品中的生物基质所影响，导致响应的波动，影响测定的准确性。相关报道如下：
Zhou于2013年建立了液-液提取联合液相色谱-串联质谱法测定血浆中AT、o-OAT和p-OAT。该方法灵敏度较高，可达20pg/mL左右，但血浆用量较大，为0.5毫升。液-液提取的方法，步骤复杂且不能有效控制提取体系的pH值，也没有对内酯和羟基羧酸之间的相互转化做有效的评估。色谱运行时间较长，需要约6分钟，不适合大批量样品测试。
Liu于2008年建立固相萃取-联合液相色谱-串联质谱法测定血浆中AT、p-OAT的分析方法。尽管色谱运行短，仅为2.5min。血浆用量少，仅0.1毫升。但分析方法的灵敏度不足，p-OAT的定量下限仅为0.2ng/mL，无法完整的检测其药动学特征，且该分析方法不能检测o-OAT。同时，固相萃取法步骤复杂、耗时长，同样不适合大批量样品检测。
Hassan于2014建立了SALLE联合液相色谱法测定人血浆中AT。方法中使用了氯化镁作为盐析试剂。该氯化镁为不挥发性盐，不适合质谱检测。该分析方法使用紫外检测器，选择性差，方法的灵敏度很低为1.00ng/mL，并且提取方法使用了1毫升血浆样品，血浆消耗量过大。灵敏度低和血浆用量大的特点使该方法不适合现有的临床研究。
有鉴于上述的缺陷，为满足临床大批量样品分析的需求，需开发更简单、可靠、高通量的样品预处理方法及血浆药物浓度测定方法，用于测定阿托伐他汀及其代谢物。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种解决血浆用量大、提取步骤复杂、提取条件不可控、灵敏度低、色谱运行时间长，无法同时高灵敏及低样品量检测等问题的液相色谱-串联质谱方法，用于检测阿托伐他汀及两种代谢物。本发明技术方案如下：
检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，含下述步骤：
预处理，取血浆，加入阿托伐他汀及代谢物同位素内标溶液，以6M醋酸铵水溶液和乙腈为盐析分层试剂沉淀蛋白，涡流及离心后制得血浆样品；
色谱，将血浆样品液相色谱分离，采用Kinetex XB C18柱，梯度洗脱，流动相A:流动相B初始体积比为60:40，流速0.8mL/min，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈；
质谱，电喷雾电离源，正离子多反应监测(+MRM)扫描，喷雾电压5500V，内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi，离子源温度500℃，阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 559→m/z 440，CE 22eV，D5-阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 564→m/z 445，CE 22eV，邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 575→m/z 440，CE 34eV，D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z580→m/z 445，CE 34eV；
计算，以阿托伐他汀及代谢物浓度为横坐标，阿托伐他汀及代谢物与阿托伐他汀及代谢物内标物的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算阿托伐他汀及代谢物的血药浓度。
本发明方法进一步地，所述预处理步骤，采用冰冻醋酸铵水溶液和乙腈。
本发明方法进一步地，所述预处理步骤，内标溶液配制：称取D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀，以甲醇溶解并定容制得1.00mg/mL的内标贮备液，吸取各内标贮备液适量，加入稀释液得浓度10.0ng/mL的D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀的内标溶液，所述稀释液为甲醇和水混合液，甲醇:水的体积比为50:50。
