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CN107108738A - 抗cd3抗体、可活化抗cd3抗体、多特异性抗cd3抗体、多特异性可活化抗cd3抗体及其使用方法 - Google Patents

抗cd3抗体、可活化抗cd3抗体、多特异性抗cd3抗体、多特异性可活化抗cd3抗体及其使用方法 Download PDF

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CN107108738A
CN107108738A CN201580051713.3A CN201580051713A CN107108738A CN 107108738 A CN107108738 A CN 107108738A CN 201580051713 A CN201580051713 A CN 201580051713A CN 107108738 A CN107108738 A CN 107108738A
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CN
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antibody
activating antibodies
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amino acid
acid sequence
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B.A.欧文
S.L.拉波特
J.G.萨格尔特
D.R.霍斯特特
O.J.拉佐
C.怀特
J.H.理查森
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Western Tom Gram This Treatment Co
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Abstract

本发明总体涉及特异性结合至少CD3的抗体、可活化抗体、多特异性抗体和多特异性可活化抗体，以及制备这些抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和在各种治疗、诊断和预防适应症中使用这些抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法。

Description

抗CD3抗体、可活化抗CD3抗体、多特异性抗CD3抗体、多特异性 可活化抗CD3抗体及其使用方法
相关申请
本申请要求2014年7月25日申请的美国临时申请号62/029,325的权益，所述申请的内容以其整体通过引用并入本文。
公开领域
本发明总体涉及特异性结合至少CD3的抗体、可活化抗体、多特异性抗体和多特异性可活化抗体，以及制备这些抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和在各种治疗、诊断和预防适应症中使用这些抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法。
公开背景
CD3(分化簇3)T细胞共受体是由称为ε、γ、δ和ζ链的四条不同多肽链构成的多聚蛋白。CD3复合物充当与T细胞受体(TCR)的抗原结合a/b链非共价缔合的T细胞受体的信号传导模块。
因为CD3的直接接合导致T细胞活化，所以它是各种治疗和/或诊断适应症的理想靶标。因此，需要靶向CD3/TCR途径的抗体和治疗剂。
公开概述
本公开提供了特异性结合CD3的ε链(也称为CD3ε)的抗体及其抗原结合片段。本公开的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段经由接合T细胞上的CD3ε来活化T细胞。也就是说，此类抗体激动、刺激、活化和/或增强CD3介导的T细胞活化。这些抗体及其抗原结合片段在本文中被称为“抗CD3ε抗体”或“抗CD3抗体”。本公开的抗CD3ε抗体及其抗原结合片段包括单克隆抗体，诸如例如哺乳动物单克隆抗体，灵长类单克隆抗体，完全人单克隆抗体，以及人源化单克隆抗体和嵌合抗体，以及其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段是IgG同种型。在一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段是IgG1同种型。在一些实施方案中，抗体及其抗原结合片段具有本文公开的任何同种型之一。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；和至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ IDNO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，以及VL CDR1序列、VL CDR2序列和VLCDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VHCDR3序列，至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；和包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQID NO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ IDNO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VHCDR3序列，以及VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ IDNO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VLCDR1序列；包括与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括与氨基酸序列TYAMN (SEQID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VHCDR3序列，与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ IDNO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR2序列；和与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含SEQID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变重链(Hv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含与SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体是结合CD3ε的scFv抗体片段。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体还包括与抗体缀合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂经由接头与抗CD3ε抗体缀合。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。
本公开还提供了编码本文所述的抗CD3ε抗体的至少一部分的分离的核酸分子和/或编码本文所述的抗CD3ε抗体的一种或多种核酸分子，诸如例如，至少编码抗体的重链的至少一部分的第一核酸和编码抗体的轻链的至少一部分的第二核酸，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本公开提供了通过在导致表达抗CD3ε抗体的条件下培养细胞来产生抗CD3ε抗体的方法，其中所述细胞包含此类核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含此载体。
本公开还提供了可活化抗体和可活化抗体组合物，其包括与掩蔽部分(MM)偶联或以其他方式连接的特异性结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段(AB)，使得MM的偶联减少AB结合CD3ε的能力。这些可活化抗体在本文中统称为可活化抗CD3ε抗体，本文中也称为抗CD3ε可活化抗体或CD3ε可活化抗体。在一些实施方案中，MM经由包括蛋白酶的底物的序列偶联。例如，所述蛋白酶由接近表达CD3ε的细胞的肿瘤产生。在一些实施方案中，所述蛋白酶由与表达CD3ε的细胞共定位的肿瘤产生。本文提供的可活化抗CD3ε抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时展现与相应的未修饰的抗体至少相当的与CD3ε的结合。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VHCDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；和至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VHCDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，以及VL CDR1序列、VL CDR2序列和VLCDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VHCDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；和包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQID NO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括VH CDR1序列、VHCDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ IDNO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VHCDR3序列，以及VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ IDNO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VLCDR1序列；包括与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括与氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR3序列，与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR2序列；和与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包含可变重链互补决定区1(VH CDR1，本文中也称为CDRH1)序列、可变重链互补决定区2(VH CDR2，本文中也称为CDRH2)序列、可变重链互补决定区3(VH CDR3，本文中也称为CDRH3)序列、可变轻链互补决定区1(VL CDR1，本文中也称为CDRL1)、可变轻链互补决定区2(VL CDR2，本文中也称为CDRL2)序列和可变轻链互补决定区3(VL CDR3，本文中也称为CDRL3)序列的组合，其中至少一个CDR序列选自表18中所示的VH CDR1序列；表18中所示的VH CDR2序列；表18中所示的VH CDR3序列；表18中所示的VLCDR1序列；表18中所示的VL CDR2序列；和表18中所示的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中至少一个CDR序列选自包括与表18中所示的VH CDR1序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与表18中所示的VH CDR2序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；包括与表18中所示的VH CDR3序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VHCDR3序列；包括与表18中所示的VL CDR1序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与表18中所示的VL CDR2序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与表18中所示的VL CDR3序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中所述组合是表18中所示的组合。
在一些实施方案中，可活化抗体包含VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VLCDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中组合中的每个CDR序列包含与表18中所示的组合中的相应CDR序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变重链(Hv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括结合CD3ε的scFv抗体片段。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv抗体片段包括与SEQID NO:30的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包含选自表17中所示的重链序列的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化抗体包含选自表17中所示的轻链序列的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化抗体包含选自表17中所示的重链序列的重链氨基酸序列和选自表17中所示的轻链序列的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包含与选自表17中所示的重链序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化抗体包含与选自表17中所示的轻链序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化抗体包含与选自表17中所示的重链序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链氨基酸序列和与选自表17中所示的轻链序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的解离常数、即平衡状态下的解离常数Kd大于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd不大于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd不小于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd约等于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd小于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd不超过AB与CD3ε的结合的Kd的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd是AB与CD3ε的结合的Kd的1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000或100-1,000倍。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力小于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力不超过AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力约等于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力不小于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力大于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力是AB与CD3ε的结合的亲和力的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500或1/1,000。在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力是AB与CD3ε的结合的亲和力的1/1-1/5、1/2-1/5、1/2-1/10、1/5-1/10、1/5-1/20、1/5-1/50、1/5-1/100、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/20-1/100、1/20-1/1000或1/100-1/1,000。在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力是AB与CD3ε的结合的亲和力的1/2-1/20。在一些实施方案中，未与AB共价连接的MM在与AB等摩尔浓度下不抑制AB与CD3ε的结合。
在一些实施方案中，当可活化抗体在切割状态下时，MM不干扰AB结合CD3ε或不与AB竞争结合CD3ε。
在一些实施方案中，MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，MM多肽序列不同于CD3ε的多肽序列。在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于50%的同一性。在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于25%的同一性。在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于10%的同一性。
在一些实施方案中，MM包含选自表7或表8中所示的序列的序列。
在一些实施方案中，蛋白酶由接近表达CD3ε的细胞的肿瘤产生和/或由与表达CD3ε的细胞在组织中共定位的肿瘤产生，且其中当可活化抗体暴露于蛋白酶时蛋白酶切割可活化抗体中的CM。在一些实施方案中，CM是最多达15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，CM是选自表3中所列的蛋白酶的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是选自以下的蛋白酶的底物：uPA、豆荚蛋白(legumain)、基质蛋白酶(matriptase)(本文中也称为MT-SP1或MTSP1)、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13、MMP-14和表3中所示的那些中的任一种。在一些实施方案中，CM是选自以下的蛋白酶的底物：uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。在一些实施方案中，CM是基质金属蛋白酶(MMP)的底物。
在一些实施方案中，其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，可活化抗体包含在MM和CM之间的连接肽。在一些实施方案中，可活化抗体包含在CM和AB之间的连接肽。在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，其中未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。在一些实施方案中，LP1和LP2各自是约1-20个氨基酸长的肽。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体还包括与可活化抗体缀合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂经由接头与可活化抗CD3ε抗体缀合。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
本公开还提供了结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的多特异性抗体，其中所述抗体包含结合CD3的ε链(CD3ε)的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，且其中AB1包含至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VHCDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CD2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，和VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，活化状态下的本文所述的可活化抗体结合CD3ε且包括(i)特异性结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段(AB)；(ii)当可活化抗体在未切割状态下时抑制AB与CD3ε的结合的掩蔽部分(MM)；和(c)与AB偶联的可切割部分(CM)，其中CM是起蛋白酶的底物的作用的多肽。在一些实施方案中，MM经由CM与AB偶联。
在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
在一些实施方案中，可活化抗体包含在MM和CM之间的连接肽。
在一些实施方案中，可活化抗体包含在CM和AB之间的连接肽。
在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:59)和(GGGS)n (SEQ ID NO:60)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自GGSG (SEQ ID NO:61)、GGSGG (SEQ ID NO:62)、GSGSG (SEQ ID NO:63)、GSGGG (SEQ ID NO:64)、GGGSG (SEQ ID NO:65)和GSSSG(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包括特异性结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、dAb、单一结构域重链抗体或单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，此类结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段是啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，AB与CD3ε的结合的解离常数为约100nM或更低。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的解离常数、即平衡状态下的解离常数Kd大于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd不大于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd不小于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd约等于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd小于AB与CD3ε的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd不超过AB与CD3ε的结合的Kd的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施方案中，MM与AB的结合的Kd是AB与CD3ε的结合的Kd的1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000或100-1,000倍。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力小于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力不超过AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力约等于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力不小于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力大于AB与CD3ε的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力是AB与CD3ε的结合的亲和力的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500或1/1,000。在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力是AB与CD3ε的结合的亲和力的1/1-1/5、1/2-1/5、1/2-1/10、1/5-1/10、1/5-1/20、1/5-1/50、1/5-1/100、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/20-1/100、1/20-1/1000或1/100-1/1,000。在一些实施方案中，MM与AB的结合的亲和力是AB与CD3ε的结合的亲和力的1/2-1/20。在一些实施方案中，未与AB共价连接的MM在与AB等摩尔浓度下不抑制AB与CD3ε的结合。
在一些实施方案中，当可活化抗体在切割状态下时，MM不干扰AB结合CD3ε或不与AB竞争结合CD3ε。
在一些实施方案中，MM是约2-40个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，MM多肽序列不同于CD3ε的多肽序列。在一些实施方案中，MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于50%的同一性。在一些实施方案中，MM多肽序列不同于CD3ε的多肽序列，且其中MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于25%的同一性。在一些实施方案中，MM多肽序列不同于CD3ε的多肽序列，且其中MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于10%的同一性。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合CD3ε的能力，使得当与MM偶联时AB对CD3ε的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对CD3ε的Kd的至少20倍。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合CD3ε的能力，使得当与MM偶联时AB对CD3ε的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对CD3ε的Kd的至少40倍。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合CD3ε的能力，使得当与MM偶联时AB对CD3ε的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对CD3ε的Kd的至少100倍。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合CD3ε的能力，使得当与MM偶联时AB对CD3ε的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对CD3ε的Kd的至少1000倍。
在一些实施方案中，MM的偶联降低AB结合CD3ε的能力，使得当与MM偶联时AB对CD3ε的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对CD3ε的Kd的至少10,000倍。
在一些实施方案中，当使用靶标置换测定法、诸如例如PCT公开号WO 2010/081173(其内容通过引用整体并入本文)中所述的测定法在体外测定时，在CD3ε存在的情况下，与当CM切割时相比，当CM未切割时，MM使AB结合CD3ε的能力降低至少90％。
在一些实施方案中，MM不干扰切割状态下的可活化抗体的AB结合CD3ε靶标或不与切割状态下的可活化抗体的AB竞争结合CD3ε靶标。
在一些实施方案中，MM是选自表7或8中所列的氨基酸序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，蛋白酶由接近表达CD3ε的细胞的肿瘤产生和/或由与CD3ε在组织中共定位的肿瘤产生，且当可活化抗体暴露于蛋白酶时蛋白酶切割可活化抗体中的CM。
在一些实施方案中，CM位于可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，可活化抗体与CD3ε的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与CD3ε的结合的解离常数的至少20倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合CD3ε。
在一些实施方案中，CM位于可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，可活化抗体与CD3ε的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与CD3ε的结合的解离常数的至少40倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合CD3ε。
在一些实施方案中，CM位于可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，可活化抗体与CD3ε的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与CD3ε的结合的解离常数的至少50倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合CD3ε。
在一些实施方案中，CM位于可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，可活化抗体与CD3ε的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与CD3ε的结合的解离常数的至少100倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合CD3ε。
在一些实施方案中，CM位于可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，可活化抗体与CD3ε的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与CD3ε的结合的解离常数的至少200倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合CD3ε。
在一些实施方案中，CM是最多达15个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，选择可切割部分与特定蛋白酶一起使用，所述蛋白酶例如已知由接近表达可活化抗体的靶标(例如，CD3ε)的细胞的肿瘤产生和/或由与可活化抗体的靶标共定位的肿瘤产生的蛋白酶。例如，用于本公开的可活化抗CD3ε抗体中的合适的可切割部分被至少蛋白酶诸如尿激酶、豆荚蛋白(legumain)和/或基质蛋白酶(matriptase) (在本文中也称为MT-SP1或MTSP1)切割。在一些实施方案中，合适的可切割部分包括以下序列中的至少一种：TGRGPSWV (SEQ ID NO:68)；SARGPSRW (SEQ ID NO:69)；TARGPSFK (SEQ ID NO:70)；LSGRSDNH (SEQ ID NO:67)；GGWHTGRN (SEQ ID NO:71)；HTGRSGAL (SEQ ID NO:72)；PLTGRSGG (SEQ ID NO:73)；AARGPAIH (SEQ ID NO:74)；RGPAFNPM (SEQ ID NO:75)；SSRGPAYL (SEQ ID NO:76)；RGPATPIM (SEQ ID NO:77)；RGPA (SEQ ID NO:78)；GGQPSGMWGW (SEQ ID NO:79)；FPRPLGITGL (SEQ ID NO:80)；VHMPLGFLGP (SEQ ID NO:81)；SPLTGRSG (SEQ ID NO:82)；SAGFSLPA (SEQ ID NO:83)；LAPLGLQRR (SEQ ID NO:84)；SGGPLGVR (SEQ ID NO:85)；和/或PLGL (SEQ ID NO:86)。
在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列TGRGPSWV (SEQ ID NO:68)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SARGPSRW (SEQ ID NO:69)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列TARGPSFK (SEQ IDNO:70)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列GGWHTGRN (SEQ ID NO:71)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列HTGRSGAL (SEQ ID NO:72)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列PLTGRSGG (SEQ IDNO:73)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列AARGPAIH (SEQ ID NO:74)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列RGPAFNPM (SEQ ID NO:75)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SSRGPAYL (SEQ ID NO:76)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列RGPATPIM (SEQ IDNO:77)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列RGPA (SEQ ID NO:78)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列GGQPSGMWGW (SEQ ID NO:79)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列FPRPLGITGL (SEQ ID NO:80)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列VHMPLGFLGP (SEQ IDNO:81)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SPLTGRSG (SEQ ID NO:82)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SAGFSLPA (SEQ ID NO:83)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LAPLGLQRR (SEQ ID NO:84)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SGGPLGVR (SEQ IDNO:85)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列PLGL (SEQ ID NO:86)。
在一些实施方案中，CM是MMP的底物，且包括序列ISSGLLSS (SEQ ID NO:321)；QNQALRMA (SEQ ID NO:322)；AQNLLGMV (SEQ ID NO:323)；STFPFGMF (SEQ ID NO:324)；PVGYTSSL (SEQ ID NO:325)；DWLYWPGI (SEQ ID NO:326)；MIAPVAYR (SEQ ID NO:327)；RPSPMWAY (SEQ ID NO:328)；WATPRPMR (SEQ ID NO:329)；FRLLDWQW (SEQ ID NO:330)；LKAAPRWA (SEQ ID NO:331)；GPSHLVLT (SEQ ID NO:332)；LPGGLSPW (SEQ ID NO:333)；MGLFSEAG (SEQ ID NO:334)；SPLPLRVP (SEQ ID NO:335)；RMHLRSLG (SEQ ID NO:336)；LAAPLGLL (SEQ ID NO:337)；AVGLLAPP (SEQ ID NO:338)；LLAPSHRA (SEQ ID NO:339)；PAGLWLDP (SEQ ID NO:340)；和/或ISSGLSS (SEQ ID NO:341)。
在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列ISSGLLSS (SEQ ID NO:321)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列QNQALRMA (SEQ ID NO:322)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列AQNLLGMV (SEQ ID NO:323)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列STFPFGMF (SEQID NO:324)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列PVGYTSSL (SEQ ID NO:325)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列DWLYWPGI (SEQ ID NO:326)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列MIAPVAYR (SEQ ID NO:327)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列RPSPMWAY (SEQID NO:328)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列WATPRPMR (SEQ ID NO:329)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列FRLLDWQW (SEQ ID NO:330)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LKAAPRWA (SEQ ID NO:331)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列GPSHLVLT (SEQID NO:332)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LPGGLSPW (SEQ ID NO:333)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列MGLFSEAG (SEQ ID NO:334)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SPLPLRVP (SEQ ID NO:335)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列RMHLRSLG (SEQID NO:336)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LAAPLGLL (SEQ ID NO:337)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列AVGLLAPP (SEQ ID NO:338)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列LLAPSHRA (SEQ ID NO:339)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列PAGLWLDP (SEQID NO:340)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列ISSGLSS (SEQ ID NO:341)。
在一些实施方案中，CM是凝血酶的底物。在一些实施方案中，CM是凝血酶的底物，且包括序列GPRSFGL (SEQ ID NO:896)或GPRSFG (SEQ ID NO:897)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列GPRSFGL (SEQ ID NO:896)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列GPRSFG(SEQ ID NO:897)。
在一些实施方案中，CM包含选自以下的氨基酸序列：NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO:898)；NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO:899)；TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO:900)；TSGRSANP (SEQID NO:901)；VAGRSMRP (SEQ ID NO:902)；VVPEGRRS (SEQ ID NO:903)；ILPRSPAF (SEQ IDNO:904)；MVLGRSLL (SEQ ID NO:905)；QGRAITFI (SEQ ID NO:906)；SPRSIMLA (SEQ IDNO:907)；和SMLRSMPL (SEQ ID NO:908)。
在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列NTLSGRSENHSG (SEQ ID NO:898)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列NTLSGRSGNHGS (SEQ ID NO:899)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO:900)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列TSGRSANP (SEQ ID NO:901)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列VAGRSMRP (SEQ IDNO:902)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列VVPEGRRS (SEQ ID NO:903)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列ILPRSPAF (SEQ ID NO:904)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列MVLGRSLL (SEQ ID NO:905)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列QGRAITFI (SEQID NO:906)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SPRSIMLA (SEQ ID NO:907)。在一些实施方案中，CM包含氨基酸序列SMLRSMPL (SEQ ID NO:908)。
在一些实施方案中，CM是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是丝氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是uPA的底物。在一些实施方案中，CM是豆荚蛋白(legumain)的底物。在一些实施方案中，CM是基质蛋白酶(matriptase)的底物。在一些实施方案中，CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是半胱氨酸蛋白酶、诸如组织蛋白酶的底物。
在一些实施方案中，CM是CM1-CM2底物，且包括序列ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO:909)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO:910)；AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ IDNO:911)；TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO:912)；VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQID NO:913)；TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO:914)；AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQID NO:915)；LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO:916)；VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ IDNO:917)；LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO:918)；LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ IDNO:919)；LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO:920)；ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ IDNO:921)；LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO:922)；QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ IDNO:923)；LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO:924)；QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ IDNO:925)和/或ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO:926)。
在一些实施方案中，CM1-CM2底物I包括序列ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO:909)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO:910)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ IDNO:911)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQID NO:912)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG(SEQ ID NO:913)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO:914)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO:915)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO:916)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO:917)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO:918)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO:919)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO:920)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO:921)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO:922)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO:923)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO:924)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO:925)。在一些实施方案中，CM1-CM2底物包含氨基酸序列ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO:926)。
在一些实施方案中，CM是选自表3中所示的蛋白酶的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)、基质蛋白酶(matriptase)、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。在一些实施方案中，所述蛋白酶是组织蛋白酶。在一些实施方案中，CM是选自以下的蛋白酶的底物：uPA(尿激酶纤溶酶原激活物)、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。在一些实施方案中，蛋白酶包含uPA。在一些实施方案中，蛋白酶包含豆荚蛋白(legumain)。在一些实施方案中，蛋白酶包含基质蛋白酶(matriptase)。在一些实施方案中，蛋白酶包含基质金属蛋白酶(MMP)。
在一些实施方案中，CM是至少两种蛋白酶的底物。在一些实施方案中，每种蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，CM是至少两种蛋白酶的底物，其中蛋白酶之一选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)，而另一蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，CM是选自以下的至少两种蛋白酶的底物：uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。
在一些实施方案中，可活化抗体至少包括第一CM和第二CM。在一些实施方案中，第一CM和第二CM各自是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体中的第一CM和第二CM具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-CM1-CM2-AB或AB-CM2-CM1-MM。在一些实施方案中，第一CM和第二CM中的至少一个是功能为选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，第一CM在靶组织中被选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的第一切割剂切割，且第二CM在靶组织中被第二切割剂切割。在一些实施方案中，另一蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的相同的蛋白酶，且第一CM和第二CM是蛋白酶的不同的底物。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是选自表3中所示的那些的相同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由在靶组织中共定位的肿瘤产生。在一些实施方案中，第一CM和第二CM在靶组织中被至少一种切割剂切割。
