CN107106649A

CN107106649A - 含脱辅基水母发光蛋白的组合物及其用于治疗神经元炎症的方法

Info

Publication number: CN107106649A
Application number: CN201580061431.1A
Authority: CN
Inventors: M·Y·安德伍德; J·R·小莫耶
Original assignee: Quincy Bioscience LLC
Current assignee: Jingshui Bioscience Group Co ltd
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2017-08-29
Also published as: MX2017006063A; NZ731340A; HK1244223A1; IL252070B; LT3217998T; AU2018279057A1; MA40959A; HUE059107T2; IL252070A0; CA2966891C; HRP20220749T1; WO2016077437A1; CY1125295T1; BR112017009599A2; ES2910021T3; EP3217998A4; PL3217998T3; SI3217998T1; DK3217998T3; PT3217998T

Abstract

本发明涉及预调节神经元以减少对象中的神经元炎症的方法。所述方法包括给予对象脱辅基水母发光蛋白的步骤，其中所述对象的神经元经预调节以减小所述对象中的后续神经元炎症。

Description

含脱辅基水母发光蛋白的组合物及其用于治疗神经元炎症的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年11月11日提交的美国临时申请62/078,099的权益，其通过引用其全文纳入本文用于所有目的。

发明领域

本发明一般涉及可用于治疗神经元炎症的组合物。更具体地，本发明涉及含脱辅基水母发光蛋白的组合物和采用那些组合物来治疗神经元炎症的方法。

发明背景

2009年，在美国，大约每19例死亡中就有一例因中风所致，这使其成为仅次于心脏疾病和癌症的第三大死因。因此，需要寻求改善中风后的损伤的方式势在必行。人们对于局部缺血中钙的作用以及通过阻断其在局部缺血后的毒性作用来提供可能的神经保护给予了极大的关注。

钙(Ca²⁺)在多种神经元过程中起关键作用，包括神经递质释放和突触可塑性。由于持续活性，神经元持续经历胞内Ca²⁺的波动然而胞内Ca²⁺的过量或持续增加对于神经元可能是毒性的。因此，神经元胞内Ca²⁺受到极其严格的调控，并且存在允许神经元限制或控制胞浆Ca²⁺水平的若干机制。具体而言，钙结合蛋白(CaBP；例如钙结合蛋白、小清蛋白和钙网膜蛋白)对于胞浆Ca²⁺的结合和缓冲而言是重要的。

关于海马体的研究已显示CaBP的存在提供一些抵抗兴奋毒性损伤的保护，而该损伤通常导致细胞死亡。有趣的是，随年龄增长，且在神经退行性疾病(包括阿兹海默病和帕金森病)中，观察到减少的CaBP水平。意图通过在缺血性损伤之前给予CaBP使毒性局部缺血过程中Ca²⁺最小化的治疗也显示了积极结果。例如，Yenari等在诱导局部缺血之前用钙结合蛋白处理动物并发现钙结合蛋白的过表达是神经保护性的。此外，Fan等在局部缺血之前用钙结合蛋白处理大鼠并显示钙结合蛋白处理的动物中有较小的梗死体积、较好的行为恢复，和减少的凋亡。事实上，已有大量研究聚焦于对中风有害作用的了解。有趣的是，中风的一项主要风险因素是衰老，而脑衰老的一项突出假设是衰老的Ca²⁺假设。该假设辩称，年龄相关的调节钙和钙依赖性过程的能力变化是认知减退和神经退行性疾病易感性增加的关键促进因素。鉴于这些年龄相关的Ca²⁺变化，以及Ca²⁺在缺血性细胞死亡中的关键作用，大量研究聚焦于神经元和神经胶质中的Ca²⁺调节异常。

已知局部缺血之后的过度胞内Ca²⁺累积会通过兴奋毒性加强细胞死亡。缺血性损伤之后，Ca²⁺通过电压门控的Ca²⁺通道(VGCC)，通过NMDA受体，并且通过从胞内细胞器释放，在细胞中累积。许多研究已显示，阻断通过NMDA受体、VGCC，或两者结合的Ca²⁺进入可能具有抵抗局部缺血的神经保护性。有趣的是，当NMDA受体阻断剂进入临床试验时，它们无法提供神经保护作用，并且它们产生了不希望的副作用，例如幻觉和昏迷。尽管尚不确定NMDA受体阻断剂为何会在临床试验中失败，但很明确，需要针对缓解缺血性中风的毁灭性作用的持续研究。

尽管已有进展，但仍需要治疗神经元炎症的替代性的新疗法。具体而言，需要相较于先前制剂具有较少副作用的药物或营养组合物，它们如果被开发出来则将满足医疗及营养卫生界长期以来的需求。

发明内容

本发明部分基于发明人对于脱辅基水母发光蛋白(apoaequorin)的近期研究，脱辅基水母发光蛋白是一种钙结合蛋白，发明人预料之外地发现脱辅基水母发光蛋白具有新的神经保护能力。具体而言，已发现脱辅基水母发光蛋白可用于预调节(preconditioning)对象中的神经元以减少后续神经元炎症。因此，本发明提供含脱辅基水母发光蛋白的组合物及其使用方法，其在神经保护性应用中提供实质性益处。

在第一方面中，本发明涉及预调节神经元以减少对象中的神经元炎症的方法。所述方法包括给予对象脱辅基水母发光蛋白的步骤，其中所述对象的神经元经预调节以减少神经元炎症。

在一个实施方式中，通过注射对所述对象进行给予。在另一个实施方式中，经口递送对所述对象进行给予，例如，采用配制成单位剂型的脱辅基水母发光蛋白，所述单位剂型选自片剂或胶囊。在某些实施方式中，脱辅基水母发光蛋白以营养组合物的形式给予对象。

可理解，本发明涵盖脱辅基水母发光蛋白，其用于预调节神经元以减少对象中的神经元炎症，以及脱辅基水母发光蛋白在制造用于预调节神经元以减少对象中的神经元炎症的组合物中的用途。

另一方面，本发明涉及降低对象中肿瘤坏死因子α(TNFα)蛋白质水平的方法。所述方法包括给予对象脱辅基水母发光蛋白的步骤，其中所述对象的TNFα蛋白质水平被降低。

在某些实施方式中，通过注射对所述对象进行给予。在另一些实施方式中，通过经口递送对所述对象进行给予，例如，采用配制成单位剂型的脱辅基水母发光蛋白，所述单位剂型选自片剂或胶囊。在某些实施方式中，脱辅基水母发光蛋白以营养组合物的形式给予对象。

可理解，本发明涵盖脱辅基水母发光蛋白，其用于降低对象中的TNFα蛋白质水平，以及脱辅基水母发光蛋白在制备用于降低对象中的TNFα蛋白质水平的组合物中的用途。

本发明提供优于现有技术组合物和方法的多项益处，其中，其通过其神经保护性的功能对于对象的身心健康提供总体改善。

在阅读了说明书和权利要求后，本发明的其他目标、特征和优势是显而易见的。

附图的简要说明

图1A-C描述短时间海马脑切片中氧-葡萄糖剥夺对于细胞死亡的作用。A)实验设计的图表。冠状海马切片在人造脑脊液(aCSF)中孵育1小时。一半切片转移至缺血性条件，持续5分钟的氧-葡萄糖剥夺(OGD)，而另一半保持含氧正常(无OGD)。然后，全部切片被转移至aCSF进行30分钟的再灌注和台盼蓝染色。然后，切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定。B)保持含氧正常(无OGD)的切片和经历5分钟OGD的切片中海马体的区域CA1中的台盼蓝染色的代表性图像。注意到，相较于OGD切片，在含氧正常切片中存在较少染色。C)相较于保持含氧正常的切片，经历5分钟OGD的切片的海马体的区域CA1中存在台盼蓝染色的神经元数量的显著增加(*，p＜.01)。

图2A-C描述脱辅基水母发光蛋白对于缺血性细胞死亡的剂量依赖性作用。A)实验设计图表。对背侧海马体中双边插管的大鼠的一个半球中输注0、0.4、1或4％脱辅基水母发光蛋白(AQ)，而另一半球中输注载剂(0％AQ)。输注后一天，冠状海马切片被切下并在人造脑脊液(aCSF)中孵育1小时。全部切片转移至缺血性条件经历5分钟的氧-葡萄糖剥夺(OGD)。然后，切片被转移至aCSF进行30分钟的再灌注和台盼蓝染色。然后，切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定。B)载剂处理的切片或4％AQ处理的切片中，局部缺血之后，海马体的区域CA1中的台盼蓝染色的典型图像。注意到，相较于载剂处理的切片，AQ处理的切片中存在较少染色。C)图表显示神经保护(援救的细胞百分比)和脱辅基水母发光蛋白剂量的关系。相较于0％AQ(载剂)，用1或4％AQ(但非0.4％AQ)处理的大鼠中存在显著神经保护(*，p＜.01)。