本发明方法进一步地，所述预处理步骤，取100μL血浆，分别加入20.0μL内标溶液、100μL6M醋酸铵水溶液和400μL乙腈，涡流及离心后取上清液于氮气流吹干浓缩，残留物以乙腈和水溶解且涡流混匀得血浆样品，乙腈:水的体积比为40:60。
本发明方法更进一步地，经所述涡流提取血浆样品的时间控不超过1min。
本发明方法更进一步地，所述涡流及离心条件为涡流1min，14000rpm离心1min。
本发明方法进一步地，所述色谱步骤，流动相A含0.1％甲酸
本发明方法进一步地，所述色谱步骤，将血浆样品置于自动进样器内，进行LC-MS/MS分析，进样体积为2.0μL。
本发明方法进一步地，所述色谱步骤，所述色谱步骤，Kinetex XB C18柱为核壳色谱柱，其长度50mm、直径2.1mm、填料粒径2.6μm。
本发明目的之二，提供检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法在评价阿托伐他汀生物等效性的应用，是以D5-阿托伐他汀为分析检测阿托伐他汀的内标物。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
①对样品预处理、色谱分离和质谱检测，建立经济简便的阿托伐他汀及代谢物检测方法，采用本发明条件的盐析辅助液-液提取预处理方法，获得高回收率且有效降低内源性杂质峰的干扰，既避免传统蛋白沉降法通过浓缩大量血浆提高检测灵敏度造成的基质效应扩大的缺点，也避免传统液-液提取法和固相萃取预处理方法的繁琐和条件不易受控，满足方法学的各项考证指标；
③本发明以氘代阿托伐他汀及代谢物做内标物，测定血液中阿托伐他汀及代谢物浓度的重现性、准确性均较好；
④专一性选择性强，Kinetex XB C18柱，分离度好，色谱仅在2min内完成测定，本发明条件下的分离过程，内源性物质不干扰待测物和内标物两者的测定；
⑤灵敏度高，血浆样品中阿托伐他汀的最低限量可低至0.02ng/ml，阿托伐他汀代谢物的最低限量可低至0.01ng/ml；
⑥检测快速，2min左右完成血浆样品的一次测定，满足高通量大批量生物样品的检测；
⑦用量小，每次血浆样品测试仅需12μL即可准确测定出阿托伐他汀及其代谢物的浓度；
⑧本发明系统的评估了阿托伐他汀及其内酯代谢物之间的相互转化情况，保证数据的准确性；
⑨采用本发明建立的LC-MS/MS方法测定阿托伐他汀血药浓度，得到阿托伐他汀及其代谢物的药动学参数，可用于评价阿托伐他汀及其代谢物各剂型的生物等效性。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是阿托伐他汀(上)、邻羟基阿托伐他汀(中)、对羟基阿托伐他汀(下)化学结构式图；
图2是阿托伐他汀产物离子扫描质谱图；
图3是D5-阿托伐他汀产物离子扫描质谱图；
图4是邻羟基阿托伐他汀产物离子扫描质谱图；
图5是D5-邻羟基阿托伐他汀产物离子扫描质谱图；
图6是对羟基阿托伐他汀产物离子扫描质谱图；
图7是D5-对羟基阿托伐他汀产物离子扫描质谱图；
图8是阿托伐他汀(上)、邻羟基阿托伐他汀(中)、对羟基阿托伐他汀(下)离子反应推测的断裂方式示意图；
图9是空白样品(左)、LLOQ样品(右)阿托伐他汀MRM色谱图
图10是空白样品(左)、LLOQ样品(右)D5-阿托伐他汀MRM色谱图；
图11是空白样品(左)、LLOQ样品(右)对羟基阿托伐他汀与邻羟基阿托伐他汀MRM色谱图；
图12是空白样品(左)、LLOQ样品(右)D5-对羟基阿托伐他汀与D5-邻羟基阿托伐他汀MRM色谱图；
图13是空白含内标样品(左)、受试者口服阿托伐他汀钙片样品(右)阿托伐他汀MRM色谱图；
图14是空白含内标样品(左)、受试者口服阿托伐他汀钙片样品(右)D5-阿托伐他汀MRM色谱图；
图15是空白含内标样品(左)、受试者口服阿托伐他汀钙片样品(右)对羟基阿托伐他汀与邻羟基阿托伐他汀MRM色谱图；
图16是空白含内标样品(左)、受试者口服阿托伐他汀钙片样品(右)D5-对羟基阿托伐他汀与D5-邻羟基阿托伐他汀MRM色谱图；
图17是24名健康受试者单次口服20mg受试制剂或参比制剂平均药物浓度-时间曲线图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