在一些实施方案中，可活化抗体暴露于蛋白酶并被蛋白酶切割，使得当可活化抗体在活化或切割状态下时，活化的抗体包括在蛋白酶已切割CM后包括LP2和/或CM序列的至少一部分的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，MM和CM包括选自本文呈现的那些的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽经由间隔区与可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区在信号肽不存在的情况下与可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区直接连接至可活化抗体的MM。
在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体包含直接连接至MM的间隔区，且具有间隔区-MM-CM-AB的N-末端至C-末端的结构排列。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQG (SEQ ID NO:407)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO:87)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSG (SEQ IDNO:408)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQS (SEQ ID NO:409)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQ (SEQ ID NO:410)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QG (SEQ ID NO:411)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸残基Q。在一些实施方案中，MM和间隔区包含选自表7或表8中所列的序列的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包括选自以下的重链序列：SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546。
在一些实施方案中，可活化抗体包括选自以下的轻链序列：SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520。
在一些实施方案中，可活化抗体包括选自SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546的重链序列；以及选自SEQ IDNO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520的轻链序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包括与选自以下的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链序列：SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546。
在一些实施方案中，可活化抗体包括与选自以下的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链氨基酸序列：SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520。
在一些实施方案中，可活化抗体包括与选自SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链序列；以及与选自SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包括SEQ ID NO:506的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化抗体包括与SEQ ID NO:506的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化抗体包括SEQ ID NO:587或SEQ ID NO:588的氨基酸序列。在一些实施方案中，可活化抗体包括与SEQ ID NO:587或SEQ ID NO:588的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂经由接头与AB缀合。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
在一些实施方案中，所述可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。
在一些实施方案中，可活化抗体的AB天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，AB可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半衰期比相应的多特异性抗体的血清半衰期更长；例如，多特异性可活化抗体的pK比相应的多特异性抗体的pK更长。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半衰期类似于相应的多特异性抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少15天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少9天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少8天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少7天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少6天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少5天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少4天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少3天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少2天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少24小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少20小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少18小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少16小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少14小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少12小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少10小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少8小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少6小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少4小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，可活化抗体的血清半衰期是至少3小时。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体是单特异性的。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体是多特异性的，例如通过非限制性实例的方式，双特异性或三功能性的。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体被配制为前双特异性T细胞接合者(BITE)分子的一部分。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体被配制为前嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞或其他工程改造的受体的一部分。
本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至AB中的一个或多个半胱氨酸残基，而不损害可活化抗CD3ε抗体的活性(例如，掩蔽、活化或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至AB中的一个或多个半胱氨酸残基，而不减少或以其他方式干扰MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生可活化抗CD3ε抗体，其与一种或多种试剂，例如多种治疗剂、诊断剂和/或预防剂中的任一种缀合，优选没有任何试剂与可活化抗CD3ε抗体的MM缀合。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活化抗CD3ε抗体，其中MM保留有效且高效地掩蔽未切割状态下的可活化抗体的AB的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合的可活化抗CD3ε抗体，其中可活化抗体在可切割CM的蛋白酶存在的情况下仍被活化，即切割。
在一些实施方案中，本文所述的抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体与一种或多种额外试剂或额外试剂的组合结合使用。合适的额外试剂包括用于预期应用、诸如例如癌症的当前药物和/或手术疗法。例如，抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体可以与额外化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。
在一些实施方案中，将抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂配制于单一治疗组合物中，且同时施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂彼此分开，例如，各自配制于分开的治疗组合物中，且同时施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂，或在治疗方案期间在不同的时间施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂。例如，在施用额外试剂之前施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体，在施用额外试剂之后施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体，或以交替的方式施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多剂量施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗CD3ε抗体和额外试剂。
本公开还提供了编码本文所述的可活化抗CD3ε抗体的至少一部分的分离的核酸分子，以及包括这些分离的核酸序列和/或编码本文所述的抗CD3ε抗体的一种或多种核酸分子，诸如例如，编码可活化抗体的重链的至少一部分的至少第一核酸和编码可活化抗体的轻链的至少一部分的第二核酸，的载体。本公开提供了通过在导致表达可活化抗体的条件下培养细胞来产生可活化抗体的方法，其中所述细胞包含此类核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含此载体。
在一些实施方案中，可活化抗体由选自以下的重链核酸序列编码：SEQ ID NO:445、451、453、455、459、461、463、465、469、471、475、477、479、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、511、513、517、522、525、529、531、533、535、537、539、541、543和546。
在一些实施方案中，可活化抗体由选自以下的轻链核酸编码：SEQ ID NO:447、449、457、467、473、481、483、507、515和519。
在一些实施方案中，可活化抗体由选自SEQ ID NO:445、451、453、455、459、461、463、465、469、471、475、477、479、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、511、513、517、522、525、529、531、533、535、537、539、541、543和545的重链核酸序列；和选自SEQ IDNO:447、449、457、467、473、481、483、507、515和519的轻链核酸序列编码。
在一些实施方案中，可活化抗体由与选自以下的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链核酸序列编码：SEQ ID NO:445、451、453、455、459、461、463、465、469、471、475、477、479、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、511、513、517、522、525、529、531、533、535、537、539、541、543和545。
在一些实施方案中，可活化抗体由与选自以下的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链核酸序列编码：SEQ ID NO:447、449、457、467、473、481、483、507、515和519。
在一些实施方案中，可活化抗体由与选自SEQ ID NO:445、451、453、455、459、461、463、465、469、471、475、477、479、485、487、489、491、493、495、497、499、501、503、511、513、517、522、525、529、531、533、535、537、539、541、543和545的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链核酸序列；以及与选自SEQ ID NO:447、449、457、467、473、481、483、507、515和519的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链序列编码。
在一些实施方案中，可活化抗体由包括SEQ ID NO:505的核酸序列的核酸编码。在一些实施方案中，可活化抗体包括与SEQ ID NO:505的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的核酸序列。
本公开还提供了通过以下制备在活化状态下结合CD3ε的可活化抗体的方法：(a)在导致表达可活化抗体的条件下培养包含编码可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)和特异性结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段(AB)，和(b)回收可活化抗体。
本公开还提供了通过以下制备在活化状态下结合CD3ε的可活化抗体的方法：(a)在导致表达可活化抗体的条件下培养包含编码可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)和特异性结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段(AB)，(i)其中所述CM是包括功能为蛋白酶的底物的氨基酸序列的多肽；且(ii)其中所述CM位于可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，MM干扰AB与CD3的特异性结合，且当可活化抗体在切割状态下时，MM不干扰AB特异性结合CD3ε或不与AB竞争特异性结合CD3ε；和(b)回收可活化抗体。
本公开还提供了结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的多特异性抗体，其中所述抗体包含结合CD3的ε链(CD3ε)的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，且其中AB1包含包括与氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的VH CDR2序列；包括与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的VH CDR3序列，以及VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，多特异性抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，AB1含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在一些实施方案中，AB1含有包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
在一些实施方案中，AB1包含scFv片段。在一些实施方案中，scFv片段包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv片段包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv片段包含与SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，scFv片段包含与SEQ ID NO:30的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体包括与抗体缀合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂、可检测部分或诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂经由接头与抗体缀合。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
本公开还提供了结合至少CD3ε的多特异性抗体和多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性抗体是识别两个或更多个不同的抗原或表位的抗体，其中至少一个抗原或表位是CD3ε。本文提供的多特异性可活化抗体是这样的多特异性抗体，其包括至少一个掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分与多特异性抗体的至少一个抗原或表位结合结构域连接，使得MM的偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。在一些实施方案中，MM经由起蛋白酶的底物的作用的可切割部分(CM)与多特异性抗体的抗原或表位结合结构域偶联。本文提供的可活化多特异性抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时展现与相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与靶标的结合。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以接合免疫效应细胞，在本文中也称为免疫效应细胞接合多特异性抗体和/或免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以接合白细胞，在本文中也称为白细胞接合多特异性抗体和/或白细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经设计以接合T细胞，在本文中也称为T-细胞接合多特异性抗体和/或T-细胞接合多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体接合白细胞(诸如T细胞、天然杀伤(NK)细胞、骨髓单核细胞、巨噬细胞和/或另一种免疫效应细胞)上的表面抗原。在一些实施方案中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是单核细胞，诸如骨髓单核细胞。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体和/或T-细胞接合多特异性可活化抗体结合CD3ε。
在一些实施方案中，免疫效应细胞接合多特异性抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分，所述免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分包括抗CD3ε抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合多特异性抗体包括癌症靶向抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，免疫效应细胞接合多特异性抗体包括癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和免疫效应细胞接合scFv。在一些实施方案中，免疫效应细胞是白细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是骨髓单核细胞。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗CD3ε抗体或其抗原结合片段和靶向抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗CD3εscFv和靶向抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗CD3ε抗体或其抗原结合片段和癌症靶向抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗CD3ε scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗CD3ε抗体或其抗原结合片段和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括抗CD3ε scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括衍生自OKT3的抗CD3 epsilon (CD3ε) scFv。在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性抗体包括衍生自SP34 (可得自BD Biosciences目录号556610)的抗CD3 epsilon (CD3ε) scFv。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括靶向抗体或其抗原结合片段和抗CD3ε抗体或其抗原结合片段，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或抗CD3ε抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括癌症靶向抗体或其抗原结合片段和抗CD3ε抗体或其抗原结合部分，其中癌症靶向抗体或其抗原结合片段和/或抗CD3ε抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和抗CD3ε，其中癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段和/或抗CD3ε抗体或其抗原结合部分中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，抗CD3ε抗体或其抗原结合片段包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3ε scFv和靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3ε scFv和/或靶向抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3ε scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3ε scFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3ε scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3ε scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，CD3ε scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括衍生自OKT3的抗CD3epsilon (CD3ε) scFv，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，OKT3 scFv或OKT3-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括衍生自SP34的抗CD3epsilon (CD3ε) scFv，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或SP34 scFv或SP34-衍生的scFv中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，SP34 scFv或SP34-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，SP34 scFv或SP34-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括SP34 scFv或SP34-衍生的scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中SP34 scFv或SP34-衍生的scFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，SP34 scFv或SP34-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，SP34 scFv或SP34-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括SP34 scFv或SP34-衍生的scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中SP34 scFv或SP34-衍生的scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，SP34 scFv或SP34-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，SP34 scFv或SP34-衍生的scFv包括结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括抗CD3 epsilon (CD3ε)scFv，其包括以下互补决定区（CDR）序列：至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VHCDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ IDNO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列，其中靶向抗体或其抗原结合片段和/或抗CD3ε scFv中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv包括具有上述CDR序列、即SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv包括包含SEQID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括包含SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的抗CD3ε scFv和癌症靶向抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3εscFv和/或癌症靶向抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv包括包含SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv包括包含SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，T-细胞接合多特异性可活化抗体包括包含SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的抗CD3εd scFv和癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段，其中抗CD3ε scFv和/或癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段中的至少一种被掩蔽。在一些实施方案中，抗CD3ε scFv包括包含SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力。在一些实施方案中，癌症靶向IgG抗体或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。在一些实施方案中，抗CD3εscFv包括包含SEQ ID NO:53、54、55、56、57和58的CDR序列的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM1的偶联降低AB1结合CD3ε的能力，且癌症靶向抗体IgG或其抗原结合片段包括第二抗体或其片段，其包括第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其结合第二癌症相关靶标，其中AB2与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM2的偶联降低AB2结合第二癌症相关靶标的能力。
在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体至少包括结合第一靶标和/或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段和结合第二靶标和/或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段，其中靶标和/或表位中的至少一个是CD3ε。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合两个或更多个不同的靶标，其中至少一个靶标是CD3ε。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合CD3ε上的两个或更多个不同的表位。在一些实施方案中，多抗原靶向抗体和/或多抗原靶向可活化抗体结合两个或更多个不同的靶标和相同的靶标上的两个或更多个不同的表位的组合，其中靶标和/或表位中的至少一个是CD3ε。
本公开的多特异性可活化抗体的各个实施方案显示于图5A-5D、6A-6F、7A-7J、8A-8J、9A-9J、10A-10J、11A-11J和12A-12D中。在一些实施方案中，包含IgG的多特异性可活化抗体具有被掩蔽的IgG可变结构域。在一些实施方案中，包含scFv的多特异性可活化抗体具有被掩蔽的scFv结构域。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中IgG可变结构域中的至少一个与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中scFv结构域中的至少一个与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中IgG可变结构域中的至少一个与掩蔽部分偶联，且scFv结构域中的至少一个与掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体具有IgG可变结构域和scFv结构域两者，其中IgG可变结构域和scFv结构域中的每个与其自身的掩蔽部分偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶抗原的特异性，且另一个抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶抗原的特异性，且另一个抗体结构域具有对另一个靶抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个抗体结构域具有对靶抗原的一个表位的特异性，且另一个抗体结构域具有对靶抗原的另一个表位的特异性。
在多特异性可活化抗体中，scFv可以与IgG可活化抗体的重链的羧基末端、与IgG可活化抗体的轻链的羧基末端、或与IgG可活化抗体的重链和轻链两者的羧基末端融合。在多特异性可活化抗体中，scFv可以与IgG可活化抗体的重链的氨基末端、与IgG可活化抗体的轻链的氨基末端、或与IgG可活化抗体的重链和轻链两者的氨基末端融合。在多特异性可活化抗体中，scFv可以与IgG可活化抗体的一个或多个羧基末端和一个或多个氨基末端的任何组合融合。在一些实施方案中，与可切割部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至IgG的抗原结合结构域并使之掩蔽。在一些实施方案中，与可切割部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至至少一个scFv的抗原结合结构域并使之掩蔽。在一些实施方案中，与可切割部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至IgG的抗原结合结构域并使之掩蔽，且与可切割部分(CM)连接的掩蔽部分(MM)连接至至少一个scFv的抗原结合结构域并使之掩蔽。
在一些实施方案中，对于结合CD3ε特异性的单链可变结构域与结合细胞表面抗原的完全人IgG1抗体(靶向抗体)的羧基末端融合。scFv可以与重链的羧基末端、轻链的羧基末端或两条链融合。在一些实施方案中，对于结合CD3ε特异性的单链可变结构域与结合细胞表面抗原的完全人IgG1抗体(靶向抗体)的氨基末端融合。scFv可以与重链的氨基末端、轻链的氨基末端或两条链融合。将融合体构建为单一遗传构建体并在培养物中的细胞中表达。靶向抗体可以对于结合一种或多种肿瘤表面抗原或靶向用于耗竭的任何细胞是特异性的。scFv可以对于相同或不同的抗原是特异性的。
多特异性可活化抗体结构的其他实例包括但不限于以下：
或
其中：VL和VH代表IgG中包含的具有第一特异性的轻链和重链可变结构域；VL*和VH*代表scFv中包含的具有第二特异性的可变结构域；L1是连接掩蔽部分(MM)和可切割部分(CM)的接头肽；L2是连接可切割部分(CM)和抗体的接头肽；L3是连接scFv的可变结构域的接头肽；L4是连接具有第一特异性的抗体与具有第二特异性的抗体的接头肽；CL是轻链恒定结构域；且CH1、CH2、CH3是重链恒定结构域。第一和第二特异性可以针对任何抗原或表位。
在T-细胞接合多特异性可活化抗体的一些实施方案中，一种抗原通常是CD3ε，而另一种是存在于肿瘤细胞或与疾病相关的其他细胞类型的表面上的抗原，诸如但不限于表1中所列的任何靶标，诸如但不限于EGFR、erbB2、EpCAM、Jagged、PD-L1、B7H3或CD71(转铁蛋白受体)。
在一些实施方案中，靶向抗体包括抗EGFR抗体。在一些实施方案中，靶向抗体包括C225v5，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体包括C225，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体包括C225v4，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体包括C225v6，其特异性结合EGFR。在一些实施方案中，靶向抗体包括抗Jagged抗体。在一些实施方案中，靶向抗体包括4D11，其特异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。在一些实施方案中，靶向抗体包括4D11v2，其特异性结合人和小鼠Jagged 1和Jagged 2。
在一些实施方案中，靶向抗体可呈可活化抗体的形式。在一些实施方案中，scFv可呈Pro-scFv的形式(参见例如WO 2009/025846、WO 2010/081173)。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合CD3ε，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合CD3ε，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ IDNO:58)的VL CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合CD3ε，且含有至少包括氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQID NO:54)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VHCDR3序列；至少包括氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:58)的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合CD3ε，且含有与氨基酸序列TYAMN (SEQID NO:53)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR1序列；与氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VH CDR2序列；与氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:55)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VHCDR3序列，与氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR1序列；与氨基酸序列GTNKRAP (SEQ IDNO:57)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR2序列；和与氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的VL CDR3序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VHCDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO:88)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO:89)的VH CDR2序列；和至少包括氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ ID NO:90)的VH CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自至少包括氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO:91)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO:92)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQ ID NO:93)的VL CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VHCDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO:88)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO:89)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；和包括与氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ ID NO:90)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VLCDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO:91)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO:92)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQID NO:93)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列至少包括氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO:88)；VHCDR2序列至少包括氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO:89)；VH CDR3序列至少包括氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ ID NO:90)；VL CDR1序列至少包括氨基酸序列RASQSISSY(SEQ ID NO:91)；VL CDR2序列至少包括氨基酸序列AASSLQS (SEQ ID NO:92)；和VL CDR3序列至少包括氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQ ID NO:93)。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合Jagged靶标，例如，Jagged 1和/或Jagged 2，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列包括与氨基酸序列SYAMS (SEQ ID NO:88)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VH CDR2序列包括与氨基酸序列SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO:89)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VH CDR3序列包括与氨基酸序列DIGGRSAFDY (SEQ IDNO:90)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VLCDR1序列包括与氨基酸序列RASQSISSY (SEQ ID NO:91)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VL CDR2序列包括与氨基酸序列AASSLQS (SEQID NO:92)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；且VL CDR3序列包括与氨基酸序列QQTVVAPPL (SEQ ID NO:93)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合表皮生长因子受体(EGFR)，且含有VHCDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO:94)的VH CDR1序列；至少包括氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO:95)的VH CDR2序列；至少包括氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO:96)的VH CDR3序列；及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合EGFR，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的至少一个选自至少包括氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQ ID NO:97)的VL CDR1序列；至少包括氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO:98)的VL CDR2序列；和至少包括氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ IDNO:99)的VL CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合EGFR，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列、VH CDR2序列和VH CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO:94)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR1序列；包括与氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:95)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR2序列；包括与氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO:96)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VH CDR3序列；及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合EGFR，且含有VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列中的至少一个选自包括与氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQ ID NO:97)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR1序列；包括与氨基酸序列KYASESIS (SEQID NO:98)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR2序列；和包括与氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO:99)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列的VL CDR3序列，及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合EGFR，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列至少包括氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO:94)；VH CDR2序列至少包括氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO:95)；VH CDR3序列至少包括氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQID NO:96)；VL CDR1序列至少包括氨基酸序列RASQSIGTNIH (SEQ ID NO:97)；VL CDR2序列至少包括氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO:98)；且VL CDR3序列至少包括氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO:99)。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其特异性结合EGFR，且含有VH CDR1序列、VH CDR2序列、VH CDR3序列、VL CDR1序列、VL CDR2序列和VL CDR3序列的组合，其中VH CDR1序列包括与氨基酸序列NYGVH (SEQ ID NO:94)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VH CDR2序列包括与氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO:95)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VH CDR3序列包括与氨基酸序列ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO:96)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VL CDR1序列包括与氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:97)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；VL CDR2序列包括与氨基酸序列KYASESIS (SEQ ID NO:98)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列；且VL CDR3序列包括与氨基酸序列QQNNNWPTT (SEQ ID NO:99)具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括选自本文提供的实施例中所示的那些序列的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括选自本文提供的实施例中所示的那些序列的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括选自本文提供的实施例中所示的那些序列的重链氨基酸序列和选自本文提供的实施例中所示的那些序列的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括与选自本文提供的实施例中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的重链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括与选自本文提供的实施例中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的轻链氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体至少包括与选自本文提供的实施例中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的重链氨基酸序列和与选自本文提供的实施例中所示的那些序列的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同一性的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还包括与AB缀合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂经由接头与多特异性抗体缀合。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还包括可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体天然可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。
