CN107073017A - 用于治疗癌前皮肤病变的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开涵盖用于治疗癌前皮肤病变的组合物和方法。本发明的组合物包含细胞毒性剂和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂。

Description

用于治疗癌前皮肤病变的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年9月10日提交的美国临时专利申请号62/048,586的优先权，该案以引用的方式整体并入本文中。

发明领域

本公开涵盖用于治疗癌前皮肤病变的组合物和方法。本发明的组合物包含细胞毒性剂和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂。

发明背景

在美国，非黑色素瘤型皮肤癌是影响众多个体的最常见癌症类型[1]。如果不加治疗，则这些癌症会导致显著发病，包括溃疡、感染及局部毁容。重要的是，就鳞状细胞癌来说，可以在临床上鉴别为光化性角化病的癌前病变可以早期治疗，以防止其发展成需要昂贵手术程序的全面爆发的皮肤恶性疾病。除用于临床上可见的光化性角化病的破坏性治疗(例如冷冻疗法)外，也已经开发出若干表面治疗，这些治疗还能治疗亚临床病变。这些针对区域的治疗(field-directed treatment)包括光动力疗法、5-氟尿嘧啶及咪喹莫特(imiquimod)[2]。然而，当前治疗的有效性、治疗持续时间及与这些治疗有关的副作用的严重程度限制了患者的顺应性及其治疗功效。因此，需要开发针对光化性角化病的新颖治疗方法，这些治疗方法可以在较少应用情况下提供最佳的结果，同时具有较少副作用。考虑到仅在美国，光化性角化病的年护理成本就超过$900,000,000[3]，故可以消除光化性角化病并预防皮肤癌发生的有效治疗也将对卫生系统带来重要影响。

发明概述

在一方面，本发明涵盖一种治疗癌前皮肤病变的方法。该方法包括向病变表面施用含细胞毒性剂和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂的组合物。

在另一方面，本发明涵盖一种预防癌前皮肤病变转变成皮肤癌的方法。该方法包括：(a)鉴别具有一个或多个癌前皮肤病变的受试者；及(b)向所述癌前皮肤病变表面施用含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中所述癌前皮肤病变的大小变小，由此防止向皮肤癌发展。

在又另一方面，本发明涵盖一种预防癌前皮肤病变发生的方法。该方法包括向有发生癌前皮肤病变的受试者表面施用含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物。

附图简述

本申请文件含有至少一个以彩色绘制的附图。此带有彩色附图的专利申请公布的复本将在提出请求并缴纳必要费用之后由专利局提供。

图1A描绘了患者随机分组的示意图。登记入选患者并且对其所有适合治疗的解剖部位进行评价并拍照。药物治疗随机分组是基于由治疗医师挑选的参与者的主要适合解剖部位。在确定药物治疗分配之后，参与者将对其所有适合解剖部位施加相同的药物治疗。*：研究药物是根据有关每一主要解剖部位的随机化清单进行分配，但参与者将对其所有适合解剖部位施加相同药物治疗。RUE：右上肢；LUE：左上肢。图1B描绘的图略述了临床试验的时间表。应注意，第2周和第4周的就诊是可选的。*：推荐在第2周和第4周就诊，但非必需的。

图2描绘了研究的患者统计数据。显示了入选患者的数量(175)、进入并完成研究的患者数量(132)及基于其主要解剖部位的分配。

图3描绘了卡泊三醇+5-氟尿嘧啶与5-氟尿嘧啶治疗之间光化性角化病病变减小百分比的比较。在8周就诊时，相较于标准护理治疗(5-FU+凡士林)，连续四天每天两次用5-FU+卡泊三醇组合治疗引起光化性角化病(AK)的明显较高清除率(对于所有解剖部位，p＜0.0001，Student t检验；RUE：右上肢；LUE：左上肢)。

图4描绘了与治疗方案有关的不良事件的图像。如紧接着在最后一次治疗后(第5天)以及在停止治疗后10天(第2周)所见，连续4天每天两次用5-FU+卡泊三醇治疗的参与者出现集中在光化性角化病部位周围的明显炎症。

