CN107105634A

CN107105634A - 肿瘤抑制基因的杂合修饰和1型神经纤维瘤病的猪模型

Info

Publication number: CN107105634A
Application number: CN201580071457.4A
Authority: CN
Inventors: A.L.比加; D.F.卡尔森; S.C.法伦克鲁格
Original assignee: Recombinetics Inc
Current assignee: Recombinetics Inc
Priority date: 2014-11-12
Filing date: 2015-11-11
Publication date: 2017-08-29
Also published as: HK1242917A1; WO2016077429A1; US20160160238A1; AU2015346422A1; EP3218393A1; JP2017533716A; CA2967027A1

Abstract

公开了基因组修饰为具有一个或多个肿瘤抑制基因的杂合修饰的动物。

Description

肿瘤抑制基因的杂合修饰和1型神经纤维瘤病的猪模型

对相关申请的交叉引用

本申请要求提交于2014年11月12日的美国临时申请号62/078,857的优先权，该美国临时申请通过引用以其整体并入本文。

发明领域

该技术领域涉及遗传修饰的动物。

发明背景

1型神经纤维瘤病(NF1)是最流行的遗传病症之一，在每3,000名活产婴儿中发生一例，仅在美国就有超过100,000名受影响的人。NF1由神经纤维瘤蛋白1(Neurofibromin1,NF1)基因中的体细胞突变引起，其中50％的病例是遗传的，并且50％的情况是新的突变。NF1是一种令人虚弱的疾病，因为患者通常显示出骨骼异常、脊柱侧凸、学习失能、高血压和癫痫[1]。NF1患者也有可能在其身体的整个周围神经中发展称为神经纤维瘤的良性肿瘤。尽管神经纤维瘤是良性的，但它们可以引起显著的疼痛和移动性(mobility)问题。此外，继发性遗传变化引起在10％的患者中神经纤维瘤的恶性转化，导致恶性外周神经鞘瘤(MPNSTs)的发展[2]。MPNST是高度攻击性和致命的肉瘤，并且目前，MPNST的唯一治疗方案是完全手术切除或高剂量非特异性化疗[2]。由与神经紧密关联，手术切除经常不可行，并且化疗经常失败。虽然在为这些肿瘤开发靶向治疗方面已经付出了相当大的努力，但没有一个在临床上显示出显著的功效，并且MPNST仍然是NF1患者死亡的主要原因。除了多种其他肿瘤类型之外，NF1患者还具有发展为视神经胶质瘤、星形细胞瘤和幼年型骨髓单核细胞白血病的较高风险[3]。

附图简述

图1：人和猪NF1基因和蛋白的比对。NF1在人和猪之间是高度保守的。猪外显子42对应于人外显子40，并且该区域的氨基酸序列也是高度保守的。氨基酸精氨酸1947(R1947)经常在人患者中突变，并且该氨基酸在猪中是保守的。

图2：TALEN设计以在NF1猪基因中创建R1947X突变。猪NF1外显子42位于顶部。放大了外显子42以显示3个TALEN对的TALEN结合位点，以及精氨酸1947(R1947)氨基酸。

图3A-D：利用TALEN和同源性依赖性修复(HDR)来诱导猪NF1基因中的R1947X突变。A.NF1基因外显子42的野生型(WT)序列显示在顶部。设计用于该基因座的TALEN(ssNF142.3TALEN)，并且对TALEN结合位点加下划线(红色)。设计了90碱基对的HDR寡聚物以诱导R1947X突变(大写字母是从野生型序列改变的碱基对)和用于RFLP分析的新型限制酶位点(红色，加下划线)。下面显示了所得的R1947X等位基因。B.在30摄氏度温育3天后，细胞群的RFLP分析显示了所有三个TALEN都能够以不同的速率诱导HDR，其中ssNF1 42.1是最有活性的(54.2％等位遗传修饰)，ssNF1 42.2是中等活性的(45.1％等位遗传修饰)以及ssNF142.3是所述3个TALEN中最低活性的(27.2％等位遗传修饰)。C.对24个克隆的RFLP分析显示了在365碱基对处的未切割(WT)条带和对应于位于191和174碱基对处的消化的HDR等位基因的条带。*指定了杂合克隆。D.对于两个克隆的测序分析显示了野生型等位基因和HDR等位基因两者。

图4A-C：TALEN活性与分离对于肿瘤抑制基因为杂合的克隆的能力相关。A.图形显示了根据RFLP为野生型、杂合，或纯合克隆的百分比，所述克隆分离自ssNF1 42.2处理的细胞，并与预测的比率比较。为了预测纯合克隆的百分比：(第3天RFLP活性)∧2。为了预测杂合克隆的百分比：(第3天RFLP活性X 2)(1-第3天RFLP活性)。对于具有比ssNF1 42.3更高的活性的ssNF1 42.2，观察到多得多的基因修饰，偏向于纯合KO克隆。B.对于ssNF1 42.3(具有较少活性的TALEN对)，如预期的，回收到较少的纯合KO克隆，并且野生型、杂合和纯合克隆的比率更接近于所预测的比率。C.图形显示了ssNF1 42.2和ssNF1 42.3TALEN的不同活性。选择通过RFLP的10个杂合克隆用于测序分析。具有比ssNF1 42.3高得多的TALEN活性的ssNF1 42.2导致90％的在野生型等位基因中具有插入/缺失(indel)的测序克隆，而来自ssNF1 42.3TALEN处理的细胞的仅30％克隆显示出插入/缺失。

图5：用于在猪中顺式修饰NF1和TP53的TALEN的设计。NF1和TP53位于猪的染色体12(人的染色体17)上极其接近。设计TALEN以创建NF1中的R1947X突变以及TP53中的Y155X突变。相对于期望突变的TALEN结合位点如上所示。

图6A-B：利用TALEN和同源性依赖性修复(HDR)来诱导猪NF1基因中的R1947X突变以及猪TP53基因中的Y155X突变。A.当共转染入原代猪成纤维细胞时，通过RFLP分析，ssNF142.3TALEN导致25.5％的等位遗传修饰，以及通过细胞分析，ssTP53E6TALENs导致11.8％的切割。B.针对24个克隆的RFLP分析显示了未切割的(野生型)条带和对应于针对NF1和TP53两者的消化的HDR等位基因的条带。*指定了杂合克隆。*指定了对NF1和TP53两者是杂合的克隆。RFLP分析显示出：通过RFLP，8.9％的克隆对NF1是杂合的，并且通过RFLP，3.7％的克隆对NF1和TP53两者是杂合的，但是所有被测序的克隆都包含NF1或TP53或两者的野生型等位基因上的插入/缺失。

图7：用于高限定熔解分析(high definition melt analysis)的熔解曲线鉴定TP53的杂合克隆。

图8A-C：NF1杂合猪表明增加的Ras活性。A，表显示了长白农场猪(Landrace FarmPig)和Ossabaw迷你猪SCNT实验的结果。B，野生型成纤维细胞(左)和NF1R1947X/+纤维细胞(右)的Western印迹。染色显示了突变体细胞中增加的Ras活性。在0、5和15分钟收集细胞裂解物。C.相对于总Ras(顶部)或GAPDH(底部)标准化的Ras-GTP。在两个分析中，相较于NF1野生型细胞，NF1R1947X/+(NF1Het)细胞显示出增加的Ras活性。

图9A-D：NF1杂合猪具有NF1相关的表型。所有出生的NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪显示出不同程度的色素沉着不足。所有的仔猪在它们的脸上显示棕褐色/棕色色素沉着不足(9A,顶部)并且一头仔猪在其背部显示白色色素沉着不足(9A,底部)。9B.通过大体观察(gross observation)(9B,左)和X射线成像(9B,右)，NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪中的两头在尸检时出现脊柱弯曲和潜在的脊柱侧凸症状。约有20％的NF1患者记载了脊柱侧凸。9C.表鉴定了在许多NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪中的一头中观察到存在多个牛奶咖啡斑(caféau lait spot)。9D,1-4是在9C中鉴定的斑的照片。

发明详述

虽然已经开发出数种小鼠模型来研究NF1，但是小鼠模型在其模拟(model)人类疾病的能力方面具有局限性，并且对于新型成像技术和手术干预的开发而言是低劣的模型。本文提供了建立NF1猪模型的材料和方法，所述模型可用于更好地理解NF1病因、疾病发展与进展、新型成像和手术技术的应用、以及临床前药物测试。此外，所述模型受益于TP53基因的敲除，并呈现了其实施方案。

在该研究过程中，本发明人最初不能产生NF1和/或TP53敲除上杂合的细胞。在该研究过程中，开发了以下行为(action)的理论；然而，本发明不限于该理论化机制。可以理解，问题在于NF1和TP53是肿瘤抑制基因。在细胞中主要研究了产生遗传修饰的方法并涉及修饰细胞并在测试前允许它们复制。所述细胞是家畜细胞，其用于通过克隆来制备动物。在此背景下，重要的是创建在原代细胞以及细胞的最少复制和/或传代的情况下有效的方法，这是进行有效遗传修饰的另一个挑战。由于敲除了肿瘤抑制基因，因此肿瘤抑制基因敲除上纯合的细胞相对于杂合或野生型细胞是有利的。

基于这种认识，尝试了产生修饰的几种不同方法。还有其他的限制，因为目的之一在于制备在F1和TP53两者的顺式敲除上杂合的家畜细胞。这些方法之一是用靶向内切核酸酶切割靶肿瘤抑制基因，以及为所述基因提供两个同源性依赖性修复(HDR)模板。HDR模板中的一个具有旨在创建敲除的改变。但是第二个HDR模板具有野生型基因。根据以下实例，该方法是有效的。

另一种方法也使用两个模板，其中所述模板中的一个非常接近于与野生型基因具有序列同一性。但是，产生了微小的改变提供容易检测几乎野生型(almost-wild type)HDR模板的存在。产生了沉默突变以提供新型限制酶位点。并且修饰了敲除等位基因以具有其自身特有的限制位点。然后可以测试细胞以确定两种变化是否存在。

肿瘤抑制基因

工作例描述了两种不同肿瘤抑制基因的修饰。因此，肿瘤抑制基因通常可以修饰，例如：

TP53肿瘤蛋白p53

PTEN磷酸化酶和Tensin同源物

RBI(pRB或RB1)成视网膜细胞瘤1

Smad4Smad家族成员4

BUBIB(BUB1)出芽不受恩唑咪唑抑制(budding uninhibited byBenzimidazoles)

BRCA1乳腺癌1，早发

BRCA2乳腺癌2，早发

ST14致瘤性抑制蛋白(Suppressor)14

pVHL Von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白

CD95Fas受体

ST5致瘤性抑制蛋白5

YPEL3Yippee样3

ST7致瘤性抑制蛋白7

NF2神经纤维瘤蛋白2(Merlin)

