CN107109389A - 具有修饰的轻链特异性的肉毒杆菌神经毒素及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本文描述了针对非神经元SNARE蛋白的蛋白酶。所述蛋白酶通过肉毒杆菌神经毒素轻链的选择性突变产生，并且利用包括全部或部分非神经元SNARE蛋白的报告构建体来表征。这种蛋白酶在治疗与分泌过多有关的疾病中具有效用，其中分泌过多由非神经元SNARE蛋白介导。

Description

具有修饰的轻链特异性的肉毒杆菌神经毒素及其生产方法

本申请要求享有于2014年8月12日提交的申请号为62/036,412的美国临时申请和于2015年4月2日提交的申请号为62/142,400的美国临时申请的优先权。这些和所有其它参考的外部材料通过引用整体并入本文。当通过引用并入的参考文献的定义或术语的使用与本文所提供的该术语的定义不一致或相反时，以本文提供的该术语的定义为准。

技术领域

本发明的领域为肉毒杆菌神经毒素。

背景技术

下面的描述包括有助于理解本发明的信息。但这里并非承认，本文所提供的任何信息为现有技术或与现有要求保护的发明有关，或本文明确或隐含引用的任何披露为现有技术。

来自疾病特异性的细胞类型的分泌过多是许多内分泌、免疫和分泌性疾病的特征。例如，肥大细胞的分泌支持严重过敏反应、过敏反应、自身免疫和其它炎症性疾病，而来自上皮细胞的粘蛋白的分泌引起囊性纤维化(CF)和慢性阻塞性肺病(COPD)。通过靶向分泌所需的核心机制来减少分泌能够为这样的疾病提供新的且有效的治疗方式。这样的来自疾病特异性细胞类型的分泌由SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺—敏感因子附着蛋白受体)蛋白介导，所述SNARE蛋白是膜相关蛋白家族，其形成复合物，所述复合物介导与质膜的囊泡融合以及随后囊泡内容物的释放。

非神经元SNARE对于内分泌和代谢途径是至关重要的，所述内分泌和代谢途径调节激素、生长因子和其他信号分子的释放。这样的分泌途径中的功能障碍导致疾病。例如，所述非神经元SNARE蛋白SNAP-23对于多个疾病途径的分泌是至关重要的，所述多个疾病途径的分泌包括关节炎中的IL-6(白细胞介素-6)和TNF(肿瘤坏死因子)的释放，COPD、CF和特发性支气管扩张中的粘蛋白分泌过多，止血中的血小板分泌，糖尿病中的胰岛素分泌，血压调节中的肾素释放以及在肿瘤细胞侵袭中的基质降解酶的释放。类似地，非神经元SNARE蛋白SNAP-29被认为是神经递质释放的负调节剂，并且是细胞内蛋白质转运途径的关键组成部分，SNAP-29的突变导致称为CEDNIK的神经皮肤综合症。

通过调节SNARE蛋白的活性阻断分泌已经通过以下事实被证明了：通过使用肉毒杆菌神经毒素(BoNT)降解介导神经递质释放的神经元SNARE蛋白，从而阻断神经递质从运动神经元的释放。肉毒杆菌神经毒素(BoNT)，是由细菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的锌内肽酶家族，是一类被FDA批准用于广泛的治疗和美容应用的功能强大的药物。有七个广泛认知的BoNT血清型(BoNT/A～BoNT/G)，和最近报告的血清型H。BoNT切割在运动神经元中发现的一种或多种可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)蛋白，阻断神经递质的释放，并导致弛缓性麻痹。

尽管在已知的最致命的天然物质中，BoNT被广泛用于各种药物和美容应用，包括颈部肌张力障碍、多汗症、斜视、眼睑痉挛、眉间皱纹和慢性偏头痛。在中毒期间，BoNT经由该分子的H链部选择性地结合并进入运动神经元。在进入运动神经元时，该分子的L链部被释放，并以高度序列特异性的方式降解受控的神经递质分泌所需的靶向SNARE蛋白。这导致与治疗运动神经元相关联的肌肉收缩的特定且长期的减少。与运动神经元的结合和神经递质释放中利用的SNARE的降解都是高度特异性的。例如，BoNT/A是大多数基于BoNT的药物的基础，其通过特异性切割蛋白SNAP-25来阻断来自暴露的运动神经元的分泌，但不与其它细胞类型结合或切割其它(例如那些在非神经元细胞中表达的)SNAP-25同种型。之前，BoNT已通过H链修饰被重定向到了非神经元细胞类型。然而，重定向的BoNT的治疗效用受到神经元SNARE蛋白的水解特异性的限制。因此，BoNT的治疗用途目前限于神经元相关的疾病/病症，对于治疗非神经元分泌紊乱不起作用。