图3A-C描述脱辅基水母发光蛋白对于缺血性细胞死亡的时间依赖性作用。A)实验设计图表。对背侧海马体中双边插管的大鼠的一个半球中输注4％脱辅基水母发光蛋白(AQ)，而另一半球中输注载剂(0％AQ)。输注后1小时、1天、2天、3天或5天切下冠状海马切片，且切片在人造脑脊液(aCSF)中孵育1小时。全部切片转移至缺血性条件经历5分钟的氧-葡萄糖剥夺(OGD)。然后，切片被转移至aCSF进行30分钟的再灌注和台盼蓝染色。然后，切片在10％中性缓冲的福尔马林中固定。对第二组大鼠双侧输注4％AQ，并且在输注后1小时、1天、2天或3天切除脑，待用于Western印迹分析。B)在局部缺血之前1或2天，4％AQ的输注获得了显著神经保护，但神经保护作用在输注后3或5天不再明显。注意到在局部缺血之前仅1小时输注时，AQ也不具有神经保护性(p＝.78)。C).22kD的AQ蛋白的Western印迹分析。AQ在输注后1小时和1天存在于背侧海马体(AQ-dhpc)，但在输注后3天时不再存在。输注后2天，仅29％的大鼠中存在条带。注意到腹侧海马体(AQ-vhpc)中从未出现条带，无关输注时间。β-肌动蛋白(45kD)的分析显示任何时间点的蛋白质加载在背侧(肌动蛋白-dhpc)或腹侧(肌动蛋白-vhpc)海马体中均无作用。*，p＜.01。

图4A-B描述脱辅基水母发光蛋白对白介素-10mRNA表达的作用。A)4％AQ输注进入背侧海马体之后1小时，白介素-10(IL-10)mRNA表达显著增加。该统计学显著增加是瞬时的，因为IL-10mRNA表达在1-2天内回到近基线水平，不过仍观察到生物学相关的2至3倍增加。B)β-肌动蛋白mRNA表达在4％AQ和载剂处理的半球之间无显著差异(p＝.52)。对于两张图表，数据表示为与载剂处理的对照半球相比的倍数变化。

图5说明用于实施例2的实验方法。

图6A-B描述的数据显示AQ的海马内输注是神经保护性的。

图7A-D描述AQ输注后的细胞因子表达。

图8A-C说明的数据显示，经口给予AQ是神经保护性的。

图9A-C描述的数据显示，AQ输注改变了IL-10和TNF-α蛋白表达。

图10A-C说明衰老大鼠中的AQ输注和痕迹性恐惧条件反射。

图11A-C描述经口给予AQ是时间和剂量依赖性的。

图12描述用于实施例4的实验方法。

图13A-C描述经口给予AQ是神经保护性的。

图14A-D显示的数据表明，经口给予AQ改变了细胞因子蛋白质表达。

图15A-B描述显示的数据表明，AQ的海马内输注改变了细胞因子蛋白质表达。

图16说明的数据显示，IL-10nAb逆转了AQ的神经保护作用。

发明详述

I.概述

在描述本发明的材料和方法前，应理解本发明不限于特定方法和所述材料，其可以变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

应注意到，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“这种”包括复数含义，除非另有明确说明。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。

动物.采用92只雄性F344成年大鼠。大鼠以14/10小时日/夜周期饲养，提供随意可取的食物和水。每周两次记录各动物的体重，以计算显著体重增加和/或减少。

药物.脱辅基水母发光蛋白(AQ；昆西生命科学公司(Quincy Bioscience))在双去离子水中以7.4％的浓度制备。剂量依赖性实验(n＝18)中，实验组接受拌入它们的每日PB中的0(n＝4)、3.6(n＝5)、48(n＝4)、240(n＝3)，或480mg/kg的AQ。对于研究的剩余者，大鼠(n＝73)接受拌入它们的每日PB的48mg/kg的AQ。动物分配至五组之一；无AQ(n＝12)、1小时AQ(n＝17)、1天AQ(n＝15)、2天AQ(n＝15)，和7天AQ(n＝14)。每天，大鼠于指定时间接受置于笼内皮氏培养皿中的1/4茶勺的PB。直至全部PB被消耗之后再移走培养皿。动物每周两次称重，以维持合适AQ剂量。

用于输注研究的AQ如先前描述制备(Detert等，2013)。IL-10中和抗体(nAb)及其IgG对照在无菌PBS中制备。0.5ug以1ul/分钟的速率通过1ul汉密尔顿注射器输注。

氧-葡萄糖剥夺.给予的最后一天，PB消耗之后，允许大鼠消化1小时，然后用异氟烷深度麻醉，并采用标准程序(Moyer和Brown，2007)制备背侧海马体(dhpc；前囱^-3.14-^-4.16；Paxinos和Watson，1998)的冠状切片(400μm)。切片在aCSF中恢复1小时之后，各脑的一个半球(平衡的)，通过转移切片至氧-葡萄糖剥夺室(葡萄糖用果糖替代，并用95％N₂-5％CO₂起泡以替代95％O₂-5％CO₂)持续5分钟来经历体外局部缺血，而另一半球保持恢复。然后，全部切片被置于包含0.2％台盼蓝的氧化的aCSF中，进行30分钟再灌注阶段。台盼蓝对死细胞染色，但不染活细胞(DeRenzis和Schechtman，1973)。切片在氧化的室温aCSF中漂洗两次，然后在10％中性缓冲的福尔马林中于冰箱内固定过夜。然后，切片在30％蔗糖中冷冻保护，在低温恒温器上切片(40μm)，并封固在包埋载片上供于细胞计数。

细胞计数.切片在Olympus显微镜(配有数码相机)下以10X视检，并拍摄照片(CellSens)。CA1(约800μm部分)中的台盼蓝染色的神经元由不知晓实验条件的实验人员计数。统计学分析进行采用SPSS(v 21.0.0；IBM公司；纽约州阿蒙克市)进行。采用ANOVA来评价药物作用，采用费舍尔LSD因果关系评价法来评价组相互作用。星号(*)指示p＜.05。

Western印迹.动物用异氟烷深度麻醉，迅速切除脑、冷冻，并贮存于-80℃。解剖时间后，从dhpc(前囱^-3.14-^-4.16mm)切下样品。样品经均质化，以4000RPM离心20分钟，移去上清液，蛋白质采用Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad)检测。蛋白质样品经标准化并上样用于SDS-PAGE(12％)。蛋白质(30μg)采用Turbo转膜系统(Bio-Rad)转移至PVDF膜。膜在如下环境中孵育：封闭缓冲液(2小时)、一抗(4℃过夜；1∶1000小鼠抗水母发光蛋白[开米康公司(Chemicon)]或1∶1000兔抗β-肌动蛋白[细胞信号转导技术公司(Cell SignalingTechnology)]，和二抗(90分钟；1∶20,000山羊抗小鼠[圣克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotechnology)]或1∶40,000山羊抗兔[密理博公司(Millipore)])。然后，膜经冲洗，置于化学发光溶液(Thermo Scientific)中，并用Syngene GBox成像。用Geneys软件(v1.2.4.0；Synoptics相机4.2MP)采集图像，并且用GeneTools软件(v 4.02；英国剑桥)评价各条带的荧光。值表示为相比对照动物的百分比。统计学采用SPSS(v.21)进行。

虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。本文具体提及的所有出版物和专利都通过引用全文纳入本文用于所有目的，包括描述和公开所述出版物报道的可与本发明关联使用的化学物质、设备、统计分析和方法。本说明书引用的所有参考文献都应看作对本领域技术水平的指示。本文中所有内容均不应解释为承认本发明不能凭借在先发明而先于这些公开内容。

II.本发明

在美国，每年有约795,000人受缺血性中风影响，其预计每年耗费737亿美元。钙在各种神经元信号转导级联中是关键的，然而，局部缺血过程中，过量钙流入可触发兴奋毒性细胞死亡。钙结合蛋白协助神经元调节/缓冲局部缺血过程中的胞内钙水平。水母发光蛋白是分离自水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的钙结合蛋白，并且已被用作钙指示剂多年，但其神经保护性的性质几乎不为人知晓。当前研究采用体外大鼠脑切片制备物来测试如下假设：脱辅基水母发光蛋白(水母发光蛋白的钙结合组分)的海马内输注能保护神经元免于缺血性细胞死亡。双侧插管的大鼠的一个半球接受脱辅基水母发光蛋白输注，而另一半球接受载剂对照。然后，制备海马切片并经历5分钟的氧-葡萄糖剥夺(OGD)，通过台盼蓝排除法测定细胞死亡。脱辅基水母发光蛋白剂量依赖性地保护神经元免于OGD-1％和4％(但非0.4％)的剂量显著减少台盼蓝标记的神经元的数量。该作用也是时间依赖性的，持续长达48小时。该时间依赖性作用与细胞因子和趋化因子表达的变化平行，指示脱辅基水母发光蛋白可通过神经免疫调节机制保护神经元。这些数据支持如下假设：采用脱辅基水母发光蛋白的预处理保护神经元抵抗缺血性细胞死亡，并且可具有有效神经治疗性。

水母发光蛋白是光-蛋白质，其初始分离自发光水母和其它海洋生物体。水母发光蛋白复合物包含22,285-道尔顿的脱辅基水母发光蛋白蛋白、分子氧和发光体腔肠荧光素。当三个Ca²⁺离子结合至该复合物时，腔肠荧光素被氧化成腔肠荧光素酰胺(coelentermide)，伴随二氧化碳和蓝光的释放。水母发光蛋白不通过细胞输出或分泌，在细胞内也不被划分或隔离。因此，水母发光蛋白测量法已被用于检测相对较长的时间段内出现的Ca²⁺变化。在若干实验系统中，水母发光蛋白的发光在细胞加载后的多个小时至多天后是可检测。还已知水母发光蛋白也不破坏细胞功能或胚胎发育。