液相色谱-串联质谱检测血浆中药物浓度的方法开发通常可分为三个部分，即提取方法(即预处理方法)、液相色谱方法和质谱方法。本发明针对现有技术缺点，从以上这三个方面着手建立检测方法。
【预处理】
取血浆，加入阿托伐他汀及代谢物同位素内标溶液，以6M醋酸铵水溶液和乙腈为盐析分层试剂沉淀蛋白，涡流及离心后制得血浆样品。
本发明采用上述提取方法，较现有分析方法操作简单、提取时间短、适合高通量样品预处理。通过使用冰冻乙腈和6M醋酸铵溶液实现了对温度和pH两个参数的控制，防止内酯(lactone，LAC)和羟基羧酸(carboxylate，CAR)型相互转化。预处理步骤制得血浆样品的时间控不超过1min，降低了预处理过程中发生相互转化的概率，确保测定准确性。与传统蛋白沉淀相比，固相萃取和液-液提取法去除血中蛋白、盐类、磷脂类等内源性物质能力强，可以获得比较洁净的提取物。然而由于操作步骤复杂、样品预处理时间冗长，CAR型化合物和LAC型化合物容易发生相互转化。即使采取低温或控制pH的方法可以有效降低相互转化，但是在样品预处理过程中的每一步都严格控制这些参数十分困难。因此需要建立步骤简单的预处理方法。
本发明预处理方法，提取物洁净度可以与液-液提取和固相萃取效果相当，并具有操作简单、提取时间短等优点。本研究选用乙腈和6M醋酸铵溶液，与质谱兼容性好。预处理条件优化时，考察了不同浓度的醋酸铵的分层效果，结果发现醋酸铵浓度大于6M时，与乙腈的分层清晰可见。现有技术中，AT的LAC与CAR型相互转化受pH影响较大，酸性条件下易于环合为LAC，碱性条件下水解开环。本发明使用的6M醋酸铵溶液pH为6，可以有效抑制相互转化的发生。并且，采用冰冻醋酸铵水溶液和乙腈，即乙腈和6M醋酸铵溶液在使用前置于冰浴中，可以降低提取过程温度。为了降低提取时间，提高样品预处理通量，对涡流提取时间进行优化，结果发现提取回收率在1min内达到峰值，回收率大于80％。
【色谱】
将血浆样品液相色谱分离，采用Kinetex XB C18柱，梯度洗脱，流动相A:流动相B初始体积比为60:40，流速0.8mL/min，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈。
o-OAT和p-OAT是同分异构体，并且有相同的质谱裂解方式。因此，为了避免相互干扰，需要将两种物质色谱分离。o-OAT结构中邻羟基和胺基之间可形成分子内氢键，因此极性较p-OAT低，易于色谱分离。现有技术常采用C18为键合相的色谱柱进行分离，色谱运行时间在2.5到20分钟之间。
本发明采Kinetex XB C18熔融核色谱柱，具有高柱效、高通量、低背景压力的特点。在方法开发过程中出现严重的色谱峰拖尾现象，通过在水相中添加1％甲酸的方法可以减轻拖尾，从而提高峰高和峰对称性。使用了高流速，如0.8mL/min的快速洗脱程序，总的色谱运行时间仅为2.2min，快速分离，尤其适合高通量样品处理，试验证明，本发明o-OAT和p-OAT获得基线分离。
本发明涡流及离心条件优选为涡流1min，14000rpm离心1min。优选流动相A含0.1％甲酸。将血浆样品置于自动进样器内，进行LC-MS/MS分析时，进样体积仅为2.0μL即可。本发明采用的Kinetex XB C18柱为核壳色谱柱，其长度50mm、直径2.1mm、填料2.6μm。
【质谱】
电喷雾电离源，正离子多反应监测(+MRM)扫描，喷雾电压5500V，内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi，离子源温度500℃，阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 559→m/z 440，CE 22eV，D5-阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 564→m/z445，CE 22eV。图2至图7为定量分析AT和D5-AT时监测的离子。如图2所示为阿托伐他汀正离子多反应监测(+MRM)扫描质谱图，图3所示为D5-阿托伐他汀正离子多反应监测(+MRM)扫描质谱图，图4所示为邻羟基阿托伐他汀正离子多反应监测(+MRM)扫描质谱图，图5所示为D5-邻羟基阿托伐他汀正离子多反应监测(+MRM)扫描质谱图，图6所示为对羟基阿托伐他汀正离子多反应监测(+MRM)扫描质谱图，图7所示为D5-对羟基阿托伐他汀正离子多反应监测(+MRM)扫描质谱图。
邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 575→m/z 440，CE 34eV，D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 580→m/z445，CE 34eV，图8是AT(上)、o-OAT(中)、p-OAT(下)离子反应推测的断裂方式示意图，反映AT、o-OAT、p-OAT以及同位素内标质谱断裂方式，“*”号为氘代位点。
实施例：
【缩写说明】
1材料
1.1仪器
色谱仪：LC-30AD快速液相色谱系统，日本岛津公司。
质谱仪：6500型三重四极杆串联质谱仪，配有电喷雾电离源(Turbo Ion Spray)，加拿大Sciex公司。
数据处理采用软件：Analyst(version 1.6.2)，加拿大Sciex公司。
离心机：CT15RE型离心机，日本Hitachi公司。
分析天平：CD225D型分析天平，北京赛多利斯仪器有限公司。
1.2对照品和试剂
阿托伐他汀钙(纯度，96％)和D5-阿托伐他汀钙盐(纯度，98％)购自加拿大Toronto Research Chemicals公司。
邻羟基化阿托伐他汀(纯度，98.5％)、对羟基化阿托伐他汀(纯度，98％)、D5-邻羟基化阿托伐他汀(纯度，99.2％)和D5-对羟基化阿托伐他汀(纯度，99.2％)购自加拿大TLC公司。
甲醇、乙腈、醋酸铵(HPLC级)购自美国Sigma公司。
去离子水(18.2mΩ，TOC≤50ppb)由法国Milli-Q超纯水系统制备。
2方法
2.1溶液及样品的配制
【标准系列样品】精密称取各对照品适量，以甲醇分别溶解并定容，配制成AT、o-OAT和p-OAT浓度约为1.00mg/mL的贮备液。精密吸取各自贮备液适量，以人空白血浆逐级稀释得到混合标准系列样品，AT、o-OAT和p-OAT浓度范围分别为0.0200～15.0、0.0200～15.0和0.0100～2.00ng/mL。
【质控样品】采用与标准系列样品相似方法配制AT、o-OAT和p-OAT四个浓度水平混合质控样品。LLOQ浓度为0.0200/0.0200/0.0100ng/mL，LQC浓度为0.0500/0.0500/0.0200ng/mL，MQC浓度为1.00/1.00/0.200ng/mL，MQC浓度为12.0/12.0/1.60ng/mL。
【内标溶液】精密称取各内标对照品，即D5-AT、D5-o-OAT和D5-p-OAT。以甲醇溶解并定容，配制成D5-AT、D5-o-OAT和D5-p-OAT浓度均约为1.00mg/mL的内标贮备液。精密吸取上述各内标贮备液适量，加甲醇:水(50:50，v/v)稀释，获得D5-AT、D5-o-OAT和D5-p-OAT浓度均为10.0ng/mL的混合内标溶液。
2.2血浆样品处理
取100μL血浆，分别加入20.0μL内标溶液、100μL6M醋酸铵水溶液和400μL乙腈。涡流1min，离心1min(14000g)，全取上清液于氮气流吹干浓缩。残留物以乙腈:水(40:60，v/v)溶解，涡流混匀，置于自动进样器内，进行LC-MS-MS分析，进样体积为12.0μL。
2.3色谱及质谱条件
【色谱条件】
色谱柱：Kinetex XB C18(50mm×2.1mm i.d，2.6μm)。
流动相A：水，含1％甲酸。
流动相B：乙腈。
梯度程序洗脱：
柱温：40℃。
流速：0.8mL·min-1。
【质谱条件】
电喷雾电离源(Turbo IonSpray)。
电压为5500V。
离子源温度为500℃；
内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi。
扫描模式为正离子多反应监测(+MRM)扫描。
监测离子反应分别为：
AT，m/z 559→m/z440，碰撞能量(collision energy，CE)22eV；
D5-AT，m/z 564→m/z 445，CE 22eV；
o/p-OAT，m/z 575→m/z440，CE 34eV；
D5-o/p-OAT，m/z 580→m/z 445，CE 34eV。
2.4方法学验证