因此，仍然存在对在非神经元细胞中的具有治疗性分泌抑制作用的BoNT和/或修饰的BONT的需要。

发明内容

本发明的主题在于提供一种装置、系统以及方法。

下面将通过优选实施例和附图的详细描述来具体阐述本发明主题的各种目的、特征、方面和优点，附图中的相同标记表示相同组成部分。

附图说明

图1的A和B描述了本发明构思的方法的示例性结果。图1的A描绘了示例性的肉毒杆菌LC(轻链)的Strep-Tactin(链霉亲和素(Streptavidin)的突变体)纯化的电泳结果以及来自一组分子量标准的结果。图1的B通过使用具有将供体荧光团接合到受体荧光团的LC切割区域的FRET构建体，示出了FRET(荧光共振能量转移)测定获得的典型结果，所述FRET(荧光共振能量转移)测定应用于LC制剂的连续稀释，所述LC制剂从5毫升或200微升培养体积的转染细胞得到。

图2示意性地描述了本发明构思的测定方法。示出了工作流程中肉毒杆菌轻链(LC)的三个不同的切入点，代表三种不同的测定方法。

图3说明了两个非神经元SNARE蛋白(SNAP-23和SNAP-29)与如在针对肉毒杆菌神经毒素A或E的示例性报告构建体中所表示的神经元SNARE SNAP-25序列的一部分的比对。示出了所述SNAP-25序列的a-外部位点(a-exosite)和β-外部位点(β-exosite)的识别区域，由箭头示出了与肉毒杆菌神经毒素A的轻链(LC)的特定氨基酸相互作用的残基。也同时示出了与肉毒杆菌神经毒素A轻链活性有关的SNAP-25切割位点。

图4示出了示例性的微孔板，其中在单个孔中进行的试验的布置通过使用本发明构思的方法便于高通量测试。

具体实施方式

下面的描述包括有助于理解本发明的信息。但这里并非承认，本文所提供的任何信息为现有技术或与现有要求保护的发明有关，或本文明确或隐含引用的任何披露为现有技术。

本发明主题提供组合物和方法，所述方法用于产生和鉴定提供突变的BoNT轻链(LC)的组合物，所述突变的BoNT轻链(LC)具有对于非神经元SNARE蛋白的蛋白水解活性。非神经元SNARE蛋白包括涉及非神经元细胞(包括神经内分泌细胞)的分泌过程的SNARE蛋白。现有BoNT蛋白(例如BoNT/A)的轻链(LC)内的选定氨基酸可以在一个或多个位点突变，以提供一个或多个例如SNAP-23和/或SNAP-29的非神经元SNARE蛋白的识别、底物特异性和/或增强的反应动力学。提供了鉴定有用的或合适的突变轻链的轻链分离和表征方法，以及利用这样的构建体的治疗方法。

应当理解，所公开的组合物和方法提供许多有利的技术效果，所述技术效果包括提供了对来自非神经元细胞的分泌过多的特定且长期的控制以及减轻相关疾病。

如本文的描述和随后的权利要求书中所使用的，除非文中另有明确说明，否则“一个”，“一种”和“所述”的含义包括复数指代。此外，如本文的描述中所使用的，除非文中另有明确说明，否则“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。

除非文中有相反指示，否则本文所阐述的所有范围应解释为包括其端点，并且开放式范围应解释为仅包括商业实用价值。类似地，除非文中有相反指示，否则所有值的列表应被认为包括中间值。在本文中值的范围的引用仅旨在用作单独提及落在所述范围内的每个单独的值的快捷方法。除非本文另有说明，具有范围的每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。

除非本文另有说明或与文中明显矛盾，否则本文所述的所有方法能够以任何合适的顺序进行。任何及所有实例的使用或相对于某些实施例提供的示例性语言(例如，"如")仅仅是为了更好地说明本发明，并不构成对本发明其他所要求保护的范围的限制。说明书的语言不应该被解释为表明本发明实践所必需的任何未要求保护的元素。

本文公开的本发明的替代元素的分组或实施例不应被解释为限制。每组成员可以单独地或者以与该组其它成员或本文中出现的其它元素的任何组合的形式来被引用和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，一个组的一个或多个成员能够被包括在一个组中或从一个组中删除。当发生任何这样的包括或删除时，本文中的说明书被视为包含经改进的组，从而实现所附权利要求中使用的所有马库什群组的书面说明。

以下讨论提供了本发明主题的许多示例实施例。尽管每个实施例表示本发明元素的单个组合，但是本发明主题被认为包括所公开元素的所有可能组合。因此，如果一个实施例包括元素A，B和C，并且第二实施例包括元素B和D，则即使没有明确公开，本发明主题也被认为包括A，B，C或D的其他剩余组合。

在本发明构思的实施例中，对非神经元SNARE具有特异性的修饰的BoNT衍生自与肉毒杆菌神经毒素相关的天然序列，所述肉毒杆菌神经毒素包括BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C，BoNT/D，BoNT/E和BoNT/F。这些神经毒素包括轻链(LC)部分，例如BoNT/A(SEQ ID NO 4)的轻链，其特异性结合并表现出对神经元SNARE的蛋白水解活性。如下文详述，本发明构思的实施例包括通过LC序列内的一个或多个选定氨基酸的位点特异性突变衍生的肽。