因为其Ca²⁺依赖性发光，水母发光蛋白复合物已被广泛用作胞内Ca²⁺指示剂。具体地，维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)水母发光蛋白已被用于：(1)分析单一肾上腺嗜铬细胞对烟碱胆碱能激动剂的分泌响应；(2)阐明Ca²⁺释放在心肌损伤中的作用；(3)显示Ca²⁺在受精过程中的大量释放；(4)研究肌质网Ca²⁺泵表达在发育中的小鸡成肌细胞中的调节；和(5)校准注射体积低至三皮升的微量吸移管。

脱辅基水母发光蛋白的分子量大约是22kDa。通过减少脱辅基水母发光蛋白中的二硫键，脱辅基水母发光蛋白可用于再生水母发光蛋白。钙加载的脱辅基水母发光蛋白保留与包含结合的底物的未反应的光蛋白相同的紧凑支架和总体折叠方式。

水母发光蛋白从水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的常规纯化需要费力的提取操作且有时会产生基本上异质的或对在研生物体具有毒性的制备物。一般而言，两吨水母产出约125mg的纯化的光蛋白。不同的是，重组水母发光蛋白优选通过从遗传工程改造的大肠杆菌纯化脱辅基水母发光蛋白，然后通过用纯腔肠荧光素体外重建水母发光蛋白复合物来产生。本发明中所用的脱辅基水母发光蛋白已经描述且可通过本领域技术人员已知的纯化方案和/或合成法市售获得。S.Inouye，S.Zenno，Y.Sakaki和F.Tsuji.脱辅基水母发光蛋白的高水平表达与纯化(High level expression and purification ofapoaequorin).(1991)Protein Expression and Purification 2，122-126。

水母发光蛋白是分离自腔肠动物维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的CaBP。水母发光蛋白属于CaBP的EF-手(hand)家族，其中EF-手环与哺乳动物中的CaBP紧密相关。此外，水母发光蛋白已被用作Ca²⁺指示剂多年，并且已显示是细胞安全且良好耐受的。然而，迄今为止，尚无人研究其治疗潜力。水母发光蛋白由两组分组成——钙结合组分脱辅基水母发光蛋白(AQ)和化学发光分子腔肠荧光素。因为该蛋白质的AQ部分包含钙结合结构域，所以AQ用于当前研究中。

对于当前实验，我们采用短时间海马脑切片中的整体局部缺血的体外模型。在短时间海马切片中，OGD诱导的损伤在海马体的区域CA1中最为明显，类似于体内观察到的情况。短时间海马切片具有优于采用细胞培养物和体内模型的多项益处，包括，组织形貌与完整动物相对没有变化，胞外离子浓度变化和神经递质释放类似于体内报告的情况，和，不存在体内无法控制的血管或其它全身性响应。在再灌注的前30分钟内观察到短时间切片中的OGD后的神经元的损伤，然而，由于切片的短寿命，仅能分析局部缺血中的早期变化。因为海马神经元在局部缺血之后易于出现细胞死亡，我们测试了如下假设：在缺血性损伤之前给予时，AQ直接输注进入海马体将具有神经保护性。

本发明涉及给予对象含脱辅基水母发光蛋白的组合物，以总体上纠正或维持该对象中的钙平衡。理解血浆和体液中的离子型钙浓度的维持对于许多身体功能而言是关键的，包括但不限于神经元兴奋性、肌肉收缩、膜透性、细胞分化、激素分泌、骨矿物化，或局部缺血之后细胞死亡的预防。据悉，钙自稳态破坏，即，钙失衡，将造成和/或相关于多种疾病、综合征和病症。示例性的疾病、综合征和病症包括与睡眠质量、能量质量、情绪质量、记忆质量和痛知觉相关的那些。CaBP的研究已导致它们被识别为在维持合适离子型钙水平中起作用的保护性因子。

在某些实施方式中，本发明的方法包括给予脱辅基水母发光蛋白作为唯一活性成分用于提供神经保护，用于延迟神经元炎症的进展，用于预防神经元炎症的发作，和用于预防和/或治疗神经元炎症的复发。在某些实施方式中，本发明提供了包括给予脱辅基水母发光蛋白和具有已知治疗或营养价值的一种或多种其它试剂的方法。

本文所用术语“治疗”包括预防性以及失调缓解性治疗。本文所用术语“降低”、“减少”、“缓解”、“阻止”和“抑制”具有其通常理解的减少或减小的含义。本文所用术语“发展”表示范围或严重程度的增加、前进、生长或恶化。本文所用术语“复发”表示疾病在缓解后重新发生。

本文所用术语“给予”表示使患者、组织、器官或细胞接触脱辅基水母发光蛋白。本文中所用的给予可体外进行，即，在试管中，或体内进行，即，在活生物体(例如，人类)的细胞或组织中。在优选的实施方式中，本发明包括向患者或对象给予本发明中有用的组合物。本文中″患者″或″对象”具有等同含义，指哺乳动物，优选人，其：(1)具有可通过给予脱辅基水母发光蛋白治愈或治疗的神经元炎症；或(2)易感于可通过给予脱辅基水母发光蛋白预防的神经元炎症。

本文所用术语“有效量”和“治疗有效量”指足以产生所需治疗响应而没有过度不良副作用(如毒性、刺激性或过敏性响应)的活性试剂的量。具体的“有效量”显然将随多种因素而变化，例如所治疗的具体病症、患者身体状况、治疗的动物类型、治疗持续时间、同步治疗(如果有)的性质和采用的具体制剂和化合物或其衍生物的结构。在该情况中，如果一定量导致如下情况中的一种或多种：(1)预防神经元炎症；和(2)使神经元炎症逆转或稳定，则认为该量是治疗有效的。可由本领域普通技术人员使用常规实验容易地确定最佳有效量。

在用于经口给予对象的某些优选的组合物中，脱辅基水母发光蛋白与至少一种可接受的运载体以约10mg/剂量的剂量配置，剂量优选是胶囊形式，具有对于对象的约10mg/天(即，一胶囊/天)的推荐的剂量。

本发明的组合物包括液体或冻干的或其它情况下干燥的制剂，并且包括多种缓冲物质(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)的稀释剂、pH和离子强度、添加剂例如白蛋白或明胶以预防表面吸收，去污剂(例如，吐温20、吐温80、普朗尼克F68、胆汁酸盐)、增溶剂(例如，甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，硫汞撒、苄醇、对羟基苯甲酸酯类)、膨胀物质或紧张调节剂(例如，乳糖、甘露醇)、聚合物例如聚乙二醇与蛋白质的共价连接、与金属离子的配合，或将材料引至聚合物化合物例如聚乳酸、聚乙醇酸，或水凝胶的微粒制剂之内或之上，或引至脂质体、微乳液、胶束、薄片或多层载剂、红细胞血影或原生质球之上。所述组合物将影响物理态、溶解性、稳定性、体内释放速率，和体内清除速率。控制的或缓释组合物包括亲脂库(例如，脂肪酸、蜡、油)形式的制剂。

本发明还涵盖给予包被有聚合物(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)的微粒组合物的方法。组合物的其它实施方式纳入微粒形式保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透性增强剂，用于多种给予途径，包括胃肠外、经肺、经鼻和经口。在某些实施方式中，组合物通过如下方式给予：胃肠外、癌旁侧(paracancerally)、穿粘膜、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内或瘤内。

此外，本文中所用的″药学上可接受的运载体″是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于，0.01-0.1M，且优选0.05M磷酸盐缓冲液或0.9％盐水。此外，所述药学上可接受的运载体可以是水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的示例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括水、醇溶液/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。

胃肠道外载剂包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液和固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、调理剂(collatingagent)和惰性气体等。

本发明的含脱辅基水母发光蛋白的组合物尤其可用于配制成药物可注射剂量的的形式，包括脱辅基水母发光蛋白与可注射运载体系统的组合。如本文所用，可注射和输注剂型(即胃肠外剂型)包括但不限于脂质体注射剂或脂双层载剂，其具有将活性药物包封在内的磷脂。注射包括胃肠道外使用的无菌制备物。