TSC1结节性硬化症1

TSC2结节性硬化症2

CDKN2A细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子2A

PTCH Patched

如其他地方所述，修饰可以是破坏(disruption)，敲除和抑制、具有插入/缺失(indel)、移码、天然或野生型等位基因等。

经遗传修饰的动物

可以制备在染色体修饰上单等位或双等位的动物。例如，本发明人已经使用了同源性依赖性重组(HDR)方法来对动物的染色体做出改变，或向其插入外源性基因。在本文的其它地方讨论了如TALENs和重组酶融合蛋白的工具，以及常规方法。本发明人的实验室先前已经证明了当从修饰细胞的多基因群体克隆时超常的克隆效率，并倡导这种方法来避免通过分离集落的体细胞核转移(SCNT)的克隆效率的变化(Carlson等，2011)。有些人使用遗传修饰和SCNT的连续周期减少了这一负担(Kuroiwa等，2004)，然而，这既是在技术上具有挑战性的又是成本过高的。在SCNT之前常规地生成双等位KO细胞的能力在大型动物遗传工程化中是显著的进步。在永生化细胞系中，使用其它方法例如ZFN和稀释克隆已经完成了双等位敲除(Liu等，2010)。最近另一个小组证明了使用商业ZFN试剂的猪GGTA1的双等位敲除(Hauschild等，2011)，其中可以通过针对GGTA1-依赖的表面表位缺乏的FACS来富集双等位裸细胞(bi-allelic null cell)。虽然这些研究证明了某些有用的概念，它们没有显示动物或家畜可以被修饰，因为简单的克隆稀释对于原代成纤维细胞隔离群(isolate)通常不可行(成纤维细胞以低密度不良生长)，且对于大多数基因，裸细胞(null cell)的生物学富集不可用。

实验结果表明，靶向性核酸酶系统在意图的关联位点处有效切割dsDNA。靶向性核酸酶系统包括基序，其通过蛋白与DNA结合或者通过核酸与DNA结合而结合至关联DNA。本文报道的效率是显著的。本发明人在其他地方公开了进一步提高这些效率的其他技术。

本发明的实施方案包括制备经遗传修饰的动物的方法，所述方法包括将胚胎或细胞暴露于编码靶向性核酸酶(例如，大范围核酸酶(meganuclease)，锌指，TALENs，引导RNA，重组酶融合分子)的载体或mRNA，其中所述靶向性核酸酶特异性结合所述胚胎或细胞中的靶染色体位点，创建对细胞染色体的改变，在代孕母体(surrogate mother)中克隆所述细胞或将所述胚胎移植到代孕母体中，由此所述代孕母体孕育在无报告基因的情况下并仅在靶定的染色体位点处遗传修饰的动物。靶定的位点可以是本文所列出的，例如，本文所述的多种基因。本文详细描述了模板驱使的基因渐渗(introgression)方法。本发明的实施方案包括模板驱使的基因渐渗，例如，通过HDR模板，来修饰非人动物，或任意物种的细胞的肿瘤抑制基因。

这一方法以及本文的一般方法涉及细胞和动物。可以从下组选择这些：非人脊椎动物，非人灵长类动物，牛，马，猪，绵羊，鸡，鸟，兔，山羊，狗，猫，实验室动物，和鱼类。术语家畜表示驯养的动物，其作为食物或生物材料商品饲养。术语偶蹄动物表示偶蹄目(Artiodactyla)的有蹄哺乳动物，其包括牛，鹿，骆驼，河马，绵羊和山羊，其每只脚具有偶数脚趾，通常为两个或有时为四个。

同源性指导的修复(HDR)

同源性指导的修复(HDR)是细胞中修复ssDNA和双链DNA(dsDNA)损伤的一种机制。当存在有与损伤位点具有显著同源性的序列的HDR模板时，细胞可以使用这一修复机制。特异性结合，该术语在生物领域中通常使用时指代分子以与非靶组织相比相对较高的亲和力结合靶物，并且通常涉及多个非共价相互作用，如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合等等。特异性杂交是具有互补序列的核酸之间的特异性结合的形式。蛋白也可以特异性结合DNA，例如，在TALEN或CRISPR/Cas9系统中或通过Gal4基序。等位基因的渐渗指代通过模板引导方法相对于内源性等位基因将外源性等位基因复制的过程。在一些情况下，内源性等位基因实际上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但现在的理论是这一过程是复制机制。由于等位基因是基因对，它们之间具有显著的同源性。等位基因可以是编码蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如编码生物活性RNA链，或提供位点以接受调节蛋白或RNA。

HDR模板是包含渐渗的等位基因的核酸。模板可以是dsDNA或单链DNA(ssDNA)。ssDNA模板优选的是从约20到约5000个残基，虽然也可以使用其它长度。技术人员将立即理解，明确陈述的范围内的所有范围和数值都是涵盖的；例如，从500到1500个残基，从20到100个残基，等等。模板可以进一步包含侧翼序列，其提供与要取代的内源性等位基因或DNA邻近的DNA的同源性。模板还可以包括结合到靶向性核酸酶系统的序列，并因此是系统的DNA结合成员的关联结合位点。术语关联指代通常相互作用的两种生物分子，例如受体及其配体。在HDR过程的语境中，生物分子中的一个可以设计为带有结合意图(即关联)DNA位点或蛋白位点的序列。

靶向核酸酶系统

基因组编辑工具(如转录激活物样效应器核酸酶(TALEN))和锌指核酸酶(ZFN)已经影响了许多物种中的生物技术、基因治疗，以及功能基因组研究领域。最近，RNA引导的内切核酸酶(RGEN)通过互补RNA分子引导到其靶位点。Cas9/CRISPR系统是REGEN。tracrRNA是另一种此类工具。这些是靶向性核酸酶系统的例子：这些系统具有将所述核酸酶定位到靶位点的DNA结合成员。接着，核酸酶切割位点。TALEN和ZFN具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在靶DNA上找到彼此的关联物。DNA结合成员具有染色体DNA中的关联序列。DNA结合成员通常根据意图的关联序列设计，以获得在意图位点处或附近获得核水解作用。某些实施方案可不受限地应用于所有此类系统；包括最小化核酸酶再切割的实施方案，在意图残基处精确产生SNP的实施方案，以及在DNA结合位点处渐渗的等位基因的放置。本文中的例子已经用TALEN来实施。其他实施方案涉及使用其他靶向核酸内切核酸酶的相同的过程和动物。

TALEN

术语TALEN用于本文是广泛的，并且包括不需要另一个TALEN辅助而能切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还用于指代工程化改造成共同起作用以在相同位点处切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。共同起工作的TALEN可以称为左-TALEN和右-TALEN，其参考DNA或TALEN对的手性。

TAL的密码(cipher)已有报道(PCT申请WO 2011/072246)，其中每个DNA结合重复负责识别靶DNA序列中的一个碱基对。可以装配残基以靶向DNA序列。简言之，确定用于TALEN结合的靶位点，并创建包含核酸酶和一系列识别靶位点的RVD的融合蛋白。在结合后，核酸酶切割DNA，使得细胞修复机器能够运行以在切割末端处产生遗传修饰。术语TALEN意指包含转录激活物样(TAL)效应器结合域和核酸酶域的蛋白，并包括本身功能性的单体TALEN以及其它要求与另一个单体TALEN二聚化的TALAN。当两个单体TALEN相同时二聚化可以产生同二聚体TALEN，或者当单体TALEN不同时可以产生异二聚体TALEN。已显示了TALEN在永生化的人类细胞中通过两种主要的真核DNA修复途径(非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复)来诱导基因修饰。TALEN通常成对使用，但单体TALENs是已知的。用于TALEN(以及其它遗传工具)处理的细胞包括培养细胞、永生化细胞、原代细胞、原代体细胞、受精卵、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞。在一些实施方案中，TAL效应器可以用于将其它蛋白结构域(例如，非核酸酶蛋白结构域)靶向特定的核苷酸序列。例如，可以将TAL效应器与蛋白结构域相连，所述蛋白结构域来自(不限于)DNA 20相互作用酶(例如，甲基化酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶，或连接酶)，转录活化子或抑制子，或与其它蛋白例如组蛋白相互作用或修饰其它蛋白例如组蛋白的蛋白。这种TAL效应器融合的应用包括例如创建或修饰表观遗传调节元件，产生DNA中的位点特异性插入、缺失，或修复，控制基因表达，以及修饰染色质结构。

术语核酸酶包括外切核酸酶和内切核酸酶。术语内切核酸酶指代能够催化DNA或RNA分子(优选DNA分子)内的核酸之间的键的水解(切割)的任意野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性例子包括II类限制性内切核酸酶，如FokI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCl、EcoRI、BglII，和AlwI。当具有通常长度约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点时，内切核酸酶还包含切点稀有切割内切核酸酶(rare-cuttingendonucleases)。稀有切割内切核酸酶在限定基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)。稀有切割内切核酸酶可以是例如靶向内切核酸酶，即由工程化锌指域与限制性酶(如FokI)或化学内切核酸酶的催化域融合得到的嵌合锌指核酸酶(ZFN)。在化学内切核酸酶中，化学或肽切割剂与核酸聚合物或另一个识别特定靶序列的DNA缀合，从而将切割活性靶向到特定的序列。化学内切核酸酶也包括合成的核酸酶，如邻二氮杂菲、DNA切割分子，以及已知结合特定DNA序列的三链体形成寡核苷酸(triplex-forming oligonucleotides，TFO)的缀合物。根据本发明，这些化学内切核酸酶包含于术语“内切核酸酶”中。酸酶的例子包括I-See I、I-Chu LI-Cre I、I-Csm I、Pi-See L PI-Tti L PI-Mtu I、I-Ceu I、I-See IL 1-See III、HO、Pi-Civ I、PI-Ctr L PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra L PI-Mav L PI-Meh I、PI-Mfu LPI-Mfl I、PI-Mga L PI-Mgo I、PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I、PI-Mma I、PI-30Msh L PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu L PI-Rma I、Pl-Spb I、PI-Ssp LPI-Fae L PI-Mja I、PI-Pho L Pi-Tag L PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-Msol。

由TALEN或其它工具产生的遗传修饰可以例如选自下组：插入，缺失，外源性核酸片段的插入，以及取代。术语插入广泛地使用，以表示字面上的插入到染色体中或使用外源性序列作为模板用于修复。一般来说，鉴定靶DNA位点并创建将特异性结合所述位点的TALEN对。向细胞或胚胎递送所述TALEN，例如，作为蛋白、mRNA，或通过编码所述TALEN的载体。所述TALEN剪切DNA以产生双链断裂，其接着被修复，通常导致插入删除的创建，或掺入伴随的外源性核酸中含有的序列或多态性，所述外源性核酸被插入染色体中或作为模板用于在修饰的序列情况下的断裂修复。这一模板驱使的修复对于改变染色体是一个有用的过程，且提供对细胞染色体的高效改变。

术语外源性核酸意指加到细胞或胚胎的核酸，不论所述核酸与细胞中的天然核酸序列相同或不同。术语核酸片段是广泛的，包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA，或其片段。所述细胞或胚胎可以例如选自下组：非人脊椎动物、非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、鸡、鸟类、兔、山羊、狗、猫、实验动物，和鱼。

一些实施方案涉及制备经遗传修饰的家畜和/或偶蹄动物的组合物或方法，其包含将TALEN对导入家畜和/或偶蹄动物的细胞或胚胎中，从而在位TALEN对特异性结合的位点处对细胞或胚胎DNA做出遗传修饰，以及从所述细胞产生家畜动物和/或偶蹄动物。直接注射可以用于细胞或胚胎，例如注射到合子、胚泡，或胚胎中。或者，可以使用用于蛋白、RNA、mRNA、DNA，或载体导入的多种已知技术之任一种，将TALEN和/或其它因子导入细胞中。可以从胚胎或细胞根据已知方法(例如将胚胎移植到妊娠期的宿主中)，或各种克隆方法产生经遗传修饰的动物。短语“在TALEN特异性结合的位点处对细胞DNA的遗传修饰”等表示当TALEN特异性结合其靶位点时，在TALEN上的核酸酶切割的位点处做出遗传修饰。核酸酶并不在TALEN对结合的地方精确切割，而是在两个结合位点之间的确定位点处切割。