图5A、图5B、图5C及图5D描绘的图显示了每一治疗的解剖部位的红斑评分是0分、1分及2分的参与者的百分比。(图5A)头皮、(图5B)面部、(图5C)RUE及(图5D)LUE。应注意，由于治疗持续时间较短，故没有红斑评分是3分或4分的参与者，而这在连续2-3周每天两次用5-FU治疗(标准护理方案)的患者中较常见。

图6A和图6B描绘了用于图6C中呈现的图像的两种治疗方案。图6C描绘了在治疗前后从AK得到的苏木精与伊红(H&E)染色的切片。这些图像显示用5-FU+卡泊三醇治疗的参与者在治疗(Tx)后真皮上层中的淋巴细胞主要积累于AK中。治疗前后针对AK的免疫荧光染色也显示，用5-FU+卡泊三醇治疗的参与者在治疗后AK中出现稳固TSLP表达，包括真皮-表皮连接区附近CD3+T细胞的积累。这些T细胞中大部分是CD4+T辅助细胞(插图)。K14指代皮肤角质细胞。

发明详述

申请人意外地发现，包含细胞毒性剂和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂的表面组合物明显减小癌前皮肤病变的数量和大小。病变数量和大小的减小是在较短治疗过程中发生，由此降低了不良作用的风险。因此，本公开提供了用于预防和治疗各种皮肤病变的组合物和方法。以下描述本发明的其它方面。

I.组合物

在一个方面，本发明的组合物包含细胞毒性剂和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂。在一个具体实施方案中，本发明的组合物包含5-氟尿嘧啶(5-FU)和维生素D类似物。相较于未修饰形式，维生素D类似物可以被修饰成改善生物利用率、溶解性、稳定性、处理特性或其组合。因此，在另一方面，本发明的组合物包含修饰的维生素D。在又另一方面，本发明的组合物包含维生素D类似物的前药。

除细胞毒性剂和TSLP诱导剂外，本发明的组合物还可以任选包含一种或多种另外的药物或治疗活性剂。本发明的组合物可以另外包含药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。此外，本发明的组合物可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、添味剂、盐(本发明的物质本身可以呈药学上可接受的盐形式)、缓冲剂、包覆剂或抗氧化剂。

以下将更详细地描述本发明的其它方面。

(a)细胞毒性剂

如本文所使用，“细胞毒性剂”一般是影响正在迅速分裂的细胞的药剂。细胞毒性剂是对正在迅速分裂的细胞有毒的任何天然存在、经过修饰或合成的化合物。此类药剂可用于治疗赘生物，以及治疗以细胞增殖或高活性细胞群为特征的其它症状或疾病。细胞毒性剂可以是烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、抗细胞骨架剂、拓扑异构酶抑制剂、抗激素剂、靶向性治疗剂、血管生成抑制剂、生长抑制性多肽、光动力治疗剂、抗肿瘤剂或其组合。在一个具体实施方案中，该细胞毒性剂可以选自由抗代谢物和光动力治疗剂组成的群组。

适合烷化剂的非限制性实例可以包括六甲密胺(altretamine)、苯佐替派(benzodopa)、白消安(busulfan)、卡铂(carboplatin)、卡波醌(carboquone)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、氯脲霉素(chlorozotocin)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cyclosphosphamide)、达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、英丙舒凡(improsulfan)、顺铂质脂体(lipoplatin)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、马磷酰胺(mafosfamide)、甘露舒凡(mannosulfan)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑(melphalan)、美妥替哌(meturedopa)、莫司汀(mustine)(氮芥)、二溴甘露醇(mitobronitol)、尼莫司汀(nimustine)、新恩比兴(novembichin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、苯芥胆固醇(phenesterine)、哌泊舒凡(piposulfan)、泼尼莫司汀(prednimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、赛特铂(satraplatin)、司莫司汀(semustine)、替莫唑胺(temozolomide)、塞替派(thiotepa)、曲奥舒凡(treosulfan)、三亚胺醌(triaziquone)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide，TEPA)、三亚乙基硫代磷酰胺(塞替派)、三羟甲基三聚氰胺、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)及乌瑞替哌(uredopa)。