按照美国FDA指导原则对本方法进行了方法学验证，内容包括稳定性、选择性、线性、准确度、精密度、回收率基质效应。
【选择性】
取六个来源不同的空白血浆及各自配制的LLOQ样品处理后进样分析。色谱共流出干扰物的峰面积须小于LLOQ待测物峰面积的1/5，小于内标峰面积的1/20。
【标准曲线】
以待测物理论浓度为横坐标(x)，待测物与内标物的峰面积比为纵坐标(y)，进行回归分析计算的直线回归方程(权重因子W＝1/x2)。方法验证每一分析批对标准曲线样品双样本分析。
【准确度和精密度】
方法验证每一分析批测定四浓度质控样本各六样本。LLOQ日内、日间精密度以RSD计算小于20％方可接受。准确度以RE在20％～20％之间方可接受。其余各浓度水平的QC样品各成分日内、日间精密度需小于15％方可接受，准确度在15％～15％之间方可接受。
【稳定性】
考察各待测物在血浆样品中的稳定性时，将LQC和HQC置于不同温度及环境中，放置结束后进行三样本分析。共考察四种放置条件，分别为：冰水浴放置6h，提取后进样器内放置24h，经历3次冷冻-解冻循环(从75±10℃到冰水浴)，75±5℃放置97天。
【回收率】
取空白血浆100μL(n＝9)，提取后(不加内标溶液)取全部乙腈层液体分别加入和LQC、MQC和HQC相同浓度的待测物溶液和内标溶液，涡流混合后测定。另提取LQC、MQC和HQC各6份，进样测定。以2种处理方法的峰面积比值计算提取回收率。
【基质效应】
取不同来源空白血浆(n＝6)，提取后(不加内标溶液)，取全部乙腈层液体加入和LQC和HQC相同浓度的待测物溶液和内标溶液，涡流混合后测定。另取去离子水代替血浆，按上述方法处理。以两种方法获得的峰面积比值计算基质因子，通过基质因子的RSD评估基质效应，基质因子小于15％方可接受。
2.5阿托伐他汀内酯(LAC)和羟基羧酸(CAR)型结构相互转化评估
样品吹干浓缩过程中以及提取后样品放置过程中，可能存在LAC和CAR型相互转化，影响浓度测定准确性。由于没有待测物LAC结构的对照品，采用受试者的混合血浆样品，评估这一影响。合并同一时间点三名受试者血浆样品，编码为1到16。
【吹干的影响】
使用本发明预处理方法提取以上样品。将100μL上层乙腈置于96孔板内吹干浓缩，残留物以250μL乙腈：水(40:60，v/v)溶解，编号为SET(A)。另取100μL上层乙腈，加入150μL去离子水，编号为SET(B)。将两套样品进样分析，评估吹干对浓度测定的影响。
【预处理后放置过程的影响】
采用预处理后放置24h再分析的方法评估放置过程对浓度测定的影响。将1-16号样品按照“2.2血浆样品处理”方法提取后分析。该样品于分析后置于自动进样器内(4℃)24h后再次分析。比较两次测定浓度，评估预处理后放置过程对浓度测定的影响。
2.6生物等效性研究
应用建立的定量分析方法测定血浆中AT及代谢物的浓度，用于评价阿托伐他汀钙片人体生物等效性。24名健康受试者随机分成两组，分别给予20mg阿托伐他汀片的参比制剂和受试制剂。8天清洗期后将参比制剂组与受试制剂组交换。于给药前(0h)、给药后0.17h、0.33h、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、6.0h、8.0h、12h、16h、24h、36h、48h和72h，静脉取血2～3mL，置肝素抗凝离心管中，离心(2000g，4℃)10min后分离血清，75±10℃保存
3结果与讨论
3.1方法学验证
【方法的选择性】
图9至图16所示为测定人血浆中AT、o-OAT、p-OAT及内标典型MRM色谱图，峰I、II、III、IV、V、VI分别为AT、D5-AT、o-OAT、p-OAT、D5-o-OAT、D5-p-OAT。AT、o-OAT和p-OAT保留时间分别约为1.4、0.5、1.3min，保留时间附近未见共流出干扰峰。
【标准曲线】
本发明以AT及代谢物浓度为横坐标，AT及代谢物内标物的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算AT及代谢物的血药浓度。测定人血浆中AT和o-OAT线性范围均为0.0200～15.0ng/mL；p-OAT线性范围为0.0100～2.00ng/mL。待测物标准曲线直线平均回归方程(n＝3x 2)分别为：