一些实施方案涉及对用于克隆动物的组合物或对细胞的处理。细胞可以是家畜和/或偶蹄动物细胞、培养的细胞、原代细胞、原代体细胞、合子、生殖细胞、原生殖细胞、胚泡，或干细胞。例如，一个实施方案是创建遗传修饰的组合物或方法，其包含将培养物中的复数个原代细胞暴露于TALEN蛋白或编码一种或多种TALEN的核酸。TALEN可以作为蛋白质或核酸片段(例如由mRNA或载体中的DNA序列编码)导入。

锌指核酸酶

锌指核酸酶(ZFNs)是人工限制酶，其通过将锌指DNA结合域和DNA剪切结构域融合产生。锌指结构域可以经工程化来靶向期望的DNA序列而这使得锌指核酸酶能够靶向复杂的基因组中的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可以用于改变高等生物的基因组。ZFN可以用于使基因失活的方法中。

锌指DNA结合域具有约30个氨基酸并折叠为稳定的结构。每个指主要结合DNA底物中的三联体。关键位置的氨基酸残基有助于大多数与DNA位点的序列特异性相互作用。这些氨基酸可以在维持剩下的氨基酸的情况下改变以保留必要的结构。通过串联连接几个结构域完成与较长DNA序列的结合。其它的功能性，如非特异性FokI剪切结构域(N)，转录活化子结构域(A)，转录抑制子结构域(R)以及甲基化酶(M)可以融合到ZFP以分别形成ZFN，锌指转录活化子(ZFA)，锌指转录抑制子(ZFR)，以及锌指甲基化酶(ZFM)。使用锌指和锌指核酸酶用于制造遗传修饰的动物的材料和方法公开于，例如US 8,106,255，US 2012/0192298，US2011/0023159,和US 2011/0281306。

载体和核酸

可以将多种核酸导入细胞中，用于敲除的目的，用于基因的失活，获得基因的表达，或用于其它目的。如本文所用，术语核酸包括DNA、RNA，以及核酸类似物，以及双链或单链(即正义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分，或磷酸主链处修饰以改进例如核酸的稳定性，杂交，或溶解性。可以修饰脱氧核糖磷酸主链来产生吗啉代核酸，其中每一个碱基部分与六元吗啉环或肽核酸相连，其中脱氧磷酸主链被假肽主链代替，而保留四种碱基。

靶核酸序列可以可操作地连接到调控区，如启动子。调控区可以是猪调控区，或者可以来自其它物种。如本文所用，可操作地连接指代将调控区相对于核酸序列以允许或促进靶核酸转录的方式定位。

一般可以将启动子类型可操作地连接到靶核酸序列。启动子的例子包括但不限于组织特异性启动子，组成性启动子，可诱导启动子，以及对特定刺激物响应或者不响应的启动子。在一些实施方案中，可以使用促进核酸分子表达而没有显著的组织或时空特异性的启动子(例如，组成型启动子)。例如，可以使用β-肌动蛋白启动子如鸡β-肌动蛋白基因启动子、泛素启动子、miniCAG启动子，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子及病毒启动子例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子，或巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，鸡β肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合物作为启动子使用。见例如Xu等，(2001)Hum.Gene Ther.12:563；和Kiwaki等，(1996)Hum.Gene Ther.7:821。

可以用于核酸构建体的另外的调节区包括但不限于多聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如内部核糖体进入区段，IRES)、增强子、诱导型元件，或内含子。这些调节区可能不是必要的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性，翻译效率等等来增加表达。在想要时核酸构建体中可以包含此类调节区以获得核酸在细胞中的最优表达。然而，有时可以在没有此类另外的元件的情况下获得足够的表达。

可以使用编码信号肽或选择标志物的核酸构建体。可以使用信号肽，使得编码的多肽定向到特定的细胞位置(例如细胞表面)。可选择标志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)，二氢叶酸还原酶(DHFR)，潮霉素-B-磷酸转移酶，胸苷激酶(TK)，以及黄嘌呤(xanthin,xanthine)-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。此类标志物对于在培养物中选择稳定的转化体是有用的。其它的选择标志物包括荧光多肽，如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

在一些实施方案中，编码可选择标志物的序列在侧翼可以有重组酶(如例如Cre或Flp)的识别序列。例如，可选择标志物在侧翼可以有loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34-bp识别位点)或者FRT识别位点，使得可选择标志物可以从构建体切除。见Orban等,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861(关于Cre/lox技术的综述)及Brand和Dymecki,Dev.Cell(2004)6:7。含有由可选择标志物基因中断的Cre-或Flp-可激活转基因的转座子也可以用于获得带有转基因的条件性表达的转基因动物。例如，驱动标志物/转基因表达的启动子可以是普遍的或者组织特异性的，其可以导致标志物在F0动物(例如猪)中的普遍或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可以通过例如将普遍表达标志物中断的转基因的猪与以组织特异性的方式表达Cre或Flp的猪杂交，或通过以组织特异性的方式表达标志物中断的转基因的猪与普遍表达Cre或Flp重组酶的猪杂交来完成。转基因的受控表达或标志物的受控切除允许转基因的表达。

在一些实施方案中，外源核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，所述标签设计为促进编码多肽的后续操作(例如，促进定位或检测)。可以将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签定位于多肽的羧基或氨基末端。编码的标签的非限制性例子包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAG^TM标签(Kodak,New Haven,CT)。

核酸构建体可以使用SssI CpG甲基化酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)甲基化。一般来说，核酸构建体可以与缓冲液中的S-腺苷甲硫氨酸和SssI CpG-甲基化酶在37℃一起孵育。可以通过将构建体与1个单位HinP1I内切核酸酶在37℃孵育1小时和通过琼脂糖凝胶电泳测定确认超甲基化。

可以使用多种技术，将核酸构建体导入任意类型的胚胎、胎儿，或成年偶蹄动物/家畜细胞，包括例如生殖细胞，如卵母细胞或卵细胞，祖细胞、成体或胚胎干细胞，原生殖细胞，肾细胞，如PK-15细胞、胰岛细胞、beta细胞、肝细胞，或成纤维细胞，如皮肤成纤维细胞中。技术的非限制性例子包括使用转座子系统、能感染细胞的重组病毒，或脂质体或能够将核酸递送到细胞的其它非病毒方法，如电穿孔，显微注射，或磷酸钙沉淀。

在转座子系统中，核酸构建体的转录单元(即可操作地连接到外源核酸序列的调控区)侧翼有转座子的反向重复。已开发了几种转座子系统(包括，例如Sleeping Beauty(见美国专利号6,613,752和美国公布号2005/0003542)；Frog Prince(Miskey等，(2003)Nucleic Acids Res.31:6873)；Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology 8(Suppl.l):S7；Minos(Pavlopoulos等，Genome Biology8(Suppl.l):S2,2007)；Hsmar1(Miskey等)MolCell Biol.27:4589,2007)；以及Passport来将核酸导入细胞(包括小鼠、人和猪细胞)中。Sleeping Beauty转座子尤其有用。转座酶可以作为蛋白递送，与外源核酸在相同的核酸构建体上编码，可以在分开的核酸构建体上导入，或作为mRNA(例如，体外转录并加帽的mRNA)提供。

核酸可以整合到载体中。载体是广义的术语，其包括设计为从携带者(carrier)移动到靶DNA中的任意特定DNA区段。载体可以称为表达载体，或载体系统，其为引起DNA插入基因组或其它靶定DNA序列(如附加体、质粒，或甚至病毒/噬菌体DNA区段)中需要的一组组分。在动物中用于基因递送的载体系统(如病毒载体(例如逆转录病毒、腺相关病毒以及整合噬菌体病毒)，以及非病毒载体(例如转座子))具有两个基本组分：1)由DNA(或RNA，其逆转录成cDNA)组成的载体，以及2)转座酶、重组酶，或其它整合酶，其识别载体和DNA靶序列两者，并将载体插入靶DNA序列中。载体最常含有一个或多个表达盒，其包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制并调节另一个DNA序列或mRNA转录和/或翻译的DNA序列。

许多不同类型的载体是已知的。例如，质粒和病毒载体(如逆转录病毒载体)是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点，适合的启动子和可选的增强子，以及还有任意必要的核糖体结合位点，多聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，以及5’侧翼非转录序列。载体的例子包括：质粒(其也可以是其他种类载体的携带者)，腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如修饰的HIV-1、SIV或FIV)，逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)，以及转座子(例如Sleeping Beauty、P-元件、Tol-2、Frog Prince、piggyBac)。

如本文所用，术语核酸指代RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成)DNA，以及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如合成的碱基或替代主链。核酸分子可以是双链或单链的(例如有义或反义单链)。术语转基因在本文中广泛使用，指代其遗传材料已经使用遗传工程技术改变的经遗传修饰的生物体或遗传工程化生物体。因此，敲除偶蹄动物是转基因的，无论外源性基因或核酸是否在动物或其后代中表达与否。

经遗传修饰的动物

可以使用TALENs和其它遗传工程化技术修饰动物，包括重组酶融合蛋白，或已知的多种载体。通过这些工具制成的遗传修饰可以包括对基因的破坏。术语对基因的破坏指代阻止功能性基因产物的形成。仅当基因产物实现它的正常(野生型)功能时，其为功能性的。对基因的破坏阻止由所述基因编码的功能性因子的表达，并包括对向基因编码的序列和/或对于所述基因在动物中的表达必要的启动子和/或操纵子中一个或多个碱基的插入、缺失，或取代。可以通过，例如从动物的基因组中去除至少一部分所述基因，改变所述基因以防止由该基因编码的功能性因子的表达，干扰RNA，或通过外源性基因的显性阴性因子的表达来破坏所述破坏的基因。遗传修饰动物的材料和方法进一步详细描述于2012年2月24日提交的美国系列号13/404,662，2012年5月9日提交的13/467,588和2009年11月10日提交的12/622,886，其各自通过提述并入本文用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语反式作用指代不同的分子作用于靶基因的过程(即分子间)。反式作用元件通常是含有基因的DNA序列。这一基因编码用于调节所述靶基因的蛋白(或microRNA或其它可扩散分子)。所述反式作用基因可以与靶基因在同一条染色体上，但活性通过其编码的中间蛋白或RNA。反式作用基因的实施方案为例如编码靶向性核酸内切核酸酶的基因。使用显性阴性(dominant negative)对基因的失活通常涉及反式作用元件。术语顺式调节或顺式作用意指在不编码蛋白或RNA的情况下的作用；在基因失活的语境中，该术语通常表示基因的编码部分的失活，或对于功能性基因的表达必要的启动子和/或操纵子的失活。

本领域已知的各种技术可以用于使基因失活以制造敲除动物和/或将核酸构建体导入动物中，来产生建立者动物(founder animals)和制造动物品系，其中所述敲除或核酸构建体整合到基因组中。这些技术包括但不限于原核(pronuclear)显微注射(美国专利号4,873,191)，逆转录病毒介导的对生殖细胞系的基因转移(Van der Putten等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:6148-1652,1985)，对胚胎干细胞的基因靶向(Thompson等，Cell,56:313-321，1989)，胚胎的电穿孔(Lo,Mol.Cell.Biol.,3:1803-1814,1983)，精子介导的基因转移(Lavitrano等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230-14235,2002；Lavitrano等,Reprod.Fert.Develop.18,19-23,2006)，以及体细胞(例如卵丘细胞或乳腺细胞)，或成体、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，接着进行核移植(Wilmut等,Nature,385:810-813,1997；和Wakayama等，Nature,394:369-374,1998)。原核显微注射、精子介导的基因转移，以及体细胞核转移是特别有用的技术。基因组修饰的动物是其中它的所有细胞都具有所述遗传修饰的动物，包括生殖系细胞。当使用产生在其遗传修饰上嵌合的动物的方法时，可以使所述动物同系交配(inbred)并可以选择基因组修饰的后代。例如，如果在胚泡阶段修饰其细胞，可以使用克隆来制造嵌合体动物，或当修饰单细胞时可以发生基因组修饰。