这些突变可以以细菌，酵母和/或携带编码感兴趣的肽的表达载体的其他细胞的形式提供。此类表达载体可以是短暂感染的结果，也可以是诱导型或非诱导型的。可以使用体外测定来鉴定对非神经元SNARE具有增强的结合和/或具有底物特异性的突变的BoNT LC的存在，这有助于自动化操作。

报告子(reporter)广泛用于高通量筛选(HTS)研究，以鉴定BoNT抑制剂和基于BoNT的药物产品效力测试。商用测定利用融合肽报告子，其包括由神经元SNARE蛋白底物的一部分分离的肽荧光团的福斯特能量共振转移(FRET)对。神经元SNARE蛋白底物的蛋白水解引起FRET对的分离，从而引起可观察的荧光的变化，所述可观察的荧光的变化使BoNT蛋白水解切割的灵敏和精确的定量测量成为可能。为了表征具有期望的非神经元SNARE特异性的突变的BoNT肽，提供了修饰的BoTest报告子，其包含代表期望的SNARE蛋白质特异性的非神经元SNARE序列，所述非神经元SNARE序列插入在肽荧光团的FRET对之间。例如，为了表征对SNAP-23具有增强的结合和/或具有底物特异性的突变的BoNT，可以使用包含SNAP-23氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2)的全部或一部分的报告构建体，所述SNAP-23氨基酸序列插入在荧光肽(例如，黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白)的FRET对之间。类似地，为了便于鉴定对SNAP-29具有增强的结合和/或具有底物特异性的突变的BoNT，可以使用包含SNAP-29氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：3)的全部或一部分的报告构建体，所述SNAP-29氨基酸序列插入在荧光肽(例如，黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白)的FRET对之间。

在一些实施例中，报告构建体能够包括锚定区域。这种锚定区域可用于将报告构建体定位于测试表面或膜。在这样的实施例中，切割位点介于在锚定区域和报告区域(例如，一种或多种荧光蛋白)之间。切割位点的切割导致报告子从测试表面或从膜上释放。可以以许多方式检测所述切割活性，包括表征来自在测试表面或膜区域的报告子的残留信号，在释放后检测来自报告子的信号，或在从测试表面或膜释放之后由于报告子区域的降解而造成的来自报告子的信号丢失。在优选的实施例中，锚定区域提供了对脂膜的定位。合适的脂膜包括施加到表面或由表面支承的细胞膜，质膜，囊泡膜和/或脂质层。在本发明构思的一些实施例中，报告构建体可以是在相同活细胞内表达和表征突变的BoNT活性。

如上所述，BoNT存在于许多不同的血清型中：BoNT/A,BoNT/B,BoNT/C,BoNT/D,BoNT/E,BoNT/F和BoNT/G。最近还提出了BoNT/H。它们在氨基酸序列，作用时间和/或底物特异性方面存在差异。例如，BoNT/A和BoNT/E都对SNAP-25(SEQ ID NO 1)具有底物特异性，然而BoNT/A具有几个月的作用时间，而BoNT/E具有几天的作用时间。能够至少部分地基于期望的作用时间来选择用于突变以改变底物特异性的BoNT。在一些实施例中，仅所选BoNT的轻链(LC)序列(即BoNT的提供底物识别和蛋白水解活性的部分)被突变。在一个优选的实施例中，BoNT/A(LC/A，SEQ ID NO 4)的LC肽用作突变的BoNT肽的基础。

本发明构思的一个实施例是用于鉴定突变的BoNT肽的方法，当相比于具有天然BoNT序列(即没有突变)的相应肽时，所述突变的BoNT肽具有改进的对非神经元SNARE的底物特异性和/或反应动力学。例如，这种突变的BoNT肽能够显示出，其对于非神经元SNARE的结合能为具有天然BoNT序列的相应肽的对于非神经元SNARE的结合能的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或比其更大。类似地，这种突变的BoNT肽能够显示出，其指示对于目的非神经元SNARE的蛋白水解切割的反应动力学为具有天然BoNT序列的相应肽的对于目的非神经元SNARE的蛋白水解切割的反应动力学的10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，或比其更大。在一些实施例中，能够对全长或截短的LC序列进行利用如上所述的修饰的BoTest报告构建体的筛选研究，以鉴定具有期望特征的那些LC序列。全长序列的使用有利地提供了完整BoNT的更准确表示，并支持提供高度纯化的活性肽产物的纯化方案。在优选的实施例中，对全长(448个氨基酸)LC/A(SEQ ID NO4)或LC/A衍生序列进行筛选研究。通过使用旋转柱，能够实现用于培养体积从5ml至200μl培养物的微型化、简化和重新优化的方案。