AT:y＝(0.461±0.042)x+(0.000335±0.000745)(r＝0.9986±0.0005)，
o-OAT:y＝(0.649±0.060)x－(0.000014±0.000734)(r＝0.9983±0.0011)，
p-OAT:y＝(0.404±0.031)x－(0.000534±0.000218)(r＝0.9986±0.0003)。
【方法的精密度与准确度】
各成分LLOQ日间精密度均不大于9.2％，日内精密度均不大于11.7％。如表1所示，准确度在0.3～9.6％范围内。各成分其余浓度QC样品日内精密度均不大于9.2％，日间精密度均不大于8.3％，同样如表1所示准确度在.7～2.7％范围内。
表1人血浆中AT、o-OAT、p-OAT精密度和准确度的测定
【处理回收率】
LQC、MQC和HQC浓度水平：AT的提取回收率分别为81.1％、94.0％和88.7％；o-OAT的提取回收率分别为85.8％、89.0％和85.6％；p-OAT的提取回收率分别为95.7％、89.9％和102％。D5-AT、D5-o-OAT和D5-p-OAT的回收率分别为89.4％、87.7％和94.9％。
【基质效应】
LQC、HQC浓度水平下AT的基质因子分别为100％和94.1％，RSD分别为4.0％和4.7％；D5-AT的基质因子为99.7％，RSD为3.8％；o-OAT基质因子分别为101％和93.0％，RSD分别为4.8％和7.3％；D5-o-OAT的基质因子为99.5％，RSD为4.3％；p-OAT基质因子分别为95.3％和94.4％，RSD为4.3％和4.6％；D5-p-OAT的基质因子为104％，RSD为4.3％。以上结果表明，基质不干扰待测物定量分析。
【血浆稳定性考察】
如表2所示，为血浆稳定性试验结果。AT血浆样品稳定性样品测定浓度的RSD范围为0.6～6.7％，RE为2.0～8.8％之间。o-OAT血浆样品稳定性样品测定浓度的RSD范围为1.0～9.0％，RE为4.5～8.9％之间。p-OAT血浆样品稳定性样品测定浓度的RSD范围为2.0～8.9％，RE为8.2～9.8％之间。结果表明在上述条件下AT、o-OAT和p-OAT均稳定。
表2 AT、o-OAT、和p-OAT在人血浆中的稳定性(n＝3)
3.2 LAC和CAR型相互转化考察
温度、pH的影响：本发明考察了AT及代谢物的CAR和LAC型化合物在不同温度、pH环境中的相互转化。结果显示在室温放置条件下血浆中LAC型容易转化为CAR型。通过降低血浆温度(4℃)或者调节pH低于6的方法，可以抑制转化的发生。
吹干方法的影响：尽管已有报道使用吹干的方法浓缩样品，但目前为止，未见文献考察该过程对待测物稳定性的影响。本研究中，我们考察了吹干过程对相互转化的影响。结果见表3，所示吹干前与吹干后的测定值偏差在-7.7～13.1％范围内。吹干过程不影响CAR型待测物测浓度测定。
表3混合血浆样品经吹干与不吹干处理后各待测物测定浓度对比
提取物复溶解及进样过程的影响：本发明考察了提取物复溶解后置于进样器内(4℃)是否发生了相互转化。结果同样如表3所示，放置24h以后重新测定值于原值之间变异在-6.3％～10.7％范围内，见表4。因此，尽管未将复溶剂的pH调节至低于6，LAC型没有水解开环生成CAR型代谢物。
表4混合血浆样品经吹干与不吹干处理后各待测物测定浓度对比
4人体生物等效性研究
提供检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法在评价阿托伐他汀生物等效性的应用，是以D5-阿托伐他汀为分析检测阿托伐他汀的内标物。将验证后的方法用于同时定量检测血浆中AT、o-OAT和p-OAT，以评价阿托伐他汀钙片的生物等效性。24名健康受试者单次口服10mg受试制剂阿托伐他汀钙(中国某制药公司)或者参比制剂(美国Pfizer公司)。平均血浆药物浓度-时间曲线见图17。采用WinNonlin软件(美国Pharsight公司)非房室模型计算的主要药动学参数Cmax、AUC(0–t)、AUC(0–∞)、Tmax和t1/2。在90％置信区间内，Cmax和AUC(0–∞)比值在0.80～1.25范围内，表明两种药物生物等效(数据未给出)。
Claims (10)
1.检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于包括下述步骤：