通常来说，在原核显微注射中，将核酸构建体导入受精卵中；1个或2细胞受精卵用作含有来自精子头部的遗传材料的原核，并且卵在原生质内可见。原核分期的受精卵可以在体外或体内获得(即从供体动物的输卵管中手术回收)。可以如下产生体外受精卵。例如，可以在屠宰场采集猪的卵巢，并在运输期间保持在22-28℃。可以冲洗并分离卵巢用于卵泡穿刺，可以使用18号针在真空下将范围从4-8mm的卵泡抽吸到50ml锥形离心管中。可以使用商业TL-FIEPES(Minitube,Verona,WI)通过预滤器润洗卵泡液和抽吸的卵母细胞。可以选择被紧密的卵丘质包围的卵母细胞并放置到TCM-199卵母细胞成熟培养基(Minitube,Verona,WI)中，其使用0.1mg/mL半胱氨酸,10ng/mL表皮生长因子,10％猪滤泡液,50μΜ2-巯基乙醇,0.5mg/ml cAMP,各10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)补充，在潮湿的空气中在38.7℃和5％CO₂持续约22个小时。接着，可以将所述卵母细胞转移到不含有cAMP,PMSG或hCG的新鲜的TCM-199成熟培养基中，并孵育另外22个小时。可以通过在0.1％的透明质酸酶中涡旋振荡1分钟将成熟的卵母细胞从它们的卵丘细胞剥离。

对于猪，成熟的卵母细胞可以在500μl Minitube PORCPRO IVF MEDIUM SYSTEM(Minitube,Verona,WI)中在Minitube 5孔受精皿中受精。在体外受精(IVF)的准备中，可以将新鲜收集的或冷冻的公猪精液清洗，并在PORCPRO IVF培养基中重悬至4x 105个精子。精子浓度可以使用计算机辅助精液测试(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)分析。最后，体外授精可以在10μl体积中以终浓度为约40个能动精子/卵母细胞进行，这取决于公猪。将所有受精的卵母细胞在5.0％CO2气氛中在38.7℃孵育6小时。授精后六小时，推定的合子可以在NCSU-23中清洗两次并移到0.5ml的相同培养基中。该系统通常可以在大多数公猪间以10-30％的多精授精率(polyspermic insemination rate)产生20-30％的胚泡。

可以将线性化的核酸构建体注射到原核之一中。接着，可以将注射的卵转移到受体雌性(例如到受体雌性的输卵管中)并允许在所述受体雌性中发育以产生转基因动物。具体的，体外受精的胚胎可以在15,000X g离心5分钟来沉淀脂质，允许所述原核的可视化。可以使用Eppendorf FEMTOJET注射器注射所述胚胎并可以培养直到胚泡形成。可以记录胚胎分裂的速率和胚泡形成以及质量。

可以通过手术将胚胎转移到异步(asynchronous)受体的子宫中。典型地，可以使用5.5英寸导管将100-200(例如，150-200)个胚胎沉积到输卵管的壶腹部-峡部连接。手术后，可以进行妊娠的实时超声检查。

在体细胞核转移中，可以将包括如上文所述的核酸构建体的转基因偶蹄动物细胞(例如，转基因猪细胞或牛细胞)例如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞，成体耳成纤维细胞，或颗粒细胞导入无核的卵母细胞中来建立组合细胞。可以如下将卵母细胞去核，即在极体附近的部分带切开(partial zona dissection)，然后在切开区处压出细胞质。通常，使用具有锋利的有斜面的尖端的注射移液管来将转基因细胞注射到阻滞于减数分裂2的去核卵母细胞中。在一些惯例中，阻滞于减数分裂2的卵母细胞称作“卵”。在生成猪或牛胚胎(例如通过融合并活化卵母细胞进行)后，在活化后约20至24小时，将胚胎转移至接受体雌性的输卵管。参见例如Cibelli等，Science280,1256-1258,1998,以及美国专利第6,548,741号。对于猪，可以在转移胚胎后约20-21天对接受体雌性检查妊娠。

可以使用标准的育种技术来创建对于来自初始杂合建立者动物的外源核酸方面纯合的动物。然而，可以不需要纯合性。可以将本文中描述的转基因猪与感兴趣的其它猪育种。

在一些实施方式中，可以在分开的转座子上提供感兴趣的核酸和可选择标志物并且以不相等的量对胚胎或细胞提供，其中含有可选择标志物的转座子的量远远超过(5-10倍过量)含有感兴趣核酸的转座子。可以基于可选择标志物的存在和表达分离表达感兴趣核酸的转基因细胞或动物。由于转座子会以精确的且不相联的方式(独立转座事件)整合入基因组中，感兴趣的核酸和可选择标志物不是遗传连锁的，并且可以容易地经由标准育种通过遗传分离分开。如此，可以生成转基因动物，其不受在后续世代中保留可选择标志物(即一个从公共安全性观点看有些顾虑的问题)约束。

一旦生成了转基因动物，可以使用标准技术评估外源核酸的表达。可以通过Southern印迹分析实现初始筛选以测定构建体整合发生与否。关于Southern分析的描述，参见Sambrook等，1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual second edition,ColdSpring Harbor Press,Plainview；NY的9.37-9.52部分。也可以在初始筛选中使用聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR指扩增靶核酸的规程或技术。一般地，采用来自感兴趣区域末端或超出的序列信息来设计与要扩增的模板的相反链在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。可以使用PCR从DNA及RNA扩增特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物的长度通常是14至40个核苷酸，但是长度范围可以是10个核苷酸至几百个核苷酸。PCR记载于例如PCR Primer：A Laboratory Manual,ed.Dieffenbach and Dveksler,Cold SpringHarbor Laboratory Press,1995。也可以通过连接酶链式反应、链置换扩增、自身维持的序列复制、或基于核酸序列的扩增来扩增核酸。参见例如Lewis Genetic Engineering News,12:1,1992；Guatelli等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:1874,1990；和Weiss Science,254:1292,1991。在胚泡期，可逐个处理胚胎用于通过PCR、Southern杂交和splinkerette PCR的分析(参见例如Dupuy等，Proc Natl Acad Sci USA 99:4495,2002)。

可以使用技术评估转基因猪的组织中编码多肽的核酸序列表达，所述技术包括例如对自动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析、Western分析、免疫测定法诸如酶联免疫吸附测定法、和逆转录酶PCR(RT-PCR)。

干扰RNAs

各种干扰RNA(RNAi)是已知的。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录体的序列特异性降解。RNA诱导的沉默复合体(RISC)将dsRNA代谢为小的21-23核苷酸的小干扰RNAs(siRNAs)。RISC包含双链RNA酶(dsRN酶，如Dicer)和ssRNA酶(如，Argonaut 2或Ago2)。RISC利用反义链作为引导以找到切割靶物。siRNA和microRNA(miRNAs)两者都是已知的。在遗传修饰的动物中使基因失活的方法包括诱导针对靶基因和/或靶核酸的RNA干扰，从而降低靶基因和/或靶核酸的表达。

例如，外源核酸序列可诱导针对编码多肽的核酸序列的RNA干扰。例如，与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)可以用于降低该DNA的表达。可以生成用于siRNA的构建体，例如Fire等，Nature,391:806,1998；Romano和Masino Mol Microbiol,6:3343,1992；Cogoni等，EMBO J,15:3153,1996；Cogoni和Masino Nature,399:166,1999；Misquitta和Paterson Proc.Natl.Acad,Sci.USA,96:1451,1999；以及Kennerdell和Carthew Cell,95:1017,1998所描述的。可以通过Mclntyre和Fanning BMCBiotechnology,6:1,2006所描述的那样产生shRNA构建体。一般来说，shRNA转录为含有互补区的单链RNA分子，其可以退火并形成短的发夹。

找到单个的、个别的有功能的针对特定基因的siRNA或miRNA的概率是高的。例如，siRNA的具体序列的预测率为约50％，但是多个干扰RNA可以以它们之一将有效的良好信心制备。

实施方案包括体外细胞，体内细胞，和经遗传修饰的动物例如家畜动物，其表达针对基因例如发育阶段选择性的基因的RNAi。例如，所述RNAi可以选自下组：siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA。

实施方案包括修饰为表达抑制一个或多个肿瘤抑制基因的RNAi的动物。

可诱导系统

可诱导系统可用于控制基因的表达。已知各种允许在时空上控制基因表达的可诱导系统。数个已被证明在转基因动物体内是有功能的。术语可诱导系统包括传统的启动子和可诱导基因表达元件。

实施方案包括修饰为可诱导控制一个或多个肿瘤抑制基因的动物。所述控制可以是正向或负向的，以打开或关闭。

诱导型系统的例子是四环素(tet)-开启启动子系统，其可以用于调节核酸的转录。在此系统中，突变的Tet阻抑物(TetR)与单纯疱疹病毒VP16反式激活物蛋白的激活域融合以创建四环素控制的转录激活物(tTA)，其受到tet或多西环素(doxycycline，dox)调节。在缺乏抗生素的情况中，转录是最小程度的，而在存在tet或dox的情况中，转录得到诱导。备选的诱导型系统包括蜕皮激素或雷怕霉素(rapamycin)系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其生成受到蜕皮激素受体和超气门蛋白(ultraspiracle)基因(USP)产物的异二聚体控制。通过用蜕皮激素或蜕皮激素类似物诸如Muristerone A处理诱导表达。对动物施用以触发诱导型系统的药剂称为诱导剂。

四环素诱导型系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型的或诱导的)是更为常用的诱导系统。四环素诱导型系统包括四环素控制的反式激活子(tTA)/反向tTA(rtTA)。在体内使用这些系统的方法包括产生两个遗传修饰的动物品系。一个动物品系在选择的启动子的控制下表达激活子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达接纳体(acceptor)，其中感兴趣的基因(或要修饰的基因)的表达在tTA/rtTA反式激活子的靶基因的控制下(或侧翼为loxP序列)。将两个品系的小鼠相交配提供了基因表达的控制。

四环素依赖的调控系统(tet系统)依赖两个组分，即四环素控制的反式激活子(tTA或rtTA)和以四环素依赖方式控制下游cDNA表达的tTA/rtTA依赖的启动子。在缺乏四环素或其衍生物(如多西环素)的情况下，tTA结合到tetO序列上，允许tTA依赖的启动子的转录激活。然而，当存在多西环素时，tTA不能与其靶物相互作用且不发生转录。使用tTA的系统被称为tet-OFF，因为四环素或多西环素允许转录下调。四环素或其衍生物的施用允许暂时控制体内转基因表达。rtTA是tTA的变体，其在缺乏多西环素时是无功能的，但需要配体存在用于反式激活。因此这种系统被称为tet-ON。已在体内将tet系统用于如编码报告基因、原癌基因，或参与信号传导级联的蛋白的数个转基因的可诱导表达。