本公开还提供了编码本文所述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一部分的分离的核酸分子、诸如例如至少编码多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的重链的至少一部分的第一核酸和编码多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的轻链的至少一部分的第二核酸，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本公开提供了通过在导致表达抗体的条件下培养细胞来产生多特异性抗体的方法，其中所述细胞包含此类核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含此载体。
本公开还提供了多特异性可活化抗体和/或多特异性可活化抗体组合物，其至少包括特异性结合第一靶标或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和结合第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中至少AB1与掩蔽部分(MM1)偶联或以其他方式连接，使得MM1的偶联降低AB1结合其靶标的能力。在一些实施方案中，MM1经由第一可切割部分(CM1)序列与AB1偶联，所述第一可切割部分(CM1)序列包括蛋白酶的底物，所述蛋白酶例如由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与AB1的靶标在主体中的治疗部位或诊断部位处共定位的肿瘤产生的蛋白酶。本文提供的多特异性可活化抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即健康)组织中不被活化，并且当被活化时展现与相应的未修饰的多特异性抗体至少相当的与AB1的靶标的结合。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含在MM1和CM1之间的连接肽。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含在CM1和AB1之间的连接肽。
在一些实施方案中，可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且未切割状态下的多特异性可活化抗体的至少一部分具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB1或AB1-LP2-CM1-LP1-MM1。在一些实施方案中，两个连接肽不需要彼此相同。
在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO:59)和(GGGS)n (SEQ ID NO:60)的氨基酸序列，其中n是至少1的整数。在一些实施方案中，LP1或LP2中的至少一个包括选自GGSG (SEQ ID NO:61)、GGSGG (SEQ ID NO:62)、GSGSG (SEQ ID NO:63)、GSGGG (SEQ ID NO:64)、GGGSG (SEQ ID NO:65)和GSSSG(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括特异性结合第一靶标或第一表位的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和特异性结合第二靶标或第二表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个AB独立地选自单克隆抗体、结构域抗体、单链、Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、dAb、单一结构域重链抗体和单一结构域轻链抗体。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个AB是啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个AB对于与其相应的靶标或表位的结合具有约100 nM或更低的解离常数。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的解离常数、即平衡状态下的解离常数Kd大于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的Kd不大于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的Kd不小于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的Kd约等于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的Kd小于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的Kd不超过AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施方案中，MM1与AB的结合的Kd是AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd的1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000或100-1,000倍。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力小于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力不大于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力约等于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力不小于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力大于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力是AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500或1/1,000。在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力是AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力的1/1-1/5、1/2-1/5、1/2-1/10、1/5-1/10、1/5-1/20、1/5-1/50、1/5-1/100、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/20-1/100、1/20-1/1000或1/100-1/1,000。在一些实施方案中，MM1与AB的结合的亲和力是AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力1/2至1/20。在一些实施方案中，未与AB共价连接的MM在与AB等摩尔浓度下不抑制AB与其对应的靶标或表位的结合。
在一些实施方案中，当多特异性可活化抗体在切割状态下时，MM1不干扰其相应的AB结合相应的靶标或表位或不与其相应的AB竞争结合相应的靶标或表位。
在一些实施方案中，MM1是约2-40个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，MM1的多肽序列不同于相应的AB的靶标的多肽序列。
在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过50%同一性。在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过25%同一性。在一些实施方案中，MM1的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过10%同一性。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少20倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少40倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少100倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少1000倍。
在一些实施方案中，MM1的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM1偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少10,000倍。
在一些实施方案中，MM1是选自本文提供的实施例中所示的MM的氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括：第二掩蔽部分(MM2)，其当所述多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB2与其靶标的结合；和与AB2偶联的第二可切割部分(CM2)，其中CM2是起第二蛋白酶的底物作用的多肽。在一些实施方案中，CM2是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，第二蛋白酶由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与第二靶标或表位在组织中共定位的肿瘤产生，且其中当多特异性可活化抗体暴露于第二蛋白酶时第二蛋白酶切割多特异性可活化抗体中的CM2。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与第一靶标或表位和第二靶标或表位在组织中共定位的肿瘤产生。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。在一些实施方案中，CM1和CM2是对于所述相同的蛋白酶而言不同的底物。在一些实施方案中，所述蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶是不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一蛋白酶和第二蛋白酶是选自表3中所示的那些的不同的蛋白酶。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的解离常数、即平衡状态下的解离常数Kd大于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的Kd不大于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的Kd不小于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的Kd约等于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的Kd小于AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的Kd不超过AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd的2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或1,000倍。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的Kd是AB与其相应的靶标或表位的结合的Kd的1-5、2-5、2-10、5-10、5-20、5-50、5-100、10-100、10-1,000、20-100、20-1000或100-1,000倍。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力小于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力不大于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力约等于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力不小于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力大于AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力是AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力的1/2、1/3、1/4、1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500或1/1,000。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力是AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力的1/1-1/5、1/2-1/5、1/2-1/10、1/5-1/10、1/5-1/20、1/5-1/50、1/5-1/100、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/20-1/100、1/20-1/1000或1/100-1/1,000。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM与AB的结合的亲和力是AB与其相应的靶标或表位的结合的亲和力的1/2至1/20。在一些实施方案中，未与AB共价连接的MM在与AB等摩尔浓度下不抑制AB与其对应的靶标或表位的结合。
在一些实施方案中，当多特异性可活化抗体在切割状态下时，多特异性可活化抗体中的每个MM不干扰其相应的AB结合相应的靶标或表位或不与其相应的AB竞争结合相应的靶标或表位。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM是约2-40个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序列不同于相应的AB的靶标的多肽序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过50%同一性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过25%同一性。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个MM的多肽序列与相应的AB的任何天然的结合配偶体具有不超过10%同一性。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少20倍。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少40倍。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少100倍。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少1000倍。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的解离常数(Kd)是当不与MM偶联时AB对其相应的靶标或表位的Kd的至少10,000倍。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少20倍。在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少1/20。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少40倍。在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少1/40。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少100倍。在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少1/100。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少1,000倍。在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少1/1,000。
在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少10,000倍。在一些实施方案中，每个MM的偶联降低相应的AB结合其靶标或表位的能力，使得当与MM1偶联时AB1的解离常数(Kd)是当与MM2偶联时AB2的Kd的至少1/10,000。
在一些实施方案中，每个MM是选自本文提供的实施例中所示的MM的氨基酸序列。
在一些实施方案中，切割第一可切割部分(CM1)序列的蛋白酶由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与多特异性可活化抗体中的AB1的靶标在组织中共定位的肿瘤产生，且当多特异性可活化抗体暴露于蛋白酶时蛋白酶切割多特异性可活化抗体中的CM1。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括多于一个可切割部分序列，且切割至少一个可切割部分序列的蛋白酶由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与多特异性可活化抗体中的至少一个AB区域的靶标在组织中共定位的肿瘤产生，且当多特异性可活化抗体暴露于蛋白酶时蛋白酶切割多特异性可活化抗体中的CM。
在一些实施方案中，每个CM (例如，CM1和至少CM2)位于多特异性可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数的至少20倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合其靶标。
在一些实施方案中，每个CM位于多特异性可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数的至少40倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合其靶标。
在一些实施方案中，每个CM位于多特异性可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数的至少50倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合其靶标。
在一些实施方案中，每个CM位于多特异性可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数的至少100倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合其靶标。
在一些实施方案中，每个CM位于多特异性可活化抗体中，使得当可活化抗体在未切割状态下时，多特异性可活化抗体与AB区域之一的靶标的结合被降低至解离常数是未修饰的AB与其靶标的结合的解离常数的至少200倍，而当可活化抗体在切割状态下时，AB结合其靶标。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个CM是最多达15个氨基酸长的多肽。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM包括氨基酸序列LSGRSDNH (SEQ ID NO:67)。在一些实施方案中，选择至少一个可切割部分与特定蛋白酶一起使用，所述蛋白酶例如已知由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与多特异性可活化抗体的至少一种靶标共定位的肿瘤产生的蛋白酶。例如，用于本公开的多特异性可活化抗体中的合适的可切割部分被至少蛋白酶诸如尿激酶、豆荚蛋白(legumain)和/或基质蛋白酶(matriptase) (在本文中也称为MT-SP1或MTSP1)切割。在一些实施方案中，合适的可切割部分包括以下序列中的至少一种：
和/或
。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个CM是选自表3中所示的那些的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，所述蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)、基质蛋白酶(matriptase)、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、中性粒细胞弹性蛋白酶、MMP-7、MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14。在一些实施方案中，蛋白酶是组织蛋白酶，诸如但不限于组织蛋白酶S。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个CM是选自uPA(尿激酶纤溶酶原激活物)、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，蛋白酶包含uPA。在一些实施方案中，蛋白酶包含豆荚蛋白(legumain)。在一些实施方案中，蛋白酶包含基质蛋白酶(matriptase)。在一些实施方案中，蛋白酶包含基质金属蛋白酶(MMP)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM是至少两种蛋白酶的底物。在一些实施方案中，每种蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM是至少两种蛋白酶的底物，其中蛋白酶之一选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)，而另一蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个CM是选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的至少两种蛋白酶的底物。
在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的每个CM的蛋白酶中的至少一种是相同的蛋白酶。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的两个CM的相同的蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的两个CM的相同的蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。
在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的每个CM的蛋白酶中的至少两种是相同的两种蛋白酶。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的两个CM的相同的两种蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的两个CM的至少两种蛋白酶中的至少一种选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)，且至少两种蛋白酶中的另一种蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的两个CM的至少两种蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。
在一些实施方案中，可以切割CM1的蛋白酶中的至少一种不同于可以切割多特异性可活化抗体中的CM2的蛋白酶中的至少一种。在一些实施方案中，蛋白酶中的至少一种可以切割多特异性可活化抗体中的CM1，但不能切割CM2。在一些实施方案中，蛋白酶中的至少一种可以切割多特异性可活化抗体中的CM2，但不能切割CM1。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的CM1、但不能切割CM2的至少一种蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，可以切割多特异性可活化抗体中的CM1、但不能切割CM2的至少一种蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括第一CM (CM1)和第二CM(CM2)。在一些实施方案中，CM1和CM2是连接MM与AB的单一可切割接头的一部分。在一些实施方案中，CM1是连接MM1与AB1的可切割接头的一部分，且CM2是连接MM2与AB2的分开的可切割接头的一部分。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含多于两个CM。在一些实施方案中，此多特异性可活化抗体包含多于两个CM和多于两个MM。在一些实施方案中，CM1和CM2各自是不超过15个氨基酸长的多肽。在一些实施方案中，第一CM和第二CM中的至少一个是起选自表3中所列的那些的蛋白酶的底物作用的多肽。在一些实施方案中，第一CM和第二CM中的至少一个是起选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的蛋白酶的底物作用的多肽。在一些实施方案中，第一CM在靶组织中被选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的第一切割剂切割，且第二CM在靶组织中被第二切割剂切割。在一些实施方案中，另一蛋白酶选自表3中所示的那些。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是选自表3中所列的那些的相同的蛋白酶，且第一CM和第二CM是蛋白酶的不同的底物。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)的相同的蛋白酶，且第一CM和第二CM是蛋白酶的不同的底物。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是选自表3中所列的那些的相同的蛋白酶，且第一CM和第二CM是相同的底物。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂是选自表3中所示的那些的不同的蛋白酶。在一些实施方案中，第一切割剂和第二切割剂由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由在靶组织中共定位的肿瘤产生。在一些实施方案中，第一CM和第二CM在靶组织中被至少一种切割剂切割。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体暴露于蛋白酶并被蛋白酶切割，使得当可活化抗体在活化或切割状态下时，活化的多特异性可活化抗体包括在蛋白酶已切割CM后包括LP2和/或CM序列的至少一部分的轻链氨基酸序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体还包括信号肽。在一些实施方案中，信号肽经由间隔区与多特异性可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区在信号肽不存在的情况下与多特异性可活化抗体缀合。在一些实施方案中，间隔区直接连接至多特异性可活化抗体的至少一个MM。
在一些实施方案中，未切割状态下的多特异性可活化抗体包含直接连接至第一MM的间隔区，且具有间隔区-MM1-CM-AB1的N-末端至C-末端的结构排列。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQ ID NO:87)。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半衰期比相应的多特异性抗体的血清半衰期更长；例如，多特异性可活化抗体的pK比相应的多特异性抗体的pK更长。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的血清半衰期类似于相应的多特异性抗体的血清半衰期。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少15天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少12天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少11天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少10天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少9天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少8天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少7天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少6天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少5天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少4天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少3天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少2天。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少24小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少20小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少18小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少16小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少14小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少12小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少10小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少8小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少6小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少4小时。在一些实施方案中，当施用于生物体时，多特异性可活化抗体的血清半衰期是至少3小时。
本公开还提供了包括多特异性可活化抗体的组合物和方法，所述多特异性可活化抗体至少包括特异性结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中多特异性可活化抗体中的至少第一AB与降低AB1结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在一些实施方案中，每个AB与降低其相应的AB对每个靶标的能力的MM偶联。例如，在双特异性可活化抗体实施方案中，AB1与降低AB1结合其靶标的能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，且AB2与降低AB2结合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含多于两个AB区域；在此类实施方案中，对于多特异性可活化抗体中的每个AB，AB1与降低AB1结合其靶标的能力的第一掩蔽部分(MM1)偶联，AB2与降低AB2结合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联，AB3与降低AB3结合其靶标的能力的第三掩蔽部分(MM3)偶联等等。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体进一步包括作为蛋白酶的底物的至少一个可切割部分(CM)，其中CM连接MM与AB。例如，在一些实施方案中，多特异性可活化抗体至少包括特异性结合靶标的第一抗体或抗体片段(AB1)和第二抗体或抗体片段(AB2)，其中多特异性可活化抗体中的至少第一AB经由第一可切割部分(CM1)与降低AB1结合其靶标的能力的掩蔽部分(MM1)偶联。在一些双特异性可活化抗体实施方案中，AB1经由CM1与MM1偶联，且AB2经由第二可切割部分(CM2)与降低AB2结合其靶标的能力的第二掩蔽部分(MM2)偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包含多于两个AB区域；在这些实施方案的一些中，对于多特异性可活化抗体中的每个AB，AB1经由CM1与MM1偶联，AB2经由CM2与MM2偶联，且AB3经由第三可切割部分(CM3)与降低AB3结合其靶标的能力的第三掩蔽部分(MM3)偶联等等。
在一些实施方案中，本文所述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体与一种或多种额外试剂或额外试剂的组合结合使用。合适的额外试剂包括用于预期应用、诸如例如癌症的当前药物和/或手术疗法。例如，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可以与额外化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。
在一些实施方案中，将多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂配制于单一治疗组合物中，且同时施用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂。在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂彼此分开，例如，各自配制于分开的治疗组合物中，且同时施用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂，或在治疗方案期间在不同的时间施用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂。例如，在施用额外试剂之前施用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体，在施用额外试剂之后施用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体，或以交替的方式施用多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多剂量施用抗多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂。
本公开还提供了编码本文所述的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一部分的分离的核酸分子、诸如例如至少编码多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的重链的至少一部分的第一核酸和编码多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的轻链的至少一部分的第二核酸，以及包括这些分离的核酸序列的载体。本公开提供了通过在导致表达多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的条件下培养细胞来产生多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法，其中所述细胞包含此类核酸分子。在一些实施方案中，所述细胞包含此类载体。
本公开还提供了通过以下制备本公开的多特异性抗体和/或本公开的多特异性可活化抗体的方法：(a)在导致表达多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的条件下培养包含编码多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的核酸构建体的细胞，和(b)回收多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。
本公开还提供了通过将本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗CD3ε抗体、特异性结合CD3ε的多特异性抗体和/或特异性结合CD3ε的多特异性可活化抗体施用于期望此类治疗或预防的主体来治疗、预防一种或多种病理的症状、延迟一种或多种病理的症状的进展或以其他方式改善一种或多种病理的症状或减轻与此类病理相关的症状的方法。待治疗的主体是例如人或其他哺乳动物。在一些实施方案中，所述主体是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所述主体是啮齿动物。
本公开还提供了通过将本公开的多特异性可活化抗体施用于期望此诱导的主体来诱导靶标依赖性T-细胞活化和杀灭靶细胞的方法，其中当多特异性可活化抗体在切割状态下、例如多特异性可活化抗体的每个掩蔽部分不再连接或以其他方式与相应的AB结构域缔合时，发生靶标依赖性T-细胞活化和靶细胞的杀灭，且当多特异性可活化抗体在未切割状态下、例如多特异性可活化抗体的至少一个掩蔽部分连接或以其他方式与相应的AB结构域缔合时，靶标依赖性T-细胞活化和靶细胞的杀灭减少或以其他方式受到抑制。本文所述的任何多特异性可活化抗体适用于此类方法。待治疗的主体是例如人或其他哺乳动物。在一些实施方案中，所述主体是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所述主体是啮齿动物。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的本公开的抗CD3ε抗体、可活化CD3ε抗体、特异性结合CD3ε的多特异性抗体和/或特异性结合CD3ε的多特异性可活化抗体可以在任何疾病阶段施用。例如，此抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可以施用于患有任何阶段的癌症(从早期至转移)的患者。术语主体和患者在本文可互换使用。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的本公开的抗CD3ε抗体、可活化CD3ε抗体、特异性结合CD3ε的多特异性抗体和/或特异性结合CD3ε的多特异性可活化抗体可以在包含新辅助疗法的治疗方案中使用。
在这些方法和用途的任何实施方案中使用的本公开的抗CD3ε抗体、可活化CD3ε抗体、特异性结合CD3ε的多特异性抗体和/或特异性结合CD3ε的多特异性可活化抗体可以单独或与一种或多种额外试剂组合施用，所述额外试剂包括小分子抑制剂、其他基于抗体的疗法、基于多肽或肽的疗法、基于核酸的疗法和/或其他生物制剂。在一些实施方案中，将抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体与一种或多种额外试剂组合施用，所述额外试剂诸如通过非限制性实例的方式，化学治疗剂，诸如烷化剂，抗代谢药，抗微管剂，拓扑异构酶抑制剂，细胞毒性抗生素和任何其他核酸损伤剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是紫杉烷，诸如紫杉醇(例如，Abraxane®)。在一些实施方案中，所述额外试剂是抗代谢物，诸如吉西他滨。在一些实施方案中，所述额外试剂是烷化剂，诸如基于铂的化学疗法，诸如卡铂或顺铂。在一些实施方案中，所述额外试剂是靶向试剂，诸如激酶抑制剂，例如索拉非尼或埃罗替尼。在一些实施方案中，所述额外试剂是靶向试剂，诸如另一种抗体，例如单克隆抗体(例如，贝伐单抗)，双特异性抗体或多特异性抗体。在一些实施方案中，所述额外试剂是蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米或卡非佐贝。在一些实施方案中，所述额外试剂是免疫调节剂，诸如来那度胺或IL-2。在一些实施方案中，所述额外试剂是辐射剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是本领域技术人员认为是护理标准的试剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是本领域技术人员众所周知的化学治疗剂。在一些实施方案中，将抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂配制在单一组合物中。在一些实施方案中，将抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂作为两种或更多种单独的组合物施用。在一些实施方案中，将抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂同时施用。在一些实施方案中，将抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和额外试剂依次施用。
在一些实施方案中，所述额外试剂是化学治疗剂，诸如选自多西他赛、紫杉醇、abraxane(即，白蛋白缀合的紫杉醇)、多柔比星、奥沙利铂、卡铂、顺铂、伊立替康和吉西他滨的化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述额外试剂是检查点抑制剂、激酶抑制剂、靶向肿瘤微环境中的抑制剂的药剂和/或T细胞或NK激动剂。在一些实施方案中，所述额外试剂是单独或与其他额外试剂诸如化学治疗剂或抗肿瘤剂组合的放射疗法。在一些实施方案中，所述额外试剂是疫苗、肿瘤病毒和/或DC-活化剂，诸如，通过非限制性实例的方式，toll样受体(TLR)激动剂和/或α- CD40。在一些实施方案中，所述额外试剂是设计为经由ADCC或经由与毒素的直接缀合(例如，抗体药物缀合物(ADC))杀死肿瘤的肿瘤靶向抗体。
在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是选自CTLA-4、LAG-3、PD-1、PDL1、TIGIT、TIM-3、B7H4和Vista的靶标的抑制剂。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂选自B-RAFi、MEKi和Btk抑制剂，诸如依鲁替尼。在一些实施方案中，所述激酶抑制剂是克里唑替尼。在一些实施方案中，所述肿瘤微环境抑制剂选自IDO抑制剂、α-CSF1R抑制剂、α-CCR4抑制剂、TGF-β、骨髓衍生的抑制细胞或T调节细胞。在一些实施方案中，所述激动剂选自Ox40、GITR、CD137、ICOS、CD27和HVEM。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是结合选自CTLA-4、PD-1和/或PD-L1的靶标的抗体。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体和/或其组合。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗CTLA4抗体，诸如例如Yervoy™。在一些实施方案中，所述检查点抑制剂是抗PD-1抗体，诸如例如Opdivo™和/或Keytruda™。
在一些实施方案中，抑制剂是CTLA-4抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是LAG-3抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是PD-1抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是PDL1抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是TIGIT抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是TIM-3抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是B7H4抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是Vista抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是B-RAFi抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是MEKi抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是Btk抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是依鲁替尼。在一些实施方案中，抑制剂是克里唑替尼。在一些实施方案中，抑制剂是IDO抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是α-CSF1R抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是α-CCR4抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是TGF-β。在一些实施方案中，抑制剂是骨髓衍生的抑制细胞。在一些实施方案中，抑制剂是T-调节细胞。
在一些实施方案中，激动剂是Ox40。在一些实施方案中，激动剂是GITR。在一些实施方案中，激动剂是CD137。在一些实施方案中，激动剂是ICOS。在一些实施方案中，激动剂是CD27。在一些实施方案中，激动剂是HVEM。
在一些实施方案中，所述额外试剂是另一种抗体或其抗原结合片段、另一种缀合的抗体或其抗原结合片段、另一种可活化抗体或其抗原结合片段和/或另一种缀合的可活化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述额外试剂是与第一抗体或其抗原结合片段、第一缀合的抗体或其抗原结合片段、可活化抗体或其抗原结合片段和/或缀合的可活化抗体或其抗原结合片段针对相同的靶标(例如，针对PDL1)的另一种抗体或其抗原结合片段、另一种缀合的抗体或其抗原结合片段、另一种可活化抗体或其抗原结合片段和/或另一种缀合的可活化抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述额外试剂是针对不同于第一抗体或其抗原结合片段、第一缀合的抗体或其抗原结合片段、可活化抗体或其抗原结合片段和/或缀合的可活化抗体或其抗原结合片段的靶标的靶标的另一种抗体或其抗原结合片段、另一种缀合的抗体或其抗原结合片段、另一种可活化抗体或其抗原结合片段和/或另一种缀合的可活化抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体和/或可活化抗体在治疗期间和/或之后与一种或多种额外试剂组合施用，所述额外试剂诸如例如化学治疗剂、抗炎剂和/或免疫抑制剂。在一些实施方案中，将抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂配制于单一治疗组合物中，且同时施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂。或者，抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂彼此分开，例如，各自配制于分开的治疗组合物中，且同时施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂，或在治疗方案期间在不同的时间施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂。例如，在施用额外试剂之前施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体，在施用额外试剂之后施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体，或以交替的方式施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂。如本文所述，以单剂量或多剂量施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂。
在一些实施方案中，同时施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂。例如，抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂可以配制在单一组合物中或作为两种或更多种分开的组合物施用。在一些实施方案中，依次施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂，或者在治疗方案期间在不同的时间施用抗CD3ε抗体和/或可活化抗体和额外试剂。
本公开还提供了用于在各种诊断和/或预防适应症中使用本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗CD3ε抗体、特异性结合CD3ε的多特异性抗体和/或特异性结合CD3ε的多特异性可活化抗体的方法和试剂盒。例如，本公开提供了用于通过如下检测主体或样品中切割剂和目标靶标的存在或不存在的方法和试剂盒：(i)使主体或样品与可活化抗体或多特异性可活化抗体接触，所述可活化抗体或多特异性可活化抗体包括至少第一掩蔽部分(MM1)、被切割剂切割的第一可切割部分(CM1)和特异性结合目标靶标的至少第一抗原结合结构域或其片段(AB1)，(a)其中MM1是抑制AB1与靶标结合的肽，且其中MM1不具有AB1的天然存在的结合配偶体的氨基酸序列且不是AB1的天然结合配偶体的修饰形式；且(b)其中在未切割的非活化状态下，MM1干扰AB1与靶标的特异性结合，且在切割的活化状态下，MM1不干扰AB1特异性结合靶标或不与AB1竞争特异性结合靶标；和(ii)测量主体或样品中的活化的抗体或活化的多特异性可活化抗体的水平，其中主体或样品中的活化的抗体或活化的多特异性可活化抗体的可检测水平表明切割剂和靶标存在于主体或样品中，且其中主体或样品中的活化的抗体或活化的多特异性可活化抗体的不可检测水平表明切割剂、靶标或切割剂和靶标两者不存在和/或不充分地存在于主体或样品中。
在一些实施方案中，可活化抗体或可活化多特异性可活化抗体是治疗剂与其缀合的可活化抗体或可活化多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，可活化抗体或可活化多特异性可活化抗体不与试剂缀合。在一些实施方案中，可活化抗体或可活化多特异性可活化抗体包含可检测标记。在一些实施方案中，所述可检测标记位于AB1上。在一些实施方案中，测量主体或样品中的可活化抗体或多特异性可活化抗体的水平使用特异性结合可活化抗体或可活化多特异性可活化抗体的第二试剂来实现，其中所述试剂包含可检测标记。在一些实施方案中，第二试剂是包含可检测标记的抗体。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可活化抗体或多特异性可活化抗体包括可检测标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，可检测标记包括成像剂、造影剂、酶、荧光标记、发色团、染料、一种或多种金属离子或基于配体的标记。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，成像剂包含放射性同位素。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，放射性同位素是铟或锝。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，造影剂包含碘、钆或氧化铁。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，酶包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或β-半乳糖苷酶。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，荧光标记包含黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、修饰的红色荧光蛋白(mRFP)、红色荧光蛋白tdimer2(RFP tdimer2)、HCRED或铕衍生物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，发光标记包含N-甲基吖啶鎓(methylacrydium)衍生物。在这些方法的一些实施方案中，标记包含AlexaFluor®标记，诸如Alex Fluor® 680或Alexa Fluor® 750。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，基于配体的标记包含生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或一种或多种半抗原。