UPS定义了5种不同类别的注射剂：乳液、脂质、粉末、溶液和悬液。乳液注射剂包括一种包含用于胃肠道外给药的无菌无热源制备物的乳浊液。用于溶液注射的脂质复合物和粉末经无菌制备，旨在经重建以形成胃肠外使用的溶液。悬液注射的粉末经无菌制备，旨在经重建以形成胃肠外使用的悬液。经冻干用于脂质体悬液注射的粉末是无菌冷冻干燥制剂，旨在经重建以胃肠外使用，其以允许脂质体(例如具有磷脂的脂双层载剂，该磷脂用于将活性药物纳入脂双层内或水性空间中)纳入的方式配制，从而可在重建后形成所述制剂。用于溶液注射剂的冻干粉末为通过冻干(“冷冻干燥”)制备的用于溶液的剂型，过程涉及在极低压下从冷冻状态的产物中去除水分，随后加入液体产生在所有方面均符合注射要求的溶液。经冻干用于悬液注射的粉末是液体制备物，旨在胃肠外使用，其含有在合适的液体介质中悬浮的固体，且其在所有方面符合无菌悬液的要求，从而通过冻干制备用于悬液的药物制剂。溶液注射剂涉及液体制备物，其包含一种或多种溶解于适合注射的合适溶剂或相互混溶的溶剂混合物中的药物物质。溶液浓缩注射剂涉及用于胃肠道外使用的无菌制备物，在加入合适的溶剂时产生在所有方面均符合注射要求的溶液。悬液注射剂涉及(适合注射的)液体制备物，包含分散于液相中的固体颗粒，所述颗粒是不溶性的，油相分散于水相或反之。悬液脂质体注射剂是(适合注射的)液体制剂，其以形成脂质体(一种脂双层载剂，通常含有用于将活性药物包封在脂双层内或水性空间中的磷脂)的方式具有分散在整个水相中的油相。悬液超声注射剂是(适合注射的)液体制备物，其含有分散在整个水相中的固体颗粒，从而颗粒不可溶。此外，在气体从悬液中冒泡时，可对该产物进行超声处理，使得固体颗粒形成微球。

胃肠外运载体系统包括一个或多个药学上合适的赋形剂，例如溶剂或共溶剂、增溶剂、润湿剂、悬浮剂、增稠剂、乳化剂、螯合剂、缓冲剂、pH调节剂、抗氧化剂、还原剂、抗菌防腐剂，膨胀剂、保护剂、张力调节剂和特殊的添加剂。

根据本发明可给予的控制的或缓释组合物包括亲脂库(例如，脂肪酸、蜡、油)形式的制剂。本发明还涵盖包被有聚合物(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)和偶联至抗体的化合物的微粒组合物，所述抗体导向针对组织特异性受体、配体或抗原或偶联至组织特异性受体的配体。

根据本发明可给予的组合物的其它实施方式纳入微粒形式保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透性增强剂，用于多种给予途径，包括胃肠外、经肺、经鼻、经眼和经口。

通过共价连接水溶性聚合物例如聚乙二醇、聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸修饰的化学实体已知在静脉内注射之后显示的血液半衰期基本长于对应未修饰化合物。所述修饰还可增加化学实体在水性溶液中的溶解性，消除聚集，增强该化合物的物理和化学稳定性，并且大幅减小该化合物的免疫原性和反应性。因此，所需体内生物活性可通过相比未修饰的实体，给予较小频率或较低剂量的所述聚合物-实体加合物(abduct)来实现。

而根据本发明的另一方法，所述组合物可以控释系统的形式递送。例如，所述物质可使用静脉输注、植入式渗透泵、透皮贴片、脂质体或其它给予模式给予。在一个实施方式中，可使用泵。在另一个实施方式中，可采用聚合材料。而在另一个实施方式中，控释系统可置于治疗靶标(即，脑)附近，因此仅需要全身性剂量的一部分。

所述组合物可仅包含脱辅基水母发光蛋白，或可还包括药学上可接受的运载体，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、粉末、胶囊、团块、溶液、悬液、酏剂、糖浆、饮品、乳液、凝胶、乳膏、经眼制剂，或栓剂，包括直肠和尿道栓剂。药学上可接受的运载体还包括树胶、淀粉、糖、纤维素材料，及其混合物。所述包含脱辅基水母发光蛋白的组合物可通过，例如，皮下植入团块来给予患者。在另一个实施方式中，团块提供一段时间内脱辅基水母发光蛋白的控释。组合物还可通过静脉内、动脉内、肌内注射液体液体，经口给予液体或固体，或通过局部应用来给予。给予还可通过利用直肠栓剂或尿道栓剂来进行。

本发明可给予的组合物可通过已知溶解、混合、粒化，或片剂形成工艺来制备。对于经口给予，脱辅基水母发光蛋白或其生理耐受的衍生物例如盐、酯、氮氧化物等与常规用于该目的的添加剂混合，例如载剂、稳定剂或惰性稀释剂，并且通过常规方法转化成适于给予的形式，例如片剂、包被的片剂、硬或软明胶胶囊、水性、含醇或油性溶液。

合适的惰性载剂的实例是常规片剂基质，例如乳糖、蔗糖，或玉米淀粉，其联合粘合剂例如阿拉伯树胶、玉米淀粉、明胶，伴随崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸，或伴随润滑剂例如硬脂酸或硬脂酸镁。

合适的油性载剂或溶剂的实例是植物或动物油，例如葵花子油或鱼肝油。组合物可以干或湿颗粒形式发挥作用。对于胃肠外给予(皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)，化学实体或其生理学耐受的衍生物例如盐、酯、氮氧化物等被转化成溶液、悬液，或排出液(expulsion)，如果是物质习惯用法所需的并适于该目的，例如，增溶剂或其它助剂。

实例有无菌液体例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其它药学上可接受的佐剂。油的例子是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。通常，水、盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选的液体运载体，尤其对于注射溶液。

包含活性组分的组合物的制备是本领域熟知的。所述组合物可以如下形式制备，气溶胶形式，其被递送至鼻咽，或可注射形式，作为液体溶液或悬液；然而，还可制备适用于在注射前在液体中形成溶液或悬液的固体形式。该组合物也可被乳化。活性治疗成分常与赋形剂混合，所述赋形剂是药学上可接受的并且与所述活性成分相容。合适的赋形剂是，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，或其任何组合。此外，所述组合物可包含少量辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂，其增强所述活性成分的有效性。

活性组分可以中和的药学上可接受的盐形式配制成组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，其用无机酸形成，例如，盐酸或磷酸，或有机酸，例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。用游离羧基形成的盐还可源自无机碱例如钠、钾、铵、钙、或铁的氢氧化物，和有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

对于采用，例如，乳膏、凝胶、滴剂等的体表的局部给予，脱辅基水母发光蛋白或其生理耐受的衍生物以如下形式制备或施用：生理学可接受的稀释剂中的溶液、悬液，或乳液，用或不用药物运载体。

在本发明的另一方法中，活性组分可在载剂中递送，具体而言，脂质体(见Langer，Science 249：1527-1533(1990)；Treat等，《感染性疾病和癌症治疗中的脂质体》(Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer)，Lopez-Berestein和Fidler(编)，纽约Liss出版社，第353-365页(1989)。

脱辅基水母发光蛋白的盐优选药学上可接受的盐。然而，其他盐可用于本发明组合物或其药学上可接受的盐的制备。合适的药学上可接受的盐包括酸加成盐，其可通过例如混合脱辅基水母发光蛋白溶液与药学上可接受的酸溶液来形成，所述酸例如盐酸、硫酸、甲磺酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、乙酸、苯甲酸、草酸、柠檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸。

此外，本文所述的含脱辅基水母发光蛋白的组合物可以营养组合物的形式提供，其中脱辅基水母发光蛋白预防神经元炎症的多种有害作用的发作，或减小或稳定神经元炎症的多种有害作用。出于本说明书目的，术语″营养″或″营养组合物″指食物，或食物的部分，其提供医学保健益处，包括预防和/或治疗疾病。本发明所述营养组合物可仅含有脱辅基水母发光蛋白作为活性成分，或者还可包括混合食品补充剂(包括维生素、辅酶、矿物质、草本植物、氨基酸等)，其通过增加这类物质的总摄取量来补充饮食。

因此，本发明提供了向患者提供营养益处的方法，该方法包括给予患者含脱辅基水母发光蛋白的营养组合物的步骤。所述组合物一般包括″营养可接受的运载体″，其如本文中所述是适于经口递送的任何运载体，包括适于经口途径的前述药学上可接受的运载体。在某些实施方式中，本发明所述营养组合物包含食品补充剂，其基于功能定义为包括免疫加强剂、抗炎剂、抗氧化剂、抗病毒剂或其混合物。

免疫加强剂和/或抗病毒剂可用于加速伤口愈合和改善的免疫功能；并且，它们包括来自金花菊或紫锥花属(Echinacea)的草药的提取物，来自桑布卡属(Sambuca)的草药的提取物，和北美黄莲提取物。紫云英属(Astragalus)的草药的天然或加工形式也是有效免疫加强剂。紫云英刺激骨髓中干细胞和淋巴组织活性免疫细胞的发育。锌及其生物活性盐，例如葡萄糖酸锌和乙酸锌，也可作为免疫加强剂用于治疗普通感冒。

抗氧化剂包括天然的含硫氨基酸氨基酸大蒜素，其作用以增加血液中抗氧化剂酶的水平。草药或草药提取物，例如大蒜，其包含大蒜素，也是有效抗氧化剂。儿茶素，以及草药提取物例如包含儿茶素的绿茶，也是有效抗氧化剂。紫云英属(Astragalus)的提取物还显示抗氧化剂活性。生物黄酮素，例如槲皮黄酮、橘皮苷、芦丁，及其混合物，也是有效的抗氧化剂。生物黄酮素的主要有益作用可能是保护身体内的维生素C不被氧化。这使更多维生素C，或抗坏血酸，可被身体利用。

生物黄酮素例如槲皮黄酮也是有效抗炎剂，因而可用于本发明组合物。源自植物或草药的抗炎草药补充剂和抗炎化合物也可作为抗炎剂用于本发明组合物中。这些包括菠萝蛋白酶(菠萝中存在的一种蛋白酶)；茶和荨麻的提取物；姜黄、姜黄提取物，或姜黄素，分离自姜黄的一种黄色颜料。