适合抗肿瘤抗生素的非限制性实例可以包括阿克拉霉素(aclacinomysin)、阿柔比星(aclarubicin)、放线菌素(actinomycins)、阿霉素(adriamycin)、奥瑞他汀(aurostatin)(例如，单甲基奥瑞他汀E(monomethylauristatin E))、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycins)、放线菌素C(cactinomycin)、刺孢霉素(calicheamicin)、卡拉比星(carabicin)、卡诺霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、环氧霉素(epoxomicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、米拉霉素(mithramycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、普卡霉素(plicamycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、司帕霉素(sparsomycin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、戊柔比星(valrubicin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)及佐柔比星(zorubicin)。

适合抗细胞骨架剂的非限制性实例可以包括卡巴他赛(cabazitaxel)、秋水仙碱(colchicines)、秋水仙胺(demecolcine)、多西他赛(docetaxel)、艾普塞隆(epothilones)、伊沙匹隆(ixabepilone)、大分子霉素(macromycin)、高三尖杉酯碱(omacetaxinemepesuccinate)、沃塔紫杉醇(ortataxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(例如DHA-太平洋紫杉醇)、紫杉烷(taxane)、特斯紫杉醇(tesetaxel)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)及长春瑞滨(vinorelbine)。

适合拓扑异构酶抑制剂可以包括但不限于，安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)(VP-16)、伊立替康(irinotecan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、RFS 2000、替尼泊苷(teniposide)及托泊替康(topotecan)。

适合抗激素剂的非限制性实例可以包括氨鲁米特(aminoglutethimide)、抗雌激素(antiestrogen)、芳香化酶抑制性4(5)-咪唑、比卡鲁胺(bicalutamide)、非那雄胺(finasteride)、氟他胺(flutamide)、氟维司群(fluvestrant)、戈舍瑞林(goserelin)、4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、那洛昔芬(keoxifene)、亮丙瑞林(leuprolide)、LY117018、米托坦(mitotane)、尼鲁米特(nilutamide)、奥那司酮(onapristone)、雷洛昔芬(raloxifene)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)及曲洛司坦(trilostane)。

靶向性治疗剂的实例可以包括但不限于，单克隆抗体，如阿仑珠单抗(alemtuzumab)、卡妥莫单抗(cartumaxomab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依帕珠单抗(epratuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉妥木单抗维多汀(glembatumumab vedotin)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、瑞妥昔(reditux)、利妥昔单抗(rimximab)、托西莫单抗(tositumomab)及曲妥珠单抗(trastuzumab)；蛋白激酶抑制剂，如贝伐珠单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、克唑替尼(crizonib)、达沙替尼(dasatinib)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、伊马替尼(imatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、莫立替尼(mubritinib)、尼罗替尼(nilotinib)、帕木单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、托西尼布(toceranib)及凡德他尼(vandetanib)。

血管生成抑制剂的非限制性实例可以包括血管抑素(angiostatin)、贝伐珠单抗、地尼白介素(denileukindiftitox)、内皮抑素(endostatin)、依维莫司(everolimus)、染料木黄酮(genistein)、干扰素α(interferon alpha)、白细胞介素-2(interleukin-2)、白细胞介素-12(interleukin-12)、帕唑帕尼、培加尼布(pegaptanib)、雷珠单抗(ranibizumab)、雷帕霉素(rapamycin)(西罗莫司(sirolimus))、坦西莫司(temsirolimus)及沙利度胺(thalidomide)。

生长抑制性多肽的非限制性实例可以包括硼替佐米(bortazomib)、促红细胞生成素、白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6)、白血病抑制因子、干扰素、罗米地辛(romidepsin)、血小板生成素(thrombopoietin)、TNF-α、CD30配体、4-1BB配体及Apo-1配体。

其它抗肿瘤剂可以包括阿那格雷(anagrelide)、三氧化二砷、门冬酰胺酶、贝沙罗汀(bexarotene)、溴匹立明(bropirimine)、塞来昔布(celecoxib)、以化学方式连接的Fab、乙丙昔罗(efaproxiral)、依托格鲁(etoglucid)、铁锈醇(ferruginol)、罗尼达胺(lonidamide)、马索罗酚(masoprocol)、米替福新(miltefosine)、米托胍腙(mitoguazone)、他仑帕奈(talapanel)、曲贝替定(trabectedin)及伏立诺他(vorinostat)。