在典型筛选研究的例子中，5ml和200μl培养物产生可测定量的LC/A。使用具有天然序列的LC/A，通常在小于1小时内对于来自200μl样品的高稀释度(例如，1:20,000)的制备物观察到完整的 A/E报告子的切割。延长孵育能够提高灵敏度。例如，将孵育时间延长至18小时通常显示来自1:200,000稀释的天然序列LC/A的典型200μl规模的制备物的可检测的活性。在本发明构思的一些实施例中，提供了对照报告构建体，其中供体和受体荧光团被未在神经元或非神经元的SNARE上表示的切割位点分开。这种对照报告构建体可用于测定非特异性蛋白酶活性，例如由于突变LC部分的污染或不期望的活性。这种对照报告构建体的例子是 KO，其是对非BoNT蛋白酶敏感的对BoNT不敏感的对照 A/E报告构建体。

以下为能够识别非神经元SNARE蛋白SNAP-23和SNAP-29的BoNT LC/A突变体的鉴定的例子。

LC/A可以从少至200μl的细菌培养物获得，使得蛋白能够在96孔微孔板的单个孔中表达(参见图1)。如图所示，将培养体积从常规5mL体积减少至200μL(其可以方便地容纳在常规96孔微孔板的单个孔内)对衍生自转化细胞的LC的产率或活性没有明显影响。由于在溶菌之后表达的突变LC/A结合于孔表面并且可以在测定前通过洗涤来纯化，能够使用市售包被的96孔板(来自IB A)在单个孔中进行一些或全部测定步骤(图2)。随后可以通过向孔中加入含有包含SNAP-23或SNAP-29的报告构建体的反应缓冲液并孵育来进行测定。这种方法提供测定的高通量，并且减少了时间、成本和样品操作。

如图2所示，存在若干有用的测试策略。在所有这些测试策略中的工作流程是相似的：培养和诱导，随后裂解诱导的细胞并分离表达的LC，随后表征表达的LC的活性。所述方法在LC进入测试过程的进入点不同。在一些实施例中，生长和诱导，裂解和分离以及活性测试能够在同一测试孔中发生。在其它实施例中，生长，诱导和裂解在另一个容器或测试装备中进行，同时LC的分离和其活性的表征在测试板的相同的孔中进行。在另一个实施例中，LC的生长、诱导、裂解和分离发生在与测试板分离的容器和/或固定器中，并且被分离的LC被转移到所述测试板的孔中用于表征其活性。在一些实施例中，单个测试板可以用于同时执行这些测试工作流程中的两个或更多个。如图2所示，在一些情况下，包被的板可用于整个测定工作流程，在其它实施例中，这种板仅用于蛋白质纯化和/或筛选测试。

如图2所示，表达突变的LC/A的细菌可以在常规96孔微孔板中培养，然后接种到标准96孔微孔板(图2的策略2和3)或包被(图2的策略1)的96孔微孔板中的新鲜培养基中，在其中所述表达突变的LC/A的细菌被培养，诱导并孵育足够的时间(例如，过夜)，以使突变的LC/A生长和表达。诱导后，细菌裂解。来自包被板的培养物的表达的突变LC/A结合板孔壁，而在标准板中生长的裂解的培养物可以加入包被的板中并进行测试。随后可以用合适的洗涤缓冲液(例如含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS-T))洗涤测试孔以除去未结合的材料。也可以使用离心柱纯化裂解的培养物，并在常规微孔板的孔中测试。在本发明构思的一些实施例中，将对照报告构建体如 KO加入至少一些测试孔中以监测非特异性蛋白酶活性。

由于相对于SNAP-25(SEQ ID NO 1)的天然LC/A切割，具有改变的底物特异性的突变体可能具有改变的反应速率和/或催化转化，可以通过滴定在纯化和测定期间使用的诱导的细菌培养物的量以确定作出响应的稀释度，从而确定测定检测限，所述稀释度作出的所述响应，与不含诱导培养物的对照的响应相比具有大约2,3,4,5,6,7,8,9,10或更多的标准偏差。在优选的实施例中，以这种方式测试的突变LC在至少约4小时内以至少约1:100的稀释度产生适当的检测肽构建体的可检测的切割。

可以通过用先前表征的BoNT报告构建体的相应部分取代SNAP-23和/或SNAP-29序列的全部或部分来产生SNAP-23和SNAP-29的报告肽构建体。例如，SNAP-23或SNAP-29可以通过用 A/E中的SNAP-25片段分别与SNAP-23(例如SEQ ID NO 2)和SNAP-29(例如SEQ ID NO 3)的部分或全长交换来生产报告肽构建体。由于名义为SNAP-23和SNAP-29插入片段(分别为SEQ ID NO：2和3)比SNAP-25(SEQ ID NO：1)(图3)略短；可以添加间隔肽序列以保持所有报告子的大小一致性。表达载体可以被构建，被表达并所得报告肽被纯化，例如用于体外测试目的。由此可以定量产生的报告构建体的大小，纯度和产量。可以用BoNT/A和/或BoNT/E测试SNAP-23和SNAP-29报告构建体以验证这些蛋白酶缺乏底物活性。通过非BoNT蛋白酶(例如，胰蛋白酶)切割这种构建体可用于验证荧光肽的性能。