可用于本发明的其它补充物可以是姜，其源自姜属(Zingiber)的草药。已发现这具有强心活性，这归因于化合物例如姜辣素和相关化合物姜烯酚(shogaol)，以及在头晕和前庭病症的治疗中提供益处。姜也有效于治疗恶心和其它胃部不适。

有助于重建软组织结构(尤其是重建软骨)的补充物可用于组合物，以处理关节炎和其它关节病症的疼痛。葡萄糖胺、硫酸盐葡萄糖胺、软骨素可源自多种来源，例如麋鹿鹿茸(Elk Velvet Antler)。海洋液体复合物，Ω3脂肪酸复合物，和鱼油也已知有利于治疗关节炎相关的疼痛。

有利于治疗偏头痛的补充物包括野甘菊和银杏(Gingko biloba)。野甘菊中的主要活性成分是倍半萜烯内酯欧苷菊，其抑制前列腺素的分泌，该分泌进而造成由血管中血管痉挛活性所致的疼痛。野甘菊还显示抗炎性质。鱼油，由于其血小板-稳定化和抗血管痉挛作用，还可用于治疗偏头痛。草药银杏(Gingko biloba)还有助于通过稳定动脉并促进血液循环来治疗偏头痛。

在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。

实施例

实施例1.采用脱辅基水母发光蛋白的预处理保护海马CA1神经元免于氧-葡萄糖剥夺。

材料和方法

对象

对象为142只成年雄性F344大鼠(平均年龄：4.0±0.1月龄；Harlan)。对象饲养于实验动物评估和认证委员会(AAALAC)级设施中，具有14小时亮-10小时暗周期，并且给予自由摄取的食物和水，分开豢养。

手术

在手术前至少一天和之后两天，给予大鼠布洛芬水(15mg/kg/天)。手术当天，大鼠用异氟烷麻醉并固定在立体定位装置上。在无菌条件下，将双侧26-号不锈钢引导插管植入背侧海马体(相对于前囱：AP-3.5mm，L±2.6mm，V-3.0mm)中。插管用不锈钢螺丝和丙烯酸骨水泥稳固至头骨。将不锈钢帽置于引导插管中以预防闭塞，并且，允许大鼠在输注前恢复至少7天。

海马内输注

水母发光蛋白由两种组分组成：脱辅基水母发光蛋白和腔肠荧光素。脱辅基水母发光蛋白组分(AQ)包含结合Ca²⁺的EF手[51]，因此是当前研究中所用的组分。对大鼠输注零Ca²⁺人造脑脊液(aCSF；以mM计：124.00NaCl、2.80KCl、2.00MgSO₄、1.25NaH₂PO₄、26.00NaHCO₃、10.00D-葡萄糖和0.40抗坏血酸钠)中的AQ，其还包含6％DMSO以促进AQ的神经元摄取。大鼠接受双侧输注(0.5μl/半球)超过60秒，然后将输注插管保持在原位，持续额外2分钟，以确保从尖部扩散出去。切开33-号输注插管以从引导插管冒出0.5mm。为确定AQ的剂量依赖性神经保护，对动物的一个半球(平衡的)输注0.4、1或4％AQ(w/v；昆西生命科学公司(Quincy Bioscience)，威斯康星州麦迪逊)，另一半球输注载剂。此外，对一大鼠亚组的两个半球输注载剂(0％AQ)以作为对照(各组n＝11)。

切片制备

为确定AQ对局部缺血的短时间脑切片模型的神经保护作用，采用94只雄性F344大鼠(平均年龄4.4±0.2月龄)。脑切片如先前描述从对照大鼠(0％AQ，n＝10)或从在输注后的如下时间点之一输注了AQ的大鼠制备：1小时(n＝10)、1天(n＝10)、2天(n＝10)、3天(n＝10)，或5天(n＝5)。简言之，大鼠用异氟烷深度麻醉，通过升主动脉灌注冰冷、氧化的(95％O₂/5％CO₂)蔗糖-CSF(以mM计：206.00蔗糖、2.80KCl、2.00MgSO₄、1.25NaH₂PO₄、1.00CaCl₂、1.00MgCl₂、26.00NaHCO₃、10.00D-葡萄糖和0.40抗坏血酸钠)，并且迅速切除脑并置于冰冷、氧化的蔗糖-CSF中。脑在插管位点附近封阻，并且在温度-控制的振动切片机(Vibratome)上切下400μm厚冠状切片，如先前描述。仅收集插管放置(且没有任何可见的插管痕迹)后即刻的前5个切片并用于下文所述实验。切片在网状网格上孵育，该网状网格浸没于35℃的氧化的(95％O₂/5％CO₂)aCSF(组成，以mM计：124.00NaCl、2.80KCl、2.00MgSO₄、1.25NaH₂PO₄、2.00CaCl₂、26.00NaHCO₃、10.00D-葡萄糖和0.40抗坏血酸钠)。1小时恢复后，切片经历5分钟氧-葡萄糖剥夺(OGD)以诱导局部缺血。OGD通过如下方式诱导：将切片转移至果糖-CSF(其中等摩尔浓度的果糖取代葡萄糖)的35℃溶液，其用95％N₂/5％CO₂(其中N₂替代O₂)起泡。OGD之后，切片转移至包含氧化的aCSF加0.2％台盼蓝(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)的35℃溶液，持续30分钟再灌注。台盼蓝穿透死细胞和死亡中的细胞，并且将它们染成蓝色，同时留下活细胞不被染色。然后，切片经室温简短漂洗，氧化的aCSF处理，并立即在10％中性缓冲的福尔马林中于冰箱内过夜固定。切片用30％蔗糖冷冻保护至少1天，之后，它们在低温恒温器以40μm细分分部，固着至明胶-包被的载片上、以渐增乙醇脱水，并盖上Permount封片物。

细胞计数

切片在配有数码相机(Olympus DP70)和10X物镜的正立显微镜(Olympus BX51)下视检。各40-μm分部中，对CA1细胞体层(齿状回的上叶尖部)拍摄照片。为了避免归因于最初海马切片制备所致的神经元损伤的过度染色，仅对内部分部拍照用于分析。然后，请不知晓处理条件的人员对整个图像中出现的台盼蓝染色的神经元计数。仅计数来自一个分部的数据。通过使来自AQ处理的半球的数据对载剂处理的半球进行标准化来评估各动物的神经保护百分比。

Western印迹分析

为确定AQ在输注后于背侧海马体中保持多久，对24只成年雄性F344大鼠(平均年龄4.2±0.1月龄)在两个半球中输注4％AQ。在输注后1小时(n＝4)、1天(n＝7)、2天(n＝7)或3天(n＝6)，大鼠用过量异氟烷麻醉，并切下脑，迅速在干冰上冷冻，并贮存于-80℃。从各大鼠切下两个双侧脑区域(分别是背侧海马体和腹侧海马体；dhpc和vhpc)并分开均质化。样品以4000rpm离心，上清液经移出并用Bradford蛋白测定试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫克里斯)检测。蛋白质样品经标准化(50或150μg/泳道)并上样进行SDS-PAGE(10％)。蛋白质采用半干转移装置(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫克里斯)转移至PVDF膜。然后，膜在封闭缓冲液(3％脱脂奶粉)中孵育2小时，然后，它们在一抗(4℃过夜；1∶5000小鼠抗水母发光蛋白[密理博公司(Millipore)，马萨诸塞州比勒利卡]或1∶1000兔抗β-肌动蛋白[细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technology)，马萨诸塞州波士顿])中孵育，然后二抗(90分钟；1∶5000山羊抗小鼠[圣克鲁兹生物技术公司(Santa CruzBiotechnology)，加利福尼亚州圣克鲁兹]或1∶5000山羊抗兔[密理博公司(Millipore)])孵育。然后，膜经冲洗(Tris-缓冲的盐水中的0.05％吐温20)，置于化学发光溶液(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology))中，并暴露于自动射线照相术薄膜(Hyperfilm MP)。采集图像并采用NIH图像J软件进行光密度法分析。如果条带的光密度值(减去各泳道的背景)比腹侧海马体条带的平均值高2个标准差，则认为该条带是阳性的。从该定量，观察到100％的1小时条带，83％的1天条带，29％的2天条带，0％的3天条带，和0％的vhpc泳道是阳性条带。与腹侧海马体做比较是因为这是不应包含AQ的近脑结构，因此用作阴性对照结构。