在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，主体是哺乳动物。在这些方法和试剂盒的一些实施方案中，主体是人。在一些实施方案中，所述主体是非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物。在一些实施方案中，所述主体是啮齿动物。
在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体内方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是原位方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是离体方法。在这些方法的一些实施方案中，所述方法是体外方法。
在方法和试剂盒的一些实施方案中，所述方法或试剂盒用于鉴定或以其他方式精选适合于用本公开的多特异性可活化抗体治疗的患者群体。例如，对于靶标和切割这些方法中所测试的多特异性可活化抗体的第一可切割部分(CM1)中的底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为用包含此CM1的此可活化抗体或多特异性可活化抗体治疗的合适的候选者。同样，对于靶标和切割使用这些方法所测试的可活化抗体或多特异性可活化抗体中的CM1中的底物的蛋白酶两者测试阴性的患者可被鉴定为另一种形式的疗法的合适候选者。
在一些实施方案中，方法或试剂盒用于鉴定或以其他方式精选适合于用本公开的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体治疗的患者群体，随后通过将该可活化抗体和/或多特异性可活化抗体施用于有需要的主体来治疗。例如，对于靶标和切割这些方法中所测试的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的第一可切割部分(CM1)中的底物的蛋白酶两者测试阳性的患者被鉴定为用包含此CM1的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体治疗的合适的候选者，且然后向所述患者施用治疗有效量的所测试的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体。同样，对于靶标和切割使用这些方法所测试的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体中的CM1中的底物的蛋白酶中任一者或两者测试阴性的患者可被鉴定为另一种形式的疗法的合适候选者。
在一些实施方案中，此类患者可用其他可活化抗体、缀合的可活化抗体或多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体进行测试，直至鉴定用于治疗的合适的可活化抗体或缀合的可活化抗体或多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体，例如，包含在疾病部位处被患者切割的CM的可活化抗体或缀合的可活化抗体或多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体。在一些实施方案中，然后向患者施用治疗有效量的患者对于其测试阳性的可活化抗体或缀合的可活化抗体或多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体。
根据本公开的药物组合物可以包括本公开的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和载体。这些药物组合物可以包括于试剂盒诸如例如诊断试剂盒中。
本领域技术人员将理解，本公开的抗体具有多种用途。例如，本公开的蛋白用作用于多种病症的治疗剂。本公开的抗体还用作诊断试剂盒中的试剂或用作诊断工具，或这些抗体可用于竞争测定法中以产生治疗剂。
附图简述
图1是描绘本文使用的一般掩蔽选择群体命名的说明。
图2A和2B是描绘SP34的scFv形式结合食蟹猴CD3ε的能力的一系列图。图1A描绘作为Fc融合蛋白浓度的函数的SP34scFv(LvHv)-Fc和SP34scFv(HvLv)-Fc结合。图2B描绘作为浓度的函数的小鼠SP34-2 IgG1结合。
图3A-3D是描绘本公开的掩蔽部分降低包含此类掩蔽部分的可活化抗CD3ε抗体结合Jurkat T细胞上的CD3ε的能力的能力的一系列图。每种可活化抗体通过其掩蔽部分名称标记。抗体SP34scFv(LvHv)-Fc通过LvHv标识。
图4A、4B和4C是描绘本公开的各种抗体和可活化抗体的一系列说明。图4A描绘scFv-Fc抗体的组分片段。图4B描绘本公开的scFv(LvHv)-Fc和scFv(HvLv)-Fc抗体。图4C描绘包含本公开的scFv(LvHv)-Fc或scFv(HvLv)-Fc抗体的可活化抗体。
图5A、5B、5C和5D是描绘本公开的多特异性抗体和多特异性可活化抗体的一系列说明。图5A描绘包含Ig抗体和scFv的本公开的多特异性抗体。图5B描绘本公开的多特异性可活化抗体，其中一级抗体位点被掩蔽。图5C描绘本公开的多特异性可活化抗体，其中二级scFv位点被掩蔽。图5D描绘本公开的多特异性可活化抗体，其中一级抗体和二级scFv位点被掩蔽。
图6A、6B、6C、6D、6E和6F是描绘本公开的多特异性可活化抗体的各个实施方案的一系列说明。
图7A、7B、7C、7D、7E、7F、7G、7H、7I和7J是本公开的多特异性抗体的可能排列的选择集合的一系列示意图。
图8A、8B、8C、8D、8E、8F、8G、8H、8I和8J是本公开的多特异性可活化抗体的可能排列的选择集合的一系列示意图。具体而言，该图显示多特异性可活化抗体，其中一级抗原结合位点被掩蔽(即，可活化)，且额外的抗原结合结构域未被掩蔽。
图9A、9B、9C、9D、9E、9F、9G、9H和9J是多特异性可活化抗体的阵列的一系列示意图，其中所有抗原结合结构域都被掩蔽。
图10A、10B、10C、10D、10E、10F、10G、10H、10I和10J是多特异性可活化抗体的阵列的一系列示意图，其中二级抗原结合结构域被掩蔽，且额外的抗原结合结构域未被掩蔽。
图11A、11B、11C、11D、11E、11F、11G、11H、11I和11J是多特异性可活化抗体的阵列的一系列示意图，其中大多数、但不是全部的抗原结合结构域被掩蔽，且至少一个额外的抗原结合结构域未被掩蔽。
图12A、12B、12C和12D是多特异性可活化抗体的阵列的一系列示意图，其中一级抗原结合结构域和另一个抗原结合结构域被掩蔽，且剩余的抗原结合结构域未被掩蔽。
图13A和13B是描绘SP34 scFv-Fc与CD3ε阳性Jurkat细胞的结合的一系列图。图13A是描绘SP34scFv-Fc与CD3εJurkat细胞的结合的两种取向的能力的图。图13B是描绘SP34-2 IgG的结合的图。SP34的所有形式都以相似的EC50值结合。
图14A和14B是描绘本公开的掩蔽部分降低包含此类掩蔽部分的可活化抗CD3ε抗体结合Jurkat T细胞上的CD3ε的能力的能力的一系列图。
图15A、15B、15C和15D是描绘CD3ε掩蔽肽改变EGFR掩蔽的多特异性可活化抗体中的CD3ε结合的EC50的一系列图，所述EGFR掩蔽的多特异性可活化抗体利用SP34 scFv的两种形式，同时保留有效的EGFR掩蔽。
图16A和16B是描绘CD3ε和EGFR掩蔽的多特异性可活化抗体的细胞毒性EC50相对于未掩蔽的对照改变的一系列图。这用SP34 scFv的两种形式(即CI023和CI024中的scFv相比CI011和CI010中的scFv)是明显的。
图17A和17B是一系列图，其描绘在多特异性、可活化抗体的情况下，EGFR结合EC50不受两个CD3ε掩蔽的存在或不存在的影响；同样地，CD3ε EC50不受EGFR掩蔽的存在或不存在的影响。
图18A和18B是一系列图，其描绘通过掩蔽EGFR和CD3结合两者获得细胞毒性EC50的最大改变。此外，多特异性抗体和多特异性可活化抗体的细胞毒性是EGFR依赖性的。
图19是描绘通过掩蔽EGFR和CD3结合两者获得活化EC50的最大改变。
图20A和20B是一系列图，其描述CD3掩蔽的多特异性抗体显示可忽略的靶标非依赖性活化，如图20A中所示的CD69+频率分析和图20B中所示的CD69平均荧光强度分析所证明。
图21A、21B、21C和21D是描述uPA活化恢复多特异性、可活化CI011 (M-EGFR/M-hCD3)抗体的结合的一系列图。所有多特异性、可活化抗体的细胞杀伤都通过uPA活化恢复。
图22是描绘含有不同底物的双重掩蔽的多特异性、可活化抗体改变EC50细胞毒性的能力的图。
图23是描绘经7天以0.1 mg/kg两次给药的双特异性抗体CI005和持续8天以0.5mg/kg/天给药的CI059 (BiTE)防止HT-29Luc2异种移植肿瘤的生长的图。
图24是描绘CI048抗体限制HT-29Luc2异种移植肿瘤的建立和CI011抑制HT-29Luc2异种移植肿瘤的生长的图。PBS和CI011之间的作用差异是显著的(p <0.05)。
图25是描绘CI048双特异性抗体用于消除HT-29Luc2异种移植肿瘤的剂量-反应的图。
图26是描绘0.3 mg/kg的CI048双特异性抗体消除HT-29Luc2异种移植肿瘤和0.1mg/kg的CI040双特异性可活化抗体限制HT-29Luc2异种移植肿瘤的生长的图。
图27是描绘1.0 mg/kg的CI040双特异性可活化抗体和0.3 mg/kg的CI048双特异性抗体消除HT-29Luc2异种移植肿瘤的图。
图28是描绘1.0 mg/kg的CI011双特异性可活化抗体显著抑制HT-29Luc2异种移植肿瘤生长(p<0.05)的图。
图29是描绘给药后48小时的血清丙氨酸转氨酶(ALT)浓度的CI048、CI011和CI048的剂量-反应图的图。
图30显示并入EGFR掩蔽的多特异性、可活化抗体的小鼠CD3ε掩蔽改变与小鼠CD3结合的EC50，同时保留有效的EGFR掩蔽。
图31表明，通过掩蔽IL6R和CD3结合最大程度地减弱IL6R+ Molp-8细胞的杀伤。
详述
本公开提供了至少结合CD3的ε链(CD3ε)的抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。如本文所用，可活化抗体是这样的抗体，其包括掩蔽部分(MM)，所述掩蔽部分(MM)与抗体的抗原或表位结合结构域连接，使得MM的偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。如本文所用，多特异性抗体是识别两种或更多种不同的抗原或表位的抗体，且多特异性可活化抗体是这样的多特异性抗体，其包括与多特异性抗体的至少一个抗原或表位结合结构域连接的至少一个掩蔽部分(MM)，使得MM的偶联降低抗原或表位结合结构域结合其靶标的能力。本文提供的可活化抗体和/或可活化多特异性抗体在循环中是稳定的，在预期的治疗和/或诊断部位处被活化，但在正常(即，健康)组织中不被活化，并且当被活化时，展现与相应的未修饰的抗体或多特异性抗体至少相当的与靶标的结合。
本公开的抗体、活化的可活化抗体、多特异性抗体和/或活化的多特异性可活化抗体以≤1 μM、例如在一些实施方案中≤ 100 nM、≤ 10 nM或≤ 1 nM的结合常数(Kd)结合CD3ε。
本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体经由接合T细胞上的CD3ε而用于活化T细胞。也就是说，此类抗体激动、刺激、活化和/或增强CD3介导的T细胞活化。CD3的生物活性包括例如T细胞活化和通过CD3和T细胞受体(TCR)的抗原结合亚基之间的相互作用的其他信号传导。例如，抗CD3ε抗体、活化的可活化抗体、多特异性抗体和/或活化的多特异性可活化抗体通过部分或完全调节(例如，激动、刺激、活化或以其他方式增强)CD3介导的T细胞活化而经由接合T细胞上的CD3ε来完全或部分活化T细胞。
多特异性抗体的非限制性实例包括双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体和其他多特异性抗体。本文提供的多特异性抗体也是多价的；如本文所用，多价是指抗体上的结合位点的总数量，不管所述结合位点是否识别相同或不同的抗原或表位。多特异性可活化抗体的非限制性实例包括双特异性可活化抗体、三特异性可活化抗体、四特异性可活化抗体和其他多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性可活化抗体也是多价的。
在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段和/或多特异性可活化抗体或其片段经设计以接合T细胞和/或其他免疫效应细胞。接合T细胞的多特异性可活化抗体或其片段在本文中也称为T-细胞接合多特异性抗体或其片段和/或T-细胞接合多特异性可活化抗体或其片段。接合免疫效应细胞的多特异性可活化抗体或其片段在本文中也称为免疫效应细胞接合多特异性抗体或其片段和/或免疫效应细胞接合多特异性可活化抗体或其片段。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段和/或多特异性可活化抗体或其片段经设计以与多于一种靶标和/或多于一种表位结合或以其他方式相互作用，在本文中也称为多抗原靶向抗体或其片段和/或多抗原靶向可活化抗体或其片段。
在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段包括IgG结构域和scFv结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段包括IgG可变结构域和scFv结构域。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶抗原的特异性，且另一个抗体结构域具有对T-细胞表面抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶抗原的特异性，且另一个抗体结构域具有对另一个靶抗原的特异性。在一些实施方案中，多特异性抗体或其片段的一个抗体结构域具有对靶抗原的一个表位的特异性，且另一个抗体结构域具有对同一靶抗原的另一个表位的特异性。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体经工程改造以包括经由不可切割接头与抗体或其抗原结合片段(AB)偶联的掩蔽部分(MM)。例如，在一些实施方案中，多特异性可活化抗体是T-细胞接合多特异性可活化抗体，其包括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1经由不可切割接头与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段包括结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB2经由可切割接头与掩蔽部分(MM2)连接，使得MM的偶联降低AB2结合第二靶标的能力。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体是T-细胞接合多特异性可活化抗体，其包括靶向抗体或其抗原结合片段和T-细胞接合抗体或其抗原结合部分，其中T-细胞接合抗体或其抗原结合片段包括结合第一T-细胞接合靶标的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，其中AB1经由不可切割接头与掩蔽部分(MM1)连接，使得MM的偶联降低AB1结合第一靶标的能力，且靶向抗体或其抗原结合片段未被掩蔽。
定义
除非另外定义，与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语“一个/种(a)”实体或“一个/种(an)”实体是指该实体中的一个/种或多个/种。例如，化合物是指一种或多种化合物。因此，术语“一个/种(a)”、“一个/种(an)”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”可以互换使用。此外，除非上下文另外要求，单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交结合使用的命名法及其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。标准技术用于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书或本领域通常实践或本文所述进行。前述技术和程序通常根据本领域众所周知的常规方法和如本说明书各处中引用和讨论的各种通用和较特定的参考文献中所述进行。参见例如，Sambrook等人Molecular Cloning: ALaboratory Manual (第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y. (1989))。与本文描述的分析化学、合成有机化学和医用和药用化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送，和治疗患者。
如根据本公开所用，除非另外说明，以下术语应理解具有以下含义：
如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的抗原结合部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与…免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其他多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd > 10-6)。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
基础抗体结构单位已知包含四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对构成，每一对具有一个“轻”链(约25 kDa)和一个“重”链(约50-70 kDa)。各链的氨基末端部分包括约100-110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。各链的羧基末端部分限定了恒定区，其主要负责效应子功能。通常，获得自人的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任一类别，它们彼此不同之处在于分子中存在的重链的性质。某些类别还具有亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。
如本文所用的术语“单克隆抗体” (mAb)或“单克隆抗体组合物”，是指仅含有一个分子种类的抗体分子的抗体分子群，所述抗体分子由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成。具体而言，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在所述群的所有分子中相同。MAb含有能够与抗原的特定表位起免疫反应的抗原结合位点，特征在于对抗原有独特的结合亲和力。
术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子的一部分，其参与抗原结合。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链的N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区内的三个高度不同的区段，被称为“超变区”，间插在称为“框架区”或“FR”的较保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白的超变区之间并与其邻近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个超变区和重链的三个超变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，重链和轻链各自的三个超变区被称为“互补决定区”或“CDR”。指定氨基酸至各结构域根据KabatSequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1987和1991))或Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987), Chothia等人Nature 342:878-883 (1989)中的定义来进行。
如本文所用，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白、scFv或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何蛋白决定簇。表位决定簇通常由分子例如氨基酸或糖侧链的化学活性表面簇(groupings)组成，和通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。例如，抗体可以针对多肽的N-端或C-端肽产生。当解离常数是≤ 1 µM；例如，在一些实施方案中≤ 100 nM和在一些实施方案中≤ 10 nM时，认为抗体特异性结合抗原。
如本文所用，术语“特异性结合”、“免疫结合”和“免疫结合性质”是指在免疫球蛋白分子和免疫球蛋白对其具有特异性的抗原之间形成的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可表示为相互作用的解离常数(Kd)，其中Kd越小表示亲和力越大。选择的多肽的免疫结合性质可使用本领域众所周知的方法定量测定。一个此类方法要求测定抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向上同等影响速率的几何参数。因此，“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数” (Koff)可通过计算浓度和缔合和解离的实际速率来测定。(参见Nature 361:186-87 (1993))。Koff /Kon之比使得能够消除与亲和力不相关的所有参数，和等于解离常数Kd。(一般参见Davies等人 (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473)。当结合常数(Kd)是≤1 μM，例如在一些实施方案中≤ 100 nM，在一些实施方案中≤ 10 nM和在一些实施方案中≤ 100 pM至约1 pM时，认为本公开的抗体特异性结合EGFR，如通过测定法诸如放射配体结合测定法或本领域技术人员已知的类似测定法所测量。
如本文所用的术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸，或其一些组合，根据其来源，“分离的多核苷酸” (1)不缔合“分离的多核苷酸”天然存在于其中的多核苷酸的全部或一部分，(2)与天然不与其连接的多核苷酸可操作连接，或(3)不作为较大序列的一部分天然存在。根据本公开的多核苷酸包括编码本文所示的重链免疫球蛋白分子的核酸分子，和编码本文所示的轻链免疫球蛋白分子的核酸分子。
本文提及的术语“分离的蛋白”意指cDNA、重组RNA或合成来源的蛋白或其一些组合，根据其来源或衍生源，“分离的蛋白” (1)不缔合天然存在的蛋白，(2)不含相同来源的其他蛋白，例如，不含鼠蛋白，(3)通过不同物种的细胞表达，或(4)不天然存在。
本文作为通称使用的术语“多肽”是指具有多肽序列的天然蛋白、片段或类似物。因此，天然蛋白片段和类似物是多肽上位概念(genus)的下位概念(species)。根据本公开的多肽包含本文所示的重链免疫球蛋白分子和本文所示的轻链免疫球蛋白分子，以及由包含重链免疫球蛋白分子与轻链免疫球蛋白分子诸如κ轻链免疫球蛋白分子的组合(和反之亦然)形成的抗体分子以及其片段和类似物。
如本文所用的术语“天然存在的”在应用于物体时是指物体可天然存在的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的、可自天然来源分离的和未在实验室中经人为有意修饰或以其他方式修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用的术语“可操作连接”是指所述组分的位置处于允许它们以其预期方式起作用的关系中。与编码序列“可操作连接”的控制序列以使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下实现的方式连接。
如本文所用的术语“控制序列”是指实现与它们连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。此类控制序列的性质取决于宿主生物体而不同，在原核生物中此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，在真核生物中通常此类控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”意欲最少包括其存在是表达和加工所必需的所有元件，和还可包括其存在是有利的其他元件，例如前导序列和融合物配偶体序列。本文提及的术语“多核苷酸”意指至少10个碱基长的核苷酸，为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一类型的核苷酸的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
本文提及的术语寡核苷酸包括通过天然存在的和非天然存在的寡核苷酸键(linkage)连接在一起的天然存在的和修饰的核苷酸。寡核苷酸是通常包含长度200个或更少的碱基的多核苷酸子集。在一些实施方案中，寡核苷酸是10-60个碱基长，例如在一些实施方案中12、13、14、15、16、17、18、19或20-40个碱基长。寡核苷酸通常是单链的，例如对于探针，但寡核苷酸也可以是双链的，例如用于构建基因突变体。本公开的寡核苷酸为有义或反义寡核苷酸。
本文提及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文提及的术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰的或取代的糖基团等的核苷酸。本文提及的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键，诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)、氨基磷酸酯(phosphoronmidate)等。参见例如，LaPlanche等人Nucl. Acids Res. 14:9081(1986); Stec等人 J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein等人Nucl. Acids Res.16:3209 (1988), Zon等人Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon等人Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach,第87-108页(F. Eckstein编辑, Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec等人美国专利号5,151,510; Uhlmann和Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)。如果需要，寡核苷酸可包括用于检测的标记。
如本文所用，20种常规氨基酸和其缩写按常规使用。参见Immunology - ASynthesis (第2版, E.S. Golub和D.R. Gren编辑, Sinauer Associates, Sunderland7Mass. (1991))。20种常规氨基酸的立体异构体(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如α-,α-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常规氨基酸也可以是本公开的多肽的合适的组分。非常规氨基酸的实例包括：4羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰基丝氨酸、N-甲酰基甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、σ-N-甲基精氨酸和其他类似的氨基酸和亚氨基酸(例如，4-羟基脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中，根据标准用法和惯例，左手方向是氨基末端方向和右手方向是羧基末端方向。
类似地，除非另外说明，单链多核苷酸序列的左手末端是5'端，双链多核苷酸序列的左手方向被称为5'方向。新生RNA转录物的5'至3'加入方向被称为转录方向，DNA链上具有与RNA相同的序列和在RNA转录物的5'末端的5'处的序列区被称为“上游序列”，DNA链上具有与RNA相同的序列和在RNA转录物的3'末端的3'处的序列区被称为“下游序列”。
应用于多肽时，术语“基本同一性”意指，两个肽序列当诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认的空位权重最佳比对时，共有至少80%的序列同一性，例如在一些实施方案中，至少90%的序列同一性，在一些实施方案中至少95%的序列同一性，和在一些实施方案中至少99%的序列同一性。
在一些实施方案中，不相同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。
如本文所讨论，抗体或免疫球蛋白分子的氨基酸序列的较少变化预期包括在本公开中，条件是氨基酸序列中的所述变化保持至少75%，例如在一些实施方案中至少80%、90%、95%，和在一些实施方案中99%。具体而言，预期保守氨基酸替换。保守替换是在其侧链上相关的氨基酸家族中发生的那些。遗传编码氨基酸通常分为以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸。疏水氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。氨基酸的其他家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，其为脂肪族羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，其为含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，其为脂肪族的家族；和(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，其为芳香族的家族。例如，可合理预期单独替换亮氨酸为异亮氨酸或缬氨酸、天冬氨酸为谷氨酸、苏氨酸为丝氨酸或类似替换氨基酸为结构相关的氨基酸，不将对所得分子的结合或性质具有主要影响，尤其是如果所述替换不涉及框架位点内的氨基酸。氨基酸变化是否产生功能肽可通过测定多肽衍生物的特定活性而容易地确定。本文详细描述了测定法。抗体或免疫球蛋白分子的片段或类似物可通过本领域普通技术人员容易地制备。在一些实施方案中，片段或类似物的氨基末端和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。结构和功能结构域可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开的或专有的序列数据库比较来鉴定。计算机比较方法用于鉴定出现在具有已知结构和/或功能的其他蛋白中的序列基序或预测的蛋白构象结构域。鉴定折叠成已知三维结构的蛋白序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253:164 (1991)。因此，前述实例证实，本领域技术人员可识别可用于定义根据本公开的结构和功能结构域的序列基序和结构构象。
在一些实施方案中，氨基酸取代为以下那些氨基酸取代，其：(1)降低对蛋白水解的敏感性，(2)降低对氧化的敏感性，(3)改变形成蛋白复合物的结合亲和力，(4)改变结合亲和力，和(4)赋予或修改此类类似物的其他物理化学或功能性质。类似物可包括具有并非天然存在的肽序列的序列的各种突变型蛋白。例如，可在天然存在的序列中，例如在形成分子间接触的结构域外的多肽部分中进行单一或多个氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)。保守氨基酸取代不应基本上改变亲本序列的结构特征(例如，替换氨基酸不应倾向于中断在亲本序列中出现的螺旋，或破坏亲本序列所特有的其他类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级和三级结构的实例描述于Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton编辑, W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction toProtein Structure (C. Branden和J. Tooze编辑, Garland Publishing, New York,N.Y. (1991));和Thornton等人Nature 354:105 (1991)。
如本文所用的术语“多肽片段”是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或一个或多个内部缺失的多肽，但其中剩余的氨基酸序列与从例如全长cDNA序列中推论的天然存在的序列的相应的位置相同。片段通常为至少5、6、8或10个氨基酸长，例如在一些实施方案中至少14个氨基酸长，在一些实施方案中至少20个氨基酸长，通常至少50个氨基酸长，和在一些实施方案中至少70个氨基酸长。如本文所用的术语“类似物”是指由至少25个氨基酸的区段构成的多肽，所述区段与推论的氨基酸序列的一部分具有基本同一性和在合适的结合条件下与EGFR特异结合。通常，多肽类似物包含相对于天然存在的序列的保守氨基酸取代(或添加或缺失)。类似物通常为至少20个氨基酸长，例如在一些实施方案中至少50个氨基酸长或更长，和通常可长至全长的天然存在的多肽。
术语“试剂”在本文用于表示化合物、化合物的混合物、生物大分子或自生物材料制备的提取物。
如本文所用，术语“标记”或“标记的”是指并入可检测标记物，例如，通过并入放射性标记的氨基酸或与可通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记或酶活性的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素基部分的多肽连接。在某些情况下，标记或标记物也可以是治疗性的。标记多肽和糖蛋白的各种方法是本领域已知的和可被使用。用于多肽的标记的实例包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标记(例如，荧光团、若丹明、镧系元素磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、p-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光、生物素基团、被第二报告分子识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记通过各种长度的间隔区臂连接以减少潜在的空间位阻。如本文所用的术语“药剂或药物”是指当适当施用于患者时能够诱导所需的治疗效果的化合物或组合物。
如本文所用，“基本上纯的”意指对象种类是存在的主要种类(即，在摩尔基础上它比组合物中的任何其他个别种类更丰富)，基本上纯化的部分是其中对象种类占存在的所有大分子种类的至少约50% (在摩尔基础上)的组合物。
通常，基本上纯的组合物将包含组合物中存在的超过约80%的所有大分子种类，例如，在一些实施方案中，超过约85%、90%、95%和99%。在一些实施方案中，对象种类纯化至基本均质(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物种类)，其中组合物基本上由单一大分子种类组成。
术语患者包括人和兽医主体。
本文的其他化学术语根据本领域的常规用法使用，如由The McGraw-HillDictionary of Chemical Terms (Parker, S.编辑, McGraw-Hill, San Francisco(1985))所举例。
多特异性抗体和多特异性可活化抗体
本公开的示例性的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体包括例如本文提供的实施例中显示的那些和其变体。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性抗体中的至少一个AB对于CD3ε是特异性的，且至少一个其他AB是表1中所列的任一靶标的结合配偶体。
在一些非限制性实施方案中，多特异性抗体的至少一个AB是或源自于本文提供的实施例中所列的序列。
在一些非限制性的实施方案中，多特异性抗体的至少一个AB是或源自于表2中所列的抗体。
表2：示例性AB来源
抗体商品名(抗体名) 靶标
Avastin™ (贝伐单抗) VEGF
Lucentis™ (雷珠单抗) VEGF
Erbitux™ (西妥昔单抗) EGFR
Vectibix™ (帕尼单抗) EGFR
Remicade™ (英夫利昔单抗) TNFα
Humira™ (阿达木单抗) TNFα
Tysabri™ (那他珠单抗) 整联蛋白α4
Simulect™ (巴利昔单抗) IL2R
Soliris™ (艾库组单抗) 补体C5
Raptiva™ (伊伐珠单抗) CD11a
Bexxar™ (托西莫单抗) CD20
Zevalin™ (替伊莫单抗) CD20
Rituxan™ (利妥昔单抗) CD20
奥瑞珠单抗(Ocrelizumab) CD20
Arzerra™ (奥法木单抗) CD20
Obinutuzumab CD20
Zenapax™ (达珠单抗) CD25
Adcetris™ (brentuximab vedotin) CD30
Myelotarg™ (吉妥单抗) CD33
Mylotarg™ (吉妥单抗奥佐米星) CD33
Campath™ (阿仑单抗) CD52
ReoPro™ (阿昔单抗) 糖蛋白受体IIb/IIIa
Xolair™ (奥马珠单抗) IgE
Herceptin™ (曲妥单抗) Her2
Kadcyla™ (曲妥单抗 emtansine) Her2
Synagis™ (帕利珠单抗) RSV的F蛋白
Yervoy™(易普利姆玛) CTLA-4
(替西木单抗(tremelimumab)) CTLA-4
Hu5c8 CD40L
(帕妥珠单抗) Her2-neu
(ertumaxomab) CD3/Her2-neu
Orencia™ (阿巴西普) CTLA-4
(他尼珠单抗(tanezumab)) NGF
(巴维昔单抗) 磷脂酰丝氨酸
(zalutumumab) EGFR
(mapatumumab) EGFR
(马妥珠单抗) EGFR
(尼妥珠单抗) EGFR
ICR62 EGFR
mAb 528 EGFR
CH806 EGFR
MDX-447 EGFR/CD64
(依决洛单抗) EpCAM
RAV12 RAAG12
huJ591 PSMA
Enbrel™ (依那西普) TNF-R
Amevive™ (阿法西普) 1-92-LFA-3
Antril™, Kineret™ (阿那白滞素) IL-1Ra
GC1008 TGFβ
Notch, 例如, Notch 1
Jagged 1或Jagged 2
(阿德木单抗) EpCAM
(figitumumab) IGF1R
(tocilizumab) IL-6受体
Stelara™ (优特克单抗) IL-12/IL-23
Prolia™ (地诺单抗) RANKL
Keytruda (派姆单抗(Pembrolizumab)) PD-1
Opdivo (纳武单抗) PD-1
Atezolizumab (MPDL3280A) PD-L1
本公开的结合CD3ε的示例性抗体、可活化抗体和其抗原结合片段包括实施例、例如实施例2和4中所述的CD3ε结合序列。示例性多特异性抗体和多特异性可活化抗体包括实施例、例如实施例4中所述的多特异性抗体和多特异性可活化抗体。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括选自以下的重链序列：SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括选自以下的轻链序列：SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括选自SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546的重链序列；以及选自SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520的轻链序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括与选自以下的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链序列：SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括与选自以下的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链序列：SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括与选自SEQ ID NO:446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的重链序列；以及与选自SEQ ID NO:448、450、458、468、474、482、484、508、516和520的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的轻链序列。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括SEQ ID NO:506的氨基酸序列。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体包括与SEQ ID NO:506的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。
本公开的结合CD3ε的示例性AB包括如下所示的CD3ε结合序列：
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括包含或衍生自表17中所示的重链氨基酸序列的重链。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括包含或衍生自表17中所示的轻链氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括包含或衍生自表17中所示的重链氨基酸序列的重链和包含或衍生自表17中所示的轻链氨基酸序列的轻链。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组A中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组B中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组C中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组D中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组E中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组F中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组G中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组H中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组I中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组J中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组K中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组L中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组M中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组N中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组O中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组P中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括来自表17中的组Q中所示的组合的重链可变区序列和轻链可变区序列的组合。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包含或源自市售抗体，诸如例如来自Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, Ind.; 目录号1273 485)的抗CD3抗体。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包含或源自由杂交瘤制备、分泌或以其他方式产生的抗体，所述杂交瘤诸如例如美国专利号4,361,549和/或4,658,019中公开且以登录号ATCC CRL 8001 OKT-3保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包含或源自由杂交瘤制备、分泌或以其他方式产生的抗体，所述杂交瘤诸如例如PCT公开号WO 1995/16037中公开且以登录号DSMACC2152保藏于Leibniz-Institut DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH的杂交瘤。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包含或源自由杂交瘤制备、分泌或以其他方式产生的抗体，所述杂交瘤诸如例如PCT公开号WO 1991/01752中公开且以登录号HB10166保藏于美国典型培养物保藏中心的杂交瘤。
在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括表18中所示的CDR序列、选自表18中所示的那些组合的VL CDR序列的组合和/或选自表18中所示的那些组合的VH CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组R中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组R中所示的组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组S中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组S中所示的组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组T中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组T中所示的组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组U中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组U中所示的组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组V中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组V中所示的组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组W中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组W中所示的组合的轻链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组X中所示的组合的重链CDR序列的组合。在一些实施方案中，可活化抗CD3ε抗体包括选自表18中的组X中所示的组合的轻链CDR序列的组合。
本公开的多特异性可活化抗体中的AB至少特异性结合哺乳动物靶标。在一些实施方案中，此类AB结合哺乳动物CD3ε。在一些实施方案中，此类AB结合人靶标。在一些实施方案中，此类AB结合非人灵长类靶标。本公开中还包括与本公开的抗体和/或本文所述的活化的可活化抗体结合相同的表位的AB。本公开中还包括与本文所述的抗体和/或活化的可活化抗体竞争结合靶标、例如人靶标的AB。本公开中还包括与本文所述的抗体和/或活化的可活化抗体交叉竞争结合靶标、例如人靶标的AB。
在一些实施方案中，本公开的多特异性可活化抗体中的AB至少特异性结合CD3ε靶标、诸如例如哺乳动物CD3ε。在一些实施方案中，此类AB结合哺乳动物CD3ε。在一些实施方案中，此类AB结合人CD3ε。在一些实施方案中，此类AB结合非人灵长类CD3ε。本公开中还包括与本公开的抗体和/或本文所述的活化的可活化抗体结合相同的CD3ε表位的AB。本公开中还包括与本文所述的抗CD3ε抗体和/或活化的抗CD3ε可活化抗体竞争结合CD3ε靶标、例如人CD3ε的AB。本公开中还包括与本文所述的抗CD3ε抗体和/或活化的抗CD3ε可活化抗体交叉竞争结合CD3ε靶标、例如人CD3ε的AB。
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一个AB结合表皮生长因子受体(EGFR)。在一些实施方案中，结合EGFR的AB包括如下所示的重链和/或轻链序列中的一种或多种。
C225v5抗体重链核苷酸序列：
C225v5抗体重链氨基酸序列
C225v5抗体轻链核苷酸序列：
C225v5抗体轻链氨基酸序列：
C225v4抗体重链核苷酸序列：
C225v4抗体重链氨基酸序列：
C225v6抗体重链核苷酸序列：
C225v6抗体重链氨基酸序列
C225抗体重链氨基酸序列
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一个AB结合白介素6受体(IL-6R)。在一些实施方案中，结合IL-6R的AB包括如下所示的重链和/或轻链序列中的一种或多种。
Av1抗体重链氨基酸序列：
Av1抗体轻链氨基酸序列：
在一些实施方案中，AB结合Jagged靶标，例如Jagged 1、Jagged 2或Jagged 1和Jagged2两者。在一些实施方案中，结合Jagged靶标的AB包括如下所示的重链和/或轻链序列中的一种或多种。
4D11轻链序列：
4D11重链序列：
4D11v2重链序列
4D11v2轻链序列
在一些实施方案中，多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一个AB结合Jagged靶标，且包括如下所示的可变重链和/或可变轻链中的一种或多种。
可变轻链氨基酸序列Lc4
可变重链氨基酸序列Hc4
可变轻链氨基酸序列Lc5
可变重链氨基酸序列Hc5
可变轻链氨基酸序列Lc7
可变重链氨基酸序列Hc7
可变轻链氨基酸序列Lc8
可变重链氨基酸序列Hc8
可变轻链氨基酸序列Lc13
可变重链氨基酸序列Hc13
可变轻链氨基酸序列Lc16
可变重链氨基酸序列Hc16
可变轻链氨基酸序列Lc19
可变重链氨基酸序列Hc19
可变轻链氨基酸序列Lc21
可变重链氨基酸序列Hc21
可变轻链氨基酸序列Lc24
可变重链氨基酸序列Hc24
可变轻链氨基酸序列Lc26
可变重链氨基酸序列Hc26