BoNT/A轻链(LC)和SNAP-25(SEQ ID NO：1)的一部分之间的结合位点和/或识别相互作用位点示于图3中，同时示出了SNAP-25(SEQ ID NO：1)与非神经元SNARE蛋白SNAP-23(SEQ ID NO：2)和SNAP-29(SEQ ID NO：3)之间的序列比对。相互作用中涉及的特定氨基酸和BoNT/A LC的相应的相互作用氨基酸由箭头示出。还示出了由BoNT A LC切割的SNAP-25(SEQ ID NO 1)上的位点。当被占据时，所示的α-和β-外部位点代表抑制与BoNT/A LC的反应的SNAP-25(SEQ ID NO 1)的区域。

使用靶向被鉴定为与LC/A：：SNAP-25相互作用相关的关键残基的定点LC/A诱变，可以实现具有所期望的改变的底物特异性的修饰的LC/A的开发，从而产生突变LC肽库。可以如上所述筛选这些库的新的底物特异性和/或反应动力学。

与许多蛋白酶不同，BoNT需要大底物用于最佳切割。LC活性位点的几何形状和组成在BoNT血清型中高度保守，表明底物特异性起源于首先通过定向底物的外部位点相互作用发生的LC::底物结合，稳定复合物，并促进额外的接触，所述接触使LC准备好切割活性。发明人已经认识到，非天然SNARE同种型的切割是有效底物结合的作用，因为LC活性位点高度保守，不参与底物侧链相互作用，并且参与肽链切割的反应不需要在切割位点的特异性氨基酸侧链的存在。

例如，负责SNAP-25(SEQ ID NO 1)相互作用的LC/A接触残基在SNAP-23和SNAP-29的相应残基中高度或部分保守(参见图3)。饱和和特异性诱变的混合可用于基于它们所匹配的SNAP结构域(例如α-外部位点，延伸的接头和活性位点残基)产生不同类别的突变体。沿着SNAP-25α-外部位点延伸的BoNT/A LC疏水性侧链相互作用在SNAP-23和SNAP-29中在很大程度上保守(参见图3)。然而，SNAP-23和SNAP-29都在SNAP-25Asp166上含有取代，破坏了具有LC/A Lys337的盐桥并且可能改变结合稳定性。SNAP-29还含有SNAP-25Gln152取代，其潜在地影响与LC/A Lys356的极性侧链接触和在SNAP-25Ile156的另外的非保守性Gly取代。在LC/A Lys356和Lys337的饱和诱变可用于产生LC/A突变体，其补偿在与SNAP-23和SNAP-29相互作用时稳定性盐桥和极性侧链接触的损失。

SNAP-25的Arg176和LC/A的Glu148之间的盐桥提供了用于底物定位的潜在的关键锚定点，并且所述锚定点与SNAP-23和SNAP-29一起丢失。通过将LC/A Glu148突变为Lys或Arg，可以提供在SNAP-29中重建盐桥的突变LC/A肽库。SNAP-23在所述位置含有Pro取代，因此通过将LC/A的Val304和Ser143突变为Asp或Glu以利用邻近的Lys和Arg残基，可以提供针对所述底物的突变LC/A的备选盐桥。极性侧链相互作用发生在SNAP-25(SEQ ID NO 1)Glu193和LC/A Asn136之间，并且在SNAP-23和SNAP-29中都被破坏。在SNAP-23中，通过将LC/A AsnI36突变为Lys或Arg，从而产生盐桥，可以提供补偿这种盐桥的突变LC/A库。类似地，也可以通过在所述位置的饱和突变产生突变LC/A库以筛选补偿SNAP-29中的Thr取代的突变体。

SNAP-23和SNAP-29的活性袋包括大的带正电荷的残基(分别为Lys和Arg)，其代替SNAP-25Thr200。这些取代可以通过扩大袋和/或在LC/A中的Leu256和Val258处引入带负电荷的残基来适应。可以在这些位置进行Asp，Ala和Gly取代以扩大和/或使活性袋更有利于SNAP-23和/或SNAP-29。SNAP-29还在SNAP-25Asp193和Asn196处分别含有两个重要的Lys和Glu取代，其与LC/A Thr176和His227相互作用并导致转化或引入带电侧基。可以构建LC/AThrl76和His227的饱和库以筛选可以适应SNAP-29中的这些变化的突变体。

在表1中总结了可以被认为适合于本发明构思的突变LC的BoNT/A轻链的突变的例子，其以“X”示出在肉毒杆菌血清型A神经毒素轻链的序列内的特定位点处的取代。应当理解，本发明构思的突变LC可以包括单个取代，并且还可以包括这些取代中的两个或更多个。

表1

在本发明构思的其它实施例中，Asn136，Ser143，Glu148，Val304，Thr176，His227，Lys337，Leu256，Val258和/或Lys356中的一个或多个可以被LC/A(SEQ ID NO 4)内任何非相应的氨基酸取代，以提供相对于天然LC/A具有增强的对非神经元SNARE蛋白的亲和力和/或反应动力学的蛋白酶的全部或部分。