定量RT-PCR

十二只雄性大鼠(各3.8月龄)接受4％AQ的单边输注(如上所述)，并且在输注后1小时、1天或2天(每组n＝4)收集组织。海马被切除并立即置于TRIzol试剂(生命技术公司(Life Technologies Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。组织采用25-号针头和注射器均质化，并且样品贮存于-80℃直至RNA分离。全部组织的RNA分离采用TRIzol方法(生命技术公司(Life Technologies Corp)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，按照生产商说明，同时进行。分离的RNA溶解于50μl无RNA酶H₂O中，并且基于260nm和280nm的吸光度比值来计算RNA纯度。1.8和2.1之间的吸光度读取被视为充分纯以进行反转录。具有小于1.8的比值的样品采用凯杰RNeasy MinElute清理试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州巴伦西亚)按照生产商说明进一步纯化，并将纯化的RNA重悬于50μl的无RNA酶H₂O中。采用凯杰RT2HT第一链试剂盒-96(凯杰公司(Qiagen))将全部样品的总RNA反转录成cDNA。样品一式三份在96孔板中纯化，采用对大鼠IL-10和β-肌动蛋白特异的引物(RT2 qPRC引物测定；凯杰公司(Qiagen))和RT²SYBR Green qPCR主混物(凯杰公司(Qiagen))，在StepOne实时PCR系统和软件(生命技术公司(Life Technologies Corp.)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)上进行。相对于载剂处理，采用AQ处理的IL-10基因表达的变化用Pfaffl等式计算，对各时间点的对应样品中的β-肌动蛋白表达标准化，并与分离自各大鼠载剂处理的海马做比较。引物效率基于针对IL-10和β-肌动蛋白的两份随机选择的样品的稀释曲线计算。相较于输注aCSF的组织，AQ输注未改变β-肌动蛋白表达，指示AQ输注一般不或不会具体地影响基因转录。

基因表达阵列

cDNA取自大鼠，用于RT-PCR(见方法)。PCR分析针对炎性细胞因子和受体的总体遗传标志物，采用凯杰公司(Qiagen)的RT2 Profiler阵列，按照生产商方案进行。简言之，合并2X RT2 SYBR Green主混物、cDNA(见上文)和无RNA酶的水，然后向96-孔PCR Profiler阵列孔板的各孔添加25μl的该混合物。样品采用StepOne实时PCR系统和软件处理，具有多条解链曲线的那些样品从分析排除(排除的n＝2)。总共需从该研究排除一只动物，因为其基因表达与平均值总体相差超过两个标准差。基因表达变化采用凯杰公司(Qiagen)的基于网络的RT2 Profiler PCR阵列分析软件v3.5计算。

数据分析和统计学

统计学分析进行采用Statview(v 5.0；SAS研究院有限公司，北卡罗来纳州卡莉)进行。ANOVA用于评价治疗作用。费舍尔PLSD用于因果关系比较。数据以平均值±平均值的标准误形式报告。

结果

氧-葡萄糖剥夺导致显著细胞死亡

制备短时间海马切片，暴露于5分钟的氧-葡萄糖剥夺(OGD)，并通过将它们转移至包含台盼蓝的氧化的aCSF来染色(见方法)。如图1所示，OGD导致的细胞死亡显著多于未经历OGD的对照切片。ANOVA分析缺血性或非缺血性条件中台盼蓝染色的细胞的平均数量显示局部缺血的统计学显著作用，F(1，12)＝9.65，p＜.01。这些结果与先前指示OGD导致海马体CA1区域中显著细胞死亡的研究[52]一致。

采用脱辅基水母发光蛋白处理的减少的细胞死亡

为了测试在OGD之前海马内输注脱辅基水母发光蛋白(AQ)的潜在的神经保护作用，大鼠在OGD前24小时输注0、0.4、1或4％的AQ(见图2A)。AQ以剂量依赖性方式发挥神经保护作用，从而相较于载剂(0％AQ)输注，在局部缺血之前海马内输注1％或4％AQ导致神经保护的显著增加，F(3，40)＝3.61，p＜.05(图2B和C)。因果关系分析揭示，相对于0％AQ组，输注1或4％AQ显著增强了神经保护，p＜.01，并且输注0.4％AQ与任何其它组不具有统计学差异。还值得注意的是，神经保护的量在1％和4％AQ处理组之间无差异。

为评价AQ起神经保护作用的时程，在OGD之前多个时间点(1小时、1天、2天、3天或5天)对大鼠输注4％AQ(图3A)。单向ANOVA指示，时间对于海马内输注AQ的保护神经元免于后续OGD的能力存在显著影响，F(5，49)＝3.35，p＜.05。因果关系测试揭示，AQ的神经保护作用需要至少1天来出现，并且它们持续至少2天(各时间点p＜.05)。当切片在AQ输注后3或5天经历OGD时，没有观察到统计学显著的神经保护(分别具有p＝.10和p＝.47)。

脱辅基水母发光蛋白的Western印迹分析

为确定海马内输注后背侧海马体中的AQ保持多久，在双侧输注4％AQ进入背侧海马体后不同时间(1小时、1天、2天或3天)采用Western印迹分析测试AQ蛋白水平。图3C说明在背侧海马体中，AQ在1小时和1天时存在，在2天时几乎不可见，并且截至输注后3天时不再存在。因此，1小时观察到100％的阳性条带，1天时观察到83％，2天时观察到29％，且3天泳道观察到0％。如同预期，未在腹侧海马体(vhpc)检测到AQ，其用作阴性对照结构，因为其远离注射位点(见图3C)。为确保足够蛋白质上样进入凝胶以允许观察到极弱的条带，对动物亚组重复Western印迹，但凝胶用150μg的蛋白质/泳道上样(而非正常的50μg/泳道)。在这些印迹中，额外条带在2天和3天泳道中展现，从而57％的2天和25％的3天泳道具有阳性条带，表明在背侧海马输注后长达3天，AQ在背侧海马体中仍可测得。重要的是，在样品针对β-肌动蛋白染色时，没有观察到时间依赖性变化，这表明这些差异反映了AQ存在时的时间依赖性变化，而不是蛋白质含量的一般变化(见图3C)。

AQ输注之后的细胞因子和趋化因子表达

在极少蛋白质存在的时间点上AQ的海马内输注导致显著神经保护，表明AQ可能触发一些事件级联，它们最终保护神经元免于缺血性损伤。一种可能是AQ诱导预调节样作用，导致稍晚时间点减少的细胞死亡。缺血性预调节是一种现象，通过该现象，短时缺血性事件减弱由后续更严重缺血性损伤造成的破坏。近期证据已显示，多种细胞因子和趋化因子与缺血性预调节相关联。鉴于缺血性预调节和细胞因子生成变化之间的联系，我们测试了如下假设：AQ输注可导致细胞因子或趋化因子表达增加，这可最终影响神经元耐受后续缺血性损伤的能力。采用RT-PCR来研究抗炎细胞因子白介素-10(IL-10)的mRNA变化，并且采用PCR阵列来观察AQ输注后的多种基因表达变化。成年大鼠在一个半球中接受4％AQ的输注，而在另一半球接受载剂，如本文所述(见方法)。在AQ输注后的不同时间点(1小时、1天或2天后)，切下海马并进行定量RT-PCR以评价时间和处理依赖性变化。单向ANOVA指示四个治疗组之间的显著差异，F(3，19)＝9.55，p＜.0005。因果关系分析揭示IL-10mRNA在AQ输注后1小时显著增加，相对于载剂处理的半球(p＜.001；参见图4A)。此外，该AQ诱导的1小时时的IL-10表达增强显著大于1天(p＜.001)或2天(p＜.001)时的增强。尽管IL-10表达在较晚时间点增加了2-3倍，这些与载剂处理的半球无统计学显著差异，表明1小时时观察到的IL-10的显著增加可归因于对AQ输注的短时间响应。

为研究AQ相关的细胞因子表达变化是否受限于IL-10而非mRNA表达模式中的更加整体变化的部分，进行PCR阵列。研究了与细胞因子和趋化因子响应相关的总共82个基因。在这些基因中，80个基因显示对照半球中的变化程度，且2个基因(CCR8，趋化因子受体8；和CRP，C-反应性蛋白)未测得。可测得的80个基因中，仅16个在AQ-和载剂处理的半球之间显著不同(见表1，数据按响应时间整理)。大部分基因在AQ输注后1小时增加，之后，截至1天时减少至或接近基线水平。在1小时显著上调的8个中，仅1个截至输注后2天时间点仍保持升高，趋化因子配体10(CXCL10)。6个基因在1小时未显著上调但在AQ输注后1天上调。这6个基因中，仅两个在2天时未保持升高-趋化因子配体11(CXCL11)和白介素-1受体II型(IL-1rII)。仅两个基因在AQ输注时间点后2天显著上调-趋化因子受体1(XCR1)和补体组分3(C3)。这些结果指示AQ输注进入背侧海马体在短期和长期时间点对于细胞因子和趋化因子mRNA表达具有巨大影响。

讨论

当前研究显示，钙结合蛋白脱辅基水母发光蛋白(AQ)在缺血性损伤之前给予时，具有时间和剂量依赖性方式的神经保护作用。海马内输注1％或4％AQ导致的死神经元或死亡中的神经元显著低于输注对照的动物(见图2)。该神经保护是时间依赖性，其中，它需用至多1或2天发展，并且在截至3至5天时减弱。神经保护可能涉及预调节样作用，由此AQ输注调节细胞因子和趋化因子表达，其后续保护神经元不受氧-葡萄糖剥夺(OGD)影响。