Cre/lox系统使用Cre重组酶，其通过在两个远端(distant)的Cre识别序列，即loxP位点间发生交换而催化位点特异性重组。导入到两个loxP序列间的DNA序列(称为敲入(floxed)DNA)被Cre介导的重组所切除。使用空间控制(带有组织或细胞特异性启动子)或时间控制(带有可诱导系统)在转基因动物中控制Cre的表达导致对两loxP位点间DNA切除的控制。一种应用是条件性基因失活(条件性敲除)。另一种方法用于蛋白过表达，其中将敲入的终止子密码子插入到启动子序列和感兴趣的DNA之间。遗传修饰的动物不表达转基因，直到表达Cre，导致切除敲入的终止子密码子。这一系统已经应用于B淋巴细胞中组织特异性肿瘤发生和受控的抗原受体的表达。还开发了可诱导的Cre重组酶。仅通过施用外源配体活化可诱导的Cre重组酶。可诱导的Cre重组酶是融合蛋白，其含有原来的Cre重组酶和特异的配体结合结构域。Cre重组酶的功能活性依赖于能够结合到融合蛋白中该特异性结构域的外部配体。

实施方案包括体外细胞、体内细胞和经遗传修饰的动物例如家畜动物，其包含受控于诱导系统的基因。动物的遗传修饰可以是基因组的或嵌合的。所述可诱导系统例如可以是例如选自下组：Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hif1alpha。实施方案是本文所列出的基因。

显性阴性(Dominant Negatives)

因此，不仅可以通过去除或RNAi抑制还可以通过创建/表达蛋白的显性阴性变体来破坏基因，所述显性阴性变体对该基因产物的正常功能具有抑制效果。显性阴性(DN)基因的表达可以导致改变的表型，其通过以下施加：a)滴定效应(titration effect)；DN被动地与内源基因产物竞争协同因子或所述内源基因的正常靶标而不发挥相同的活性，b)毒丸(poison pill)(或活动扳手(monkey wrench))效应，其中所述显性阴性基因产物主动地干扰正常基因功能所需的过程，c)反馈效应，其中DN主动地刺激对所述基因功能的负调控因子。可以制备显性阴性体以阻碍肿瘤抑制基因。

建立者动物、动物系、性状和繁殖

可通过克隆和其它本文中描述的方法生产建立者动物。建立者动物可以是遗传修饰上纯合的，如在合子或原代细胞经历纯合修饰的情况中。类似地，也可产生杂合的建立者。建立者可以是基因组修饰的，这意味着所有细胞在它们的基因组中都经历修饰。建立者可以是修饰上嵌合的，如可发生在当将载体导入胚胎的多个细胞之一中时，通常在胚泡期。可检测嵌合动物的后代以鉴定基因组修饰的后代。当已经创建了可以通过有性繁殖或通过辅助生殖技术繁殖的动物池时建立动物系，其中杂合或纯合后代一致性表达修饰。

重组酶

本发明的实施方案包括将靶向性核酸酶系统与重组酶(例如RecA蛋白，Rad51)或其它与DNA重组相关的DNA结合蛋白一同施用。重组酶与核酸片段形成细丝，并实际上搜索细胞DNA来寻找与序列基本同源的DNA序列。例如，重组酶可以与充当HDR模板的核酸序列组合。接着，重组酶与HDR模板组合以形成细丝并置入细胞中。重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板可以作为蛋白、mRNA，或与编码重组酶的载体置于细胞或胚胎中。美国公开文本2011/0059160(美国系列号12/869,232)的公开内容通过提述特此并入本文中用于所有目的；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语重组酶指代遗传重组酶，其在细胞中酶促催化两条相对较长的DNA链之间相对短的DNA部分的连接。重组酶包括Cre重组酶，Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre，以及FLP。Cre重组酶是来自PI噬菌体的I型拓扑异构酶，其催化loxP位点之间的DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是由198个氨基酸组成的21kD蛋白，其存在于细菌沙门氏菌属(Salmonella)中。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于活性位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是人类基因。由该基因编码的蛋白是RAD51蛋白家族的成员，其辅助DNA双链断裂的修复。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51同源。Cre重组酶是实验中用来删除侧翼有loxP位点的特定序列的酶。FLP指代衍生于面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2μ质粒的Flippase重组酶(FLP或Flp)。

本文中，“RecA”或“RecA蛋白”指代RecA样重组蛋白家族，其具有基本上全部或大部分相同的功能，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸正确定位到其同源靶物上以用于通过DNA聚合酶的后续延伸的能力；(ii)在拓扑学上制备双链体核酸以合成DNA的能力；和(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物高效寻找并结合互补序列的能力。表征得最好的RecA蛋白来自于大肠杆菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鉴定了许多突变体RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇(Drosophila)、哺乳动物(包括人)，以及植物。这些蛋白包括例如Ree1、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2以及DMC1。重组蛋白的一个实施方案是大肠杆菌的RecA蛋白。或者，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白，来自另一种细菌来源的Rec蛋白，或来自另一种生物体的同源重组蛋白。

组合物和试剂盒

本发明还提供组合物和试剂盒，其含有例如编码位点特异性核酸内切核酸酶、CRISPR、Cas9、ZNFs、TALENs、Rec-gal4融合物的核酸分子，它们的多肽，含有这些核酸分子或多肽的组合物，或工程化的细胞系。还可以提供对于指示的等位基因渐渗有效的HDR。此类物品可以用作例如研究工具或在治疗上使用。

实施例

实施例1：鉴定猪和人NF1基因之间的保守区域以选择靶位点

NF1患者在整个肿瘤抑制基因神经纤维瘤蛋白(NF1)中显示多种突变。无义突变(R1947X)已被鉴定为NF1患者中最常见的改变，占所有NF1突变的1至2个百分点[1]。R1947发现于猪的外显子42中，该外显子42与人中的外显子40高度保守，因此我们选择将人中通常发现的R1947X突变工程改造到猪基因组中，以创建NF1的大型动物模型。图1是人和猪的NF1基因和蛋白质的比对。

实施例2：设计TALEN以工程改造猪NF1基因中的杂合R1947X突变

我们选择在猪中通过以下来模拟人NF1R1947X突变：TAL效应器核酸酶(TALEN)介导的同源性依赖性修复(HDR)，其使用靶向猪基因组中NF1基因的外显子42(对应于人基因组中的外显子40)的TALEN对，以及HDR构建体来引入终止密码子、移码，和新型限制酶位点，允许通过限制性片段长度多态性(RFLP)分析来快速分析克隆(图2和3A)。除了改变TALEN结合位点并防止TALEN重新切割的新型RFLP位点之外，将三个NF1TALEN与设计为诱导R1947X突变的HDR寡聚物一并转染入Ossabaw猪原代成纤维细胞中(图2和3A)。30℃下温育3天后，通过RFLP分析来对细胞群分析每个TALEN诱导HDR的能力(图3B)。该分析显示，所有三个TALEN在不同比率时是有活性的(图3B)。在用TALEN和HDR构建体处理后，将克隆经历(RFLP)分析以鉴定修饰的等位基因以及以获得杂合NF1敲除克隆(图3C)。对每个通过RFLP得到的杂合克隆测序以确认野生型和HDR等位基因两者的存在，并且可被用于染色质转移克隆技术以产生NF^R1947/+猪(图3D)。

实施例3：TALEN活性与分离肿瘤抑制基因上杂合的克隆的能力相关

存在两个拷贝的肿瘤抑制基因的丧失的选择优势，因此需要新技术用于分离NF1杂合克隆。由于TALEN ssNF1 42.2相较于ssNF1 42.1(54.2％)和ssNF1 42.3(27.2％)(我们预测其可能分别具有过高或过低的活性)的中间活性(45.1％)，我们选择TALEN ssNF142.2用于创建NF1R1947X杂合克隆的努力。当用ssNF1 42.2处理细胞时，通过RFLP，41/89(46.1％)的克隆显示出对NF1R1947X是杂合的(图4A)。有趣的是，41.6％的回收的克隆显示为纯合的KO，比预测的比率(20.3％,参见等式的图例)高得多的比率，这表明存在丢失两个NF1等位基因的选择压力(图4A)。丢失两个拷贝NF1的此选择压力来自这一事实，即NF1是肿瘤抑制基因，因此具有纯合丢失的细胞可能比NF1的野生型或杂合的细胞具有生长和/或存活优势。TOPO克隆和测序分析后，仅1/10(10％)的分离自ssNF1 42.3TALEN处理的细胞的克隆对HDR等位基因和野生型等位基因二者是杂合的(图4C)。9/10克隆(90％)对HDR等位基因是杂合的，并显示出在野生型等位基因中的小的插入或缺失(插入/缺失(indels))(图4C)。我们假设在野生型等位基因中看到的插入/缺失可能是由于过量的TALEN活性和两个拷贝基因都为非功能性的选择性优势两者，因此我们实施了ssNF1 42.3，一个根据RFLP评估仅具有27.2％活性的TALEN(图3B)。与ssNF1 42.2相比，通过RFLP，ssNF1 42.3导致更少的显示出杂合的克隆数目(35/91克隆,38.5％)，但是野生型、杂合子和纯合子的比率与预期的非常相似(图4B)。当将这些克隆进行TOPO克隆并且对每个等位基因测序后，发现仅3/10的克隆(30％)对于HDR等位基因是杂合的，并且在野生型等位基因中显示出小的插入/缺失，而7/10(70％)的克隆对于HDR等位基因和野生型等位基因二者是杂合的(图4C)。这些实验显示出对于肿瘤抑制基因的纯合敲除存在选择优势，以及具有高活性的TALEN将可能通过HDR或者插入/缺失在两个等位基因中显示出修饰。可以通过使用具有较低活性的TALEN(如NF1展示的那样)来克服该挑战(图4C)。

实施例4：野生型夹(Clamp)法

另一种解决创建肿瘤抑制基因上杂合敲除的细胞的技术挑战的方法是同时使用两个HDR寡聚物来分别修饰基因的每个等位基因，该方法称为“野生型夹”。一个HDR寡聚物将诱导KO等位基因，并且另一个将在阻止再切割和后续的插入/缺失的同时维持野生型等位基因(表1)。基于来自实施例1的结果，很明显，高活性的TALEN具有切割基因的两个等位基因的倾向。由于当HDR发生时TALEN结合位点中的变化，设计为针对NF1的HDR寡聚物防止了HDR修饰的等位基因的再切割(图2A)。应当指出，还应当通过诱导间隔物长度(spacerlengths)中的变化来阻止再切割，尽管对于NF1，没有采取该方法。在实施例1中，ssNF142.2是一个高活性的TALEN，其导致以低于预期的比率的杂合克隆的回收(图4)。此外，野生型等位基因的再切割导致大比率的含有插入/缺失的克隆(90％)(图4)。虽然使用具有减弱活性的TALEN(如ssNF1 42.3)可以帮助克服该问题并导致在野生型等位基因上没有插入/缺失的更高产率的杂合克隆(70％)，但是具有减弱活性的TALEN产生较少的通过RFLP为杂合的克隆来开始，使得肿瘤抑制基因杂合的克隆的回收在技术上有挑战(图4C)。此外，没有选择具有RFLP等位基因的杂合子与未修饰的野生型等位基因的方法，因此所有克隆必须进行TOPO克隆并测序，这是耗时且费力(resource-heavy)的方法。

表1：设计用于野生型夹法的HDR寡聚物

为了克服该挑战，我们设计了一种新的方法，其中可以通过如下来阻止野生型等位基因的再切割：实施第二个HDR寡聚物，其将沉默核苷酸变化放置到第二个等位基因中，阻止了再切割和后续的插入/缺失，并为更有效筛选克隆以鉴定杂合子创建新的限制酶位点。表1提供了演示该方法的实例。