可以通过产生适当的突变体集合并针对SNAP-23和SNAP-29报告构建体进行测试来鉴定对SNAP-23和/或SNAP-29具有底物特异性的LC/A突变体。在测试方案的典型例子中，96孔微孔板可容纳20个突变LC/A肽以及对照，使得快速处理肽库内容物成为可能。可以培养和测定来自突变LC库克隆的单个克隆。在测试期间可以将原始克隆储存在4℃以允许克隆恢复和/或重新测试。通常，只有当在与这些报告肽构建体的孵育进行4小时后，阳性(即野生型)LC/A对照显示 A/E的完全切割且没有显著(即，<10)阴性对照报告构建体(例如， KO)切割，才能评价板。可以重新测试一开始不满足这些标准的板。阳性突变LC/A可以定义为在重复测试的一个或两个样品中显示大于约20％的适当的报告子切割的任何突变LC/A。可以培养任何阳性结果的原始亲本培养物，并用甘油保存和储存。所有阳性克隆可以重新测试，并且重新测试为阳性的克隆可以存储并全部测序以鉴定突变。可以验证显示阳性结果的克隆，例如使用重组全长SNAP-23或SNAP-29和蛋白质印迹分析以确认底物切割，并且可以将所述显示阳性结果的克隆转染到细胞中以测量体内分泌减少。

上述整合的生长/诱导，裂解，分离和活性测定使得鉴定这样的突变LC成为可能。然而，在一些实施例中，对于实现高通量、自动化或半自动化(即，结合手动和自动步骤)筛选方法来促进这样的鉴定是有用的。在本发明构思的一些实施例中，这样的方法可以通过使用24,48,96,384和/或1,536孔板来实现。在一些实施例中，在单个平板上进行生长，诱导，裂解，分离和活性测试的所有步骤。在其它实施例中，对于待表征的给定突变LC链，这些步骤可以跨两个或更多个板进行。在其它实施例中，可以在加入微孔板的孔之前离线(例如，使用小亲和柱用于分离突变LC)进行这些步骤中的一个或多个。

图4中示出了促进用于筛选目的的LC突变的高通量和/或自动化测试的96孔微孔板的示例性布置。如图所示，所述板包括使用BoTest A/E报告构建体和针对非特异性蛋白酶的报告构建体(例如，BoTest KO)测试的LC/A阳性和空载体阴性对照。通过使用携带合适的非神经元SNARE蛋白(例如，SNAP-23或SNAP-29)或其插入FRET对的供体和受体荧光团之间的切割片段的报告构建体来测试LC突变。在所描述的板的布局中，针对这样的非神经元SNARE报告构建体测试每个LC突变两次。此外，对于针对非特异性蛋白酶的报告构建体(例如BoTest KO)每第五次LC突变作为对照测试两次。

应当理解，鉴定为对非神经元SNARE蛋白具有期望活性的轻链序列可以与提供与非神经元细胞的选择性结合的靶向部分组合。合适的靶向部分包括天然或突变的肉毒杆菌重链序列，其当与LC组合时提供能够靶向细胞，被内化和被加工的完整的功能性蛋白。在本发明构思的一些实施例中，一个或多个突变LC链与BoNT./A，BoNT/B，BoNT/C，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F和/或BoNT/G的一个或多个天然或突变重链组合。应当理解，衍生自给定BoNT血清型的突变LC可以与来自相应BoNT血清型或不同BoNT血清型的天然序列或突变重链组合。在本发明构思的其它实施例中，一种或多种突变LC与一种或多种突变的肉毒杆菌重链组合，所述突变的肉毒杆菌重链对所需细胞类型显示改变的细胞特异性。

在本发明构思的其它实施例中，靶向部分可以是不对应于肉毒杆菌神经毒素重链的肽或其他分子。例如，靶向部分可以是抗体，抗体片段或单链抗体。在其它实施例中，靶向部分可以是细胞表面受体(例如，药物，激素，糖类，多糖或脂多糖)的配体或存在于靶细胞表面上的配体的受体(例如，凝集素)。在其他实施例中，靶向部分可以是亲和对(例如，生物素和亲和素)的一个成员，亲和对的另一个成员具有对靶细胞的亲和性(或者是具有对靶细胞的亲和性的分子的一部分)。在另外的其它实施例中，非肽大分子(例如适体)可以用作靶向部分。在一些实施例中，靶向部分可以通过接头肽连接到突变LC。这样的接头肽可以选择为柔性的(例如，以减少空间位阻)，或者可以选择为刚性的(例如，以提供期望的几何形状)。在一些实施例中，选择接头肽在内化后的细胞过程切割或降解，从而释放突变LC。