先前的研究已表明CaBP的神经保护性作用。例如，包含CaBP钙结合蛋白的神经元对于兴奋毒性和局部缺血相关的损伤的抗性高于缺乏钙结合蛋白的神经元。此外，一些研究已注意到，创伤性脑损伤和局部缺血之后，钙结合蛋白表达增加，这指示钙结合蛋白可能增加以维持Ca²⁺自稳态并保护抵抗兴奋毒性。同样地，采用基因治疗或蛋白质转导，CaBP在局部缺血之前的过表达也被发现是神经保护性的。不同的是，钙结合蛋白存在于齿状回(对缺血性细胞死亡具有抗性的区域)和CA1(易于细胞死亡的区域)已用于反驳钙结合蛋白在神经保护中的作用。最后，他人已报道从局部缺血的恢复在钙结合蛋白敲除的小鼠中有所增强。鉴于这些不是诱导型敲除，可能有其它补偿性机制在观察到的神经保护中发挥作用。

测试人造钙螯合剂(例如，BAPTA-AM、EGTA等)对兴奋毒性的作用的研究已具有混杂的结果，其中一些研究发现神经保护而另一些发现对细胞死亡增强的易损性。Nikonenko等显示在用EGTA、BAPTA、米贝拉地尔、可毒素(Kurtoxin)、镍、锌和哌咪清处理的切片中，OGD之后的大鼠器官型海马切片培养物的神经保护。相反，Abdel-Hamid和Baimbridge用钙螯合剂BAPTA-AM加载培养了海马神经元并在那些神经元中发现增强的谷氨酸兴奋毒性。这些作者表明存在人造钙螯合剂对于正常Ca²⁺依赖性机制的干扰，其防止Ca²⁺流入细胞。这些相反的结果可能归因于多种因素，包括诱导兴奋毒性的模式、所用Ca²⁺螯合剂的类型，或相较于短时间脑切片的培养的神经元的应用。

有趣的是，当AQ蛋白最容易在背侧海马体中检测到时，输注后1小时，未观察到神经保护(见图3)。尽管不知道AQ如何或是否进入细胞，当前研究采用DMSO伴随AQ用于输注，其用于运输药物穿过膜。因此，可能AQ有机会进入细胞。此外，用于Western印迹样品的离心过程经设计以分离细胞的胞内组分(通过低速离心)，并且这些样品中AQ的存在强烈表明其存在于细胞中。尽管显著神经保护在输注后1和2天时是明显的，背侧海马体中显现少得多的AQ(图3C)，这表明神经保护不仅由AQ结合Ca²⁺的即刻作用所致。此外，数据表明由AQ输注造成的事件级联导致神经保护。鉴于当蛋白质几乎不存在或未测到时(但非在AQ表达处于其最高点的1小时处)，在输注后1和2天观察到神经保护作用，该级联可能归因于其它AQ-触发性的机制，包括输注后预调节样作用。该类型的作用可能需要时间来发展，这可能解释了神经保护未被立即观察到(例如，输注后1小时)的原因。预调节还可解释稳健神经保护为什么在输注后1或2天观察到，无关于在这些时间点检测到较低蛋白质。尽管目前尚不知准确机制，研究已牵涉到预调节中的细胞因子和趋化因子。

为研究观察到的AQ输注后神经保护是否归因于预调节样作用，我们检测了IL-10mRNA的变化，其为预调节中已知涉及的一种抗炎细胞因子。输注后1小时观察到IL-10 mRNA的统计学显著增加。尽管不是统计学显著，在AQ输注后长达2天的时间中持续观察到IL-10mRNA的生物学显著(＞2倍)增加(见图4A)。抗炎细胞因子可通过招募通过细胞因子分泌具有保护性的细胞群来作用，这进而预防或下调对于破坏性促炎免疫响应的诱导，主动保护抵抗未来的损伤。AQ输注后1小时增加的IL-10表达发挥针对未来OGD损伤的保护性基础的作用，从而1-2天后，脑做好充分准备并能更好地抵抗缺血性损伤。该作用是短时的，从而截至AQ输注后3-5天，显现从几乎无到无的神经保护。

鉴于IL-10 mRNA在AQ输注后1小时增加，表明预调节样作用，采用多基因PCR阵列来评价AQ对于广泛多种细胞因子和趋化因子表达的作用(见表1)。这些研究揭示，相较于载剂处理的半球，AQ输注以时间依赖性方式差异性地调节多种细胞因子和细胞因子受体基因的表达。阵列中检测的总共82个基因中，16个在AQ输注后显著上调。在这16个基因中，显现时间依赖性作用，从而8个在AQ输注后即刻迅速上调，而剩下8个仅在1或2天延迟后上调。

表1. 4％AQ输注后的基因倍数变化，按响应时间分组

数字代表与载剂-输注半球相比的倍数变化(*p＜.05；p＜.01)。

AQ输注后上调的细胞因子中，预调节作用仅在四个中被检测到：(1)白介素-1β(IL-1β)、(2)IL-10、(3)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，和(4)补体组分3(C3)。这些细胞因子中全部四个已显示在预调节后增加。IL-1β，一种促炎细胞因子，已显示在预调节后6小时内增加，之后，它在3-4天内回到基线。这与现有研究相一致，其显示IL-1β mRNA的快速增加，然后在截至AQ后2天时回到基线水平(表1)。尽管IL-1β是促炎细胞因子，中等增加也可具有神经保护性。同样地，IL-10还显示预调节后的迅速增加，同样快速回到基线。我们现在采用定量RT-PCR(图4)和PCR阵列(表1)显示，IL-10在AQ输注后1小时显著上调。IL-10显示减少TNF-α的释放并减小大鼠中病灶局部缺血之后的脑损伤。预调节后，TNF-α迅速上调，持续长达2天，并且在3-4天之后不再被检测到。当前实验显示AQ输注后1小时的TNF-α基因表达的增加，但在AQ输注后1或2天并非如此。C3在脂多糖(LPS)预调节之后24小时显著上调。我们观察到AQ-输注后2天时的C3基因表达的显著增加。补体宿主防御系统(包括C3)的活化显示同时具有破坏性和保护性作用。总之，这些数据指示，当前实验中IL-1β、IL-10、TNF-α和C3的增加可能是AQ输注的神经保护作用的原因之一。

尽管预调节中仅检测到四个上调的细胞因子，但这16种几乎全部在脑局部缺血之后检测到。仅趋化因子配体-9(CXCL9)、趋化因子配体-11(CXCL11)和趋化因子受体-1(XCR1)未被检测到，就我们了解，先前检测了它们与脑局部缺血的关系。其它细胞因子中，全部显示局部缺血之后的增加，除了白介素-2受体，β(IL-2rβ)。正常条件下，IL-2rβ存在于海马CA1椎体神经元的细胞膜中。局部缺血之后，IL-2rβ不仅在CA1中减少，而且它还从细胞膜易位至胞质与核。局部缺血之后一些细胞因子发挥何种作用可能取决于它们的表达概况，这可影响它们何时或是否发挥神经保护性作用。例如，CD40配体在炎症和组织损伤中起作用，并且其在病灶局部缺血之后上调。然而，CD40配体还保护神经元免受神经元胁迫，而CD40配体缺陷则导致神经元功能障碍，指示CD40配体对于一般神经元功能是重要的。现有数据指示，CD40配体在AQ输注后1和2天显著增加。该CD40配体的持续增加可影响我们观察到的神经保护的时程。尽管超出了现有研究范围，它将是重要的(并且数据表明值得研究)对于采用局部缺血的体内模型进一步评估AQ在较长时程中的神经保护作用。

总之，当前实验支持如下假设：在缺血性损伤之前直接给予脑时，AQ保护神经元免于局部缺血。这些作用是剂量和时间依赖性的，从而单一AQ的海马内输注保护神经元不受OGD影响长达2天。此外，AQ输注以与缺血性预调节中所见那些相似的方式活化细胞因子和趋化因子基因表达。因此，采用AQ的预处理可能是通过以化学预调节剂形式发挥作用来保护神经元免于缺血性中风的有效途径。

实施例2.海马内输注脱辅基水母发光蛋白对细胞因子蛋白质表达的作用。

在先前的实验中，我们实验室已显示体外缺血性损伤前24和48小时的单次AQ的海马内输注显著减少细胞死亡(Detert等，2013)。还已发现AQ输注后存在细胞因子mRNA的同时变化，包括白介素-10(IL-10)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α；Detert等，2013)。这些数据指示，AQ的神经保护性的机制可涉及某些抗炎和促炎分子的调节，可能涉及预调节样作用。设计当前研究以进一步研究细胞因子蛋白质表达在AQ的海马内输注之后是否以时间依赖性方式变化。通过集中于蛋白质水平的可能变化，我们希望获得对于AQ调节多种细胞因子至何种程度的更好理解，并最终了解AQ保护神经元免于氧-葡萄糖剥夺影响的机制。

我们实验室先前已显示将脱辅基水母发光蛋白(AQ)输注进入海马体的CA1区域能以时间和剂量依赖性方式发挥神经保护性作用(Detert等，2013)。

显著神经保护在AQ输注后1和2天但非1小时观察到。这与改变的细胞因子mRNA表达平行出现，表明该缺血性神经保护可能涉及神经免疫调节响应(Detert等，2013)。