在某些实施方案中，细胞毒性剂是光动力治疗剂。光动力治疗剂的非限制性实例可以包括氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、类视黄醇(阿利维甲酸(alitretinon)、他米巴罗汀(tamibarotene)、维甲酸(tretinoin))及替莫泊芬(temoporfin)。在一个具体实施方案中，光动力治疗剂是氨基乙酰丙酸。

在一个具体实施方案中，细胞毒性剂是抗代谢物。适合抗代谢物可以包括但不限于，氨基蝶呤(aminopterin)、安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、8-氮杂鸟嘌呤、6-氮杂尿苷、卡培他滨(capecitabine)、卡莫氟(carmofur)(1-己基氨甲酰基-5-氟尿嘧啶)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C))、地西他滨(decitabine)、二甲叶酸(denopterin)、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氮尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、5-氟尿嘧啶、吉西他宾(gemcitabine)、羟基脲、亚叶酸、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、萘福昔定(nafoxidine)、奈拉滨(nelarabine)、奥利默森(oblimersen)、培美曲塞(pemetrexed)、蝶罗呤(pteropterin)、雷替曲塞(raltitrexed)、替加氟(tegofur)、噻唑呋林(tiazofurin)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤及三甲曲沙(trimetrexate)。在一个具体实施方案中，抗代谢物是5-氟尿嘧啶(5-FU)。5-FU是一种作为嘧啶类似物的药物，可用于治疗癌症。它是一种自杀抑制剂并且通过不可逆地抑制胸苷酸合成酶起作用。

一般来说，细胞毒性剂的剂型是乳膏或表面溶液。不过，也涵盖其它适于表面施用的细胞毒性剂剂型。适于表面施用的药物组合物可以被配制为油膏、乳膏、混悬液、洗液、散剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、油或敷药膏形式。表面施用还可以涉及使用透皮施用，如透皮贴片或离子导入装置。在一个具体实施方案中，该药物组合物是以表面油膏或乳膏形式施用。

细胞毒性剂的剂量可以取决于待治疗的疾病或病症和/或待治疗的受试者的年龄和状况而变化。在向受试者施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物的实施方案中，该组合物中细胞毒性剂的浓度可以是约0.01％至约25％，或约0.1％至约10％，或更优选是约0.5％至约5％。举例来说，该组合物中细胞毒性剂的浓度可以是约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％或约10％。或者，该组合物中细胞毒性剂的浓度可以是约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。在某些实施方案中，该组合物中细胞毒性剂的浓度可以是约0.5％、约1％、约2％、约2.5％或约5％。在另一实施方案中，该组合物中细胞毒性剂的浓度是约2％至约5％。在一个具体实施方案中，该组合物中细胞毒性剂的浓度是约2.5％。在又另一实施方案中，该组合物中细胞毒性剂的浓度是约5％。

在某些实施方案中，细胞毒性剂是氨基乙酰丙酸。氨基乙酰丙酸的剂量可以取决于待治疗的疾病或病症和/或待治疗的受试者的年龄和状况而变化。在向受试者施用包含氨基乙酰丙酸和TSLP诱导剂的组合物的实施方案中，该组合物中氨基乙酰丙酸的浓度可以是约10％至约25％，或更优选是约15％至约20％。举例来说，该组合物中氨基乙酰丙酸的浓度可以是约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。在某些实施方案中，该组合物中氨基乙酰丙酸的浓度可以是约18％至约22％。在一个实施方案中，该组合物中氨基乙酰丙酸的浓度是约8％至约12％。在一个具体实施方案中，该组合物中氨基乙酰丙酸的浓度是约10％。在另一实施方案中，该组合物中氨基乙酰丙酸的浓度是约20％。

在一个具体实施方案中，细胞毒性剂是5-FU。5-FU的剂量可以取决于待治疗的疾病或病症和/或待治疗的受试者的年龄和状况而变化。在向受试者施用包含5-FU和TSLP诱导剂的组合物的实施方案中，该组合物中5-FU的浓度可以是约0.1％至约10％，或更优选是约0.5％至约5％。举例来说，该组合物中5-FU的浓度可以是约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％。在某些实施方案中，该组合物中5-FU的浓度可以是约0.5％、约1％、约2％、约2.5％或约5％。在一个实施方案中，该组合物中5-FU的浓度是约2％至约5％。在一个具体实施方案中，该组合物中5-FU的浓度是约2.5％。在另一实施方案中，该组合物中5-FU的浓度是约5％。