野生型夹法利用了TALEN是高特异性和模块化(modular)的事实，所述TALEN含有一个结合靶序列的单个核苷酸的RVD。通过经由改变HDR中每个密码子的摇摆碱基来制备沉默突变，我们可以阻止TALEN在HDR发生后与该基因座的再结合，阻止HDR野生型等位基因中的插入/缺失。此外，通过工程化改变特定沉默碱基对，所得的HDR野生型等位基因现在将含有新的限制酶位点(在这种情况下是BceAI)，这将允许我们使用RFLP有效地筛选我们的集落。应当注意，使用猪密码子选择数据库制备了沉默碱基对变化，以使用每个氨基酸在相似的水平上使用的密码子。在应用该方法中，我们将简单地筛选出具有用HindIII切割的等位基因(代表R1947X HDR等位基因)以及用BceA1切割的等位基因(代表HDR野生型等位基因)的集落。该野生型夹法允许更为有效地分离出肿瘤抑制基因(如NF1)上杂合的集落。

实施例5：将野生型夹法应用到多个基因

在癌症中，常常必需诱导多个突变。在NF1的情况下，两个肿瘤抑制基因通常牵涉疾病进展，NF1和TP53在相同染色体上极其接近(连锁)。因此，发明人设计出顺式敲除NF1和TP53(两个肿瘤抑制基因)的实验以使动物易患见于NF1患者中的恶性肿瘤，这包括恶性周围神经鞘瘤(MPNSTs)。常见的现象是：这些基因以顺式杂合突变，并经历杂合性丢失，导致NF1和TP53两者无效的细胞[4-6]。该遗传变化驱动多种类型的恶性肿瘤的肿瘤发生，并且在动物模型中工程改造该变化对理解该疾病是至关重要的[4-6]。由于在靶位点之间创建大缺失的倾向，顺式多基因编辑是非常具有挑战的。我们之前已经展示了以10.3％的比率发生在ssDMD基因座上的大缺失的发生[7]。这个实施例进一步被两个靶定基因都是肿瘤抑制基因的这一事实所困惑，因此需要避免肿瘤抑制基因的纯合丢失的新方法，和避免通过在染色体上两个相互邻近位置中的DNA切割带来的大缺失的策略。

使用如上所述的类似方法进行开发并测试针对猪TP53基因(ssTP53E6)的TALEN和HDR寡聚物，该基因在染色体12上与NF1基因连锁(图5)[7]。在TP53的常见突变的外显子6中引入无义突变的TALEN和HDR寡聚物以17％的效率工作[7]。当使用多重方法以创建具有NF1和TP53突变两者的成纤维细胞系时，ssNF1 42.3以25.5％的比率诱导HDR并且ssTP53E6以11.8％的比率切割(图6A)。使用多重方法，其中将ssNF1 42.3和ssTP53E6二者与它们各自的HDR寡聚物转染入Ossabaw细胞中，我们以3.7％(7/190个克隆)的比率回复了NF1^-/+；TP53^-/+克隆(图6B)。因为ssTP53E6经常不能诱导HDR，而仍以高得足以诱导插入/缺失的比率切割；我们进行高限定熔解分析以确定在缺少HDR的情况下任何TP53等位基因是否杂合地含有插入/缺失。对于这两个基因上潜在杂合的总共17个克隆，我们鉴定出10个根据RFLP在NF1上杂合且根据高限定熔解分析在TP53上杂合的克隆(参见材料和方法)。我们测序了所有17个对于这两种基因杂合的克隆，并发现6/17NF1杂合子在野生型等位基因中含有插入/缺失，2/17TP53杂合子在野生型等位基因中含有插入/缺失，并且通过高限定熔解分析鉴定的7/10TP53杂合子在事实上为野生型。总共，通过RFLP，17/190(8.9％)的克隆对NF1是杂合的；通过RFLP，7/190(3.7％)的克隆对NF1和TP53两者是杂合的；17/17的克隆含有在NF1或TP53或两者的野生型等位基因上的插入/缺失。这导致了没有克隆对于NF1和TP53两者是杂合的。

为了克服分离NF1和TP53两者上杂合的克隆的挑战，我们提出以下方法：

通过在转染反应中使用较少的TALEN mRNA或设计具有减弱的活性的TALEN来减少TALEN的活性。

1.通过减少在30℃时的时间来避免再切割。

2.为野生型等位基因设计阻止再切割和后续插入/缺失，并允许通过RFLP有效筛选野生型等位基因的HDR寡聚物(描述于实施例4)。

一旦鉴定出对于NF1和TP53两者杂合的克隆，将通过辐射杂种定位(radiationhybrid mapping)完成顺式发生NF1和TP53突变的克隆鉴定，如前所述的[8]。

材料和方法

TALEN设计

使用在线工具“TAL Effector Nucleotide Targeter 2.0”鉴定候选TALEN靶DNA序列和RVD序列，如前所述[9]。在神经纤维瘤蛋白(NF1)基因的野猪外显子42(其对应于NF1基因的智人外显子40)(其中精氨酸1947(R1947)定位于此)中选择TALEN靶DNA序列。输入DNA序列是R1947的上游和下游的45碱基对。选择R1947X无义突变来突变，因为其是在1型神经纤维瘤病(NF1)患者中观察到的最频繁的改变[10]。在野猪外显子6中设计了设计为靶向TP53基因的TALEN以诱导Y155X突变[11]。表2提供了设计的TALEN的列表：

表2：

供体修复模板设计

设计了同源性依赖性修复(HDR)寡聚物以在NF1基因中工程化改造R1947X突变。该HDR寡聚物含有与野猪NF1外显子42同源的82碱基对序列；导致R→X氨基酸变化的C→T突变，以及新的HindIII限制酶位点(AAGCTT)，其允许在克隆上实施灵活的限制性长度多态性(RFLP)测定以确定是否同源重组已实际发生。设计了HDR寡聚物以工程化改造TP53基因中的Y155X突变。该HDR寡聚物含有与野猪TP53外显子6同源的83碱基对序列，TALEN结合位点侧翼的两个碱基对的改变，导致Y→X氨基酸变化的C→T突变，以及新的HindIII限制酶位点(AAGCTT)，其允许在克隆上实施RFLP测定以确定是否同源重组已实际发生。通过Integrated DNA Technologies来合成这些90mer寡核苷酸模板，100nmol合成，通过标准脱盐纯化，并且重悬于400uM Tris-EDTA中。所设计的HDR寡聚物示于以下表3中，其中加粗字体代表自野生型(WT)序列的变化，并且大写字母表示构成限制性位点的导入的残基。

表3：为修复模板设计的HDR寡聚物

TALEN生产

如前所述[9]生产TALEN。通过遵循Golden Gate Assembly方案，使用RCIscript-GoldyTALEN(Addgene ID 38143)作为最终目的载体来构建质粒[12]。使用QIAPREP SPINMINIPREP试剂盒(Qiagen)制备装配的RCIscript载体，通过SacI线性化，并用作使用mMESSAGET3试剂盒(Ambion)进行体外TALEN mRNA转录的模板。

组织培养和转染

于37℃或30℃(如指示)于5％CO2在补充有10％胎牛血清、100I.U./ml青霉素和链霉素、2mM L-谷氨酰胺、10mM Hepes、5ug/mL脱铁-转铁蛋白(apo-transferrin)、25ng/uLrhEGF，和20ng/uL rhIG的DMEM中维持猪成纤维细胞。使用Neon转染系统(LifeTechnologies)递送TALEN和HDR寡聚物。将在70-100％汇合的低传代Ossabaw、长白猪成纤维细胞以1:2分开，并且次日在70-80％汇合时收获。将约600,000个细胞与mRNA TALEN和HDR寡聚物重悬于“R”缓冲液(Life Technologies)中，并且在100μl尖端通过下述参数电穿孔：输入电压；1800V；脉冲宽度；20ms；和脉冲数目；每次转染中包含0.5-2ug的TALEN mRNA和0.1-0.4nmol针对感兴趣的特定基因的HDR寡聚物。将转染的细胞在30℃下培养2或3天，并且然后分析基因编辑效率并且铺板得到集落。

克隆衍生(Clone Derivation)

转染后2或3天，将50至250个细胞接种到10cm皿上，并且培养到个体集落达到直径约5mm。添加8mL的TrypLE和DMEM培养基(Life Technologies)1:4(vol/vol)混合物并且吸出集落，转移至48孔皿和重复(replica)96孔皿的孔中，并且在相同的条件下培养。收集达到汇合的集落用于冷冻保存以及用于基因型分型的样品制备。

冷冻保存

通过旋转沉降细胞并重悬于冷冻保存培养基中来制备用于冷冻保存的样品，所述培养基由以下组成：90％胎牛血清(Atlas)和10％二甲基亚砜(Sigma)。最初将样品冷冻降至-80℃4小时，然后转移至液氮中用于长期储存。

样品制备

从6孔皿的孔收集第3天经转染的细胞群体，并且在20μl下述1X PCR相容性裂解缓冲液中重悬约10％：10mM Tris-Cl pH 8.0，2mM EDTA，0.45％Tryton X-100(vol/vol)，0.45％Tween-20(vol/vol)，新鲜补充有200μg/ml蛋白酶K。使用下述程序在热循环仪中处理裂解物：55℃60分钟，95℃15分钟。使用20-30μl裂解缓冲液如上文处理来自稀释克隆的集落样品。

Surveyor突变检测和RFLP分析

使用铂Taq DNA聚合酶HiFi(Life Technologies)用1μl细胞裂解物根据制造商的推荐进行在意图位点侧翼的PCR。针对每个位点的引物列于表4中。用SURVEYOR突变检测试剂盒(Transgenomic)根据制造商的推荐使用10ul PCR产物分析群体中的突变频率，如上文描述。使用表5中指定的限制酶对10μl上述PCR反应进行RFLP分析。在10％TBE聚丙烯酰胺凝胶上解析Surveyor和RFLP反应，并且通过溴化乙啶染色显现。使用ImageJ进行条带的密度测定测量；并且计算Surveyor反应的突变率，如前记载[13]。经由用RFLP片段的总和强度除以亲本条带+RFLP片段的总和强度计算百分比HDR。类似地处理集落的RFLP分析，只是用1XACCUSTART II GELTRACK SUPERMIX(Quanta Biosciences)扩增PCR产物并在2.5％琼脂糖凝胶上解析。

表4：用于突变检测的引物

表5：用于HDR检测的限制酶

高限定熔解分析

使用以下进行高限定熔解分析：1:10稀释的2uL细胞裂解液(如上所述)，2uM高限定熔解引物(表6)，1X PRECISION MELT SUPERMIX(BioRad)。在BioRad CFX Connect机器中使用退火温度55℃和40循环的2步骤方案运行反应。使用BioRad’s CFX Manager高限定熔解分析来分析熔解曲线。通过图7中显示的特征曲线来鉴定杂合克隆。

表6：用于高限定熔解分析的引物

扩增子测序和分析

从转染的群体中分离DNA并通过1X ACCUSTART II GELTRACK SUPERMIX(QuantaBiosciences)克隆和扩增。在使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen)对PCR产物进行清洁(cleanup)之前，将PCR产物的一部分在2.5％琼脂糖凝胶上解析以确认大小。将样本提交到明尼苏达大学基因组学中心，使用标准Sanger测序法进行测序。对于其中等位基因是杂合的样本，将新鲜的PCR产物用TOPO-TA克隆入pCR4(Life Technologies)，并且个体TOPO克隆被用作第二PCR反应的模板，以在使用MINELUTE PCR纯化试剂盒(Qiagen)对PCR产物进行清洁(cleanup)之前扩增感兴趣的区域。