可变轻链氨基酸序列Lc27
可变重链氨基酸序列Hc27
可变轻链氨基酸序列Lc28
可变重链氨基酸序列Hc28
可变轻链氨基酸序列Lc30
可变重链氨基酸序列Hc30
可变轻链氨基酸序列Lc31
可变重链氨基酸序列Hc31
可变轻链氨基酸序列Lc32
可变重链氨基酸序列Hc32
可变轻链氨基酸序列Lc37
可变重链氨基酸序列Hc37
可变轻链氨基酸序列Lc39
可变重链氨基酸序列Hc39
可变轻链氨基酸序列Lc40
重链氨基酸序列Hc40
可变轻链氨基酸序列Lc47
可变重链氨基酸序列Hc47
可变4B2轻链
可变4B2重链
可变4D11轻链
可变4D11重链
可变4E7轻链
可变4E7重链
可变4E11轻链
可变4E11重链
可变6B7轻链
可变6B7重链
可变6F8轻链
可变6F8重链
本公开的抗体和/或可活化抗体特异性结合给定靶标，例如人靶蛋白诸如人CD3ε。本公开中还包括与本文所述的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体结合相同表位的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。本公开中还包括与本文所述的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体竞争结合CD3ε、例如人CD3ε的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。本公开中还包括与本文所述的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体交叉竞争结合CD3ε、例如人CD3ε的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。
本领域技术人员将认识到，可能通过确定抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体是否阻止本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体结合靶标而在无需过度实验的情况下确定前者是否具有与后者相同或类似的特异性。如果所测试的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体与本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体竞争，如通过本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的结合降低所示，则所述抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、两种多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体结合相同或紧密相关的表位。
用于确定抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体是否具有与本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体相同或类似的特异性的一个实施方案是将本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体与所述抗体与之正常反应的可溶性靶标预孵育，然后添加所测试的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体以确定所测试的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体在其结合靶标的能力上是否受到抑制。如果所测试的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体受到抑制，则很可能其具有与本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体相同或功能等同的表位特异性。
抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体例如使用下文提供的实施例中描述的程序产生。抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体也可以使用多种本领域公认的用于抗体生产和/或纯化的技术中的任一种产生。
用于抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的抗体片段，诸如Fv、F(ab’)2和Fab，可以通过切割完整蛋白，例如，通过蛋白酶或化学切割来制备。在一些实施方案中，设计截短的基因。例如，编码F(ab’)2片段的一部分的嵌合基因将包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列，随后是翻译终止密码子，以得到截短的分子。
表达载体包括质粒、逆转录病毒、YAC、EBV来源的附加体等。适宜的载体是编码功能完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有工程改造的适当的限制性位点以使任何VH或VL序列可容易地插入和表达。在此类载体中，剪接通常发生在插入的J区的剪接供体位点和人C区之前的剪接受体位点之间，也发生在人CH外显子内存在的剪接区。多腺苷酸化和转录终止发生在编码区下游的天然染色体位点。所得抗体可以与任何强启动子连接，所述强启动子包括逆转录病毒LTR，例如，SV-40早期启动子(Okayama等人Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983))、劳斯肉瘤病毒LTR (Gorman等人P.N.A.S. 79:6777 (1982))和莫洛尼鼠白血病病毒LTR (Grosschedl等人Cell 41:885 (1985))。如将理解的是，也可使用天然Ig启动子等。
此外，抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可使用本领域众所周知的技术通过展示型技术(包括但不限于噬菌体展示、逆转录病毒展示、核糖展示和其他技术)产生，所得分子可进行额外成熟，诸如亲和力成熟，因为此类技术是本领域众所周知的。Wright等人Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992),Hanes和Plückthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (核糖体展示), Parmley和SmithGene 73:305-318 (1988) (噬菌体展示), Scott, TIBS, 第17卷:241-245 (1992),Cwirla等人PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel等人Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom等人Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell和McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)和美国专利号5,733,743。
可期望针对效应子功能修饰本公开的抗CD3ε抗体、抗CD3ε可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体以增强或降低此功能来改进抗体在将CD3+细胞募集至一种或多种与待治疗疾病相关的靶标、诸如例如在肿瘤细胞上表达的靶标中的有效性。例如，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而允许链间二硫键在该区中形成。由此产生的同型二聚体抗体可具有改进的内在化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。(参见Caron等人, J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992)和Shopes, J.Immunol., 148: 2918-2922 (1992))。在一些实施方案中，抗体可经工程改造以具有双Fc区，从而可具有增强的补体溶解和ADCC能力。(参见Stevenson等人, Anti-Cancer DrugDesign, 3: 219-230 (1989))。在一些实施方案中，进行Fc突变以除去糖基化位点，从而降低Fc功能。
可活化抗体和多特异性可活化抗体
本文提供的可活化抗体含有特异性结合靶标和/或表位的抗体或其抗体片段(在整个本公开中统称为AB)，其中AB被掩蔽部分(MM)修饰。本文提供的多特异性可活化抗体至少含有特异性结合第一靶标和/或第一表位的第一抗体或其抗体片段(在整个本公开中统称为AB1)和特异性结合第二靶标和/或第二表位的第二抗体或其抗体片段(在整个本公开中统称为AB2)，其中至少一个AB被掩蔽部分(MM)修饰。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体中的每个AB被其自身的掩蔽部分修饰。
当可活化抗体的AB或多特异性可活化抗体中的至少一个AB用MM修饰且在其靶标存在的情况下时，与未用MM修饰的AB的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。
用MM修饰的AB对靶标的Kd是未用MM修饰的AB或亲本AB对靶标的Kd的至少5、10、20、25、40、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更大，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反，用MM修饰的AB对靶标的结合亲和力是未用MM修饰的AB或亲本AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/20、1/25、1/40、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或1/5-1/10、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/10-1/10,000、1/10-1/100,000、1/10-1/1,000,000、1/10-1/10,000,000、1/100-1/1,000、1/100-1/10,000、1/100-1/100,000、1/100-1/1,000,000、1/100-1/10,000,000、1/1,000-1/10,000、1/1,000-1/100,000、1/1,000-1/1,000,000、1/1000-1/10,000,000、1/10,000-1/100,000、1/10,000-1/1,000,000、1/10,000-1/10,000,000、1/100,000-1/1,000,000或1/100,000-1/10,000,000。
MM对可活化抗体中的AB的解离常数(Kd)通常大于AB对靶标的Kd。MM对多特异性可活化抗体中的至少一个AB的解离常数(Kd)通常大于AB对靶标的Kd。MM对AB的Kd可以是AB对靶标的Kd的至少5、10、25、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、100,000、1,000,000或甚至10,000,000倍。相反，MM对AB的结合亲和力通常低于AB对靶标的结合亲和力。MM对AB的结合亲和力可以是AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/25、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/100,000、1/1,000,000或甚至1/10,000,000。
当可活化抗体中的AB用MM修饰且在其靶标存在的情况下时，与未用MM修饰的AB的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当多特异性可活化抗体中的至少一个AB用MM修饰且在其靶标存在的情况下时，与未用MM修饰的AB的特异性结合或亲本AB与靶标的特异性结合相比，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当与未用MM修饰的AB与靶标的结合或亲本AB与靶标的结合相比时，当在体内或在体外测定法中测量时，当用MM修饰时的AB结合靶标的能力可以降低至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和甚至100%持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
MM抑制可活化抗体中的AB与其靶标的结合。MM抑制可活化抗体中的至少一个AB与其靶标的结合。MM结合AB的抗原结合结构域且抑制AB与其靶标的结合。MM可以空间抑制AB与靶标的结合。MM可以变构抑制AB与其靶标的结合。在这些实施方案中，与未经MM修饰的AB、亲本AB或未与MM偶联的AB与靶标的结合相比，当AB用MM修饰或与MM偶联且在靶标存在的情况下时，当在体内或在体外测定法中测量时，不存在AB与靶标的结合或基本上无AB与靶标的结合，或不多于0.001%、0.01%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或50%的AB与靶标的结合，持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时，或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
当可活化抗体中的AB与MM偶联或被MM修饰时，MM“掩蔽”或降低或以其他方式抑制AB与其靶标的特异性结合。当可活化抗体中的AB与MM偶联或被MM修饰时，此偶联或修饰可以实现降低或抑制AB特异性结合其靶标的能力的结构改变。
当多特异性可活化抗体中的至少一个AB与MM偶联或被MM修饰时，MM“掩蔽”或降低或以其他方式抑制AB与其靶标的特异性结合。当多特异性可活化抗体中的至少一个AB与MM偶联或被MM修饰时，此偶联或修饰可以实现降低或抑制AB特异性结合其靶标的能力的结构改变。
在可活化抗体中，当AB与MM偶联或用MM修饰时，可活化抗体的至少一部分可以通过下式表示(以从氨基(N)端区域至羧基(C)端区域的顺序)：
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
其中MM是掩蔽部分，AB是抗体或其抗体片段，且L是接头。在许多实施方案中，可期望将一个或多个接头，例如，柔性接头插入组合物中以提供柔性。
在多特异性可活化抗体中，当至少一个AB与MM偶联或用MM修饰时，多特异性可活化抗体的至少一部分可以通过下式表示(以从氨基(N)端区域至羧基(C)端区域的顺序)：
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
其中MM是掩蔽部分，AB是抗体或其抗体片段，且L是接头。在许多实施方案中，可期望将一个或多个接头，例如，柔性接头插入组合物中以提供柔性。
在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施方案中，MM不含或基本上不含与AB的任何天然结合配偶体的同源性。在其他实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的相似性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于25%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于50%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于20%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于10%的同一性。
在一些实施方案中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体包括通过MM修饰的AB且还包括一个或多个可切割部分(CM)。此类可活化抗体和/或多特异性可活化抗体展现与AB的靶标的可活化/可变换结合。可活化抗体和/或多特异性可活化抗体通常包括被掩蔽部分(MM)和可修饰或可切割部分(CM)修饰或与掩蔽部分(MM)和可修饰或可切割部分(CM)偶联的至少一个抗体或抗体片段(AB)。在一些实施方案中，CM含有起目标蛋白酶的底物作用的氨基酸序列。
可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的元件经排列，使得每个MM和CM经放置，使得在切割(或者相对活性)状态下且在靶标存在的情况下，相应的AB结合靶标，而在未切割(或者相对无活性)状态下在靶标存在的情况下，AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。AB与其靶标的特异性结合可以由于AB特异性结合其靶标的能力被MM抑制或掩蔽而降低。
每个用MM和CM修饰的AB对靶标的Kd是未用MM和CM修饰的AB或亲本AB对靶标的Kd的至少5、10、20、25、40、50、100、250、500、1,000、2,500、5,000、10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000或更多倍，或5-10、10-100、10-1,000、10-10,000、10-100,000、10-1,000,000、10-10,000,000、100-1,000、100-10,000、100-100,000、100-1,000,000、100-10,000,000、1,000-10,000、1,000-100,000、1,000-1,000,000、1000-10,000,000、10,000-100,000、10,000-1,000,000、10,000-10,000,000、100,000-1,000,000或100,000-10,000,000倍。相反，每个用MM和CM修饰的AB对靶标的结合亲和力是未用MM和CM修饰的AB或亲本AB对靶标的结合亲和力的至多1/5、1/10、1/20、1/25、1/40、1/50、1/100、1/250、1/500、1/1,000、1/2,500、1/5,000、1/10,000、1/50,000、1/100,000、1/500,000、1/1,000,000、1/5,000,000、1/10,000,000、1/50,000,000或更低，或1/5-1/10、1/10-1/100、1/10-1/1,000、1/10-1/10,000、1/10-1/100,000、1/10-1/1,000,000、1/10-1/10,000,000、1/100-1/1,000、1/100-1/10,000、1/100-1/100,000、1/100-1/1,000,000、1/100-1/10,000,000、1/1,000-1/10,000、1/1,000-1/100,000、1/1,000-1/1,000,000、1/1000-1/10,000,000、1/10,000-1/100,000、1/10,000-1/1,000,000、1/10,000-1/10,000,000、1/100,000-1/1,000,000或1/100,000-1/10,000,000。
当至少一个AB用MM和CM修饰且在靶标存在的情况下、但不在修饰剂(例如蛋白酶)存在的情况下时，与未用MM和CM修饰的AB或亲本AB与靶标的特异性结合相比，该AB与其靶标的特异性结合被降低或抑制。当与亲本AB与其靶标的结合或未用MM和CM修饰的AB与其靶标的结合相比时，当在体内或在体外测定法中测量时，当用MM和CM修饰时的AB结合靶标的能力可以降低至少50%、60%、70%、80%、90%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%和甚至100%持续至少2、4、6、8、12、28、24、30、36、48、60、72、84或96小时或5、10、15、30、45、60、90、120、150或180天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长。
如本文所用，术语切割状态是指在CM被蛋白酶修饰后可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的状况。如本文所用，术语未切割状态是指在不存在CM被蛋白酶切割的情况下可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的状况。如上所讨论，术语“可活化抗体”在本文用于指呈其未切割(天然)状态以及呈其切割状态的可活化抗体。对普通技术人员显而易见的是，在一些实施方案中，切割的可活化抗体可以由于CM被蛋白酶切割、导致至少MM的释放而缺乏MM (例如，其中MM未通过共价键(例如，半胱氨酸残基之间的二硫键)与可活化抗体连接)。如上所讨论，术语“多特异性可活化抗体”在本文用于指呈其未切割(天然)状态以及呈其切割状态的多特异性可活化抗体。对普通技术人员显而易见的是，在一些实施方案中，切割的多特异性可活化抗体可以由于CM被蛋白酶切割、导致至少MM的释放而缺乏MM (例如，其中MM未通过共价键(例如，半胱氨酸残基之间的二硫键)与多特异性可活化抗体连接)。
可活化或可变换的意指可活化抗体和/或多特异性可活化抗体当可活化抗体在抑制、掩蔽或未切割状态下(即，第一构象)时展现与靶标的第一结合水平，且当可活化抗体在未抑制、未掩蔽和/或切割状态下(即，第二构象)时展现与靶标的第二结合水平，其中第二靶标结合水平大于第一结合水平。通常，靶标对可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的相应AB的接近在能够切割CM的切割剂存在的情况下比在此切割剂不存在的情况下更大。因此，当可活化抗体和/或多特异性可活化抗体在未切割状态下时，至少一个AB被抑制免于靶标结合且可以被掩蔽免于靶标结合(即，第一构象使得AB不能结合靶标)，且当可活化抗体在切割状态下时，对于靶标结合，AB未被抑制或未被掩蔽。
选择可活化抗体的CM和AB，使得第一AB代表CD3ε的结合部分，且CM代表由接近表达CD3ε的细胞的肿瘤产生和/或由与CD3ε在主体中的治疗部位或诊断部位处共定位的肿瘤产生的蛋白酶的底物。本文公开的可活化抗体特别可用于其中例如能够切割CM中的位点的蛋白酶以比非治疗部位的组织(例如健康组织)相对更高的水平存在于治疗部位或诊断部位的含有CD3ε的组织中的情况。
选择可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的CM和AB，使得第一AB代表第一靶标和/或表位的结合部分，且CM代表由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与靶标在主体中的治疗部位或诊断部位处共定位的肿瘤产生的蛋白酶的底物。本文公开的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体特别可用于其中例如能够切割CM中的位点的蛋白酶以比非治疗部位的组织(例如健康组织)相对更高的水平存在于治疗部位或诊断部位的含有靶标的组织中的情况。
在一些实施方案中，可活化抗体提供降低的毒性和/或不良副作用，如果AB未被掩蔽或以其他方式被抑制免于结合CD3ε，则所述毒性和/或不良副作用可以其他方式由在非治疗部位处的AB的结合导致。
通常，可活化抗体可以通过如下来设计：首先选择目标AB和构建可活化抗体的剩余部分，使得当构象上被限制时，MM提供AB的掩蔽或AB与CD3ε的结合的降低。可以考虑结构设计标准以提供该功能特征。
在一些实施方案中，多特异性可活化抗体提供降低的毒性和/或不良副作用，如果AB未被掩蔽或以其他方式被抑制免于结合其靶标，则所述毒性和/或不良副作用可以其他方式由在非治疗部位处的第一AB的结合导致。
通常，多特异性可活化抗体可以通过如下来设计：首先选择目标AB和构建可活化抗体的剩余部分，使得当构象上被限制时，MM提供AB的掩蔽或AB与其靶标的结合的降低。可以考虑结构设计标准以提供该功能特征。
提供了对在抑制构象相比于非抑制构象中的靶标结合展现所需动态范围的可变换表型的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体。动态范围通常是指(a)在第一组条件下参数的最大检测水平与(b)在第二组条件下该参数的最小检测值的比率。例如，在可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的背景下，动态范围是指(a)在能够切割可活化抗体的CM的蛋白酶存在的情况下与可活化抗体和/或多特异性可活化抗体结合的靶蛋白的最大检测水平与(b)在蛋白酶不存在的情况下与可活化抗体和/或多特异性可活化抗体结合的靶蛋白的最小检测水平的比率。可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的动态范围可计算为可活化抗体和/或多特异性可活化抗体切割剂(例如，酶)处理的解离常数与可活化抗体切割剂处理的解离常数的比率。可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的动态范围越大，可活化抗体的可变换表型越好。具有相对更高的动态范围值(例如，大于1)的可活化抗体展现更加期望的变换表型，使得在能够切割可活化抗体的CM的切割剂(例如，酶)存在的情况下比在切割剂不存在的情况下，可活化抗体的靶蛋白结合在更大的程度上发生(例如，主要发生)。
可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可以各种结构构型提供。下文提供可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一部分的示例性式。特别考虑，AB、相应的MM和CM的N-至C-末端顺序可以在可活化抗体内反转。还特别考虑，CM和MM的氨基酸序列可以重叠，例如，使得CM包含于MM内。
例如，可活化抗体可活化抗体的至少一部分可以由下式代表(以从氨基(N)端区域至羧基(C)端区域的顺序)：
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
其中MM是掩蔽部分，CM是可切割部分，且AB是抗体或其片段。应注意，尽管MM和CM在上式中表示为不同的组分，但在本文公开的所有示例性实施方案(包括式)中，考虑MM和CM的氨基酸序列可以重叠，例如，使得CM完全或部分地包含于MM内。此外，上式提供额外氨基酸序列，其可以位于可活化抗体元件的N-末端或C-末端。
例如，多特异性可活化抗体的至少一部分可以由下式代表(以从氨基(N)端区域至羧基(C)端区域的顺序)：
(MM)-(CM)-(AB)
(AB)-(CM)-(MM)
其中MM是掩蔽部分，CM是可切割部分，且AB是第一抗体或其片段。应注意，尽管MM和CM在上式中表示为不同的组分，但在本文公开的所有示例性实施方案(包括式)中，考虑MM和CM的氨基酸序列可以重叠，例如，使得CM完全或部分地包含于MM内。此外，上式提供额外氨基酸序列，其可以位于可活化抗体元件的N-末端或C-末端。
在某些实施方案中，MM不是AB的天然结合配偶体。在一些实施方案中，MM不含或基本上不含与AB的任何天然结合配偶体的同源性。在其他实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的相似性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%或80%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于50%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于25%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于20%的同一性。在一些实施方案中，MM与AB的任何天然结合配偶体具有不多于10%的同一性。
在许多实施方案中，可期望将一个或多个接头、例如柔性接头插入可活化抗体和/或多特异性可活化抗体构建体，以在MM-CM连接、CM-AB连接或两者中的一个或多个处提供柔性。例如，AB、MM和/或CM可以不含足够数量的残基(例如，Gly、Ser、Asp、Asn，尤其是Gly和Ser，特别是Gly)以提供期望的柔性。因此，此类可活化抗体和/或多特异性可活化抗体构建体的可变换表型可以获益于引入一个或多个氨基酸以提供柔性接头。此外，如下所述，在作为构象受限的构建体提供可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的情况下，可以可操作插入柔性接头，以促进形成和维持未切割的可活化抗体和/或未切割的多特异性可活化抗体的环状结构。
例如，在某些实施方案中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体包含下式之一(其中下式代表以N-至C-末端方向或C-至N-末端方向的氨基酸序列)：
(MM)-L1-(CM)-(AB)
(MM)-(CM)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM)-L2-(AB)
其中MM、CM和AB如上文所定义；其中L1和L2各自独立地且任选地存在或不存在，是相同或不同的柔性接头，其包括至少1个柔性氨基酸(例如，Gly)。此外，上式提供额外氨基酸序列，其可以位于可活化抗体和/或多特异性可活化抗体元件的N-末端或C-末端。实例包括但不限于靶向部分(例如，靶组织中存在的细胞的受体的配体)和血清半衰期延长部分(例如，结合血清蛋白诸如免疫球蛋白(例如，IgG)或血清白蛋白(例如，人血清白蛋白(HAS))的多肽)。
在一些非限制性实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB是表1中所列的任一靶标的结合配偶体。
在一些非限制性实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB包含、是或衍生自本文提供的实施例中所述的序列。
在一些非限制性实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB包含、是或衍生自本文提供的实施例中的实施例2和/或实施例4中所述的序列。
在一些非限制性实施方案中，多特异性可活化抗体中的至少一个AB是或衍生自表2中所列的抗体。
在一些实施方案中，选择掩蔽部分用于与特定抗体或抗体片段一起使用。例如，用于与结合EGFR的抗体一起使用的合适的掩蔽部分包括包含序列CISPRG (SEQ ID NO:164)的MM。通过非限制性实例的方式，MM可以包括序列诸如CISPRGC (SEQ ID NO:165)；CISPRGCG (SEQ ID NO:166)；CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO:167)；CISPRGCPDGPYVM (SEQID NO:168)，CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO:169)和CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO:170)。其他合适的掩蔽部分包括PCT公开号WO 2010/081173中公开的任何EGFR-特异性掩蔽物，诸如，通过非限制性实例的方式，
和/或
。
与结合Jagged靶标、例如Jagged 1和/或Jagged 2的抗体一起使用的合适的掩蔽部分包括，通过非限制性实例的方式，掩蔽部分，其包括序列，诸如
和/或
。
与结合白介素6靶标、例如白介素6受体(IL-6R)的抗体一起使用的合适的掩蔽部分包括，通过非限制性实例的方式，掩蔽部分，其包括序列，诸如
和/或
。
在一些实施方案中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的可切割部分(CM)包括可以充当蛋白酶(通常为胞外蛋白酶)的底物的氨基酸序列。CM可以基于由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与多特异性可活化抗体的至少一个AB的期望靶标共定位于组织中的肿瘤产生的蛋白酶进行选择。其中目标靶标由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与蛋白酶共定位的肿瘤产生的各种不同的条件是已知的，其中所述蛋白酶的底物是本领域已知的。在癌症的实例中，靶组织可以是癌组织，特别是实体瘤的癌组织。文献中报道，在许多癌症(例如，实体瘤)中具有已知底物的蛋白酶的水平增加。参见，例如，La Rocca等人,(2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421。疾病的非限制性实例包括：所有类型的癌症(乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、头颈癌、胰腺癌等)、类风湿性关节炎、克罗恩病、SLE、心血管损伤、缺血等。例如，适应症包括白血病，包括T-细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)，成淋巴细胞性疾病，包括多发性骨髓瘤，和实体瘤，包括肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌，包括三重阴性乳腺癌。例如，适应症包括骨疾病或癌转移，无论原发性肿瘤源；乳腺癌，包括，通过非限制性实例的方式，ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三重阴性乳腺癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；成胶质细胞瘤；头颈癌，诸如食管癌；肺癌，诸如，通过非限制性实例的方式，非小细胞肺癌；多发性骨髓瘤；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，诸如骨肉瘤；肾癌，诸如，通过非限制性实例的方式，肾细胞癌；和/或皮肤癌，诸如，通过非限制性实例的方式，鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑色素瘤。在一些实施方案中，癌症是鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是皮肤鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是食管鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是头颈鳞状细胞癌。在一些实施方案中，癌症是肺鳞状细胞癌。
CM被酶以约0.001-1500 x 104 M-1S-1或至少0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、7.5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、200、250、500、750、1000、1250或1500 x 104M-1S-1的速率特异性切割。
对于酶的特异性切割，进行酶和CM之间的接触。当包含与MM和CM偶联的AB的可活化抗体在靶标和足够的酶活性存在的情况下时，CM可以被切割。当至少包含与MM和CM偶联的第一AB的多特异性可活化抗体在靶标和足够的酶活性存在的情况下时，CM可以被切割。足够的酶活性可以是指酶与CM进行接触并实现切割的能力。可以容易设想，酶可以在CM的附近，但因为其他细胞因子或酶的蛋白修饰而不能切割。
示例性底物包括但不限于可被一种或多种表3中的以下酶或蛋白酶切割的底物：
例如，在一些实施方案中，底物可被以下酶或蛋白酶中的一种或多种切割：uPA、豆荚蛋白(legumain)、基质蛋白酶(matriptase)、ADAM17、BMP-1、TMPRSS3、TMPRSS4、MMP-9、MMP-12、MMP-13和/或MMP-14。在一些实施方案中，蛋白酶选自uPA、豆荚蛋白(legumain)和基质蛋白酶(matriptase)。在一些实施方案中，蛋白酶是基质金属蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶包含uPA。在一些实施方案中，蛋白酶包含豆荚蛋白(legumain)。在一些实施方案中，蛋白酶包含基质蛋白酶(matriptase)。
在一些实施方案中，选择CM与特定蛋白酶一起使用。在一些实施方案中，CM是选自以下的至少一种蛋白酶的底物：ADAM 17、BMP-1、半胱氨酸蛋白酶诸如组织蛋白酶、HtrA1、豆荚蛋白(legumain)、基质蛋白酶(MT-SP1)、基质金属蛋白酶(MMP)、中性粒细胞弹性蛋白酶、TMPRSS诸如TMPRSS3或TMPRSS4、凝血酶和u-型纤溶酶原激活物(uPA，也称为尿激酶)。
在一些实施方案中，CM是ADAM17的底物。在一些实施方案中，CM是BMP-1的底物。在一些实施方案中，CM是组织蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是HtrA1的底物。在一些实施方案中，CM是豆荚蛋白(legumain)的底物。在一些实施方案中，CM是基质蛋白酶(matriptase)的底物。在一些实施方案中，CM是MMP的底物。在一些实施方案中，CM是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是凝血酶的底物。在一些实施方案中，CM是TMPRSS的底物。在一些实施方案中，CM是TMPRSS3的底物。在一些实施方案中，CM是TMPRSS4的底物。在一些实施方案中，CM是uPA的底物。
在一些实施方案中，选择可切割部分与特定蛋白酶一起使用，所述蛋白酶例如已知由接近表达靶标的细胞的肿瘤产生和/或由与可活化抗体的靶标共定位的肿瘤产生的蛋白酶。例如，用于本公开的可活化抗体中的合适的可切割部分包括序列
和/或。
在一些实施方案中，CM是至少一种基质金属蛋白酶(MMP)的底物。MMP的实例包括MMP1；MMP2；MMP3；MMP7；MMP8；MMP9；MMP10；MMP11；MMP12；MMP13；MMP14；MMP15；MMP16；MMP17；MMP19；MMP20；MMP23；MMP24；MMP26；和MMP27。在一些实施方案中，CM是MMP9、MMP14、MMP1、MMP3、MMP13、MMP17、MMP11和MMP19的底物。在一些实施方案中，CM是MMP7的底物。在一些实施方案中，CM是MMP9的底物。在一些实施方案中，CM是MMP14的底物。在一些实施方案中，CM是两种或更多种MMP的底物。在一些实施方案中，CM是至少MMP9和MMP14的底物。在一些实施方案中，CM包含相同的MMP的两种或更多种底物。在一些实施方案中，CM包含至少两种或更多种MMP9底物。在一些实施方案中，CM包含至少两种或更多种MMP14底物。
在一些实施方案中，CM是MMP的底物，且包括序列
和/或。
在一些实施方案中，CM是凝血酶的底物。在一些实施方案中，CM是凝血酶的底物，且包括序列GPRSFGL (SEQ ID NO:896)或GPRSFG (SEQ ID NO:897)。
在一些实施方案中，CM包含选自以下的氨基酸序列：
和。
在一些实施方案中，CM是中性粒细胞弹性蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是丝氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是uPA的底物。在一些实施方案中，CM是豆荚蛋白(legumain)的底物。在一些实施方案中，CM是基质蛋白酶(matriptase)的底物。在一些实施方案中，CM是半胱氨酸蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM是半胱氨酸蛋白酶、诸如组织蛋白酶的底物。
在一些实施方案中，CM是CM1-CM2底物，且包括序列
和/或
。
在一些实施方案中，本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体和/或多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可以使用重组DNA技术和在真核或原核物种中表达来生物合成制备。对于可活化抗体和/或多特异性可活化抗体，编码掩蔽部分、接头序列(其可包括可切割部分(CM)和抗体链(重链或轻链))的cDNA可以5’至3’ (翻译产物的N-至C-末端)序列连接，以产生核酸构建体，其遵循常规抗体表达方法表达为可活化抗体蛋白和/或多特异性可活化抗体蛋白。在一些实施方案中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可以通过表达CM-抗体、然后在蛋白的N-末端处或附近化学偶联掩蔽物来半合成产生。在一些实施方案中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可以通过如下产生：表达抗体，然后在蛋白的N-末端处或附近化学偶联掩蔽物和CM，使得未切割状态下的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的至少一部分具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
适合用于本文所述的组合物的接头通常是提供修饰的AB或多特异性可活化抗体的柔性以促进至少第一AB与靶标的结合的抑制的接头。此类接头通常被称为柔性接头。合适的接头可以容易地选择，且可以具有任何合适的不同长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，且可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸长。
示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如，(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO:59)和(GGGS)n (SEQ ID NO:60)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对无结构，因此可能能够充当各组分之间的中性系链。甘氨酸获得比甚至丙氨酸显著更多的phi-psi空间，且比具有更长侧链的残基受到少得多的限制(参见Scheraga, Rev. Computational Chem.11173-142 (1992))。示例性柔性接头包括但不限于GGSG (SEQ ID NO:61)、GGSGG(SEQ ID NO:62)、GSGSG(SEQ ID NO:63)、GSGGG(SEQ IDNO:64)、GGGSG(SEQ ID NO:65)、GSSSG (SEQ ID NO:66)等。普通技术人员将认识到，可活化抗体的设计可以包括全部或部分柔性的接头，使得接头可以包括柔性接头以及赋予较少柔性结构的一个或多个部分，以提供期望的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体结构。
除了上述元件之外，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可以含有额外元件，诸如例如可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的N-或C-末端氨基酸序列。例如，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可以包括靶向部分，以促进递送至目标细胞或组织。可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可以与试剂缀合，所述试剂诸如治疗剂、可检测部分或诊断剂。本文公开了试剂的实例。
可活化抗体和/或多特异性可活化抗体还可以包括与本公开的可活化抗体和/或多特异性抗体结合的缀合的试剂、接头和本文所述的其他组分中的任一种，包括，通过非限制性实例的方式，表4中所列的任何试剂和/或表5和/或表6中所列的任何接头。
缀合的抗体、缀合的可活化抗体、缀合的多特异性抗体和缀合的多特异性可活化 抗体
在一些实施方案中，本公开的抗体和/或可活化抗体可以与试剂缀合，所述试剂诸如例如治疗剂、可检测部分或诊断剂。通过非限制性实例的方式，合适的治疗剂包括用于靶向T细胞衍生的淋巴瘤的治疗剂。通过非限制性实例的方式，合适的可检测剂包括荧光染料(例如荧光团、异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明异硫氰酸盐(TRITC)、Alexa Fluor®标记)，近红外(NIR)染料(例如，Qdot®纳米晶体)，胶体金属，半抗原，放射性标记，生物素和扩增试剂诸如链霉抗生物素蛋白或酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
可活化抗CD3ε抗体具有试剂的至少一个缀合点，但在本文提供的方法和组合物中，少于所有可能的缀合点可用于与试剂缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与链间二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与链间硫化物键的硫原子，但不是参与链内二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或含有硫原子的其他氨基酸残基的硫原子。此类残基可以天然存在于抗体结构中，或者可以通过定点诱变、化学转化或错误并入非天然氨基酸而并入抗体中。
还提供了制备具有AB中的一个或多个链间二硫键和MM中的一个或多个链内二硫键的可活化抗CD3ε抗体和与游离硫醇反应的药物的缀合物的方法。该方法通常包括用还原剂(诸如例如TCEP)部分还原可活化抗体中的链间二硫键；和将与游离巯基反应的药物与部分还原的可活化抗体缀合。如本文所用，术语部分还原是指其中可活化抗CD3ε抗体与还原剂接触且少于所有二硫键，例如少于所有可能的缀合位点被减少的情况。在一些实施方案中，少于99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或少于5％的所有可能的缀合位点被还原。
在还有其他实施方案中，提供了将试剂例如药物还原和缀合至可活化抗CD3ε抗体、导致试剂放置的选择性的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原可活化抗CD3ε抗体，使得可活化抗体的掩蔽部分或其他非AB部分中的任何缀合位点不被还原，并将该试剂缀合至AB中的链间巯基。选择缀合位点以便允许试剂的期望放置，以允许在期望的位点发生缀合。还原剂例如为TCEP。通过鉴定产生其中MM保留有效和高效地掩蔽未切割状态下的可活化抗体的AB的能力的缀合的可活化抗体的条件来确定还原反应条件，诸如例如还原剂与可活化抗体的比率，孵育时间，孵育期间的温度，还原反应溶液的pH等。还原剂与可活化抗CD3ε抗体的比率将根据可活化抗体而变化。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗CD3ε抗体的比率将范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
在一些实施方案中，提供了还原可活化抗CD3ε抗体的AB中的链间二硫键和将试剂(例如，含巯基的试剂，诸如药物)缀合至所得链间巯基以将试剂选择性定位在AB上的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原AB以形成至少两个链间巯基，而不在可活化抗体中形成所有可能的链间巯基；和将所述试剂缀合至部分还原的AB的链间巯基。例如，以还原剂:可活化抗体的期望比率将可活化抗体的AB在约37℃下部分还原约1小时。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率将范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
含巯基的试剂可以是例如半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸。还原剂可以是例如TCEP。在一些实施方案中，可以在缀合之前使用例如柱色谱、透析或渗滤纯化还原的可活化抗体。在一些实施方案中，在部分还原后和缀合之前不纯化还原的抗体。
本公开还提供了部分还原的可活化抗CD3ε抗体，其中可活化抗体中的至少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰可活化抗体中的任何链内二硫键，其中可活化抗体包括特异性结合CD3ε靶标的抗体或其抗原结合片段(AB)，抑制未切割状态下的可活化抗体的AB与CD3ε靶标的结合的掩蔽部分(MM)，和与AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是功能为蛋白酶的底物的多肽。在一些实施方案中，MM经由CM与AB偶联。在一些实施方案中，可活化抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，可活化抗体内的MM的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，未切割状态下的可活化抗体具有如下的从N-端至C-端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。在一些实施方案中，还原剂是TCEP。
本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至任何AB区域中的一个或多个半胱氨酸残基，而不损害多特异性可活化抗体的活性(例如，掩蔽、活化或结合活性)。在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使得能够将一种或多种试剂连接至任何AB区域中的一个或多个半胱氨酸残基，而不减少或以其他方式干扰任何MM内的一个或多个二硫键。本文提供的组合物和方法产生多特异性可活化抗体，其与一种或多种试剂，例如多种治疗剂、诊断剂和/或预防剂中的任一种缀合，优选没有任何试剂与多特异性可活化抗体的任何MM缀合。本文提供的组合物和方法产生缀合的多特异性可活化抗体，其中每个MM保留有效且高效地掩蔽未切割状态下的多特异性可活化抗体的其相应AB的能力。本文提供的组合物和方法产生缀合的多特异性可活化抗体，其中可活化抗体在可切割CM的蛋白酶存在的情况下仍被活化，即切割。
多特异性可活化抗体具有试剂的至少一个缀合点，但在本文提供的方法和组合物中，少于所有可能的缀合点可用于与试剂缀合。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与链间二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是参与链间硫化物键的硫原子，但不是参与链内二硫键的硫原子。在一些实施方案中，一个或多个缀合点是半胱氨酸或含有硫原子的其他氨基酸残基的硫原子。此类残基可以天然存在于抗体结构中，或者可以通过定点诱变、化学转化或错误并入非天然氨基酸而并入抗体中。
还提供了制备具有一个或多个AB中的一个或多个链间二硫键和相应MM中的一个或多个链内二硫键的多特异性可活化抗体和与游离硫醇反应的药物的缀合物的方法。该方法通常包括用还原剂(诸如例如TCEP)部分还原可活化抗体中的链间二硫键；和将与游离巯基反应的药物与部分还原的可活化抗体缀合。如本文所用，术语部分还原是指其中多特异性可活化抗体与还原剂接触且少于所有二硫键，例如少于所有可能的缀合位点被还原的情况。在一些实施方案中，少于99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%或少于5％的所有可能的缀合位点被还原。
在还有其他实施方案中，提供了将试剂例如药物还原和缀合至多特异性可活化抗体、导致试剂放置的选择性的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原多特异性可活化抗体，使得可活化抗体的掩蔽部分或其他非AB部分中任一种的任何缀合位点不被还原，和将该试剂缀合至多特异性可活化抗体的一个或多个AB区域中的链间巯基。选择缀合位点以便允许试剂的期望放置，以允许在期望的位点发生缀合。还原剂例如为TCEP。通过鉴定产生其中MM保留有效且高效地掩蔽未切割状态下的可活化抗体的AB的能力的缀合的可活化抗体的条件来确定还原反应条件，诸如例如还原剂与可活化抗体的比率，孵育时间，孵育期间的温度，还原反应溶液的pH等。还原剂与多特异性可活化抗体的比率将根据可活化抗体而变化。在一些实施方案中，还原剂与多特异性可活化抗体的比率将范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