(b)胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂

如本文所使用，“TSLP诱导剂”是能够诱导胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的任何化合物。TSLP是属于白细胞介素-7(IL-7)细胞因子家族的上皮细胞源性细胞因子。本发明人已经发现，TSLP在皮肤中通过募集CD4+Th2细胞对皮肤中设置免疫监视而充当有效抗肿瘤细胞因子。用于确定一种化合物是否诱导TSLP的方法是本领域中已知的。举例来说，TSLP核酸表达、TSLP蛋白质表达或TSLP活性可以如以下在部分I(b)i、ii、iii中的详细描述进行测量。TSLP诱导剂的非限制性实例包括维生素D类似物、聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(I：C)及其它TLR3配体)、FSL-1(和其它TLR2-TLR6配体)、鞭毛蛋白(及其它TLR5配体)、β2-肾上腺素受体激动剂、cAMP升高剂(例如Forskolin)、脂肪酸(庚酸、辛酸、壬酸及癸酸)、二甲苯、1，2，4-三甲基苯、12-O-十四烷酰基佛波醇-13-乙酸酯(TPA，十四烷酰基佛波醇乙酸酯及佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA))、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)及邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)。

在一个具体实施方案中，TSLP诱导剂可以是维生素D或其类似物。维生素D是指一组脂溶性开环类固醇。开环类固醇与类固醇结构极其类似，不过典型的四个类固醇环的两个B环碳原子未联接，而在类固醇中是联接的。活性维生素D或固化三醇是式(I)的化合物：

维生素D₃，又称胆骨化醇，是维生素D的一种形式并且当前驱分子7-脱氢胆固醇吸收光能时在动物的皮肤中产生。维生素D₃或胆骨化醇是式(II)的化合物：

维生素D的结构改变的衍生物可以称为维生素D类似物。相较于未修饰形式，维生素D类似物可以被修饰成改善生物利用率、溶解性，具有改善的稳定性和/或处理特性。也涵盖维生素D类似物的前药。能够结合至维生素D受体并且诱导胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的任何维生素D类似物都可以适用于本发明的组合物。维生素D类似物有许多，并且是熟练技术人员所了解的。适合维生素D类似物的非限制性实例包括1,25-(OH)₂D₃(骨化三醇)、26,27-F_fi-1，25-(OH)₂D₃(ST-630)、lα-(OH)D₂、lα-(OH)D₃、1,24-(OH)₂D₃(TV-02)、22-氧杂骨化三醇(OCT)、卡泊三醇(MC 903)、1，25-(OH)₂-16-亚基-23-炔-D₃(Ro 23-7553)、EB1089、ED-71、PRI-2191、PRI-2205、胆骨化醇、麦角钙化醇、钙化醇、Calcijex、骨化三醇、度骨化醇(doxercalciferol)、Hectorol、帕立骨化醇(paricalcitol)、Rocaltrol、Daivonex及Zemplar。在本发明的上下文中，术语“类似物”意图包括合成类似物以及维生素D代谢物。在一个具体实施方案中，维生素D类似物是卡泊三醇。卡泊三醇(Calcipotriol/calcipotriene/calcitrene)或是式(III)的化合物：

一般来说，TSLP诱导剂的剂型是乳膏、油膏或表面溶液。不过，也涵盖其它适于表面施用的TSLP诱导剂剂型。适于表面施用的药物组合物可以被配制为油膏、乳膏、混悬液、洗液、散剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、油或敷药膏形式。表面施用还可以涉及使用透皮施用，如透皮贴片或离子导入装置。在一些实施方案中，该药物组合物是以表面油膏或乳膏形式施用。

TSLP诱导剂的剂量可以取决于待治疗的疾病或病症和/或待治疗的受试者的年龄和状况而变化。在向受试者施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物的实施方案中，该组合物中TSLP诱导剂的浓度可以是约0.001％至约20％、约0.001％至约10％、约0.001％至约1％、约0.001％至约0.1％，或更优选是约0.001％至约0.01％。举例来说，该组合物中TSLP诱导剂的浓度可以是约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％或约1.0％。在一个示例性实施方案中，该组合物中TSLP诱导剂的浓度是约0.002％至约0.005％。在另一示例性实施方案中，该组合物中TSLP诱导剂的浓度是约0.0025％。在又另一示例性实施方案中，该组合物中TSLP诱导剂的浓度是约0.005％。