实施例6：生产显示Ras超活性的Nf1杂合猪

对雄性长白猪细胞进行3轮体细胞核转移，所述细胞对NF1基因中R1947X突变是杂合的。从3轮克隆和胚胎转移中，建立了一次妊娠，其中出生4头仔猪--两头胎死腹中、一头在2天龄时死亡、一头在93天龄时死亡，图8A。令人惊讶地，在长白猪遗传背景中没有观察到NF1相关表型。随后，对雄性Ossabaw迷你猪细胞进行3轮体细胞核转移，所述细胞对NF1基因中R1947X突变是杂合的。从3轮克隆和胚胎转移中，建立了两次妊娠，并且出生共8头仔猪(3头来自一窝，并且5头来自另一窝)，图9A。三头仔猪在1、5和24天死亡。多个动物显示出牛奶咖啡斑和潜在的脊柱侧凸体征，图9A-D。五头NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪仍活着。

使用活性Ras下拉试剂盒(ThermoFisher)定量活性Ras(Ras-GTP)，其中用栓在谷胱甘肽琼脂糖树脂上的GST-Raf1Ras结合结构域下拉GTP结合的Ras。血清刺激前，将细胞经血清饥饿12小时，并且血清刺激后0、5，和15分钟以及基础血清刺激(未血清饥饿)时收集细胞裂解物。血清饥饿后5min，NF1野生型(WT)和NF1杂合(R1947X/+)细胞显示出Ras-GTP水平的峰值，图8B。当相对于总Ras(图8C,顶部)或GAPDH(图8C,底部)标准化Ras-GTP时，NF1R1947X/+(NF1Het)细胞显示出相较于NF1野生型细胞增加的Ras活性。血清刺激后15分钟，与NF1野生型细胞相比，对于NF1R1947X/+(NF1Het)细胞，Ras-GTP保持更高水平。这些结果显示，在人中鉴定的并转移至猪的R1947X突变确实参与神经纤维瘤病的病因(etiotolgy)。此外，这表明Ras在病理学中起主要作用。此外，这表明NF1突变对Ras高活性起作用。

NF1杂合猪具有NF1相关表型：图9A-C提供了显示神经纤维瘤病表型的出生的NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪表型的例子。图9A，NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪的面部的棕褐色/褐色色素沉着不足(顶部)以及背部的白色色素沉着不足(底部)。图9B，尸体解剖后，通过大体观察(左)和X射线成像(右)，两头NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪显示出脊柱弯曲的征兆以及潜在的脊柱侧凸的体征。已经在许多NF1R1947X/+Ossabaw迷你猪中观察到牛奶咖啡斑。表(左)描述了在单个动物中见到的11个牛奶咖啡斑，具有如指示的病变照片。NF1患者中牛奶咖啡斑是非常常见的，并且用作诊断人中NF1的标准。图9D，1-4是对应于9C中1-4的斑点的照片。

实施例7：鉴定SNP以确定NF1和TP53中诱导的突变是顺式还是反式

发明人在由TALEN介导的同源性依赖性修复诱导的NF1R1947X或TP53S119X突变的5,100个碱基对中鉴定了潜在SNP(表7和8)。一个或多个所鉴定的SNP将用于鉴定哪个染色体上发生NF1R1947X突变，以及哪个染色体上发生TP53S119X突变。使用收集自携带NF1和TP53基因的染色体12上基因座的辐射杂合图的数据，发明人将能够鉴定出在相同染色体上发生NF1R1947X和TP53S119X突变的克隆。

表7

表8

从1到50连续列举的以下段落提供了本公开的各个方面。在一个实施方案中，在第一段(1)中，本公开提供：

1.猪或细胞或胚胎，其包含遗传修饰的NF1基因和/或修饰的TP53基因。

2.段落1的猪或细胞或胚胎，其中所述修饰的NF1基因包含在人中精氨酸1947的等同的位置处的修饰。

3.段落1和2的猪或细胞或胚胎，其中修饰所述修饰的NF1基因和/或修饰的TP53基因以含有提前终止密码子。

4.段落1-3中任一项的猪或细胞或胚胎，其具有NF1基因的杂合修饰。

5.段落1-4中任一项的猪或细胞或胚胎，其具有TP53基因的杂合修饰。

6.段落1-5中任一项的猪或细胞或胚胎，其具有NF1基因和TP53基因两者的修饰。

7.段落1-6中任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述修饰是顺式的。

8.段落1-7中任一项的猪或细胞或胚胎，其中NF1基因的一个等位基因是野生型等位基因。

9.段落1-8中任一项的猪或细胞或胚胎，其中TP53基因的一个等位基因是野生型等位基因。

10.段落1-9中任一项的猪或细胞或胚胎，其中除了野生型NF1等位基因具有至少1个沉默突变之外，NF1基因的1个等位基因是野生型等位基因。或者：仅具有1、2、3、4，或5个沉默突变。

11.段落1-10中任一项的猪或细胞或胚胎，其中除了野生型TP53等位基因具有至少1个沉默突变之外，TP53基因的1个等位基因是野生型等位基因。或者：仅具有1、2、3、4，或5个沉默突变。

12.段落1-11中任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述沉默突变为限制酶提供攻击位点。例如：提供1、2、3、4，或5位点的1、2、3、4、5个沉默突变，其中所述位点是单个酶特异性的或为多个限制酶提供位点。

13.段落1-12中任一项的猪或细胞或胚胎，其具有修饰(沉默或其他)，所述修饰由于修饰而为限制酶提供攻击位点。例如：提供1、2、3、4，或5位点的1、2、3、4、5个突变，其中所述位点是单个酶特异性的或为多个限制酶提供位点。

14.段落1-13中任一项的猪或细胞或胚胎，其是微型猪(miniature pig)和/或ossabaw猪和/或长白猪(landrace pig)和/或建立者(founder)和/或F1。

15.段落1-14中的细胞，其是原代(primary)和/或猪和/或低传代(低于13代)细胞。

16.段落1-15中的细胞，其是受精卵、卵母细胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成员。

17.制备段落1-16中任一项的方法，其包含使用靶向内切核酸酶和/或同源性依赖性修复模板。所述细胞可以被用于制备动物，例如通过克隆。

18.制备动物、细胞，或胚胎的方法，其包含向细胞或胚胎中导入：

定向(directed)至靶染色体DNA位点的靶向内切核酸酶；

与靶染色体DNA位点同源的第一HDR模板，所述第一HDR模板包含对于靶染色体DNA位点外源的第一序列，和

与靶染色体DNA位点同源的第二HDR模板，所述第二HDR模板包含对于靶染色体DNA位点外源的第二序列。

19.段落18中的方法，其中所述第二序列与靶DNA染色体位点相同。

20.段落18和19的方法，其中所述第二序列与靶DNA染色体位点具有99％同一性。或者，数值为95至99.99％；技术人员将立即意识到，在这个范围内的所有范围和数值都被考虑和支持，例如97、99.8，至少95％。

21.段落18至20的方法，其中所述第二序列与靶DNA染色体位点相同，除了：(i)一个或多个沉默突变；(ii)碱基数目在1-5的范围内。例如，沉默突变的数目可以是1-5。

22.段落18-21中任一项的方法，其中除了在允许由预先确定的限制酶切割的序列中的变化之外，所述第二序列与靶DNA染色体位点相同。进一步的方法提供了任何数目的此类改变，例如1-5。

23.段落18-22中任一项的方法，其中所述外源序列包含：(i)在自然界中发现的等位基因；(ii)在同一物种中发现的等位基因；(iii)在同一物种的另一品种中发现等位基因(不在相同品种中的等位基因)；(iv)来自不同物种的等位基因(不来自相同物种的等位基因)；(v)创建基因敲除的序列；(vi)可表达的选择标志物(例如抗生素，荧光蛋白)；(viii)可诱导的启动子；(ix)着落垫(landing pad)；或(x)i-ix的任何组合，其可以是适当的。

24.段落18-23中任一项的方法，其中所述动物、细胞，或动物对于由第一HDR模板产生的遗传修饰是杂合的。

25.段落18-24中任一项的方法，其应用于制备修饰的NF1和/或TP53位点。

26.段落18-24中任一项的方法，其应用于制备修饰的肿瘤抑制基因。

27.段落18-26中任一项的方法，还包含调整第一HDR模板与第二HDR模板的比率。

28.段落18-27中任一项的方法，其中所述第一模板包含用于第一限制酶的第一位点，以及第二模板包含对于第二限制酶的第二位点。其中所述第一位点和第二位点相对于靶位点和/或靶染色体和/或品种和/或物种和/或动物是新的。或者：对于额外的独特酶的添加位点，因此存在3个或更多个限制酶位点，例如数目从3至10；例如，4、5、6、7、8、9。

29.段落18-28中任一项的方法，其包含对多个细胞筛选遗传修饰，所述方法包含鉴定包含所述第一位点和所述第二位点的细胞。或3-10个位点。

30.动物或细胞或胚胎，其包含基因组修饰的肿瘤抑制基因，所述基因是杂合修饰的。

31.段落30的动物或细胞或胚胎，其通过18-30中任一项的方法制备。

32.段落30-31中任一项动物或细胞或胚胎，其中除了野生型NF1等位基因具有至少一个沉默突变之外，所述修饰基因的一个等位基因是野生型等位基因。或者：仅具有1、2、3、4，或5个沉默突变。

33.段落30-32的动物或细胞或胚胎，其中所述沉默突变为限制酶提供了攻击位点。例如：提供1、2、3、4，或5个位点的1、2、3、4、5个沉默突变，其中所述位点是单个酶特异性的或为多个限制酶提供位点。

34.段落30-33中任一项动物或细胞或胚胎，其包含在基因上(在修饰完成后的基因的一个或两个等位基因上)的修饰(沉默或其他)，所述修饰由于该修饰而为限制酶提供攻击位点。例子：提供1、2、3、4，或5个位点的1、2、3、4、5个突变，其中所述位点是单个酶特异性的或为多个限制酶提供位点。

35.段落30-34中任一项动物或细胞或胚胎，其是家畜、牛、猪、微型猪(miniaturepig)和/或ossabaw猪和/或长白猪(landrace pig)和/或建立者和/或F1。

36.段落30-35中任一项的细胞，其是原代和/或动物和/或低传代(低于13代)细胞。

37.段落30-36中任一项的细胞，其是其是受精卵、卵母细胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成员。

参考文献

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序列表

<110> 重组股份有限公司

DANIEL, CARLSON

<120> 肿瘤抑制基因的杂合修饰和1型神经纤维瘤病的猪模型

<130> 5054.34/US2

<150> US 62/078,857

<151> 2014-11-12

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 85

<212> DNA

<213> 野猪

<400> 1

tcaaatctag tacgtttttg taagcacaat gatgatgcca aacgacaaag agttactgcg 60

atccttgata agctgataac aatga 85

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 创建R1947X的NF1 HDR寡聚物

<400> 2

tcaaatctag tacgtttttg taagcacaat gatgatgcca aatgaagctt caaagagtta 60

ctgcgatcct tgataagctg ataacaatga 90

<210> 3

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 用于野生型夹的NF1 HDR寡聚物

<400> 3

tcaaatctag tacgtttttg taagcacaat gacgacgcta aacggcaaag agttactgcg 60

atcctcgaca aactcattac aatga 85

<210> 4

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 左TALEN RVD

<400> 4

Asn Gly Asn Asn Asn Gly Asn Ile Asn Ile Asn Asn His Asp Asn Ile

1 5 10 15

His Asp Asn Ile Asn Ile Asn Gly Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Asn