在一些实施方案中，提供了还原多特异性可活化抗体的一个或多个AB区域中的链间二硫键和将试剂(例如，含巯基的试剂，诸如药物)缀合至所得链间巯基以将试剂选择性定位在AB上的方法。该方法通常包括用还原剂部分还原一个或多个AB区域以形成至少两个链间巯基，而不在可活化抗体中形成所有可能的链间巯基；和将所述试剂缀合至部分还原的AB的链间巯基。例如，以还原剂:可活化抗体的期望比率将多特异性可活化抗体的一个或多个AB区域在约37℃下部分还原约1小时。在一些实施方案中，还原剂与可活化抗体的比率将范围为约20:1至1:1、约10:1至1:1、约9:1至1:1、约8:1至1:1、约7:1至1:1、约6:1至1:1、约5:1至1:1、约4:1至1:1、约3:1至1:1、约2:1至1:1、约20:1至1:1.5、约10:1至1:1.5、约9:1至1:1.5、约8:1至1:1.5、约7:1至1:1.5、约6:1至1:1.5、约5:1至1:1.5、约4:1至1:1.5、约3:1至1:1.5、约2:1至1:1.5、约1.5:1至1:1.5或约1:1至1:1.5。在一些实施方案中，比率在约5:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约5:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约4:1至1.5:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约8:1至约1:1的范围内。在一些实施方案中，比率在约2.5:1至1:1的范围内。
含巯基的试剂可以是例如半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸。还原剂可以是例如TCEP。在一些实施方案中，可以在缀合之前使用例如柱色谱、透析或渗滤纯化还原的可活化抗体。在一些实施方案中，在部分还原后和缀合之前不纯化还原的抗体。
本公开还提供了部分还原的多特异性可活化抗体，其中多特异性可活化抗体中的至少一个链间二硫键已用还原剂还原，而不干扰多特异性可活化抗体中的任何链内二硫键，其中多特异性可活化抗体包括特异性结合靶标的至少第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，抑制未切割状态下的多特异性可活化抗体的AB1与靶标的结合的第一掩蔽部分(MM1)，和与AB1偶联的第一可切割部分(CM1)，其中所述CM1是功能为蛋白酶的底物的多肽，和特异性结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)。在一些实施方案中，MM1经由CM1与AB1偶联。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，多特异性可活化抗体内的MM1的一个或多个链内二硫键不被还原剂干扰。在一些实施方案中，还原剂是TCEP。
本公开还涉及免疫缀合物，其包含与细胞毒性剂诸如毒素(例如，细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，或其片段)或放射性同位素(即，放射性缀合物)缀合的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体。用于靶向患病T细胞诸如T细胞来源的淋巴瘤的合适的细胞毒性剂包括例如多拉司他汀和其衍生物(例如，阿里他汀E、AFP、MMAD、MMAF、MMAE)。例如，细胞毒性剂是单甲基阿里他汀E (MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E (MMAD)。在一些实施方案中，试剂是选自表4中所列的试剂。在一些实施方案中，试剂是多拉司他汀。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是阿里他汀E或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀E(MMAE)。在一些实施方案中，试剂是单甲基阿里他汀D (MMAD)。在一些实施方案中，试剂是类美登素或类美登素衍生物。在一些实施方案中，试剂是DM1或DM4。在一些实施方案中，试剂是倍癌霉素(duocarmycin)或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是卡奇霉素或其衍生物。在一些实施方案中，试剂是吡咯并苯并二氮杂。
可使用的酶活性毒素和其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、朔莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美国商陆(Phytolaca Americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、mitogellin、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢霉烯类(tricothecenes)。各种放射性核素可用于制备放射性缀合的抗体。实例包括212Bi、64Cu、125I、131I、131In、99mTc、90Y、186Re和89Zr。
抗体和细胞毒性剂的缀合物使用各种双官能蛋白偶联剂制备，所述双官能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸盐(SPDP)、亚氨基硫杂环戊烷(thiolane) (IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二甲基己二酰亚胺酸酯HCL)、活性酯(诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双-叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(诸如双-(对重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯类(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人, Science 238: 1098 (1987)中所述制备。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是将放射性核素(radionucleotide)与抗体缀合的示例性螯合剂。(参见WO94/11026)。
表4列举了可用于本文所述的公开内容的一些示例性的药剂，但其绝不意指为详尽的列表。
本领域普通技术人员将认识到，很多可能的部分可与本公开的所得抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体偶联。(参见例如“ConjugateVaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse和R. E.Lewis, Jr (编辑), Carger Press, New York, (1989)，其完整内容通过引用并入本文)。
偶联可通过结合两个分子的任何化学反应进行，只要抗体和另一部分保持它们各自的活性。该键可包括许多化学机制，例如共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合和络合。然而在一些实施方案中，优选的结合是共价结合。共价结合可通过现有侧链的直接缩合或通过并入外部的桥接分子实现。许多二价或多价连接剂可用于将蛋白分子，诸如本公开的抗体，与其他分子偶联。例如，代表性的偶联剂可包括有机化合物，诸如硫代酸酯、碳二亚胺、琥珀酰亚胺酯、二异氰酸酯、戊二醛、重氮苯和六亚甲基二胺。该列表不意欲穷尽本领域已知的各种类别的偶联剂，而是较常见偶联剂的例示。(参见Killen和Lindstrom, Jour.Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen等人, Immunological Reviews 62:185-216(1982);和Vitetta等人, Science 238:1098 (1987)。
在一些实施方案中，除了本文提供的组合物和方法以外，缀合的可活化抗体还可通过插入或以其他方式包括在可活化抗体序列中的修饰的氨基酸序列，经修饰用于位点特异性缀合。这些修饰的氨基酸序列经设计以允许在缀合的可活化抗体内受控的放置和/或给药缀合的试剂。例如，可活化抗体可经工程改造以在轻链和重链的位置上包括半胱氨酸取代，其提供反应性巯基和不负面影响蛋白折叠和装配，也不改变抗原结合。在一些实施方案中，可活化抗体可经工程改造以在可活化抗体内包括或以其他方式引入一个或多个非天然氨基酸残基，以提供用于缀合的合适位点。在一些实施方案中，可活化抗体可经工程改造以在可活化抗体序列内包括或以其他方式经酶促引入可活化肽序列。
合适的接头描述于文献中(参见例如Ramakrishnan, S.等人, Cancer Res. 44:201-208 (1984)，描述使用MBS (M-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)。也参见美国专利号5,030,719，描述使用通过寡肽接头与抗体偶联的卤代乙酰基酰肼衍生物。特别合适的接头包括：(i) SMPT (4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-联硫基)-甲苯(Pierce Chem. Co., 目录号(21558G)；(ii) SPDP (琥珀酰亚胺基-6 [3-(2-吡啶基联硫基)丙酰胺基]己酸酯(Pierce Chem. Co., 目录号21651G)；和(iii) 磺基-LC-SPDP (磺基琥珀酰亚胺基6 [3-(2-吡啶基联硫基)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem. Co. 目录号2165-G。额外的接头包括但不限于SMCC、磺基-SMCC、SPDB或磺基-SPDB。
上述接头含有具有不同属性的元件，因此产生具有不同物理化学性质的缀合物。例如，接头SMPT含有空间阻碍的二硫键，且可形成具有增加的稳定性的缀合物。二硫键通常比其他键更不稳定，因为二硫键被体外切割，导致较少的可获得缀合物。
以羧酸和伯胺或仲胺开始，试剂EDC (1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐可用于产生羧酰胺。因此，EDC可用于连接抗体中的赖氨酸残基与接头或毒素中的羧酸，或连接抗体中的天冬氨酸或谷氨酸残基与接头或毒素中的胺。此类利用EDC的缀合反应可通过加入NHS (N-羟基琥珀酰亚胺)或磺基-NHS (N-羟基-3-氧基磺酰基琥珀酰亚胺)而增强。加入NHS或磺基-NHS至此类缀合反应中可增强缀合反应的速率、完全性、选择性和/或再现性。
在一些实施方案中，接头是可切割的。在一些实施方案中，接头是不可切割的。在一些实施方案中，存在两个或更多个接头。所述两个或更多个接头全都相同，例如是可切割的或不可切割的，或所述两个或更多个接头是不同的，例如至少一个可切割且至少一个不可切割。
本公开利用几种方法来将试剂连接至抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的Ab：(a) 连接至AB的碳水化合物部分，或(b) 连接至AB的巯基，或(c) 连接至AB的氨基，或(d) 连接至AB的羧酸基团。根据本公开，AB可通过具有至少两个反应性基团的中间体接头共价连接至试剂，一个基团与AB反应和一个基团与所述试剂反应。可包括任何相容的有机化合物的接头可经选择使得与AB (或试剂)的反应不会不利地影响AB的反应性和选择性。此外，连接接头至试剂，可能不破坏试剂的活性。对于与氧化的抗体或氧化的抗体片段反应，合适的接头包括含有胺的那些，所述胺选自伯胺、仲胺、肼、酰肼、羟胺、苯肼、氨基脲和氨基硫脲基团。此类反应性官能团可作为接头结构的部分存在，或可通过不含此类基团的接头的合适化学修饰引入。
根据本公开，用于连接至抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的还原的AB的合适的接头包括具有能够与还原抗体或片段的巯基反应的某些反应性基团的那些。此类反应性基团包括但不限于：反应性卤代烷基(包括例如，卤代乙酰基)、对汞基苯甲酸基团和能够Michael-型加成反应的基团(包括例如，马来酰亚胺和Mitra和Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110描述的类型的基团)。
根据本公开，用于连接至抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的非氧化也非还原的AB的合适的接头包括具有能够与存在于AB的未经修饰的赖氨酸残基中的伯氨基反应的某些官能团的那些。此类反应性基团包括但不限于NHS羧酸或碳酸酯、磺基-NHS羧酸或碳酸酯、4-硝基苯基羧酸或碳酸酯、五氟苯基羧酸或碳酸酯、酰基咪唑、异氰酸酯和异硫氰酸酯。
根据本公开，用于连接至非氧化也非还原的AB的合适的接头包括具有能够与存在于AB的天冬氨酸或谷氨酸残基中的羧酸基团反应的某些官能团的那些，所述羧酸基团已被合适的试剂活化。合适的活化试剂包括EDC (具有或不具有加入的NHS或磺基-NHS)和用于羧酰胺形成的其他脱水剂。这些实例中，存在于合适的接头中的官能团包括伯胺和仲胺、肼、羟胺和酰肼。
所述试剂可在接头与AB连接之前或之后与接头连接。在某些应用中，首先产生AB-接头中间体可能是需要的，其中接头不包含相关的试剂。根据具体的应用，特定的试剂可然后与接头共价连接。在其他实施方案中，AB首先与MM、CM和相关的接头连接，且然后与用于缀合目的的接头连接。
分支接头：在特定的实施方案中，利用具有多个试剂连接位点的分支接头。对于多位点接头，与AB的单一共价连接将产生能够在多个位点上结合试剂的AB-接头中间体。所述位点可以是醛基团或巯基或试剂可连接的任何化学位点。
在一些实施方案中，通过在AB的多个位点上连接单一位点接头，可获得较高的特异活性(或较高的试剂:AB比)。通过两种方法的任一种，该多个位点可引入AB中。第一，可在同一AB上产生多个醛基团和/或巯基。第二，可连接AB的醛或巯基与具有用于随后连接接头的多个功能位点的"分支接头"。分支接头或多位点接头的功能位点可以是醛基团或巯基，或可以是接头可连接的任何化学位点。还更高的特异活性可通过组合这两种方法获得，即在AB的数个位点上连接多位点接头。
可切割的接头：在本公开的一个实施方案中，可使用易于被补体系统的酶(诸如但不限于尿激酶、组织纤溶酶原激活物、胰蛋白酶、纤溶酶或具有蛋白水解活性的另一种酶)切割的肽接头。根据本公开的一种方法，试剂经由对补体切割敏感的接头连接。抗体选自可活化补体的类别。因此，抗体-试剂缀合物活化补体级联且在靶标位点上释放试剂。根据本公开的另一种方法，试剂经由易于被具有蛋白水解活性的酶(例如尿激酶、组织纤溶酶原激活物、纤溶酶或胰蛋白酶)切割的接头连接。这些可切割的接头可用于缀合的可活化抗体，其包括胞外毒素，例如通过非限制性实例的方式的表4中所示的任何胞外毒素。
可切割的接头序列的非限制性实例提供于表5中。
此外，试剂可经由二硫键(例如半胱氨酸分子上的二硫键)与AB连接。因为许多肿瘤天然释放高水平的谷胱甘肽(还原剂)，所以这可还原二硫键，随后在递送位点上释放试剂。在某些具体的实施方案中，修饰CM的还原剂也将修饰缀合的可活化抗体的接头。
间隔区和可切割的元件：在又另一个实施方案中，以使得优化试剂和可活化抗体的AB之间的间隔的方式构建接头可能是必需的。这可通过使用以下通式结构的接头实现：
W – (CH2)n – Q
其中
W是--NH--CH2--或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；且
n是0-20的整数。
在还有其他实施方案中，接头可包含间隔区元件和可切割的元件。间隔区元件用于定位可切割的元件远离AB的核心，使得可切割的元件更易接近负责切割的酶。上述的某些分支接头可用作间隔区元件。
在整个讨论中，应理解接头与试剂(或间隔区元件与可切割的元件、或可切割的元件与试剂)的连接不需要是特定的连接或反应模式。提供具有合适的稳定性和生物相容性的产物的任何反应都是可接受的。
血清补体和接头选择：根据本公开的一种方法，当需要试剂释放时，使用作为可活化补体的类型的抗体的AB。所得缀合物同时保留结合抗原和活化补体级联的能力。因此，根据本公开的该实施方案，试剂连接可切割的接头或可切割的元件的一个末端，且接头基团的另一末端与AB上的特定位点连接。例如，如果试剂具有羟基或氨基，其可与肽、氨基酸或其他合适选择的接头的羧基末端分别经由酯或酰胺键连接。例如，此类试剂可与接头肽经由碳二亚胺反应连接。如果试剂含有会干涉接头连接的官能团，这些干涉官能团可在连接之前被封闭且在产物缀合物或中间体制备后解封闭。接头的相对或氨基端然后直接或在进一步修饰后用于结合能够活化补体的AB。
接头(或接头的间隔区元件)可具有任何需要的长度，其一个末端可与可活化抗体的AB的特定位点共价连接。接头或间隔区元件的另一末端可与氨基酸或肽接头连接。
因此，当这些缀合物在补体的存在下结合抗原时，连接试剂与接头的酰胺或酯键将被切割，导致释放呈其活性形式的试剂。这些缀合物当施用于主体时，将在靶标位点上实现试剂的递送和释放，且对于药剂、抗生素、抗代谢物、抗增殖药等(如在表4中(但不限于此)提供的那些)的体内递送特别有效。
用于无补体活化下的释放的接头：在靶向递送的又一种应用中，无补体活化的试剂释放是需要的，因为补体级联的活化将最终溶解靶细胞。因此，当试剂的递送和释放应在不杀死靶细胞的情况下实现时该方法是有用的。这是当需要递送细胞介质诸如激素、酶、皮质类固醇、神经递质、基因或酶至靶细胞时的目标。这些缀合物可通过将试剂与不能活化补体的AB经由接头连接制备，所述接头对通过血清蛋白酶的切割轻度敏感。当将该缀合物施用于个体时，抗原-抗体复合物将快速形成，而试剂的切割将缓慢发生，因此导致在靶标位点上释放化合物。
生物化学交叉接头：在其他实施方案中，使用某些生物化学交叉接头，可活化抗体可与一种或多种治疗剂缀合。交叉连接试剂形成分子桥，其将两个不同分子的官能团系在一起。为了以逐步方式连接两个不同的蛋白，可使用杂-双官能交叉-接头，其排除不需要的均聚物形成。
还可使用通过溶酶体蛋白酶可切割的肽基接头，例如Val-Cit、Val-Ala或其他二肽。此外，可使用在溶酶体的低pH环境中可切割的酸不稳定性接头，例如：双-唾液酸醚。其他合适的接头包括组织蛋白酶不稳定性底物，特别是在酸性pH下显示最佳功能的那些。
示例性的杂-双官能交叉-接头在表6中提及。
不可切割的接头或直接连接：在本公开的还有其他实施方案中，缀合物可经设计，使得所述试剂被递送至靶标而不释放。这可通过将试剂与AB直接或经由不可切割的接头连接实现。
这些不可切割的接头可包括氨基酸、肽、D-氨基酸或可经修饰以包括可随后用于通过本文所述的方法连接AB的官能团的其他有机化合物。此类有机接头的通式可以是
W – (CH2)n – Q
其中
W是--NH--CH2--或--CH2--；
Q是氨基酸、肽；且
n是0-20的整数。
不可切割的缀合物：在一些实施方案中，化合物可与不活化补体的AB连接。当使用不能补体活化的AB时，该连接可使用对活化的补体的切割敏感的接头或使用对活化的补体的切割不敏感的接头来实现。
本文公开的抗体还可被配制为免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知的方法制备，诸如Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等人, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980);和美国专利号4,485,045和4,544,545中描述的方法。具有提高的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556。
特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发方法产生。脂质体通过限定孔径的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。本公开的抗体的Fab’片段可按Martin等人, J. Biol. Chem.,257: 286-288 (1982)中所述，经由二硫化物交换反应与脂质体缀合。
具有非结合空间部分或非结合空间部分的结合配偶体的可活化抗体和多特异性 可活化抗体
本公开还提供包括非结合空间部分(NB)或非结合空间部分的结合配偶体(BP)的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体，其中BP募集或以其他方式吸引NB至可活化抗体和/或多特异性可活化抗体。本文提供的可活化抗体包括例如，包括非结合空间部分(NB)、可切割接头(CL)和结合第一靶标或表位的抗体或抗体片段(AB)的可活化抗体；包括非结合空间部分的结合配偶体(BP)、CL和AB的多特异性可活化抗体；和包括NB所募集的BP、CL和结合第一靶标或表位的AB的多特异性可活化抗体。本文提供的多特异性可活化抗体包括例如，包括非结合空间部分(NB)、可切割接头(CL)和结合第一靶标或表位的至少第一抗体或抗体片段(AB1)的多特异性可活化抗体；包括非结合空间部分的结合配偶体(BP)、CL和AB1的多特异性可活化抗体；和包括NB所募集的BP、CL和结合第一靶标或表位的AB1的多特异性可活化抗体。其中NB与CL和AB共价连接或通过与CL和AB共价连接的BP相互作用而缔合的可活化抗体在本文被称为“含有NB的可活化抗体”。其中NB与CL和AB1共价连接或通过与CL和AB1共价连接的BP相互作用而缔合的多特异性可活化抗体在本文被称为“含有NB的多特异性可活化抗体”。可活化或可变换的是指可活化抗体当可活化抗体在抑制、掩蔽或未切割状态(即，第一构象)时，显示与靶标的第一结合水平，且当可活化抗体在未抑制、未掩蔽和/或切割状态(即，第二构象，即，活化的抗体)时显示与靶标的第二结合水平，其中第二靶标结合水平大于第一靶标结合水平。与常规抗体疗法相比，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体组合物可显示增加的生物利用度和更有利的生物分布。
在一些实施方案中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体提供降低的毒性和/或不利的副作用，如果可活化抗体和/或多特异性可活化抗体未被掩蔽或以其他方式抑制免于结合非治疗部位和/或非诊断部位，所述毒性和/或副作用否则可因在此部位上可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的结合而产生。
包括非结合空间部分(NB)的抗CD3ε可活化抗体可使用PCT公开号WO 2013/192546(其内容在此以其整体通过引用并入)中所述的方法制备。
抗CD3ε、可活化抗体、多特异性抗体和多特异性可活化抗体的用途
应理解，本公开的治疗实体的施用将与合适的载体、赋形剂和并入制剂中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其他试剂一起施用。大多数合适的制剂可见于所有制药化学家已知的药典：Remington's Pharmaceutical Sciences (第15版, Mack PublishingCompany, Easton, PA (1975))，特别是其中Blaug, Seymour的第87章。这些制剂包括例如，粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂聚乙二醇(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。任何前述的混合物可适合于本公开的治疗和疗法，条件是制剂中的活性成分未被制剂失活和制剂与施用途径在生理学上是相容和耐受的。对于与制药化学家众所周知的制剂、赋形剂和载体相关的其他信息，还参见Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need forpreclinical guidance” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)；Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals” Int. J.Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)；Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oraldrug delivery-some emerging concepts” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)；Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm SciTechnol. 52:238-311 (1998)和其中的引文。
在一个实施方案中，本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用作治疗剂。此类试剂通常用于诊断、预测、监测、治疗、减轻和/或预防主体的疾病或病理。使用标准方法通过鉴定主体例如患有病症(或处于发生病症的风险)的人患者或其他哺乳动物，进行治疗方案。将抗CD3ε抗体和/或可活化抗体制剂施用于主体，且通常将具有由于其与CD3ε的结合导致的作用。将多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体制剂，例如在一些实施方案中，对其两种或更多种靶抗原具有高特异性和高亲和力的制剂，施用于主体和其通常由于其与靶标结合而具有效果。施用抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可经由接合T细胞上的CD3ε来活化T细胞。施用抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可激动、刺激、活化和/或增强CD3介导的T细胞活化。
通常，缓解或治疗疾病或病症包括减轻与所述疾病或病症相关的一个或多个症状或医学问题。例如，在癌症的情况下，治疗有效量的药物可实现以下方面的一个或其组合：减少癌细胞数；减少肿瘤大小；抑制(即，在某种程度上降低和/或终止)癌细胞侵润至周围器官；抑制肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解与癌症相关的一个或多个症状。在一些实施方案中，本公开的组合物可用于预防主体(例如，人或其他哺乳动物诸如非人灵长类动物、伴侣动物(例如，猫、狗、马)、家畜、耕畜或动物园动物)的疾病或病症的发作或复发。术语主体和患者在本文可互换使用。
治疗有效量的本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体通常涉及实现治疗目标所需要的量。如上文所述，这可以是抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体和其靶抗原之间的结合相互作用，其在某些情况下激动、刺激、活化和/或增强CD3介导的T细胞活化。此外，施用所需的量将取决于抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体对其特定抗原的结合亲和力，且还将取决于施用的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体从其所施用的自由体积其他主体中耗尽的速度。本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或抗体片段和/或多特异性可活化抗体的治疗有效剂量的常见范围可以是通过非限制性实例的方式的约0.01 µg/kg体重至约10 mg/kg体重。在一些实施方案中，本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或抗体片段和/或多特异性可活化抗体的治疗有效剂量可以是通过非限制性实例的方式的约0.01 mg/kg体重至约5-10 mg/kg体重。常见的给药频率范围可以是例如每天两次至每周一次。
结合用于诊断或治疗特定病症的任何已知的方法，确定治疗的有效性。用于筛选具有所需特异性的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的方法包括但不限于酶联免疫吸附测定法(ELISA)和本领域内已知的其他免疫学介导的技术。
在另一个实施方案中，针对两种或更多种靶标的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体用于本领域中已知的涉及靶标的定位和/或定量的方法(例如，用于测量合适的生理学样品中一种或多种靶标的水平，用于诊断方法，用于将蛋白成像等)。在一个给定实施方案中，针对两种或更多种靶标的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体，或其含有抗体衍生的抗原结合结构域的衍生物、片段、类似物或同源物，用作药理学活性化合物(下文称为“治疗剂”)。
在另一个实施方案中，针对两种或更多种靶标的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体用于通过标准技术，诸如免疫亲和力、色谱或免疫沉淀分离一种或多种靶标。针对两种或更多种靶标(或其片段)的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体在诊断上用于监测组织中的蛋白水平，作为临床检验程序的一部分，例如，以检测给定治疗方案的效力。可通过偶联(即，物理连接)抗体与可检测物质促进检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三吖嗪基胺荧光素、丹酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；和合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
在又另一个实施方案中，针对两种或更多种靶标的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用作检测样品中一种或多种靶标(或其片段)的存在的试剂。在一些实施方案中，抗体含有可检测标记。抗体是多克隆的，或在一些实施方案中，是单克隆的。使用完整抗体或其片段(例如Fab、scFv或F(ab)2)。对于探针或抗体，术语“标记的”意欲包括通过偶联(即物理连接)可检测的物质与探针或抗体直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂的反应性间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，和用生物素末端标记抗体使得其可用荧光标记的链霉亲和素检测。术语“生物样品”意欲包括自主体分离的组织、细胞和生物流体，以及在主体内存在的组织、细胞和流体。因此，血液和血液级分或组分(包括血清、血浆或淋巴)包括在术语“生物样品”的用法内。即，本公开的检测方法可用于体外以及体内检测生物样品中的蛋白。例如，用于检测分析物蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。用于进行免疫测定的程序描述于例如“ELISA: Theory andPractice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (编辑) HumanPress, Totowa, NJ, 1995；“Immunoassay”, E. Diamandis和T. Christopoulus,Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996；和“Practice and Theory of EnzymeImmunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985。此外，用于检测分析物蛋白的体内技术包括将标记的抗分析物蛋白抗体引入主体。例如，抗体可用放射性标记物进行标记，在主体中所述标记物的存在和位置可通过标准成像技术检测。
本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于各种诊断性和预防性制剂。在一个实施方案中，将抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体施用于处于发生一种或多种前述病症的风险的患者。患者或器官对一种或多种病症的素因可使用基因型、血清学或生物化学标记物确定。
在本公开的另一个实施方案中，将抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体施用于诊断患有与一种或多种前述病症相关的临床适应症的人个体。在诊断后，施用抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体以减轻或逆转临床适应症的影响。
抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于检测患者样品中的一种或多种靶标且因此可用作诊断剂。例如，本公开的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体用于体外测定法，例如，ELISA，以检测患者样品中的一种或多种靶标水平。
在一个实施方案中，抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体固定在固体支持物(例如，微量滴定板的孔)上。固定的抗体和/或可活化抗体用作测试样品中可存在的任何靶标的捕获抗体。将固定的抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或固定的多特异性可活化抗体与患者样品接触之前，将固体支持物清洗，和用封闭试剂诸如乳蛋白或白蛋白处理以防止分析物的非特异性吸附。
随后，将孔用疑似含有抗原的测试样品或用含有标准量的抗原的溶液处理。此样品是例如来自疑似具有被认为是病理诊断的循环抗原水平的主体的血清样品。在洗去测试样品或标准品后，固体支持物用可检测标记的第二抗体处理。标记的第二抗体用作检测抗体。测量可检测标记的水平，测试样品中靶抗原的浓度通过与自标准样品产生的标准曲线相比较来测定。
应理解，基于在体外诊断测定法中使用抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体获得的结果，可能基于靶抗原的表达水平将主体的疾病分期。对于给定的疾病，从诊断为处于疾病进展中的各种阶段和/或处于疾病的治疗处理中的各个点的主体获取血液样品。使用对进展或治疗的各阶段提供统计学显著结果的一组样品，指定可被认为是各阶段的特征的抗原的浓度范围。
抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于诊断和/或成像方法。在一些实施方案中，此类方法为体外方法。在一些实施方案中，此类方法为体内方法。在一些实施方案中，此类方法为原位方法。在一些实施方案中，此类方法为离体方法。例如，具有酶促可切割的CM的多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体可用于检测能够切割CM的酶的存在或不存在。此类可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可用于诊断，其可包括通过在给定宿主生物体的给定细胞或组织中测量的多特异性活化抗体(即，由可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的切割所产生的抗体)的积聚，体内检测(例如定性或定量)酶活性(或者在一些实施方案中，还原电位增加的环境，诸如其可提供二硫键的还原)。活化的多特异性抗体的此类积聚不仅表明所述组织表达酶活性(或增加的还原电位，取决于CM的性质)，而且还表明所述组织表达活化的抗体结合的至少一种靶标。
例如，可选择CM为在肿瘤部位处、在病毒或细菌感染部位处、在生物学限制的部位处(诸如在脓肿中、在器官中等)等存在的蛋白酶的蛋白酶底物。至少一个AB可以是结合靶抗原的AB。使用本领域技术人员熟悉的方法，可检测的标记(例如荧光标记或放射性标记或放射性示踪剂)可与AB或多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的其他区域缀合。合适的可检测的标记在上述筛选方法的文中进行讨论，且其他具体的实例在下文提供。使用对疾病状态的蛋白或肽特异性的至少一个AB以及在目标疾病组织中其活性升高的蛋白酶，可活化抗体将表现出相对于其中CM特异性的酶不以可检测的水平存在或以比在疾病组织中低的水平存在或无活性(例如，呈酶原形式或与抑制剂复合)的组织，对疾病组织的结合率增加。因为小的蛋白和肽从血液中通过肾过滤系统快速清除，且因为对CM特异性的酶不以可检测的水平存在(或在非疾病组织中以较低水平存在或以无活性构象存在)，在疾病组织中活化的多特异性抗体的积聚相对于非疾病组织提高。
在另一个实例中，可活化抗体和/或可活化多特异性抗体可用于检测样品中切割剂的存在或不存在。例如，在可活化抗体和/或多特异性可活化抗体含有对酶切割敏感的CM的情况下，多特异性可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中酶的存在。在另一个实例中，在可活化抗体和/或多特异性可活化抗体含有对还原剂切割敏感的CM的情况下，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可用于检测(定性地或定量地)样品中还原条件的存在。为了便于在这些方法中分析，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可经可检测标记，且可结合至支持物(例如，固体支持物，诸如载片或珠粒)。可检测的标记可置于在切割后不释放的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的部分上，例如可检测的标记可以是直到发生切割时才可检测的猝灭的荧光标记或其他标记。测定法可如下进行：例如通过使固定的可检测标记的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体与疑似含有酶和/或还原剂的样品接触足以发生切割的一段时间，然后洗涤以除去过量的样品和污染物。然后通过在与样品接触之前可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的可检测信号的变化，例如由于样品中的切割剂切割可活化抗体和/或多特异性可活化抗体导致的可检测信号的存在和/或增加，评价在样品中切割剂(例如酶或还原剂)的存在或不存在。
此类检测方法可适合于还提供当切割时能够结合多特异性可活化抗体的至少一个AB的靶标的存在或不存在的检测。因此，所述测定法可适合于评价切割剂的存在或不存在和目标靶标的存在或不存在。切割剂的存在或不存在可通过上述多特异性可活化抗体的可检测的标记的存在和/或增加来检测，且靶标的存在或不存在可通过检测靶标-AB复合物，例如通过使用可检测标记的抗靶标抗体来检测。
可活化抗体和/或多特异性可活化抗体还可用于原位成像以验证可活化抗体活化(例如通过蛋白酶切割)和与特定靶标的结合。原位成像是能够在生物样品诸如细胞培养物或组织切片中定位蛋白水解活性和靶标的技术。使用该技术，可能基于可检测的标记(例如荧光标记)的存在证实与给定靶标的结合和蛋白水解活性两者。
这些技术可用于源自疾病部位(例如肿瘤组织)或健康组织的任何冷冻细胞或组织。这些技术还可用于新鲜细胞或组织样品。
在这些技术中，可活化抗体和/或多特异性可活化抗体用可检测的标记进行标记。可检测的标记可以是荧光染料(例如荧光团、异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸若丹明(TRITC)、Alexa Fluor®标记)、近红外(NIR)染料(例如Qdot®纳米晶体)、胶体金属、半抗原、放射性标记物、生物素和放大试剂例如链霉亲和素或酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)。
已与标记的多特异性可活化抗体孵育的样品中标记的检测表明，样品含有靶标和含有对可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的CM特异性的蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶的存在可使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文描述的那些和/或通过使用对蛋白酶特异性的试剂(例如抗体诸如A11，其对蛋白酶基质蛋白酶(MT-SP1)特异性并抑制基质蛋白酶的蛋白水解活性；参见例如，公开于2010年11月11日的国际公开号WO 2010/129609)来证实。使用广谱蛋白酶抑制剂诸如本文描述的那些和/或通过使用更有选择性的抑制剂的相同方法可用于鉴定对可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的CM特异性的一种蛋白酶或一类蛋白酶。在一些实施方案中，靶标的存在可使用对靶标特异性的试剂来证实，或可检测的标记可与未标记的靶标竞争。在一些实施方案中，未标记的可活化抗体和/或多特异性可活化抗体可用于通过标记的第二抗体或更复杂的检测系统进行的检测。
类似的技术也可用于体内成像，其中在主体(例如哺乳动物，包括人类)中荧光信号的检测表明疾病部位包含靶标和包含对可活化抗体和/或多特异性可活化抗体的CM特异性的蛋白酶。
这些技术还可用于试剂盒和/或用作试剂以基于多特异性可活化抗体中的蛋白酶特异性CM在各种细胞、组织和生物体中检测、鉴定或表征蛋白酶活性。
抗CD3ε抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体的治疗性施用 和制剂
应理解，施用根据本公开的治疗实体将与并入制剂中以提供改进的转移、递送、耐受等的合适的载体、赋形剂和其他试剂一起施用。许多合适的制剂可在所有制药化学家已知的药典中找到：Remington’s Pharmaceutical Sciences (第15版, Mack PublishingCompany, Easton, PA (1975))，特别是其中Blaug, Seymour的第87章。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的囊泡(诸如Lipofectin™)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、聚乙二醇乳剂(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有聚乙二醇的半固体混合物。任何前述混合物可适合于本公开的治疗和疗法，条件是制剂中的活性成分未被制剂失活，且制剂与施用途径是生理学上相容和耐受的。对于与制药化学家众所周知的制剂、赋形剂和载体相关的其他信息，还参见Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinicalguidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000)；Wang W.“Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J.Pharm. 203(1-2):1-60 (2000)；Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oraldrug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000)；Powell等人“Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm SciTechnol. 52:238-311 (1998)和其中的引文。
在一些实施方案中，抗CD3ε抗体、缀合的抗CD3ε抗体、可活化抗体、缀合的可活化抗体、多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物(本文中统称为治疗剂)与一种或多种额外的试剂或额外的试剂的组合结合施用。合适的额外的试剂包括用于预期应用的当前的药物和/或手术疗法。例如，所述治疗剂可与额外的化学治疗剂或抗肿瘤剂结合使用。例如，所述治疗剂和额外的试剂配制成单一治疗组合物，所述治疗剂和额外的试剂同时施用。在一些实施方案中，所述治疗剂和额外的试剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗组合物，且所述治疗剂和额外的试剂同时施用，或所述治疗剂和额外的试剂在治疗方案期间在不同的时间施用。例如，所述治疗剂在施用额外的试剂之前施用，所述治疗剂在施用额外的试剂之后施用，或所述治疗剂和额外的试剂以交替的方式施用。如本文所述，所述治疗剂和额外的试剂以单剂量或多个剂量施用。
在一些实施方案中，额外的试剂与治疗剂偶联或以其他方式连接。
合适的额外的试剂根据预期应用的目的(即，杀死、防止细胞增殖、激素疗法或基因疗法)进行选择。此类试剂可包括但不限于例如，药剂、毒素、毒素的片段、烷化剂、酶、抗生素、抗代谢物、抗增殖剂、激素、神经递质、DNA、RNA、siRNA、寡核苷酸、反义RNA、适体、诊断剂、不透射线染料、放射性同位素、发荧光化合物、磁性标记、纳米粒、标记化合物、凝集素、改变细胞膜通透性的化合物、光化学化合物、小分子、脂质体、胶束、基因疗法载体、病毒载体等。最后，可使用试剂的组合或不同类别的试剂的组合。
本公开的抗CD3ε抗体、缀合的抗CD3ε抗体、可活化抗体、缀合的可活化抗体、多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物(在本文中也称为“治疗剂”或“活性化合物”)和其衍生物、片段、类似物和同源物，可并入适合于给药的药物组合物中。制备此类组合物中涉及的原理和考量以及组分选择的指导提供于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences：The Science and Practice Of Pharmacy第19版(Alfonso R. Gennaro,等人编辑) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995；DrugAbsorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, and Trends,Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994；和Peptide and Protein DrugDelivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, NewYork。
此类组合物通常包含抗CD3ε抗体、缀合的抗CD3ε抗体、可活化抗体、缀合的可活化抗体、多特异性抗体、多特异性可活化抗体和/或缀合的多特异性可活化抗体组合物和药学上可接受的载体。在抗体、可活化抗体、多特异性抗体和/或多特异性可活化抗体包括AB结构域的片段时，可使用特异性结合靶标蛋白的结合结构域的AB的最小片段。例如，根据抗体的可变区序列，可设计保留AB结合靶标蛋白序列的能力的肽分子。此类肽可经化学合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见例如，Marasco等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993))。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”意图包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。合适的载体描述于最新版的Remington’s Pharmaceutical Sciences，其为本领域的标准参考科教书，其通过引用并入本文。此类载体或稀释剂的合适的实例包括但不限于水、盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和5%人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水媒介物诸如固定油。用于药物活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，考虑其在组合物中的使用。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。这通过无菌滤膜过滤容易实现。
本公开的药物组合物经配制以与其预期施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、皮内、皮下、经口(例如吸入)、经皮(即局部)、经粘膜和直肠施用。用于胃肠外、皮内或皮下施用的溶液或混悬液可包括以下组分：无菌稀释剂诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗细菌剂诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲剂诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节张力的试剂诸如氯化钠或葡萄糖。可用酸或碱诸如盐酸或氢氧化钠调节pH。可将胃肠外制剂包封在用玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物都必须是无菌的，且应该是流动的至存在容易可注射性的程度。在制备和储存的条件下其必须是稳定的，且必须针对微生物诸如细菌和真菌的污染作用而防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。可保持合适的流动性，例如通过使用包衣料诸如卵磷脂，在分散体的情况下通过保持所需的粒度和通过使用表面活性剂。预防微生物作用可通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现。在许多情况下，合适的是在组合物中包括等渗剂例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过在组合物中包括延长吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶产生。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物并入含有上文列举的成分之一或成分的组合(根据需要)的合适的溶剂中，随后无菌过滤而制备。通常，分散体通过将活性化合物并入含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需的其他成分的无菌媒介物制备。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，其自它们之前的无菌过滤溶液产生活性成分加任何其他所需成分的粉末。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载体。它们可包封在明胶胶囊中或压制成片剂。为了口服治疗施用的目的，活性化合物可掺有赋形剂和以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。口服组合物还可使用液体载体制备，用作漱口剂，其中液体载体中的化合物经口施用，并漱口和吐出或咽下。可包括药学上相容的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可含有任何以下成分或具有类似性质的化合物：粘合剂诸如微晶纤维素、西黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖；崩解剂诸如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂诸如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂诸如胶态二氧化硅；甜味剂诸如蔗糖或糖精；或矫味剂诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调料。
对于通过吸入施用，化合物以气溶胶喷雾剂的形式从含有合适的抛射剂例如气体诸如二氧化碳的加压容器或分配器，或喷雾器递送。
全身性施用还可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，适合于待渗透屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂通常是本领域已知的，和对于经粘膜施用，包括例如去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用经鼻喷雾剂或栓剂实现。对于经皮施用，将活性化合物配制成本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
化合物还可以用于直肠递送的栓剂(例如，用常规栓剂基料诸如可可脂和其他甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备。
在一个实施方案中，活性化合物用将保护化合物免于快速从身体清除的载体制备，诸如持续/控制释放制剂，包括植入体和微囊递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。
例如，活性成分可被包封在微囊中，所述微囊在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒和纳米囊)或大乳剂中例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚-(异丁烯酸甲酯)微囊)制备。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质呈成型物的形式，例如，膜或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟乙酸共聚物诸如LUPRON DEPOT TM (由乳酸-羟乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟乙酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白较短的时间。