本发明构思的另一个实施例是用于治疗患有以分泌过多为特征的疾病的个体的方法。在这种方法中，将包含靶向非神经元SNARE的突变LC的药物组合物施用于患有这种疾病或需要这种治疗的患者。在这样的实施例中，可以选择突变LC，其对与分泌相关的一种或多种非神经元SNARE蛋白具有底物特异性和/或增强的反应动力学(相对于其来源的天然序列LC)，其中这样的一个或多个SNARE蛋白存在于以患病个体中的分泌过多为特征的细胞中。这样的药物组合物可以是可注射液体的形式，并且这种形式可以包括适合于静脉内，肌内，皮下，眼内，腹膜和/或中枢神经系统使用的缓冲液和保存剂(preservatives)。在其它实施例中，药物组合物可以作为局部用制剂提供，例如悬浮液，软膏，凝胶，洗剂或霜剂。在这样的实施例中，药物组合物可以包括辅助成分，例如润肤剂，赋形剂和/或有助于经皮递送的试剂。在一些这样的实施例中，药物组合物可以以局部施用的贴剂或膜的形式提供。在另外一些实施例中，药物组合物可以以促进透粘膜递送的形式提供。在这些实施例中，药物组合物可以作为吸入物质(例如，粉末，蒸气和/或滴雾)，舌下滴剂或锭剂，鼻喷雾剂，滴眼剂，栓剂或阴道栓剂提供。在另外一些实施例中，药物组合物可以供应用于口服食用，例如作为食用液体或食物。在这些实施例中，药物组合物可包括着色剂，调味剂和/或增稠剂。当被包装用于口服给药时，包含突变LC的药物组合物可以包括延迟释放和/或吸收直至达到胃肠道的期望位置的制剂或机构(例如，定时释放包衣，具有穿孔的胶囊等)。

通过使用在最小化不期望的效应的同时实现有效治疗的给药剂量/时间表可以进行使用修饰的LC轻链治疗分泌过多疾病。例如，本发明构思的突变LC可以以1μg/kg体重至100mg/kg体重的剂量施用。在一些本发明构思的实施例中，包含本发明构思的突变LC的药物组合物的单剂量可足以产生有益效果。在本发明构思的其它实施例中，在一段时间内施用多个剂量。例如，包含突变LC的相对小剂量的药物组合物可以按照规律的时间表(例如每隔一天，每天，每天2-12次)施用，直到达到所需的结果。由于它们的作用方法，一旦达到所需的治疗效果，含有突变LC的药物组合物可以具有延长的效果。如上所述，可以至少部分地基于选择突变LC所源自的天然LC序列来选择所述效果的持续时间。在一些实施例中，治疗效果可以在施用突变LC后持续至少3个月。在其它实施例中，在施用有效剂量的突变LC后，治疗效果可持续1天，3天，1周，2周，3周，4周，6周，8周或更长时间。

在本发明构思的一些实施例中，可以施用具有相似底物特异性但不同序列的一系列突变LC，以减少患者体内针对突变LC产生的抗体的效果和/或减少在用这种组合物治疗的患者中这种抗体应答的诱导。在另外一些实施例中，可以施用具有相似底物特异性但不同序列的突变LC的混合物，从而将每种突变LC的浓度降低到可能诱导显著免疫应答的水平同时保持治疗效果。类似地，可以修饰突变LC以降低抗原性(例如，通过PEG化)。

应该是显而易见的是，对于本领域技术人员来说，除了已经描述的那些，在不偏离本文的发明构思的前提下，可以进行更多的修改。因此，除了所附的权利要求的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在说明书和权利要求的解释中，所有术语应该以与文中一致的最宽的可能方式解释。特别是，术语“包括”和“包括了”应当被解释为指以非排他的方式的元素、组分或步骤，表明所引用的元素、组分或步骤可以存在或被利用或与其他未明确引用的元素、组分或步骤组合。其中，本说明书的权利要求指至少一个选自由A，B，C......和N组成的组的物品，说明书正文应当被解释为只需要一个来自所述组的元素，而不是A加N，或B加N等。

Claims (27)

1.用于检测对非神经元SNARE蛋白具有特异性的蛋白酶的报告构建体，其包括：

第一报告子和第二报告子；以及

插在第一报告子和第二报告子之间的非神经元SNARE蛋白或其可切割片段，

其中所述非神经元SNARE蛋白或其可切割片段的大小设定为调节第一报告子和第二报告子之间的能量转移。

2.根据权利要求1所述的报告构建体，其中所述第一报告子和所述第二报告子是FRET对。

3.根据权利要求1或2所述的报告构建体，其中所述非神经元SNARE蛋白选自由SNAP-23和SNAP-29构成的组。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的报告构建体，其中所述可切割片段包括选自由SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3构成的组的肽。