预处理，取血浆，加入阿托伐他汀及代谢物同位素内标溶液，以6M醋酸铵水溶液和乙腈为盐析分层试剂沉淀蛋白，涡流及离心后制得血浆样品；
色谱，将血浆样品液相色谱分离，采用Kinetex XB C18柱，梯度洗脱，流动相A:流动相B初始体积比为60:40，流速0.8mL/min，柱温40℃，流动相A为水，流动相B为乙腈；
质谱，电喷雾电离源，正离子多反应监测(+MRM)扫描，喷雾电压5500V，内源气体1(N2)65psi，气体2(N2)75psi，气帘气体(N2)35psi，离子源温度500℃，阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 559→m/z 440，CE 22eV，D5-阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 564→m/z445，CE 22eV，邻羟基阿托伐他汀和对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z 575→m/z440，CE34eV，D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀反应监测离子[M+H]+m/z580→m/z 445，CE 34eV；
计算，以阿托伐他汀及代谢物浓度为横坐标，阿托伐他汀及代谢物与阿托伐他汀及代谢物内标物的峰面积比为纵坐标，回归制得相应标准曲线方程，计算阿托伐他汀及代谢物的血药浓度。
2.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述预处理步骤，采用冰冻醋酸铵水溶液和乙腈。
3.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述预处理步骤，内标溶液配制：称取D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀，以甲醇溶解并定容制得1.00mg/mL的内标贮备液，吸取各内标贮备液适量，加入稀释液得浓度10.0ng/mL的D5-阿托伐他汀、D5-邻羟基阿托伐他汀和D5-对羟基阿托伐他汀的内标溶液，所述稀释液为甲醇和水混合液，甲醇:水的体积比为50:50。
4.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述预处理步骤，取100μL血浆，分别加入20.0μL内标溶液、100μL 6M醋酸铵水溶液和400μL乙腈，涡流及离心后取上清液于氮气流吹干浓缩，残留物以乙腈和水溶解且涡流混匀得血浆样品，乙腈:水的体积比为40:60。
5.根据权利要求4所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：经所述涡流提取血浆样品的时间控不超过1min。
6.根据权利要求4所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述涡流及离心条件为涡流1min，14000rpm离心1min。
7.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述色谱步骤，流动相A含0.1％甲酸。
8.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述色谱步骤，将血浆样品置于自动进样器内，进行LC-MS/MS分析，进样体积为2.0μL。
9.根据权利要求1所述的检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法，其特征在于：所述色谱步骤，所述色谱步骤，Kinetex XB C18柱为核壳色谱柱，其长度50mm、直径2.1mm、填料粒径2.6μm。
10.检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法在评价阿托伐他汀生物等效性的应用，其特征在于：以D5-阿托伐他汀为分析检测阿托伐他汀的内标物。
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