在一个具体实施方案中，TSLP诱导剂是维生素D类似物。维生素D类似物的剂量可以取决于待治疗的疾病或病症和/或待治疗的受试者的年龄和状况而变化。在向受试者施用包含5-FU和维生素D类似物的组合物的实施方案中，该组合物中维生素D类似物的浓度可以是约0.001％至约0.1％，或更优选是约0.001％至约0.01％。举例来说，该组合物中维生素D类似物的浓度可以是约0.001％、约0.002％、约0.003％、约0.004％、约0.005％、约0.006％、约0.007％、约0.008％、约0.009％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％。在一个示例性实施方案中，该组合物中维生素D类似物的浓度是约0.002％至约0.005％。在另一个示例性实施方案中，该组合物中维生素D类似物的浓度是约0.0025％。在又另一个示例性实施方案中，该组合物中维生素D类似物的浓度是约0.005％。

i.TSLP核酸表达

在一个实施方案中，可以测量TSLP核酸表达以鉴别诱导TSLP的化合物。举例来说，当相对于未处理对照物，TSLP核酸表达在化合物存在下增加时，该化合物诱导TSLP。在一个具体实施方案中，可以测量TSLP mRNA以鉴别诱导TSLP的化合物。

用于评估细胞中核酸表达量的方法是本领域众所周知的，并且本领域技术人员已知的评估核酸表达量的任何适合方法都涵盖在本发明的范围内。如本文所使用，术语“核酸表达量”或“核酸表达水平”是指可测量的核酸表达水平，如但不限于，表达的信使RNA(mRNA)转录物或者mRNA的特定变体或其它部分的水平、核酸的酶活性或其它活性，及特定代谢物的水平。术语“核酸”包括DNA和RNA并且可以是双股或单股的。评估核酸表达量的适合方法的非限制性实例可以包括阵列法，如微阵列；PCR，如RT-PCR(包括定量RT-PCR)；核酸酶保护阵列；及Northern印迹分析。在一个具体实施方案中，测定目标核酸的表达量部分地包括测量目标核酸mRNA表达水平。

在一个实施方案中，可以使用阵列，如微阵列测定核酸表达量。使用核酸微阵列的方法是本领域中众所周知的。举例来说，可以在阵列中使用与目标基因的表达产物互补或可杂交的核酸探针。术语“杂交”或“可杂交”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。在一个优选实施方案中，杂交是在高严格度条件下进行。促进杂交的适当严格度条件是本领域技术人员所知的，或者可以见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.16.3.6。如本文所使用，术语“探针”是指将与核酸目标序列杂交的核酸序列。在一个实施例中，探针与核酸的RNA产物或其互补核酸序列杂交。探针的长度取决于杂交条件以及探针的序列和核酸目标序列。在一个实施方案中，探针是至少8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、400、500或更多个核苷酸长度。

在另一实施方案中，可以使用PCR测定核酸表达量。PCR方法是本领域中众所周知的，并且可以包括定量PCR、半定量PCR、多重PCR或其任何组合。确切地说，可以使用定量RT-PCR测定核酸表达量。进行定量RT-PCR的方法是本领域中常用的。在此类实施方案中，用于定量RT-PCR的引物可以包含目标基因的正向和反向引物。如本文所使用，术语“引物”是指当处于诱导(例如在核苷酸和如DNA聚合酶等诱导剂存在下及在适合温度和pH下)合成与核酸股互补的引物延伸产物的条件下时能够用作合成点的以纯化的限制性消化物天然存在或以合成方式产生的核酸序列。引物必须足够长以在诱导剂存在下引发所希望延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多种因素，包括温度、印务序列及所用方法。引物典型地含有15-25个或更多个核苷酸，不过其可以含有更少或更多个核苷酸。测定引物的适当长度所涉及的因素是本领域普通技术人员易于了解的。