温和胁迫刺激的诱导可通过炎性细胞因子表达的调节来触发缺血性预调节(Gidday，2006)。

IL-10保护神经元不受缺血性损伤影响，在体外和体内皆如此(Grilli等，2000)。

IL-10抑制TNF-α(一种促炎细胞因子)的上调，其涉及出血性中风的病理机制(Ewen等，2013)。

当前实施例显示AQ的海马内输注启动神经免疫调节响应，其触发IL-10和TNF-α蛋白表达的变化。支持该结论的数据示于图5、6A-B、7A-D和8A-C。

实施例3.钙结合蛋白脱辅基水母发光蛋白的神经治疗作用。

钙-结合蛋白(CaBP)减少缺血性细胞死亡。

我们实验室的数据显示，CaBP脱辅基水母发光蛋白(AQ)在体外局部缺血之前输注进入背侧海马体时具有神经保护性，并且导致IL-10和TNF-α mRNA的时间特异性升高，表明AQ在预调节中的作用(Detert等，2013)。

当前实施例显示，单次AQ海马输注将差异性地调节IL-10和TNF-α蛋白表达。

钙毒性在正常衰老中显见。根据衰老的钙假设，钙自稳态的失调导致正常衰老中的认知减退(Khachaturian，1987)。

存在CaBP的年龄相关的减少(DeJong等，1996；Bu等，2003；Moyer等，2011)，并且，我们实验室的结果显示海马体(对于痕迹性恐惧学习中要的结构(McEchron等，1998))中减少的CaBP表达。痕迹性恐惧条件反射在正常衰老中是受损的(Villarreal等，2004；McEchron等，2004；Moyer等，2006)。减少过量的钙导致衰老动物中改善的认知功能(Deyo等，1989；Veng等，2003)。

该实施例还显示，单次AQ海马输注将减轻痕迹性恐惧条件反射获得中的年龄相关的缺陷。

经口给予用作递送方法。采用榛子酱或花生酱作为载剂，向大鼠递送化合物可经口完成(Isaksson等，2011；Cundell等，2003)。

我们实验室的近期数据显示AQ在体外局部缺血之前以单一剂量经口给予时是神经保护性的(Adams等，SfN 2013)。该实施例还显示AQ经口给予的神经保护作用是剂量和时间依赖性的。

图9A-C、10A-C和11A-C支持下述结论。AQ的直接输注导致相对于载剂改变的IL-10和TNF-α蛋白表达。IL-10和TNF-α均显示AQ输注后的差异性的表达概况，指示AQ的神经保护作用可能通过免疫调节响应介导。

AQ输注未援救衰老动物中的痕迹性恐惧学习障碍，并且其未干扰成年动物中该任务的学习。相对于成年动物，衰老大鼠在调理后24小时显示减少的僵直，但如同预期，AQ给予未导致衰老大鼠增加的僵直。

经口给予AQ导致时间和剂量依赖性的神经保护。48mg/kg的AQ剂量，7天的经口给予导致局部缺血之后细胞死亡的显著减少。

实施例4.AQ的经口给予在短时间切片模型中有神经保护性。

我们实验室近期显示，脱辅基水母发光蛋白(AQ)在称为氧葡萄糖剥夺(OGD)的缺血性中风的短时间脑切片模型中具有神经保护性。接受4％AQ输注的大鼠显示OGD之后减少的细胞死亡(Detert等，2013)。

该实施例显示细胞死亡的减少归因于免疫调节机制，涉及细胞因子mRNA的时间依赖性变化。

经口给予化合物至大鼠通过采用榛子酱(Isaksson等，2011)或花生酱(Cundell等，2003)作为载剂来完成。近期，AQ已显示在通过管饲法给予大鼠时是无毒的(Moran等，2013)。经口给予在载剂(例如花生酱)中递送的AQ的侵入性低于其它方法(例如病毒递送、直接输注或管饲法)，并且经口递送系统能够通用至人研究。

该实施例显示，AQ的经口给予保护神经元免疫氧葡萄糖剥夺诱导的细胞死亡。

方法

药物.脱辅基水母发光蛋白(AQ；昆西生命科学公司(Quincy Bioscience))在双去离子水中以7.4％的浓度制备。剂量依赖性实验(n＝18)中，实验组接受混入它们的每日PB中的0(n＝4)、3.6(n＝5)、48(n＝4)、240(n＝3)，或480mg/kg的AQ。对于研究的剩余者，大鼠(n＝73)接受拌入它们的每日PB的48mg/kg的AQ。动物分配至五组之一；无AQ(n＝12)、1小时AQ(n＝17)、1天AQ(n＝15)、2天AQ(n＝15)，和7天AQ(n＝14)。每天，大鼠于指定时间接受置于笼内皮氏培养皿中的1/4茶勺的PB。直至全部PB被消耗之后再移走培养皿。动物每周两次称重，以维持合适AQ剂量。

氧-葡萄糖剥夺.给药的最后一天，PB消耗之后，允许大鼠消化1小时，然后用异氟烷深度麻醉，并采用标准程序(Moyer和Brown，2007)制备背侧海马体(dhpc；前囱^-3.14-^-4.16；Paxinos和Watson，1998)的冠状切片(400μm)。切片在aCSF中恢复1小时之后，各脑的一个半球(平衡的)，通过转移切片至氧-葡萄糖剥夺室(葡萄糖用果糖替代，并用95％N₂-5％CO₂起泡以替代95％O₂-5％CO₂)持续5分钟来经历体外局部缺血，而另一半球保持恢复。然后，全部切片被置于包含0.2％台盼蓝的氧化的aCSF中，进行30分钟再灌注阶段。台盼蓝对死细胞染色，但不染活细胞(DeRenzis和Schechtman，1973)。切片在氧化的室温aCSF中漂洗两次，然后在10％中性缓冲的福尔马林中于冰箱内固定过夜。然后，切片在30％蔗糖中冷冻保护，在低温恒温器上切片(40μm)，并封固在包埋载片上供于细胞计数。

Western印迹.动物用异氟烷深度麻醉，迅速切除脑、冷冻，并贮存于-80℃。解剖时间后，从dhpc(前囱^-3.14-^-4.16mm)切下样品。样品经均质化，以4000RPM离心20分钟，移去上清液，蛋白质采用Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad)检测。蛋白质样品经标准化并上样用于SDS-PAGE(12％)。蛋白质(30μg)采用Turbo转膜系统(Bio-Rad)转移至PVDF膜。膜在如下环境中孵育：封闭缓冲液(2小时)、一抗(4℃过夜；1∶1000小鼠抗水母发光蛋白[Chemicon]或1∶1000兔抗β-肌动蛋白[Cell Signaling Technology]，和二抗(90分钟；1∶20,000山羊抗小鼠[圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)]或1∶40,000山羊抗兔[Millipore])。然后，膜经冲洗，置于化学发光溶液(Thermo Scientific)中，并用SyngeneGBox成像。用Geneys软件(v 1.2.4.0；Synoptics相机4.2MP)采集图像，并且用GeneTools软件(v 4.02；英国剑桥)评价各条带的荧光。值表示为相比对照动物的百分比。统计学采用SPSS(v.21)进行。

概述

图12、13A-C、14A-D、15A-B和16支持如下结论：脱辅基水母发光蛋白的神经保护作用是剂量依赖性的。经口给予时，48mg/kg剂量的AQ保护免于OGD诱导的细胞死亡。

脱辅基水母发光蛋白具有持久神经保护作用。接受1小时、1天、2天或7天经口给予AQ的大鼠的脑切片显示神经保护。

脱辅基水母发光蛋白给予改变细胞因子蛋白质表达。

TNF-α蛋白表达在2天经口给予AQ后增加，而IL-10蛋白质表达保持不变。

输注时，相较于载剂输注的半球，IL-10蛋白质表达在1小时时增加。此外，TNF-α在1天时增加，并且之后蛋白质水平降至基线下。4.脱辅基水母发光蛋白的神经保护作用由IL-10中和抗体逆转。

体外OGD前1天输注时，若与IL-10nAb成对，AQ的神经保护作用被消除。

现有数据表明，AQ的神经保护作用涉及IL-10；其通过IL-10的中和或下游级联。

应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。

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Claims

1.一种预调节神经元以减少对象中的神经元炎症的方法，其包括：给予对象脱辅基水母发光蛋白，其中所述对象的神经元经预调节以减少神经元炎症。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述给予通过注射进行。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述给予通过经口递送进行。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述组合物是单位剂型形式，所述单位剂型选自片剂或胶囊。

5.如权利要求3所述的方法，其中脱辅基水母发光蛋白以营养组合物的形式给予所述对象。

6.脱辅基水母发光蛋白，其用于预调节神经元以减少对象中的神经元炎症。

7.脱辅基水母发光蛋白在制备用于预调节神经元以减少对象中的神经元炎症的组合物中的用途。

8.一种降低对象中肿瘤坏死因子α(TNFα)蛋白质水平的方法，其包括：给予对象脱辅基水母发光蛋白，其中所述对象的TNFα蛋白质水平被降低。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述给予通过注射进行。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述给予通过经口递送进行。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述组合物是单位剂型形式，所述单位剂型选自片剂或胶囊。

12.如权利要求10所述的方法，其中脱辅基水母发光蛋白以营养组合物的形式给予所述对象。

13.脱辅基水母发光蛋白，其用于降低对象中的肿瘤坏死因子α蛋白质水平。

14.脱辅基水母发光蛋白在制备用于降低对象中肿瘤坏死因子α(TNFα)蛋白质水平的组合物中的用途。