5.一种对非神经元SNARE蛋白具有底物特异性的蛋白酶，其包含具有非天然外部位点识别序列的突变的肉毒杆菌毒素轻链，其中所述非天然外部位点识别序列包括肽序列，所述肽序列具有相对于对应于天然肉毒杆菌毒素外部位点序列的肽序列的突变，并且其中所述突变被选择为提供在所述突变的肉毒杆菌毒素轻链与非神经元SNARE蛋白之间的增强的结合，而不是与神经元SNARE蛋白之间的结合，所述神经元SNARE蛋白充当具有相应的天然肉毒杆菌毒素外部序列的天然肉毒杆菌毒素轻链的底物。

6.根据权利要求5所述的蛋白酶，其中所述突变的肉毒杆菌毒素轻链衍生自肉毒杆菌毒素序列，所述肉毒杆菌毒素序列对应于由BoNT/A,BoNT/B,BoNT/C,BoNT/D,BoNT/E,BoNT/F,and BoNT/G构成的组中的至少一个的轻链序列。

7.根据权利要求5所述的蛋白酶，其中所述非天然外部位点识别序列包括对应于由SEQID NO.4的Asn136，Ser143，Glu148，Val304，Thr176，His227，Lys337，Leu256，Val258和Lys356构成的组中的一个或多个的位点的一个或多个突变。

8.根据权利要求6或7所述的蛋白酶，其中Asn136的突变选自由Ala，Arg，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的蛋白酶，其中所述Ser143的突变选自由Asp和Glu构成的组。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的蛋白酶，其中Glu148的突变选自由Lys和Arg构成的组。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的蛋白酶，其中所述Val304的突变选自由Asp和Glu构成的组。

12.根据权利要求6-11中任一项所述的蛋白酶，其中Thr176的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Trp，Tyr和Val构成的组。

13.根据权利要求6至12中任一项所述的蛋白酶，其中His 227的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

14.根据权利要求6至13中任一项所述的蛋白酶，其中Lys337的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

15.根据权利要求6至14中任一项所述的蛋白酶，其中所述Leu256的突变选自由Asp，Ala和Gly构成的组。

16.根据权利要求6至15中任一项所述的蛋白酶，其中Val258的突变选自由Asp，Ala和Gly构成的组。

17.根据权利要求6至16中任一项所述的蛋白酶，其中Lys356的突变选自由Ala，Arg，Asn，Asp，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val构成的组。

18.权利要求7所述的蛋白酶，其中所述非神经元SNARE蛋白选自由SNAP-23和SNAP-29构成的组。

19.一种鉴定对非神经元SNARE蛋白具有底物特异性的蛋白酶的方法，包括：

提供第一报告构建体，其包括插入第一报告子和第二报告子之间的第一非神经元SNARE蛋白或其片段，其中所述第一非神经元SNARE蛋白或其片段的大小设定为提供所述第一报告子与第二报告子之间的能量转移，以产生第一信号；

提供包括多个突变的肉毒杆菌毒素轻链肽的库，每个所述突变的肉毒杆菌毒素轻链肽具有非天然的外部位点识别序列；

使库的单个突变的肉毒杆菌毒素轻链肽与报告构建体接触；并且

表征从报告构建体获得的信号，

其中所述信号的调节指示具有针对所述第一非神经元SNARE蛋白的底物特异性的蛋白酶的鉴定。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括以下步骤：

提供第二报告构建体，其包括插入第三报告子和第四报告子之间的第二非神经元SNARE蛋白或其片段，

其中所述第二非神经元SNARE蛋白或其片段的大小设定为提供所述第三报告子与所述第四报告子之间的能量转移，以产生可与所述第一信号区分开的第二信号；

提供包括多个突变的肉毒杆菌毒素轻链肽的库，每个所述突变的肉毒杆菌毒素轻链肽具有非天然外部位点识别序列；

使库的单个突变的肉毒杆菌毒素轻链肽与第二报告构建体接触；并且

表征从第二报告构建体获得的第二信号，其中所述第二信号的调节指示具有针对所述第二非神经元SNARE蛋白的底物特异性的蛋白酶的鉴定。

21.根据权利要求20所述的方法，其中在第一时间间隔期间表征所述第一信号，在第二时间间隔期间表征所述第二信号，并且其中所述第一时间间隔和所述第二时间间隔至少部分重叠。

22.一种治疗患有具有升高的分泌活性的疾病的个体的方法，其包括：

提供包括具有蛋白酶活性的合成肽的药物，所述蛋白酶活性的特征在于对非神经元SNARE蛋白的底物特异性，其中所述非神经元SNARE蛋白与所述分泌活性相关；以及

按照有效降低分泌活性的时间表施用个体药物。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述合成肽包含靶向部分。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述靶向部分结合与所述分泌活性相关的细胞或组织。

25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述靶向部分选自由抗体，抗体片段，受体配体，药物化合物，微粒和适体构成的组。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述突变LC链来自肉毒杆菌血清型A神经毒素LC。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述突变LC链包括氨基酸位点的取代，所述氨基酸位点对应于肉毒杆菌血清型A神经毒素轻链(SEQ ID NO.4)的AsnI36，Ser143，Glu148，Val304，Thr176，His227，Lys337，Leu256，Val258和Lys356中的一个或多个。