核酸表达量可以通过测量核酸序列的整个mRNA转录物或测量核酸序列的一部分mRNA转录物来测量。举例来说，如果利用核酸阵列测量mRNA表达量，则该阵列可以包含针对所关注核酸序列的一部分mRNA的探针，或该阵列可以包含针对所关注核酸序列的全部mRNA的探针。类似地，在PCR反应中，引物可以被设计成扩增所关注核酸序列的整个cDNA序列，或一部分cDNA序列。本领域技术人员应认识到，可以使用超过一组引物来扩增所关注核酸序列的整个cDNA或一部分cDNA。设计引物的方法是本领域中已知的。从生物样品中提取RNA的方法是本领域中已知的。

表达水平可以或可以不归一化为对照核酸水平。此类对照核酸不应与本发明的mRNA核苷酸序列特异性杂交。这允许在不同情形执行的分析之间进行比较。

ii.TSLP蛋白质表达

在另一个实施方案中，可以测量TSLP蛋白质表达以鉴别诱导TSLP的化合物。举例来说，当相对于未处理对照物，TSLP蛋白质表达在化合物存在下增加时，该化合物诱导TSLP。在一个具体实施方案中，TSLP蛋白质表达可以使用免疫印迹法测量。在另一具体实施方案中，TSLP蛋白质表达可以使用免疫荧光染色法测量。

用于评估细胞中蛋白质表达量的方法是本领域众所周知的，并且本领域技术人员已知的评估蛋白质表达量的任何适合方法都涵盖在本发明的范围内。评估蛋白质表达量的适合方法的非限制性实例可以包括基于表位结合剂的方法及基于质谱的方法。

在一些实施方案中，评估蛋白质表达量的方法是质谱法。通过利用质量和电荷的固有特性，质谱法(MS)可以解析并且确信地鉴别多种复杂的化合物，包括蛋白质。传统的定量MS使用了电喷雾电离(ESI)，随后串联MS(MS/MS)(Chen等人，2001；Zhong等人，2001；Wu等人，2000)，而开发的新颖定量方法使用了基质辅助激光解吸/电离(MALDI)，随后飞行时间(TOF)MS(Bucknall等人，2002；Mirgorodskaya等人，2000；Gobom等人，2000)。根据本发明，可以使用质谱法来了解由本发明的目标核酸编码的蛋白质的水平。

在一些实施方案中，该评估蛋白质表达量的方法是基于表位结合剂的方法。如本文所使用，术语“表位结合剂”是指识别并且能够结合至目标基因蛋白的抗体、适体、核酸、寡聚核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、脂质、代谢物、小分子或其片段。核酸可以包括RNA、DNA及天然存在或合成产生的衍生物。

如本文所使用，术语“抗体”一般是指识别并且能够结合至抗原表位的多肽或蛋白质。如本文所使用，抗体可以是本领域中所了解的完整抗体，即，由两个重链和两个轻链组成的抗体，或者可以是具有抗原结合区的任何类抗体分子，并且包括但不限于，抗体片段，如Fab’、Fab、F(ab’)2、单结构域抗体、Fv及单链Fv。术语抗体还指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体及人源化抗体。有关制备和使用各种抗体类构建体和片段的技术是本领域中众所周知的。用于制备和表征抗体的方式也是本领域中众所周知的(参见例如，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；以引用的方式整体并入本文中)。

如本文所使用，术语“适体”是指就生物化学活性、分子识别或结合属性来说具有有用的生物活性的多聚核苷酸，一般是RNA或DNA。通常，适体具有分子活性，如在特定表位(区域)处结合至目标分子。普遍认为，对结合至多肽具有特异性的适体可以通过体外进化法合成和/或鉴别。用于制备和表征适体的方式，包括体外进化法，是本领域中众所周知的(参见例如US 7,939,313；以引用的方式整体并入本文中)。

一般来说，评估蛋白质表达量的基于表位结合剂的方法包括使包含多肽的样品与对该多肽具有特异性的表位结合剂在允许该表位结合剂与该多肽之间形成复合物的条件下接触。基于表位结合剂的方法可以在溶液中发生，或者表位结合剂或样品可以固定于固体表面上。适合表面的非限制性实例包括微量滴定盘、试管、珠粒、树脂及其它聚合物。

本领域技术人员应理解，表位结合剂可以通过多种方式附接至衬底。可以先合成表位结合剂，随后附接至衬底，或者可以直接在衬底上合成表位结合剂。衬底和表位结合剂可以用随后将附接这两者的化学官能团衍生化。举例来说，衬底可以用化学官能团，包括但不限于，氨基、羧基、氧代基或硫醇基衍生化。使用这些官能团，表位结合剂可以使用官能团直接附接，或使用连接子间接附接。