所述材料还可市售获得自Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals, Inc。脂质体混悬液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载体。这些可根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利号4,522,811中所述。
为了易于施用和剂量均匀，特别有利的是以剂量单位形式配制口服或胃肠外组合物。如本文所用的剂量单位形式是指作为单元剂量适合于待治疗的主体的物理离散单位；各单位含有经计算以产生所需治疗效果的预定量的活性化合物以及所需药用载体。本公开的剂量单位形式的规格由活性化合物的独特性质和待实现的特定治疗效果以及配制此活性化合物用于治疗个体的本领域固有的限制来支配，并直接依赖于它们。
所述药物组合物以及用于施用的说明书可包括在容器、包或分配器中。
所述制剂还可含有所治疗的特定适应症所必需的超过一种活性化合物，例如具有补充活性的那些，它们不会不利地彼此影响。在一些实施方案中或另外，组合物可包含提高其功能的试剂，诸如例如细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子以对预期目的有效的量合适地组合存在。
在一个实施方案中，活性化合物以组合疗法施用，即，与其他试剂(例如，治疗剂)组合，所述试剂可用于治疗病理性病况或病症，诸如自身免疫性病症和炎性疾病。在该背景下，术语“组合”意指基本上同期(同时或依次)施用试剂。如果依次施用，在开始施用第二化合物时，两种化合物的第一种仍可在治疗部位处以有效浓度可检测到。
例如，组合疗法可包括本公开的一种或多种抗体，其与一种或多种额外的治疗剂共配制和/或与一种或多种额外的治疗剂共同施用，所述额外的治疗剂例如一种或多种细胞因子和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎剂、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒性或细胞生长抑制剂，如下文更详细所述。此外，本文所述的一种或多种抗体可与两种或更多种本文所述的治疗剂组合使用。此类组合疗法可有利地使用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
在其他实施方案中，本公开的一种或多种抗体可与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢或酶抑制剂共配制和/或与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢或酶抑制剂共同施用。可与本文所述的抗体组合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于以下的一种或多种：非甾类抗炎药(NSAID)，例如，布洛芬、替尼达普、萘普生、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺吡啶；皮质类固醇诸如泼尼松龙；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；核苷酸生物合成的抑制剂，例如，嘌呤生物合成的抑制剂、叶酸拮抗剂(例如，甲氨喋呤(N-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成的抑制剂，例如，二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂。与本公开的抗体组合使用的合适的治疗剂包括NSAID、CSAID、(DHODH)抑制剂(例如，来氟米特)和叶酸拮抗剂(例如，甲氨喋呤)。
额外的抑制剂的实例包括以下的一种或多种：皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制剂，例如，环孢霉素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(雷帕霉素 - RAPAMUNETM或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；干扰通过促炎细胞因子诸如TNFα或IL-1的信号转导的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如，塞来考昔、罗非考昔和其变体；磷酸二酯酶抑制剂，例如，R973401 (磷酸二酯酶IV型抑制剂)；磷脂酶抑制剂，例如，细胞溶质磷脂酶2 (cPLA2)的抑制剂(例如，三氟甲基酮类似物)；血管内皮细胞生长因子或生长因子受体的抑制剂，例如，VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；和血管发生的抑制剂。与本公开的抗体组合使用的合适的治疗剂是免疫抑制剂，例如，环孢霉素、他克莫司(FK-506)；mTOR抑制剂，例如，西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如，可溶性雷帕霉素衍生物(例如，酯雷帕霉素衍生物，例如，CCI-779)；COX2抑制剂，例如，塞来考昔和其变体；和磷脂酶抑制剂，例如，细胞溶质磷脂酶2 (cPLA2)的抑制剂，例如，三氟甲基酮类似物。
可与本公开的抗体组合的治疗剂的额外的实例包括以下的一种或多种：6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤柳氮磺吡啶；美沙拉秦；奥沙拉秦；氯喹/羟氯喹(PLAQUENIL®)；青霉胺；aurothiornalate (肌内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙碱；β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)；黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)；色甘酸酯；奈多罗米；酮替芬；异丙托铵和氧托品(oxitropium)；麦考酚酸莫酯；腺苷激动剂；抗凝血剂；补体抑制剂；和肾上腺素能剂。
本文引用的所有出版物和专利文件通过引用并入本文，如同各个此类出版物或文件具体且单独地指出通过引用并入本文一样。出版物和专利文件的引用不意欲承认任何是相关的现有技术，也不构成关于出版物和专利文件的内容或日期的任何承认。本发明现在已通过书面描述的方式进行了描述，本领域技术人员将认识到，本发明可以各种实施方案实施，和前述描述和下文的实施例为说明的目的，并不限制所附的权利要求。
实施例
实施例1. 可活化抗CD3ε抗体掩蔽部分
本实施例描述了鉴定掩蔽部分(MM)以减少可活化抗CD3ε抗体与其靶标的结合。
MACS1和MACS2选择
使用与2005年5月26日公开的PCT国际公开号WO 2005/047461和2009年1月29日公开的WO 2009/014726中描述的细菌展示技术相似的方法，使用抗CD3ε抗体SP34(本文中也称为SP34抗体)筛选具有6x1010个成员的插入大肠杆菌中的环形排列的外膜蛋白OmpX中的肽文库。选择涉及两轮磁性活化的细胞分离(MACS)，随后是两种不同的基于荧光活化的细胞分选(FACS)的选择策略。图1显示在选择过程期间的MACS和FACS群体的通用命名方案：磁性活化的细胞分离(MACS)用“M”表示，且荧光活化的细胞分选(FACS)选择用“F”表示。缩写的顺序指示选择/分选的顺序，且数字指示该群体已经经历的那种类型的选择/分选的轮数。例如，M2F3群体已经历2轮MACS选择，随后为3轮FACS选择。经历选择以得到给定群体的起始群体被假定为命名中最右侧分选指示符的N-1。例如，被分选以产生M2F3群体的群体被假定为M2F2群体。
使用蛋白-G Dynabeads (Invitrogen 目录号:10003D)和浓度为100 nM的SP34抗体(可得自BD Biosciences 目录号556610)进行初始MACS(M1)。对于M1，筛选6x1011个细胞用于结合，且收集6.6x107个细胞。以与第一轮类似且具有以下差异的方式进行第二轮MACS分选(M2)。将SP34抗体添加至50nM的终浓度，且筛选总共4.5x1011个细胞用于结合，且收集3.1x105个细胞。
FACS选择
选择#1
对于所有FACS选择，将50μl诱导的培养物离心下来(以3000xg离心5分钟)，并用指定浓度的抗体标记。对于M2，将MACS2FACS1 (M2F1)和MACS2FACS2 (M2F2)选择细胞用500 µlPBS, 0.5% BSA中的1 nM SP34-dylight-488 (ThermoScientific Cat#:53025)标记，并且通过荧光活化的细胞分选(FACS)使用FACSARIAI仪器(BD Biosciences)分选最好0.5％的阳性细胞。对于M2分选，分选3x106个细胞，且收集5000个细胞。对于后续分选，分选至少1x106个细胞。MACS2FACS3 (M2F3)群体如本文所述分选，但添加100 nM未标记的同种型对照抗体(BD Biosciences目录号：556657)。FACS选择的最终MACS2FACS4 (M2F4)轮如前所述分选，但使用用抗小鼠IgG-488次级1:100 (Jackson ImmunoResearch 目录号:315-486-045)标记的未标记的SP34抗体标记，导致MACS2FACS5 (M2F5)群体。通过表明在100nM可溶性人CD3ε蛋白(Sino Biologics目录号：10977-H08H)存在的情况下抑制1 nM SP34-dylight-488结合，验证了最终的M2F5群体特异性结合SP34。选择100个单独的克隆用于序列分析，且91个给出可解释的数据。结果概述于表7中。
对于所有FACS选择，将50μl诱导的培养物离心下来(以3000xg离心5分钟)，并用指定浓度的抗体标记。M2、M2F1和M2F2分选，细胞如本文所述用500 µL PBS, 0.5% BSA, 100nM未标记的同种型对照抗体中的10 nM SP34-dylight-488标记，且分别分选最好的10％、38％和60％的结合剂。在每种情况下，分选约3x106个细胞。选择20个单独的克隆用于序列分析，且19个给出可解释的数据。结果概述于表8中。
关于细胞肽表征
选择8个肽(5个来自选择#1 M2F5且3个来自选择#2 M2F2群体)用于在细胞上进一步表征。将单个克隆如本文所述在100nM未标记的同种型对照抗体存在的情况下用100、10、1和0.1 nM SP34-dylight-488标记。将每个克隆分别用yPet-Mona标记以定量肽的细胞表面表达水平，允许计算表达归一化的结合。
并且假设：
。
为了验证结合肽抑制SP34与人CD3ε的相互作用的能力，将每个克隆在100 nM人CD3ε存在的情况下用1 nM SP34-dylight-488标记。结果概述于表9中。所有评估的肽特异性结合SP34-dylight-488，并且被抑制免于被过量游离人CD3ε结合。
实施例2. 可活化抗CD3ε抗体
本实施例描述了本公开的可活化抗CD3ε抗体的产生。
使用标准分子生物学技术组装SP34scFv(LvHv)-Fc融合构建体的表达载体。简言之，用引物CX2005和CX2008使用合成的SP34scFv(LvHv)序列作为模板，扩增编码SP34 scFv(LvHv)区域的DNA片段。使用引物CX2007和CX2006从pFIL-CHIg-hG1载体(Invitrogen)扩增编码Fc结构域的DNA。将重叠片段组合并用引物CX2005和CX2006扩增，随后使用EcoRI和NotI限制性位点克隆至pOP Hyg表达载体(修饰的pCDNA3.1表达载体(Invitrogen))中，以形成抗体SP34scFv(LvHv)-Fc。以类似且具有以下差异的方式产生编码抗体SP34scFv(HvLv)-Fc的DNA片段。使用引物CX2001和CX200,4扩增编码PSP34scFv(HvLv)的DNA片段，且使用引物CX2002和CX2003扩增编码Fc结构域的DNA。将重叠片段组合并使用引物CX2001和C2002扩增。所有引物序列显示于表10中。发现抗体SP34scFv(LvHv)-Fc和SP34scFv(HvLv)-Fc结合Jurkat T细胞的亲和力类似于SP34 IgG结合Jurkat T细胞的能力。图4A-4C描述了scFv(LvHv)-Fc和scFv(HvLv)-Fc抗体以及本公开的可活化抗体。
还测试抗体SP34scFv(LvHv)-Fc和SP34scFv(HvLv)-Fc结合食蟹猴(本文中也称为cyno)CD3ε的能力。为了确定抗体SP34scFv(LvHv)-Fc和SP34scFv(HvLv)-Fc是否可以结合食蟹猴CD3ε，进行基于ELISA的结合测定。在4℃下以0.1μg/ ml的浓度将在C末端具有多组氨酸亲和标签的重组食蟹猴(Macaca fascicularis)CD3ε在50μl PBS(PBS, Gibco LifeTechnologies, 目录号20012-043)中过夜包被至96孔、平底板(Maxisorb Nunc, ThermoScientific, 目录号12-565-226)。将板用250μl/孔PBS-T(0.05％的吐温20)洗涤3次，用200μl PBS-T 2％BSA(BSA级分V，Fisher Scientific，产品BP1600-1)在环境温度下封闭1小时并用250μl/孔PBS-T洗涤3次。使用50μl/孔，将稀释至PBS-T 2% BSA中的37 nM至0.017nM的浓度范围在环境温度下将任一抗体SP34scFv(LvHv)-Fc或SP34scFv(HvLv)-Fc(纯化至> 95％单体)孵育1小时。将板用250μl/孔PBS-T洗涤三次，与1/5000稀释至PBS-T 2% BSA(过氧化物酶AffiniPure小鼠抗人IgG, Fcγ片段特异性, Jackson ImmunoResearch,Catalog 209-035-098)中的二级抗人Fc-HRP在环境温度下孵育30分钟，并用250μl/孔PBS-T洗涤3次。将HRP底物(TMB-ELISA，Thermo Scientific，产品34029)以50μl/孔添加至板2分钟，然后用50μl/孔1M HCl猝灭，然后在Tecan infinite 200Pro上读取450nM处的吸光度，并用Prism 6 (GraphPad)通过将数据拟合至log(激动剂) vs. 响应(三个参数)来分析。在分开的cynoCD3ε包被的ELISA板上，以相同的方式并使用二级抗小鼠IgG-HRP缀合物(Jackson ImmunoResearch，目录号715-035-150)包被并分析SP34小鼠抗体(SP34-2，BDBiosciences，目录号551916)。图2A和2B表明scFv抗体SP34scFv(LvHv)-Fc和SP34scFv(HvLv)-Fc以及抗体SP34-2在0.1-0.3nM的EC50的类似范围内结合猕猴CD3εHIS。
编码可活化抗体SP34scFv(LvHv)-Fc的载体如下构建。使用重叠正向引物CX2013和CX2014和反向引物CX2014来使用SP34scFv(LvHv)-Fc构建体作为模板来扩增可活化scFv抗体。然后使用EcoR1和BstXI限制性位点将DNA片段克隆至SP34scFv(LvHv)-Fc载体中。使用SP34scFv(LvHv)-Fc融合载体作为模板，使用肽15003、15263、15860、15864和15865分别的正向引物CX2041-CX2045和反向引物CX2002添加掩蔽肽序列，随后使用SfiI和NotI限制性位点来克隆以产生编码可活化抗CD3ε抗体的核酸分子。
SP34 Lv
核苷酸序列
氨基酸序列
SP34 Hv
核苷酸序列
氨基酸序列
SP34scFv(LvHv)
核苷酸序列
氨基酸序列
抗体SP34scFv(LvHv)-Fc融合体
核苷酸序列
氨基酸序列
15003-1204-SP34scFv(LvHv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的抗体15003-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ IDNO:547)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的抗体15003-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:548)]
可活化抗体15003-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15003-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc 融合体(SEQ ID NO:549)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:407)][无间隔区的可活化抗体15003-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:550)]
15263-1204-SP34scFv(LvHv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15263-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:551)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15263-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:552)]
可活化抗体15263-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15263-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:553)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15263-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:554)]]
15860-1204-SP34scFv(LvHv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15860-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:555)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15263-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:556)]
可活化抗体15860-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15860-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:557)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15860-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:558)]
15864-1204-SP34scFv(LvHv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15864-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:559)]
氨基酸
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15864-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:560)]
可活化抗体15864-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15864-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:561)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15864-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:562)]
15865-1204-SP34scFv(LvHv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15865-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:563)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15865-1204-SP34scFv(LvHv)(SEQ ID NO:564)]
可活化抗体15865-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15865-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:565)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15865-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体(SEQ ID NO:566)]
SP34scFv(HvLv)
核苷酸序列
氨基酸序列
抗体SP34scFv(HvLv)-Fc融合体
核苷酸序列
氨基酸序列
15003-1204-SP34scFv(HvLv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15003-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:567)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15003-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:568)]
可活化抗体15003-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15003-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:569)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15003-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:570)]
15263-1204-SP34scFv(HvLv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15263-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:571)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15263-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:572)]
可活化抗体15263-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15263-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:573)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15263-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:574)]
15860-1204-SP34scFv(HvLv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15860-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:575)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15860-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:576)]
可活化抗体15860-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15860-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:577)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15860-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:578)]
15864-1204-SP34scFv(HvLv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15864-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:579)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15864-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:580)]
可活化抗体15864-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15864-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:581)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15864-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:582)]
15865-1204-SP34scFv(HvLv)
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的15865-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:583)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的15865-1204-SP34scFv(HvLv)(SEQ ID NO:584)]
可活化抗体15865-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的可活化抗体15865-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:585)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的可活化抗体15865-1204-SP34scFv(HvLv)-Fc融合体(SEQ ID NO:586)]
实施例3. 可活化抗CD3ε抗体的体外表征
本实施例描述了本公开的掩蔽部分降低包含此掩蔽部分的本公开的可活化抗CD3ε抗体结合CD3ε的能力的能力。
为了确定先前实施例中描述的掩蔽肽是否可以抑制SP34 scFv-Fc背景下的结合，进行基于流式细胞术的结合测定。根据ATCC指南将Jurkat T细胞(克隆E6-1，ATCC，TIB-152)在RPMI-1640+glutamax (Life Technologies，目录号72400-120)、10%热灭活的胎牛血清(HI-FBS, Life Technologies，目录号10438-026)、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素(Life Technologies，目录号15140-122)中培养。通过离心(200xg，4℃，5分钟)收获细胞，并重悬浮于补充有2% HI-FBS的PBS(FACS缓冲液)中。将约180,000个Jurkats/孔转移至96孔U底板，收获，并重悬浮于50μL一抗中。可活化抗体的起始浓度为1μM，随后3倍连续稀释，总共12个浓度。测试以下可活化抗体；15003-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体；15860-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体；15864-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体；和15865-1204-SP34scFv(LvHv)-Fc融合体；如同抗体SP34scFv(LvHv)-Fc。
将细胞在4℃下振荡孵育约1小时，收获，并用3x200μL FACS缓冲液洗涤。将Jurkats重悬浮于50 µl Alexa Fluor 488缀合的抗人IgG Fc(1:100稀释液，JacksonImmunoResearch，产品109-546-098)中，并在4℃下振荡孵育约30分钟。收集细胞，用3x200µL FACS缓冲液洗涤，并重悬浮于最终体积为120μL的FACS缓冲液中。在BD Accuri C6 (BDBiosciences)上收集样品，并使用FlowJo V10 (Treestar)计算活细胞的中值荧光强度(MFI)。在GraphPad Prism 6中通过将数据曲线拟合至log(激动剂) vs. 响应(三个参数)来计算EC50值。
图3A-3D表明，将掩蔽肽并入SP34 scFv-Fc背景下以产生可活化抗体，将CD3ε结合的EC50值从单位数nM改变至三位数nM。
实施例4. 双特异性可活化抗体
本实施例描述了本公开的双特异性可活化抗体的产生、表达和表征。
载体构建：使用标准分子生物学技术将重链和轻链分别克隆至哺乳动物表达载体中。简言之，用结合末端的引物扩增编码目标区域的DNA片段。组合重叠片段并根据需要用侧接引物扩增以构建完整的所需区域。随后使用市售的同源重组试剂盒(MCLabs, SouthSan Francisco, CA)将DNA片段克隆至表达载体中。内部哺乳动物表达载体是来自Invitrogen的cDNA3.1(+)的修饰版本，其具有G418或潮霉素的选择标记。使用QuikChange试剂盒(Agilent, Santa Clara, CA)引入突变。
使用标准转染试剂盒(Life Technologies, Grand Island, NY)在哺乳动物细胞中表达双特异性抗体和双特异性可活化抗体。简言之，使用基于脂质的系统，遵循制造商推荐的方案用核酸转染293细胞。使用蛋白A珠粒(GE, Piscataway, NJ)从无细胞上清液纯化双特异性可活化抗体和双特异性抗体，并使用标准缓冲液交换柱(Millipore, Temecula,CA)浓缩。
下表11描述了本公开的各种双特异性抗体和双特异性可活化抗体的重链和轻链。
表12A提供了用于每种构建体的引物，而表12B提供了所用引物的序列。
双特异性抗体和双特异性可活化抗体的序列如下所示。在一些实施方案中，可活化抗体还包括间隔区序列。在一些实施方案中，间隔区直接连接至可活化抗体的MM。在一些实施方案中，间隔区以间隔区-MM-CM-AB的N-末端至C-末端的结构排列直接连接至可活化抗体的MM。在一些实施方案中，直接连接至可活化抗体的MM的N-末端的间隔区选自QGQSGQG(SEQ ID NO:407)、QGQSGQ (SEQ ID NO:87)、QGQSG (SEQ ID NO:408)、QGQS (SEQ ID NO:409)、QGQ (SEQ ID NO:410)、QG (SEQ ID NO:411)和Q. 在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQG (SEQ ID NO:412)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQG (SEQ ID NO:407)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSGQ (SEQID NO:87)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQSG (SEQ ID NO:408)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQS (SEQ ID NO:409)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QGQ (SEQ ID NO:410)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸序列QG (SEQ ID NO:411)。在一些实施方案中，间隔区至少包括氨基酸残基Q。
尽管以下所示的一些序列包括SEQ ID NO:362的间隔区序列，但本领域普通技术人员理解本公开的多特异性可活化抗体可以包括任何合适的间隔区序列，诸如例如，选自QGQSGQG (SEQ ID NO:407)、QGQSGQ (SEQ ID NO:87)、QGQSG (SEQ ID NO:408)、QGQS (SEQID NO:409)、QGQ (SEQ ID NO:410)、QG (SEQ ID NO:411)和Q的间隔区序列。
CI005: C225v5N297Q-CD3-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
OPP007: LC C225 IL2ss
核苷酸序列
氨基酸序列
CI007: 3954-1204-C225v5N297Q-CD3-H-N
pLW019: HC C225v5N297Q-CD3HvLv-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
OPP022: LC C225 3954-1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:509)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:508)]
CI009: C225v5N297Q-15865-CD3LvHv-H-N
pLW023: C225v5N297Q-15865-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW023(SEQ ID NO:511)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW023(SEQ ID NO:512)]
OPP007: LC C225 IL2ss
核苷酸序列
氨基酸序列
CI010: 3954-1204-C225v5N297Q-15003-CD3LvHv-H-N
pLW022: C225v5N297Q-15865-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW022(SEQ ID NO:895)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW022(SEQ ID NO:510)]
OPP022: LC C225 3954-1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:509)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:508)]
CI011: 3954-1204-C225v5N297Q-15865-CD3LvHv-H-N
pLW023: HC C225v5N297Q-15865-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW023(SEQ ID NO:511)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW023(SEQ ID NO:512)]
OPP022: LC C225 3954-1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:509)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:508)]
CI012: C225v5N297Q
pLW006: C225v5N297Q
核苷酸序列
氨基酸序列
OPP021: LC C225
核苷酸序列
氨基酸序列
CI015: C225v5N297Q-CD3LvHv-H-N
pLW057: HC C225v5N297Q-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
OPP021: LC C225
核苷酸序列
氨基酸序列
CI016: 3954-1204-C225v5N297Q-CD3LvHv-H-N
pLW057: HC C225v5N297Q-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
OPP022: LC C225 3954-1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:509)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:508)]
CI025: IL6RN297Q
pLW078: HC IL6RN297Q
核苷酸序列
氨基酸序列
pLW077: LC IL6R
核苷酸序列
氨基酸序列
CI026: IL6RN297Q-CD3LvHv-H-N
pLW083: HC IL6RN297Q-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
pLW077: LC IL6R
核苷酸序列
氨基酸序列
CI027: IL6RN297Q-15865_1204-CD3LvHv-H-N
pLW085: HC IL6RN297Q-15865_1204-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW085(SEQ ID NO:513)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW085(SEQ ID NO:514)]
pLW077: LC IL6R
核苷酸序列
氨基酸序列
CI029: 4792-1204-IL6RN297Q-15865_1204-CD3LvHv-H-N
pLW085: HC IL6RN297Q-15865_1204-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW085(SEQ ID NO:513)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW085(SEQ ID NO:514)]
pLW080: LC IL6R 4792 1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW080(SEQ ID NO:515)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW080(SEQ ID NO:516)]
CI036: 4792-1204-IL6RN297Q-CD3LvHv-H-N
pLW083: HC AV1N297Q-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
pLW080: LC IL6R 4792 1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW080(SEQ ID NO:515)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW080(SEQ ID NO:516)]
CI039: 3954-2001-C225v5 N297Q-15865-2001-CD3LvHv-H-N
pLW101: HC C225v5N297Q-15865-2001-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW101(SEQ ID NO:517)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW101(SEQ ID NO:518)]
LC C225-3954-2001
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的3954-2001-C225v5(SEQ ID NO:519)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW080(SEQ ID NO:520)]
CI040: 3954-2001-C225v5 N297Q-CD3LvHv-H-N
pLW057: HC C225v5N297Q-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
氨基酸序列
LC C225-3954-2001
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的3954-2001-C225v5(SEQ ID NO:519)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW080(SEQ ID NO:520)]
CI021: C225v5N297Q-15003-CD3HvLv-H-N
pLW047: HC C225v5N297Q-15003-CD3HvLv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW047(SEQ ID NO:522)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW047(SEQ ID NO:524)]
OPP021: LC C225
核苷酸序列
氨基酸序列
CI022: C225v5N297Q-15865-CD3HvLv-H-N
pLW048: HC C225v5N297Q-15865-CD3HvLv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW048(SEQ ID NO:525)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW048(SEQ ID NO:526)]
OPP021: LC C225
核苷酸序列
氨基酸序列
CI023: 3954-1204-C225v5N297Q-15003-CD3HvLv-H-N
pLW047: HC C225v5N297Q-15003-CD3HvLv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW047(SEQ ID NO:522)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW047(SEQ ID NO:524)]
OPP022: LC C225 3954-1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:509)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:508)]
CI024: 3954-1204-C225v5N297Q-15865-CD3HvLv-H-N
pLW048: HC C225v5N297Q-15865-CD3HvLv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW048(SEQ ID NO:525)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW048(SEQ ID NO:526)]
OPP022: LC C225 3954-1204
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:509)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的OPP022(SEQ ID NO:508)]
CI028: IL6R 4792 Nsub N297Q-15865_1204-CD3LvHv-H-N
pLW085: HC IL6RN297Q-15865_1204-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW085(SEQ ID NO:513)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW085(SEQ ID NO:514)]
pLW079: LC IL6R 4792 Nsub
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW079(SEQ ID NO:527)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW079(SEQ ID NO:528)]
CI030: IL6RN297Q-15865_Nsub-CD3LvHv-H-N
pLW087: HC IL6RN297Q-15865_Nsub-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW087(SEQ ID NO:529)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW087(SEQ ID NO:530)]
pLW077: LC IL6R
核苷酸序列
氨基酸序列
CI031: IL6R 4792 Nsub N297Q-15865_Nsub-CD3LvHv-H-N
pLW087: HC IL6RN297Q-15865_Nsub-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW087(SEQ ID NO:529)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW087(SEQ ID NO:530)]
pLW079: LC IL6R 4792 Nsub
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW079(SEQ ID NO:527)]
氨基酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:87)][无间隔区的pLW079(SEQ ID NO:528)]
CI032: 4792-1204-IL6RN297Q-15865_Nsub-CD3LvHv-H-N
pLW087: HC IL6RN297Q-15865_Nsub-CD3LvHv-H-N
核苷酸序列
[间隔区(SEQ ID NO:507)][无间隔区的pLW087(SEQ ID NO:529)]
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CI059: BiTE420
BiTE420
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实施例5. SP34 scFv-Fc与CD3ε阳性Jurkat细胞的结合
为了确定SP34 scFv Fc融合体是否可以结合CD3ε阳性Jurkat T细胞，进行基于流式细胞术的结合测定。根据ATCC指南将Jurkat T细胞(克隆E6-1，ATCC，TIB-152)在RPMI-1640+glutamax (Life Technologies，目录号72400-120)、10%热灭活的胎牛血清(HI-FBS, LifeTechnologies，目录号10438-026)、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素(LifeTechnologies，目录号15140-122)中培养。通过离心(200xg，4℃，5分钟)收获细胞，并重悬浮于补充有2% HI-FBS的PBS(FACS缓冲液)中。将约250,000个Jurkats/孔转移至96孔U底板，收获，并重悬浮于50μL一抗中。抗体的起始浓度为200 nM，随后5倍连续稀释，总共8个浓度。测试以下化合物：SP34 LvHv scFv Fc、SP34 HvLv scFv Fc和SP34-2。
将细胞在4℃下振荡孵育约2小时，收获，并用3x200μL FACS缓冲液洗涤。将用SP34scFv-Fc融合体处理的Jurkats重悬浮于50 µl Alexa Fluor 488缀合的抗人IgG Fc(1:100稀释液，Jackson ImmunoResearch，产品109-546-098)中。将用SP34-2和小鼠同种型处理的细胞重悬浮于50 µl Alexa Fluor 647缀合的抗-小鼠IgG(1:100稀释液，JacksonImmunoResearch，产品715-605-150)中。将Jurkats在4℃下振荡孵育约30分钟，收获，用3x200 µL FACS缓冲液洗涤，并重悬浮于最终体积为120μL的FACS缓冲液中。在BD AccuriC6 (BD Biosciences)上分析样品，并使用FlowJo V10 (Treestar)计算活细胞的中值荧光强度(MFI)。在GraphPad Prism 6中通过将数据曲线拟合至log(激动剂) vs. 响应(三个参数)来计算EC50值。
图13A和13B表明SP34的所有形式以相似的EC50值结合CD3ε Jurkat细胞。
实施例6. 可活化抗CD3ε抗体与CD3ε Jurkat细胞的结合
为了确定先前实施例中描述的掩蔽肽是否可以抑制SP34 scFv-Fc背景下的结合，进行基于流式细胞术的结合测定。如所述将Jurkat T细胞培养并在FACS缓冲液中处理。将约100,000个Jurkats/孔转移至96孔U底板，收获，并重悬浮于50μL一抗中。滴定开始于1μM或333 nM，随后在FACS缓冲液中进行3倍系列稀释。测试以下抗体和可活化抗体：15003 1204SP34 LvHv Fc；15860 1204 SP34 LvHv Fc；15865 1204 SP34 LvHv, SP34 LvHv, 150031204 SP34 HvLv；15860 1204 SP34 HvLv Fc；15865 1204 SP34 HvLv, SP34 HvLv Fc和小鼠SP34。
将细胞在4℃下振荡孵育约1小时，收获，并用3x200μL FACS缓冲液洗涤。将用SP34Fc融合体处理的Jurkats重悬浮于50 µl Alexa Fluor 647缀合的抗人IgG Fc(1:100稀释液，Jackson ImmunoResearch，产品109-606-008)中。将用小鼠SP34处理的细胞重悬浮于50µl Alexa Fluor 647缀合的抗-小鼠IgG(1:100稀释液，Jackson ImmunoResearch，产品715-605-150)中。将Jurkats在4℃下振荡孵育约30分钟，收获，用3x200 µL FACS缓冲液洗涤，并重悬浮于最终体积为100μL的含有2.5 µg/ml 7-AAD (BD Biosciences，目录号559925)的FACS缓冲液中。在MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi)上收集样品，并使用FlowJo V10 (Treestar)计算活细胞的中值荧光强度(MFI)。在GraphPad Prism 6中通过将数据曲线拟合至log(激动剂) vs. 响应(三个参数)来计算EC50值。
图14A和14B表明，掩蔽肽并入SP34 scFv-Fc背景下以产生可活化抗体将CD3ε结合的EC50值从单位数nM改变至三位数nM。
实施例7. 双重掩蔽的多特异性、可活化抗体与EGFR+ HT-29细胞和CD3ε+ Jurkat细胞的结合
为了确定先前实施例中描述的CD3ε掩蔽肽是否可以抑制EGFR掩蔽的多特异性、可活化抗体的背景下的结合，进行基于流式细胞术的结合测定。
根据制造商指南将EGFR+ HT-29-luc2 (Caliper)在RPMI-1640+glutamax (LifeTechnologies，目录号72400-120)、10%热灭活的胎牛血清(HI-FBS, Life Technologies，目录号10438-026)、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素(Life Technologies，目录号15140-122)中培养。将细胞用细胞解离缓冲液(Sigma，目录号C5789)提升(lifted)，洗涤，并重悬浮于50μL一抗中。滴定开始于图15A-15D中所示的浓度，随后在FACS缓冲液中进行3倍系列稀释。测试以下多特异性抗体和多特异性、可活化抗体：CI005 (EGFR/hCD3)、CI023(M-EGFR/M-hCD3)、CI024 (M-EGFR/M-hCD3)、CI015 (EGFR/hCD3)、CI011 (M-EGFR/M-hCD3)、CI010 (M-EGFR/M-hCD3)。利用SP34 scFv的两种形式，即CI005、CI023、CI024中的scFv相比CI015、CI011、CI010中的scFv。多特异性抗体的结合特异性由抗原名称(在本实施例中为EGFR和CD3)指示，且字母M指示抗原结合的掩蔽。