20 25 30

Asn Ile

<210> 5

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 右TALEN RVD

<400> 5

His Asp Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Asn Asn Ile Asn Gly His Asp

1 5 10 15

Asn Asn His Asp Asn Ile Asn Asn Asn Gly Asn Ile Asn Ile His Asp

20 25 30

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 左TALEN RVD

<400> 6

Asn Ile Asn Ile Asn Asn His Asp Asn Ile His Asp Asn Ile Asn Ile

1 5 10 15

Asn Gly Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Asn

20 25 30

His Asp

<210> 7

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 右TALEN RVD

<400> 7

Asn Gly Asn Ile Asn Gly His Asp Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Asn

1 5 10 15

Asn Ile Asn Gly His Asp Asn Asn His Asp Asn Ile Asn Asn Asn Gly

20 25 30

<210> 8

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 左TALEN RVD

<400> 8

Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Asn Asn Ile Asn Gly Asn Asn His Asp

1 5 10 15

His Asp Asn Ile Asn Ile Asn Ile His Asp Asn Asn Asn Ile His Asp

20 25 30

<210> 9

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 右TALEN RVD

<400> 9

Asn Gly Asn Ile Asn Gly His Asp Asn Ile Asn Asn His Asp Asn Gly

1 5 10 15

Asn Gly Asn Ile Asn Gly His Asp Asn Ile Asn Ile Asn Asn Asn Asn

20 25 30

<210> 10

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 左TALEN RVD

<400> 10

Asn Asn Asn Asn His Asp Asn Ile His Asp His Asp His Asp Asn Asn

1 5 10 15

Asn Gly Asn Asn Asn Gly His Asp His Asp Asn Asn His Asp Asn Asn

20 25 30

His Asp

<210> 11

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> 右TALEN RVD

<400> 11

His Asp Asn Ile Asn Gly Asn Asn Asn Gly Asn Ile His Asp Asn Gly

1 5 10 15

His Asp Asn Gly Asn Asn Asn Ile His Asp Asn Gly Asn Gly

20 25 30

<210> 12

<211> 85

<212> DNA

<213> 野猪

<400> 12

tcaaatctag tacgtttttg taagcacaat gatgatgcca aacgacaaag agttactgcg 60

atccttgata agctgataac aatga 85

<210> 13

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> ssNF1 HDR寡核苷酸序列

<400> 13

tcaaatctag tacgtttttg taagcacaat gatgatgcca aatgaagctt caaagagtta 60

ctgcgatcct tgataagctg ataacaatga 90

<210> 14

<211> 85

<212> DNA

<213> 野猪

<400> 14

agctcgccac ccccgcctgg cacccgtgtc cgcgccatgg ccatctacaa gaagtcagag 60

tacatgaccg aggtggtgag gcgct 85

<210> 15

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> ssTP53 HDR寡核苷酸序列

<400> 15

agctcgccac ccccgcctgg cacccgggtc cgcgccatgg ccatctaagc ttaaagaagt 60

cagagtacat gcccgaggtg gtgaggcgct 90

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 16

cctgccccca ccatcttctt att 23

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 17

gctctcgtac agtgctttgc acaa 24

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 18

ctcccctgcc ctcaataagc tgtt 24

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物

<400> 19

tgggaatgag gggtttggca g 21

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物-正向

<400> 20

gtgggtcagc tcgccacccc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> PCR引物-反向

<400> 21

gtgggtcagc tcgccacccc 20

Claims

1.猪或细胞或胚胎，其包含基因组修饰的肿瘤抑制基因。

2.权利要求1的猪、细胞或胚胎，其中所述肿瘤抑制基因是NF1基因和/或TP53基因。

3.上述任一项的猪、细胞或胚胎，其中所述基因在染色体12上。

4.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述修饰的NF1基因包含在人中精氨酸1947的等同的位置处的修饰。

5.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述修饰的NF1基因和/或修饰的TP53基因经修饰以含有提前终止密码子。

6.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其具有所述NF1基因的杂合修饰。

7.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其具有所述TP53基因的杂合修饰。

8.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其具有所述NF1基因和所述TP53基因两者的修饰。

9.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述修饰是顺式的。

10.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述NF1基因的一个等位基因是野生型等位基因。

11.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述TP53基因的一个等位基因是野生型等位基因。

12.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中除了野生型NF1等位基因具有一个或多个沉默突变之外，所述NF1基因的一个等位基因是野生型等位基因。

13.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中除了野生型TP53等位基因具有一个或多个沉默突变之外，所述TP53基因的一个等位基因是野生型等位基因。

14.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其中所述NF1等位基因的一个或多个沉默突变为一个或多个限制酶提供了攻击位点。

15.权利要求11的猪或细胞或胚胎，其中所述TP53等位基因的一个或多个沉默突变为一个或多个限制酶提供了攻击位点。

16.权利要求1的猪或细胞或胚胎，其是微型猪(miniature pig)和/或ossabaw猪和/或长白猪(landrace pig)和/或建立者(founder)和/或F1。

17.上述任一项的猪或细胞或胚胎，其是原代(primary)和/或低传代猪、细胞或胚胎。

18.上述任一项的细胞，其是受精卵、卵母细胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成员。

19.制备上述任一项的猪或细胞或胚胎的方法，其包含使用靶向内切核酸酶和/或同源性依赖性修复模板。

20.权利要求19的方法，其中从所述细胞克隆动物。

21.制备具有一个或多个遗传修饰的动物、细胞，或胚胎的方法，其包含向细胞或胚胎导入：

定向至靶染色体DNA位点的靶向内切核酸酶；

与所述靶染色体DNA位点同源的第一HDR模板，所述第一HDR模板包含对于所述靶染色体DNA位点外源的第一序列；和与所述靶染色体DNA位点同源的第二HDR模板，所述第二HDR模板包含对于所述靶染色体DNA位点外源的第二序列。

22.权利要求21的方法，其中所述第二序列与所述靶DNA染色体位点相同。

23.权利要求21至22中任一项的方法，其中所述第二序列与所述靶DNA染色体位点具有99％同一性。

24.权利要求21至23中任一项的方法，其中所述第二序列与所述靶DNA染色体位点具有95％同一性。

25.权利要求21至24中任一项的方法，其中除了一个或多个沉默突变之外，所述第二序列与所述靶DNA染色体位点相同。

26.权利要求21至25中任一项的方法，其中所述一个或多个沉默突变中变化的碱基数目为1-6。

27.权利要求21至26中任一项的方法，其中除了允许由一个或多个限制酶切割的序列中的变化之外，所述第二序列与所述靶DNA染色体位点相同。

28.权利要求21至27中任一项的方法，其中所述外源序列包含：(i)在自然界中发现的等位基因；(ii)在同一物种中发现的等位基因；(iii)在同一物种的另一品种中发现的等位基因；(iv)来自不同物种的等位基因；(v)创建基因敲除的序列；(vi)可表达的选择标志物；(viii)可诱导的启动子；(ix)着落垫(landing pad)；或(x)i-ix的任何组合。

29.权利要求21至28中任一项的方法，其中所述动物、细胞或胚胎对于由所述第一HDR模板产生的遗传修饰是杂合的。

30.权利要求21至29中任一项的方法，其中所述遗传修饰是一个或多个肿瘤抑制基因的修饰。

31.权利要求21至30中任一项的方法，其应用于产生修饰的NF1和/或TP53位点。

32.权利要求21至31中任一项的方法，其还包含调整所述第一HDR模板与所述第二HDR模板的比率。

33.权利要求21至32中任一项的方法，其中所述第一模板包含用于第一限制酶的第一位点，以及所述第二模板包含用于第二限制酶的第二位点。

34.权利要求21至33中任一项的方法，其包含对多个细胞筛选遗传修饰，包括鉴定包含所述第一位点和所述第二位点的细胞。

35.动物或细胞或胚胎，其包含一个或多个基因组修饰的肿瘤抑制基因，所述一个或多个基因是杂合修饰的。

36.权利要求35的动物或细胞或胚胎，其由权利要求21-33中任一项的方法制备。

37.权利要求35或36中任一项的动物或细胞或胚胎，其中除了野生型NF1等位基因具有一个或多个沉默突变之外，所述修饰的基因的一个等位基因是野生型等位基因。

38.权利要求35至37中任一项的动物或细胞或胚胎，其中所述一个或多个沉默突变为限制酶提供了攻击位点。

39.权利要求35-38中任一项的动物或细胞或胚胎，其包含在所述一个或多个基因的一个或两个等位基因处的修饰，所述修饰为一个或多个限制酶提供攻击位点。

40.权利要求35至39中任一项的动物或细胞或胚胎，其是家畜、牛、猪、微型猪和/或ossabaw猪和/或长白猪和/或建立者和/或F1。

41.权利要求35至40中任一项的细胞，其是原代和/或动物和/或低传代(低于13代)细胞。

42.权利要求35至41中任一项的细胞，其是受精卵、卵母细胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成员。

43.靶向内切核酸酶以基因组修饰细胞、胚胎或动物的用途，其中所述修饰包含对一个或多个肿瘤抑制基因的突变。

44.权利要求43的用途，其中所述修饰还包含

与靶染色体DNA位点同源的第一HDR模板，所述第一HDR模板包含对于所述靶染色体DNA位点外源的第一序列，和

与所述靶染色体DNA位点同源的第二HDR模板，所述第二HDR模板包含对于所述靶染色体DNA位点外源的第二序列。

45.权利要求43和44的用途，其中所述第二序列与所述靶DNA染色体位点相同。

46.权利要求43至45中任一项的用途，其中所述第二序列与所述靶DNA染色体位点具有99％同一性。

47.权利要求43至46中任一项的用途，其中所述第二序列与所述靶DNA染色体位点具有95％同一性。

48.权利要求43至47中任一项的用途，其中除了一个或多个沉默突变之外，所述第二序列与所述靶DNA染色体位点相同。

49.权利要求43至48中任一项的方法，其中所述一个或多个沉默突变中变化的碱基数目为1-6。

50.权利要求43至49中任一项的用途，其中除了允许由一个或多个限制酶切割的序列中的变化之外，所述第二序列与所述靶DNA染色体位点相同。

51.权利要求43至50中任一项的用途，其中所述外源序列包含：(i)在自然界中发现的等位基因；(ii)在同一物种中发现的等位基因；(iii)在同一物种的另一品种中发现的等位基因；(iv)来自不同物种的等位基因；(v)创建基因敲除的序列；(vi)可表达的选择标志物；(viii)可诱导的启动子；(ix)着落垫；或(x)i-ix的任何组合。

52.权利要求43至51中任一项的用途，其中所述动物、细胞或胚胎对于由所述第一HDR模板产生的遗传修饰是杂合的。

53.权利要求43至52中任一项的用途，其中所述遗传修饰是一个或多个肿瘤抑制基因的修饰。

54.权利要求43至53中任一项的用途，其应用于产生修饰的NF1和/或TP53位点。

55.权利要求43至54中任一项的用途，其还包含调整所述第一HDR模板与所述第二HDR模板的比率。

56.权利要求43至55中任一项的用途，其中所述第一模板包含用于第一限制酶的第一位点，以及所述第二模板包含用于第二限制酶的第二位点。

57.具有一个或多个修饰的肿瘤抑制基因的细胞或胚胎以从其克隆动物的用途。

58.权利要求57的细胞或胚胎的用途，其中所述一个或多个肿瘤抑制基因是杂合修饰的。

59.权利要求57和58的细胞或胚胎的用途，其中所述修饰包含NF1基因和/或TP53基因的修饰。

60.权利要求57至59的细胞或胚胎的用途，其中所述一个或多个修饰以顺式产生。