将HT29-luc2细胞在4℃下振荡孵育约1小时，收获，并用3x200μL FACS缓冲液洗涤。将细胞重悬浮于50 µl Alexa Fluor 647缀合的抗人IgG Fc(1:100稀释液，JacksonImmunoResearch，产品109-606-008)中，并在4℃下振荡孵育约30分钟。将HT29-luc2收获，用3x200 µL FACS缓冲液洗涤，并重悬浮于最终体积为100μL的含有2.5 µg/ml 7-AAD (BDBiosciences，目录号559925)的FACS缓冲液中。在MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi)上收集样品，并使用FlowJo V10 (Treestar)计算活细胞的中值荧光强度(MFI)。在GraphPad Prism 6中通过将数据曲线拟合至log(激动剂) vs. 响应(三个参数)来计算EC50值。
如前所述测试多特异性抗体和多特异性、可活化抗体与CD3ε Jurkats的结合。
图15A-15C表明，CD3ε掩蔽肽并入EGFR掩蔽的多特异性可活化抗体将CD3ε结合的EC50值从单位数nM改变至三位数nM。该结合改变在利用SP34 scFv的两种形式(即CI005、CI023、CI024中的scFv相比CI015、CI011、CI010中的scFv)的多特异性、可活化抗体中是明显的。此外，EGFR掩蔽在针对EGFR和CD3结合两者被掩蔽的多特异性、可活化抗体中仍然是有效的。
实施例8. 双重掩蔽的多特异性、可活化抗体与EGFR+ HT-29细胞和CD3ε+ Jurkat细胞的细胞毒性
为了确定先前实施例中描述的CD3ε掩蔽肽是否可以在EGFR掩蔽的多特异性、可活化抗体的背景下起作用，进行细胞毒性测定。
人PBMC作为冷冻等分试样(HemaCare, 目录号PB009C-1)购买或经由Ficoll密度梯度离心分离自获得自健康供体的血沉棕黄层(Stanford Blood Center)(参考文献 = Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.Bøyum, A., Scand. J., Clin. Lab. Invest. 21 Suppl, 97, 77–89 (1968))。 将人PBMC与表达EGFR的HT29-luc2细胞以10:1的PBMC:HT29-luc比率在白壁96孔板中的RPMI-1640+glutamax、5%热灭活的人血清(Sigma，目录号H3667)和100 U/ml青霉素以及100 µg/ml链霉素中共培养。测试以下多特异性抗体和多特异性、可活化抗体的滴度：CI005 (EGFR/hCD3)、CI023 (M-EGFR/M-hCD3)、CI024 (M-EGFR/M-hCD3)、CI011 (M-EGFR/M-hCD3)、CI010 (M-EGFR/M-hCD3)。此外，EGFR抗体(CI012)和同种型用作单一浓度的阴性对照。添加效应细胞、靶细胞和抗体后的总体积为150μL。48小时后，将CytoTox-Glo™细胞毒性测定(Promega)的发光肽底物直接添加至板以测量释放的蛋白酶活性。在Infinite M200 Pro (Tecan)上添加底物后50分钟测量发光。结果以未处理值的背景减去后的发光表示，并在Prism中用曲线拟合分析log(激动剂) vs. 响应(三个参数)进行绘制。
图16A和16B表明，相对于未掩蔽的对照，EGFR和CD3ε掩蔽的多特异性、可活化抗体改变细胞毒性EC50。该改变在利用SP34 scFv的两种形式(即CI023和CI024中的scFv相比CI011和CI010中的scFv)的多特异性、可活化抗体中是明显的。
实施例9. 单一和双重掩蔽的多特异性、可活化抗体与EGFR+ HT-29细胞和CD3ε+Jurkat细胞的结合
为了确定CD3ε和EGFR掩蔽是否可以减弱多特异性、可活化抗体中的结合，进行流式细胞术测定。如前所述对以下多特异性抗体和多特异性、可活化抗体进行CD3ε+ Jurkat细胞和EGFR+ HT-29细胞的结合：CI005 (EGFR/hCD3)、CI007 (M-EGFR/hCD3)、CI008 (EGFR/M1-hCD3)、CI009 (EGFR/M2-hCD3)、CI010 (M-EGFR/M1-hCD3)和CI011 (M-EGFR/M2-hCD3)。
图17A和17B表明，在CD3ε掩蔽的存在(CI010，CI011)和不存在(CI007)的情况下，EGFR掩蔽可以改变EGFR结合的EC50。在EGFR掩蔽的存在(CI010，CI011)和不存在(CI008，C009)的情况下，两种CD3ε掩蔽可以改变CD3ε结合的EC50。
实施例10. 单一和双重掩蔽的多特异性、可活化抗体的EGFR依赖性细胞毒性
为了确定CD3ε和EGFR掩蔽是否可以减弱多特异性、可活化抗体的细胞杀伤，进行细胞毒性测定。如前所述通过共培养PBMC和EGFR+ HT-29 luc细胞来评估EGFR依赖性细胞杀伤。通过将PBMC与EGFR阴性U266细胞系(ATCC，目录号TIB-196)共培养来评估EGFR非依赖性细胞杀伤。根据ATCC指南在RPMI-1640+glutamax、10％热灭活的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素中培养U266细胞。测试以下多特异性抗体和多特异性、可活化抗体的滴度：CI005 (EGFR/hCD3)、CI007 (M-EGFR/hCD3)、CI009 (EGFR/M2-hCD3)、CI011 (M-EGFR/M2-hCD3)。在前面实施例中描述了共培养条件和细胞毒性的定量。
图18A和18B表明，通过掩蔽多特异性、可活化抗体中的EGFR和CD3结合最大程度地减弱EGFR+ HT29-luc2细胞的杀伤。相比之下，在相同的共培养条件下，EGFR阴性U266细胞的杀伤是检测不到的。
实施例11. 单一和双重掩蔽的多特异性、可活化抗体的EGFR依赖性原代T细胞活化
为了确定CD3ε和EGFR掩蔽是否可以减弱多特异性、可活化抗体的原代T细胞活化，进行流式细胞术测定。PBMC和EGFR+ HT-29 luc2共培养条件描述于前面实施例中。在24小时孵育后，将培养物转移至U底板，并用0.25％胰蛋白酶(Life Technologies，目录号25200-056)分离剩余的细胞。通过添加3个体积的FACS缓冲液猝灭胰蛋白酶活性，并将细胞悬浮液转移至同一U底板。收获后，将细胞重悬浮于50μL的抗-CD69 PE/抗-CD8 APC-Vio770混合物(抗-CD69 PE，BD Biosciences，目录号555531；抗-CD8 APC-Vio770，Miltenyi Biotec，目录号130- 096-561)，APC-Vio770同种型对照(Miltenyi Biotec，目录号130-099-637)或PE同种型对照(BD BioSciences，目录号340761)。所有抗体以制造商推荐的浓度使用。将细胞在4℃下振荡染色1小时，收获并重悬浮于最终体积为100μL的具有2.5 µg/ml 7-AAD的FACS缓冲液中。在MACSQuant® Analyzer 10 (Miltenyi)上收集样品，并在FlowJo V10(Treestar)中将活化定量为CD69表达高于PE同种型对照的CD8+ T细胞的百分比。在GraphPad Prism 6中通过将数据曲线拟合至log(激动剂) vs. 响应(三个参数)来计算EC50值。
图19表明，通过掩蔽多特异性、可活化抗体中的EGFR和CD3结合最大程度地减弱原代CD8+ T细胞的活化。
实施例12. 单一和双重掩蔽的多特异性、可活化抗体的EGFR非依赖性原代T细胞活化
为了确定CD3ε掩蔽是否可以减弱多特异性、可活化抗体的EGFR非依赖性活化，进行流式细胞术测定。PBMC和EGFR阴性U266共培养条件描述于前面实施例中。如前所述通过CD69染色评价原代CD8+ T细胞的活化。评估以下多特异性抗体和多特异性、可活化抗体：CI005(EGFR/hCD3)、CI007 (M-EGFR/hCD3)、CI009 (EGFR/M2-hCD3)、CI011 (M-EGFR/M2-hCD3)。
图20A和20B表明，未掩蔽的双特异性抗体的靶标非依赖性T细胞活化仅仅是非常小的，并且在掩蔽抗-CD3部分后，该低活性程度被消除。
实施例13. 多特异性、可活化抗体的uPA消化恢复与EGFR+ HT-29 luc2细胞和CD3+ Jurkat细胞的结合以及针对EGFR+ HT-29 luc2细胞的细胞毒性
多特异性可活化抗体的活化如下进行：通过将uPA (R&D Systems, Catalog 1310-SE)添加至约1μM的最终浓度来切割PBS中的多特异性可活化抗体。将消化物在37℃下孵育过夜，并通过移取等分试样用于毛细管电泳分析(GX-II毛细管电泳，Perkin Elmer)或SDS-PAGE来证实切割。通过蛋白A纯化除去蛋白酶和切割的掩蔽部分。简言之，将消化的样品用PBS稀释至2 ml，并加载至平衡的MabSelect SuRe™珠粒(GE Healthcare Life Sciences，产品11-0026-01 AD)。将珠粒用5个柱体积(CV)的1xPBS洗涤，随后用5 CV的补充有5％异丙醇(IPA)的5xPBS洗涤，最后用5CV的1xPBS洗涤。将抗体用10 CV的0.1M甘氨酸(pH 3.0)洗脱，并将级分用1M Tris(pH 8.0)中和，合并，浓缩并缓冲液交换至PBS。如前所述进行与CD3ε+ Jurkat细胞和EGFR+ HT-29细胞的结合和针对HT-29 luc2细胞的细胞杀伤。
图21A-21D表明uPA活化恢复多特异性、可活化CI011 (M-EGFR/M-hCD3)抗体与EGFR+ HT29-luc2细胞和CD3+ Jurkat细胞的结合。此外，所有多特异性、可活化抗体的细胞杀伤都通过uPA活化恢复。
实施例14. 并入不同底物的双重掩蔽的多特异性、可活化抗体
为了确定不同底物是否影响双重掩蔽的多特异性、可活化抗体的EGFR依赖性杀伤，进行细胞毒性测定。如前所述进行针对HT-29 luc2细胞的细胞杀伤。
图22表明含有不同底物的双重掩蔽的多特异性、可活化抗体改变EC50细胞毒性。
实施例15. 实施方案的多特异性抗体和多特异性可活化抗体防止小鼠中的HT-29Luc2肿瘤生长
在本实施例中，分析靶向EGFR和CD3ε的多特异性抗体和多特异性可活化抗体防止免疫缺陷的NOD-scid小鼠中的HT-29Luc2异种移植物肿瘤的生长的能力。
人结肠癌细胞系HT-29Luc2获得自Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA(以前为Caliper Life Sciences, Inc.)。新鲜人PBMC和针对T细胞富集的PBMC通过Hemacare,Inc., Van Nuys, CA获得自人供体，并将其过夜送至CytomX。将HT-29Luc2细胞与人PBMC或针对T细胞富集的新鲜PBMC皮下植入NOD scid (NOD.CB17-Prkdc scid /J)小鼠(JacksonLaboratory, Bar Harbor, ME)的右侧腹。在37℃下，在空气中5% CO2的气氛中，使HT-29Luc2细胞在含有10％胎牛血清(Gibco-brand, ThermoFisher, Inc. Waltham, MA)的McCoy's 5a培养基(ATCC, Manassas, VA)中生长。将肿瘤细胞常规地每周二次继代培养。在对数生长期期间收获细胞并保持在环境温度用于肿瘤诱导。
在一项预防研究中，用100μL含有2x106个肿瘤细胞且有或无2x106个新鲜、未刺激的PBMC的细胞悬液皮下接种小鼠(第0天)。在同一天，小鼠通过静脉内注射接受第一剂量的测试或对照制品(第0天)。使用数字卡尺以二维每周两次测量肿瘤体积，且体积使用式V =0.5 a x b 2以mm3表示，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
如表13中所示将小鼠分组并给药。
表13. HT-29Luc2异种移植物研究的组别和剂量。*BiTE以0.5mg/kg/天给药。
组别 计数 肿瘤 PBMC 治疗 剂量 (mg/kg) 时间表
1 8 HT-29Luc2 -- PBS -- q7dx2, iv
2 8 HT-29Luc2 供体A PBS -- q7dx2, iv
3 8 HT-29Luc2 供体A CI005 0.10 q7dx2, iv
4 8 HT-29Luc2 供体A CI059 (BiTE) 0.5* qdx8, iv
图23(其绘制初始剂量后的肿瘤体积相比天数)表明以0.1 mg/kg两次给药(分开7天)的多特异性抗体CI005和连续8天以0.5 mg/kg/天给药的CI059 (BiTE)防止HT-29Luc2异种移植肿瘤的生长。
在分开的研究中，使用与上述方法类似的方法，测试靶向EGFR和CD3ε的多特异性抗体CI048和多特异性可活化抗体CI011防止或抑制HT-29Luc2异种移植肿瘤的生长的能力。组别和剂量描述于表14中。该研究中的效应细胞是从PBMC富集的新鲜、未刺激的CD3+ T细胞，并以效应细胞:肿瘤细胞的1:1比率共注射。
图24(其绘制初始剂量后肿瘤体积相比天数)表明，CI048多特异性抗体限制HT-29Luc2异种移植肿瘤的建立且CI011多特异性可活化抗体抑制HT-29Luc2异种移植物肿瘤的生长。第26天时PBS和CI011之间的作用差异是统计学显著的(p <0.05)。
实施例16. 实施方案的多特异性抗体和多特异性可活化抗体诱导小鼠中建立的HT-29Luc2肿瘤的消退
在本实施例中，分析靶向EGFR和CD3ε的多特异性抗体和多特异性可活化抗体在人T细胞移植的NSG小鼠中产生建立的HT-29Luc2异种移植肿瘤的退化或生长降低的能力。
人结肠癌细胞系HT-29Luc2获得自Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA(以前为Caliper Life Sciences, Inc.)并如实施例15中所述进行培养。纯化的冷冻人PBMC通过Hemacare, Inc., Van Nuys, CA获得自人供体。NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rg tm1Wjl /SzJ)小鼠获得自The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME。
在用于肿瘤干预研究的准备中，每只小鼠在右侧腹皮下接种100 µL RPMI +Glutamax、无血清培养基中的2x106个HT-29Luc2细胞。分析来自单个供体(“A”)的先前冷冻的PBMC以测定CD3+ T细胞的百分比。该值用于计算实现2:1的CD3+ T细胞:肿瘤细胞比率所需的PBMC的总数。在肿瘤细胞植入当天，将该总数的PBMC(1020万)注入每只小鼠的腹膜中。
在PBMC接种后11天从所有小鼠收集血液(~100 µl)，以通过流式细胞术评估每只小鼠中人T细胞移植的程度。测定全血(抗凝血剂，肝素锂)的人CD3 +的存在与CD4+和CD8+T细胞百分比。
每周两次测量肿瘤体积和体重，并如实施例15中所述计算肿瘤体积。在肿瘤接种后13天，将具有足够的T细胞移植且具有目标大小范围(50-100 mm3；平均~ 70 mm3)肿瘤的小鼠随机分组，每组8只。第二天，将分配至治疗组的小鼠根据表15 IV给药(5 mL/kg)。
图25(其绘制初始治疗剂量后的肿瘤体积相比天数)表明CI048多特异性抗体对HT-29Luc2异种移植肿瘤生长的剂量依赖性作用。CI048的最有效剂量是0.3 mg/kg，其导致100％小鼠中持续、完全的肿瘤消退。0.1mg/kg的CI048也是高度有效的，其中大多数小鼠展现肿瘤消退。
图26(其绘制初始治疗剂量后肿瘤体积相比天数)表明，0.3 mg/kg的CI048多特异性抗体消除HT-29Luc2异种移植肿瘤，并且0.1 mg/kg的CI040多特异性可活化抗体比CI048效力更低，但相对于PBS对照限制HT-29Luc2异种移植肿瘤的生长。
使用来自携带HT-29Luc2肿瘤的人T细胞移植的NSG小鼠的相同合并物的未指定动物设置两个额外的效力研究。第一项研究在肿瘤植入后18天开始，其中平均起始肿瘤体积为107 mm3。该研究比较了CI048多特异性抗体和CI040多特异性可活化抗体的活性。如表16、组1-4中所示将小鼠分组并给药。第二项研究在肿瘤植入后26天开始，其中平均起始肿瘤体积为190 mm3。该研究评估CI011多特异性可活化抗体的效力。如表16、组5和6中所示将小鼠分组并IV给药。
图27(其绘制初始治疗剂量后的肿瘤体积相比天数)表明1.0 mg/kg的CI040多特异性可活化抗体和0.3 mg/kg的CI048多特异性抗体在100％的处理的小鼠中产生完全的肿瘤消退。在用0.3 mg/kg CI040给药的大多数小鼠中观察到肿瘤消退。
图28(其绘制初始治疗剂量后的肿瘤体积相比天数)表明相对于媒介物对照，1.0mg/kg的CI011多特异性可活化抗体显著抑制HT-29Luc2异种移植肿瘤生长(p<0.05)。
实施例17. 食蟹猴中多特异性抗体和多特异性可活化抗体的最大耐受剂量(MTD)测定
在本实施例中，递增剂量研究设计用于建立在向未处理(naïve)雄性食蟹猴单次IV推注施用后CI048 EGFRxCD3ε多特异性抗体和CI011和CI040(两种多特异性可活化抗体)的最大耐受剂量。所述猴来自柬埔寨，且体重范围为2.5至4 kg。CI011和CI040仅在蛋白酶可切割位点的氨基酸序列中不同。向每剂量水平一个动物各自施用CI048、CI011和CI040，对于CI048，以0.1微克/ kg(μg/ kg)开始，对于CI011和CI040，以60μg/ kg开始。剂量以2至10倍增量递增，直到达到或超过每种制品的MTD。然后使用一只额外动物来证实MTD。每个研究动物给药一次，并监测至少7天。基于临床体征、体重、食物消耗和包括血清化学和血液学的实验室分析来评估耐受性。在适应期间一次和在给药后48小时和7天收集血液用于标准血清化学和血液学分析。
用剂量为10 µg/kg和以上的未掩蔽的CI048多特异性抗体和剂量≥ 200 µg/kg的CI011或CI040多特异性可活化抗体观察到异常临床体征，包括呕吐、弓背和食物摄入减少。在20 µg/kg (CI048)、≥200 µg/kg (CI040)和≥600 µg/kg (CI011)的MTD时，这些发现(当存在时)是短暂的，并且通常限于给药时段后48小时。在MTD的血清化学发现包括在48小时时丙氨酸转氨酶(ALT，在肝细胞裂解后在血清中发现的肝酶标记物)的轻度至中度升高，其在第8天完全逆转。用60μg/kg的CI048给药的单个动物表明更严重和持久的临床体征，与在给药后48小时的显著升高的ALT、AST、胆红素和血液尿素氮相关。该动物还具有在给药后1或4小时的血清细胞因子(包括IL-6、IFN-γ和TNF-α)的显著增加，以及在第8天大量扩增的淋巴细胞群体。在超过MTD的CI048剂量下的肝和肾损伤的发现类似于Lutterbuese和同事在用EGFR x CD3双特异性分子的研究中指出的那些(PNAS 2010, vol. 107(28) 12605-12610)，并且可以归因于T细胞介导的组织损伤。
图29描绘作为测试制品剂量的函数的给药后48小时的丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血清浓度。在60 µg/kg CI048多特异性抗体下观察到ALT的显著增加。以20 µg/kg重新给药CI048建立20 µg/kg的耐受剂量。以600 µg/kg的剂量施用CI011和CI040多特异性可活化抗体导致与10-20 µg/kg CI048相关的血清ALT浓度相当的血清ALT水平。
实施例18. 双重掩蔽的多特异性可活化抗体与EGFR+ HT-29细胞和小鼠CD3ε+TK1细胞的结合
为了确定小鼠CD3ε和EGFR掩蔽是否可以减弱多特异性可活化抗体中的结合，进行流式细胞术测定。根据ATCC指南在RPMI-1640+glutamax、10％热灭活的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素中培养小鼠CD3ε+ TK1细胞(ATCC，目录号CRL-2396)。如先前所述对以下多特异性抗体和多特异性可活化抗体进行与小鼠CD3ε+ TK1细胞和EGFR+ HT-29细胞的结合：CI052 (EGFR/mCD3)、CI053 (M-EGFR/M01-mCD3)、CI054 (M-EGFR/M02-mCD3)、CI055 (M-EGFR/M03-mCD3)、CI056 (M-EGFR/M04-mCD3)、CI049 (M-EGFR/M05-mCD3)、CI050(M-EGFR/M06-mCD3)、CI051 (M-EGFR/M07-mCD3)、CI057 (M-EGFR/M08-mCD3)和CI058 (M-EGFR/M09/mCD3)。图30表明，将小鼠CD3ε掩蔽物并入EGFR掩蔽的多特异性可活化抗体改变小鼠CD3ε结合的EC50值，同时保留有效的EGFR掩蔽。
实施例19. 靶向IL6R的双重掩蔽的多特异性可活化抗体的表征
为了确定多特异性可活化抗体的CD3ε和IL6R掩蔽是否可以减弱细胞杀伤，进行细胞毒性测定。通过以6:1比率共同培养纯化的人CD8+细胞和IL6R+ Molp-8细胞来评估细胞杀伤。通过使用Dynabeads® Untouched™人CD8 T细胞试剂盒(Life Technologies，目录号11348D)的阴性选择从冷冻的PBMC分离人CD8+ T细胞。根据DSMZ指南在RPMI-1640+glutamax、20％热灭活的胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 µg/ml链霉素中培养Molp-8cells (DSMZ，目录号ACC 569)。测试以下多特异性抗体和多特异性、可活化抗体的滴度：CI026 (IL6R/hCD3)、CI027 (IL6R/M-hCD3)、CI036 (M-IL6R/hCD3)和CI029 (M-IL6R/M-hCD3)。在前面实施例中描述了共培养条件和细胞毒性的定量。
图31表明，通过掩蔽多特异性、可活化抗体中的IL6R和CD3结合最大程度地减弱IL6R+ Molp-8细胞的杀伤。
其他实施方案
尽管本发明已经结合其详述进行了描述，但前面的描述意欲说明而非限制由随附权利要求书的范围限定的本公开的范围。其他方面、优点和改变在随附权利要求书的范围内。

Claims (118)

1.结合CD3的ε链(CD3ε)的分离的单链可变抗体片段，其含有包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:53)的可变重链互补决定区1(VH CDR1)；包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的可变重链互补决定区2(VH CDR2)；包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的可变重链互补决定区3(VH CDR3)，包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的可变轻链互补决定区1 (VL CDR1)；包含氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的可变轻链互补决定区2 (VL CDR2)；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的可变轻链互补决定区3 (VL CDR3)。
2.权利要求1的分离的单链可变抗体片段，其中AB含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
3.权利要求1的分离的单链可变抗体片段，其中scFv片段包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
4.权利要求1的分离的单链可变抗体片段，其中AB包含SEQ ID NO:587的氨基酸序列。
5.权利要求1的分离的单链可变抗体片段，其中AB包含SEQ ID NO:588的氨基酸序列。
6.权利要求1的分离的单链可变抗体片段，其包含与所述抗体缀合的试剂。
7.权利要求6的分离的单链可变抗体片段，其中所述试剂是治疗剂、抗肿瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。
8.权利要求6的分离的单链可变抗体片段，其中所述试剂经由接头与所述抗体缀合。
9.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项的抗体和载体。
10.药物组合物，其包含权利要求1至5中任一项的抗体和载体。
11.在活化状态下结合CD3的ε链(CD3ε)的可活化抗体，所述可活化抗体包含：
特异性结合CD3ε的抗体或其抗原结合片段(AB)；
当所述可活化抗体在未切割状态下时抑制AB与CD3ε的结合的掩蔽部分(MM)；和
与所述AB偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是功能为蛋白酶的底物的多肽。
12.权利要求11的可活化抗体，其中所述MM具有选自以下的与所述AB结合的解离常数：大于AB与CD3ε的解离常数；等于AB与CD3ε的解离常数；和小于AB与CD3ε的解离常数。
13.权利要求11的可活化抗体，其中当所述可活化抗体在切割状态下时，所述MM不干扰AB结合CD3ε或与AB竞争结合CD3ε。
14.权利要求11的可活化抗体，其中所述MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
15.权利要求11的可活化抗体，其中所述MM多肽序列不同于CD3ε的多肽序列，且其中MM多肽序列与AB的任何天然结合配偶体具有不多于50%同一性。
16.权利要求11的可活化抗体，其中所述MM包含选自表7或表8中所示的序列的序列。
17.权利要求11的可活化抗体，其中所述蛋白酶由接近组织中表达CD3ε的细胞的肿瘤产生和/或由与CD3ε在组织中共定位的肿瘤产生，且其中当所述可活化抗体暴露于所述蛋白酶时，所述蛋白酶切割所述可活化抗体中的CM。
18.权利要求11的可活化抗体，其中所述CM是最多达15个氨基酸长的多肽。
19.权利要求11的可活化抗体，其中所述CM是选自表3中所示蛋白酶的蛋白酶的底物，或其中所述CM包含选自SEQ ID NO:67-86、321-341和896-926的氨基酸序列。
20.权利要求11的可活化抗体，其中其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
21.权利要求11的可活化抗体，其中未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-CM-AB或AB-CM-MM。
22.权利要求11的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含MM和CM之间的连接肽。
23.权利要求11的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含CM和AB之间的连接肽。
24.权利要求11的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且其中未切割状态下的可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。
25.权利要求24的可活化抗体，其中所述两个连接肽彼此不相同。
26.权利要求24的可活化抗体，其中LP1和LP2各自是约1-20个氨基酸长的肽。
27.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述AB含有包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:53)的VH CDR1；包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VHCDR2；包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3，包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1；包含氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3。
28.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述AB包含SEQ ID NO:587的氨基酸序列。
29.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述AB包含SEQ ID NO:588的氨基酸序列。
30.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含选自以下的重链序列：SEQ ID NO: 446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546。
31.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含选自以下的轻链序列：SEQ ID NO: 448、450、458、468、474、482、484、508、516和520。
32.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含选自SEQ IDNO: 446、452、454、456、460、462、464、466、470、472、476、478、480、486、488、490、492、494、496、498、500、502、504、510、512、514、518、524、526、530、532、534、536、538、540、542、544和546的重链序列；以及选自SEQ ID NO: 448、450、458、468、474、482、484、508、516和520的轻链序列。
33.权利要求11至26中任一项的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含SEQ ID NO:506的氨基酸序列。
34.权利要求11至33中任一项的可活化抗体，其包含与所述AB缀合的试剂。
35.权利要求34的可活化抗体，其中所述试剂是治疗剂、抗肿瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。
36.权利要求34的可活化抗体，其中所述试剂经由接头与AB缀合。
37.权利要求11的可活化抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
38.权利要求11的可活化抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含scFv片段。
39.权利要求38的可活化抗体，其中所述scFv片段包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
40.药物组合物，其包含权利要求11-33或37-39中任一项的可活化抗体和载体。
41.药物组合物，其包含权利要求11-39中任一项的可活化抗体和载体。
42.分离的核酸分子，其编码权利要求1至5中任一项的分离的单链可变抗体的至少一部分。
43.分离的核酸分子，其编码权利要求11-33或37-39中任一项的可活化抗体的至少一部分。
44.载体，其包含权利要求42或权利要求43的分离的核酸分子。
45.通过在导致表达分离的单链可变抗体或可活化抗体的条件下培养细胞来产生所述抗体或可活化抗体的方法，其中所述细胞包含权利要求42或权利要求43的核酸分子。
46.制备在活化状态下结合CD3的ε链(CD3ε)的可活化抗体的方法，所述方法包括：
(a) 在导致表达所述可活化抗体的条件下培养包含编码所述可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中所述可活化抗体包含掩蔽部分(MM)、可切割部分(CM)和特异性结合CD3的ε链(CD3ε)的抗体或其抗原结合片段(AB)，
和
(b) 回收所述可活化抗体。
47.权利要求46的方法，其中所述CM是功能为蛋白酶的底物的多肽。
48.权利要求46的方法，其中所述CM位于所述可活化抗体中，使得当所述可活化抗体在未切割状态下时，MM干扰AB与CD3ε的特异性结合，且当所述可活化抗体在切割状态下时，MM不干扰AB特异性结合CD3ε或不与AB竞争特异性结合CD3ε。
49.结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的分离的多特异性抗体，其中所述抗体包含结合CD3的ε链(CD3ε)的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，且其中AB1含有包含氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1；包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2；包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3，包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ IDNO:56)的VL CDR1；包含氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3。
50.权利要求49的多特异性抗体，其中AB1含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
51.权利要求49的多特异性抗体，其中所述AB1包含scFv片段。
52.权利要求51的多特异性抗体，其中所述scFv片段包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
53.权利要求49的多特异性抗体，其中AB包含SEQ ID NO:587的氨基酸序列。
54.权利要求49的多特异性抗体，其中AB包含SEQ ID NO:588的氨基酸序列。
55.权利要求49的抗体，其包含与所述抗体缀合的试剂。
56.权利要求49的多特异性抗体，其中所述试剂是治疗剂、抗肿瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。
57.权利要求49的多特异性抗体，其中所述试剂经由接头与抗体缀合。
58.权利要求57的多特异性抗体，其中所述接头是可切割接头。
59.权利要求57的多特异性抗体，其中所述接头是不可切割接头。
60.权利要求49的多特异性抗体，其中所述多特异性抗体选自：
多特异性抗体，其包含：
与所述AB2偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是功能为蛋白酶的底物的多肽；和
当所述CM在未切割状态下时抑制AB2与第二靶标的结合的掩蔽部分(MM)；和
多特异性抗体，其包含：
与所述AB1偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是功能为蛋白酶的底物的多肽；和
当所述CM在未切割状态下时抑制AB1与CD3ε的结合的掩蔽部分(MM)。
61.结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的分离的多特异性可活化抗体，所述多特异性可活化抗体包含
特异性结合CD3ε的第一抗体或其抗原结合片段(AB1)和结合第二靶标的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，其中AB1含有包含氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1；包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2；包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3，包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ IDNO:56)的VL CDR1；包含氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3；
当所述多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB2与第二靶标的结合的掩蔽部分(MM)；和
与所述AB2偶联的可切割部分(CM)，其中所述CM是功能为蛋白酶的底物的多肽。
62.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述AB2的靶标选自表1中所列的靶标。
63.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中AB2是或源自选自表2中所列的抗体的抗体。
64.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scAb、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
65.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述MM具有选自以下的与所述AB结合的解离常数：大于AB与所述靶标的解离常数；等于AB与CD3ε的解离常数；和小于AB与CD3ε的解离常数。
66.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中当所述多特异性可活化抗体在切割状态下时，所述MM不干扰AB结合靶标或与AB竞争结合靶标。
67.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述MM是不超过40个氨基酸长的多肽。
68.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述MM多肽序列不同于AB2的靶标的多肽序列，且其中MM多肽序列与AB2的任何天然结合配偶体具有不多于50%同一性。
69.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述CM是最多达15个氨基酸长的多肽。
70.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述蛋白酶由接近组织中表达CD3ε的细胞的肿瘤产生和/或由与AB2的靶标在组织中共定位的肿瘤产生，且其中当所述多特异性可活化抗体暴露于所述蛋白酶时，所述蛋白酶切割所述多特异性可活化抗体中的CM。
71.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述多特异性可活化抗体包含MM和CM之间的连接肽。
72.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述多特异性可活化抗体包含CM和AB之间的连接肽。
73.权利要求61至72中任一项的多特异性可活化抗体，其中所述多特异性可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且其中未切割状态下的多特异性可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM-LP1-CM-LP2-AB或AB-LP2-CM-LP1-MM。
74.权利要求73的多特异性可活化抗体，其中所述两个连接肽彼此不相同。
75.权利要求73的多特异性可活化抗体，其中LP1和LP2各自是约1-20个氨基酸长的肽。
76.权利要求73的多特异性可活化抗体，其中LP1或LP2中的至少一个包含选自(GS)n、(GGS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO:59)和(GGGS)n (SEQ ID NO:60)、GGSG (SEQ ID NO:61)、GGSGG (SEQ ID NO:62)、GSGSG (SEQ ID NO:63)、GSGGG (SEQ ID NO:64)、GGGSG (SEQ IDNO:65)和GSSSG (SEQ ID NO:66)的氨基酸序列，其中n是至少为1的整数。
77.权利要求61的多特异性可活化抗体，其中所述CM是选自表3中所示蛋白酶的蛋白酶的底物，或其中所述CM包含选自SEQ ID NO:67-86、321-341和896-926的氨基酸序列。
78.在活化状态下结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的多特异性可活化抗体，所述多特异性可活化抗体包含：
特异性结合CD3ε的至少第一抗体或其抗原结合片段(AB1)；
特异性结合第二靶标或表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)；
当所述多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB1与CD3ε的结合的至少第一掩蔽部分(MM1)；和
与所述AB1偶联的至少第一可切割部分(CM1)，其中所述CM1是功能为蛋白酶的底物的多肽。
79.在活化状态下结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的多特异性可活化抗体，所述多特异性可活化抗体包含：
特异性结合CD3ε的至少第一抗体或其抗原结合片段(AB1)；
当所述多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB1与CD3ε的结合的至少第一掩蔽部分(MM1)；
与所述AB1偶联的至少第一可切割部分(CM1)，其中所述CM1是功能为蛋白酶的底物的多肽；
特异性结合第二靶标或表位的至少第二抗体或其抗原结合片段(AB2)；
当所述多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB2与第二靶标或表位的结合的至少第二掩蔽部分(MM2)；和
与所述AB2偶联的至少第二可切割部分(CM2)，其中所述CM2是功能为蛋白酶的底物的多肽。
80.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述MM1和/或MM2具有选自以下的与AB1和/或AB2结合的解离常数：大于AB1与CD3ε的解离常数和/或大于AB2与第二靶标或表位的解离常数；等于AB1与CD3ε的解离常数和/或等于AB2与第二靶标或表位的解离常数；和小于AB1与CD3ε的解离常数和/或小于AB2与第二靶标或表位的解离常数。
81.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述MM1多肽序列不同于CD3ε的多肽序列，所述MM2多肽序列不同于所述第二靶标或表位的多肽序列，并且其中所述MM1多肽序列和/或MM2多肽序列与AB1和/或AB2的任何天然结合配偶体具有不超过50％同一性。
82.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中当所述多特异性可活化抗体在切割状态下时，所述MM1和/或MM2不干扰AB1结合CD3ε或不与AB1竞争结合CD3ε和/或不干扰AB2结合第二靶标或表位或不与AB2竞争结合第二靶标或表位。
83.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述MM1包含选自表7或表8中所示的序列的序列。
84.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中切割CM1和/或CM2的蛋白酶由接近组织中表达CD3ε的细胞的肿瘤产生和/或由与CD3ε和/或第二靶标或表位在组织中共定位的肿瘤产生，且其中当所述多特异性可活化抗体暴露于所述蛋白酶时，所述蛋白酶切割所述多特异性可活化抗体中的CM1和/或CM2。
85.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中未切割状态下的多特异性可活化抗体的至少一部分具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM1-CM1-AB1、AB1-CM1-MM1、MM2-CM2-AB2或AB2-CM2-MM2。
86.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述多特异性可活化抗体包含MM1和CM1之间和/或MM2和CM2之间的连接肽。
87.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述多特异性可活化抗体包含CM1和AB1之间和/或CM2和AB2之间的连接肽。
88.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述多特异性可活化抗体包含第一连接肽(LP1)和第二连接肽(LP2)，且其中未切割状态下的多特异性可活化抗体具有如下的N-末端至C-末端的结构排列：MM1-LP1-CM1-LP2-AB1、AB1-LP2-CM1-LP1-MM1、MM2-LP1-CM2-LP2-AB2或AB2-LP2-CM2-LP1-MM2。
89.权利要求88的多特异性可活化抗体，其中所述两个连接肽不必彼此相同。
90.权利要求88的多特异性可活化抗体，其中LP1和LP2各自是约1-20个氨基酸长的肽。
91.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述MM1和/或MM2是不超过40个氨基酸长的多肽。
92.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述CM1和/或CM2是最多达15个氨基酸长的多肽。
93.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中所述CM1和/或CM2是选自表3中所列蛋白酶的蛋白酶的底物，或其中所述CM1和/或CM2包含选自SEQ IDNO:67-86、321-341和896-926的氨基酸序列。
94.权利要求61、权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其中AB1和/或AB2的其抗原结合片段选自Fab片段、F(ab')2片段、scFv、scab、dAb、单结构域重链抗体和单结构域轻链抗体。
95.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中AB1含有包含氨基酸序列TYAMN (SEQ ID NO:53)的VH CDR1；包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO:54)的VH CDR2；包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO:55)的VH CDR3，包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO:56)的VL CDR1；包含氨基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO:57)的VL CDR2；和包含氨基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO:58)的VL CDR3。
96.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中AB1含有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的可变重链(Hv)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的可变轻链(Lv)。
97.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中所述AB1和/或AB2包含scFv片段。
98.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中所述AB1包含scFv片段，且其中所述scFv片段包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
99.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中所述AB1包含SEQ ID NO:587的氨基酸序列。
100.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中所述AB1包含SEQ ID NO:588的氨基酸序列。
101.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中AB2的所述靶标选自表1中所列的靶标。
102.权利要求78至94中任一项的多特异性可活化抗体，其中AB2是或源自选自表2中所列的抗体的抗体。
103.权利要求78或权利要求79的多特异性可活化抗体，其包含与AB1和AB2中的至少一个缀合的试剂。
104.权利要求103的多特异性可活化抗体，其中所述试剂是治疗剂、抗肿瘤剂、毒素或其片段、可检测部分或诊断剂。
105.权利要求103的多特异性可活化抗体，其中所述试剂经由接头与AB1和AB2中的至少一个缀合。
106.药物组合物，其包含权利要求49-55或60-77中任一项的多特异性抗体或权利要求78-102中任一项的多特异性可活化抗体和载体。
107.药物组合物，其包含权利要求49-77中任一项的多特异性抗体或权利要求78-102中任一项的多特异性可活化抗体和载体。
108.分离的核酸分子，其编码权利要求49-54中任一项的多特异性抗体的至少一部分。
109.分离的核酸分子，其编码权利要求95-100中任一项的多特异性可活化抗体的至少一部分。
110.载体，其包含权利要求108或权利要求109的分离的核酸分子。
111.产生特异性结合至少CD3的ε链(CD3ε)的多特异性抗体或多特异性可活化抗体的方法，所述方法包括在导致表达所述多特异性抗体或多特异性可活化抗体的条件下培养细胞，其中所述细胞包含权利要求108或权利要求109的核酸分子。
112.制备在活化状态下结合CD3的ε链(CD3ε)和第二靶标的多特异性可活化抗体的方法，所述方法包括：
(a) 在导致表达所述多特异性可活化抗体的条件下培养包含编码所述多特异性可活化抗体的核酸构建体的细胞，其中所述可活化抗体选自：
(i) 可活化抗体，其包含特异性结合CD3ε的至少第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，特异性结合第二靶标或表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，当多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB1与CD3ε的结合的至少第一掩蔽部分(MM1)，和与AB1偶联的至少第一可切割部分(CM1)，和
(ii) 可活化抗体，其包含特异性结合CD3ε的至少第一抗体或其抗原结合片段(AB1)，特异性结合第二靶标或表位的第二抗体或其抗原结合片段(AB2)，当多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB1与CD3ε的结合的第一掩蔽部分(MM1)，当多特异性可活化抗体在未切割状态下时抑制AB2与其靶标的结合的第二掩蔽部分(MM2)，与AB1偶联的第一可切割部分(CM1)，和与AB2偶联的第二可切割部分(CM2)；
和
(b) 回收所述可活化抗体。
113.权利要求112的方法，其中所述CM1、CM2或CM1和CM2两者是功能为蛋白酶的底物的多肽。
114.权利要求112的方法，其中所述CM1位于所述可活化抗体中，使得当所述可活化抗体在未切割状态下时，MM1干扰AB1与CD3ε的特异性结合，且当所述可活化抗体在切割状态下时，MM1不干扰AB1特异性结合CD3ε或不与AB1竞争特异性结合CD3ε，且其中所述CM2位于所述可活化抗体中，使得当所述可活化抗体在未切割状态下时，MM2干扰AB2与其靶标的特异性结合，且当所述可活化抗体在切割状态下时，MM2不干扰AB2特异性结合其靶标或不与AB2竞争特异性结合其靶标。
115.减轻主体中的与病症相关的临床适应症的症状的方法，所述方法包括向有需要的主体以足以减轻与所述病症相关的临床适应症的症状的量施用权利要求1-5中任一项的分离的单链可变抗体或权利要求11-33或37-39中任一项的可活化抗体或权利要求49-54或60中任一项的多特异性抗体或权利要求61-102中任一项的多特异性可活化抗体。
116.减轻主体中的与病症相关的临床适应症的症状的方法，所述方法包括向有需要的主体以足以减轻与所述病症相关的临床适应症的症状的量施用权利要求1-8中任一项的分离的单链可变抗体或权利要求11-39中任一项的可活化抗体或权利要求49-60中任一项的多特异性抗体或权利要求61-105中任一项的多特异性可活化抗体。
117.权利要求115或权利要求116的方法，其中所述主体是人。
118.权利要求115或权利要求116的方法，其中所述病症是癌症。
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