表位结合剂也可以非共价附接至衬底。举例来说，可以制备生物素化的表位结合剂，该表位结合剂可以结合至共价涂布抗生蛋白链菌素的表面，引起附接。或者，可以使用如光聚合和光刻术等技术在表面上合成表位结合剂。将表位结合剂附接至固体表面的额外方法及在衬底上合成生物分子的方法是本领域中众所周知的，即，来自Affymetrix的VLSIPS技术(参见例如，美国专利号6,566,495以及Rockett和Dix，Xenobiotica 30(2)：155-177，二者以引用的方式整体并入本文中)。

使样品与表位结合剂在有效条件下接触足以允许形成复合物的时间段一般涉及将表位结合剂组合物添加至样品中及温育该混合物足够长时间以使表位结合剂结合至存在的任何抗原。随后，洗涤复合物并且可以通过本领域中众所周知的任何方法检测该复合物。检测表位结合剂-多肽复合物的方法一般是基于检测标记或标记物。如本文所使用，术语“标记”是指附接至表位结合剂或其它衬底材料的任何物质，其中该物质可以用检测方法检测。适合标记的非限制性实例包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光淬灭剂、显色分子、放射性同位素、闪烁剂、生物素、抗生物素蛋白、抗生蛋白链菌素、蛋白质A、蛋白质G、抗体或其片段、聚组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属及酶(包括碱性磷酸酶、过氧化酶及荧光素酶)。基于标记或标记物的检测来检测表位结合剂-多肽复合物的方法是本领域中众所周知的。

在一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫分析法。免疫分析法可以用多种不同的形式执行。一般来说，免疫分析法可以分成两类：竞争性免疫分析和非竞争性免疫分析。在竞争性免疫分析中，样品中未标记的分析物与标记的分析物竞争结合抗体。洗掉未结合的分析物并测量结合的分析物。在非竞争性免疫分析中，抗体而非分析物被标记。非竞争性免疫分析可以使用一种抗体(例如，捕获抗体被标记)或超过一种抗体(例如，至少一种未标记的捕获抗体及至少一种标记的“戴帽”或检测抗体)。适合标记如上文所描述。

在一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是ELISA。在其它实施方案中，基于表位结合剂的方法是放射免疫分析法。在又其它实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫印迹法或Western印迹法。在替代性实施方案中，基于表位结合剂的方法是阵列法。在另一实施方案中，基于表位结合剂的方法是流式细胞术。在不同实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫组织化学法(IHC)或免疫荧光法。IHC使用了抗体(或在免疫荧光法情况下是荧光标记的抗体)来检测和定量完整组织样品中的抗原。组织样品可以是制备用于IHC或免疫荧光法研究的新鲜冷冻和/或福尔马林固定、石蜡包埋(或塑料包埋的)组织块。制备供IHC或免疫荧光法研究的组织块的方法以及进行IHC或免疫荧光法的方法是本领域中众所周知的。

iii.TSLP活性

在一个实施方案中，可以测量TSLP活性以鉴别诱导TSLP的化合物。TSLP是属于白细胞介素-7(IL-7)细胞因子家族的上皮细胞源性细胞因子。TSLP在皮肤中通过募集CD4+Th2细胞而充当有效抗肿瘤细胞因子。因此，可以测量炎症和/或Th2细胞作为TSLP活性的指示。可以使用本领域中的标准方法测量炎症。举例来说，可以使用IHC、免疫荧光法和/或RT-PCR目测测量炎症。可以检查的炎症的非限制性标记物包括GR1、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD11c、CD117、B220及IFNγ。当相对于未处理对照物，炎症在化合物存在下增加时，该化合物诱导TSLP。

在另一实施方案中，可以测量CD4+细胞和/或CD8+细胞作为TSLP活性的指示。可以使用本领域中的标准方法测量CD4+细胞和/或CD8+细胞的量。举例来说，可以使用流式细胞术测量CD4+细胞和/或CD8+细胞。当相对于未处理对照物，CD4+细胞和/或CD8+细胞的量在化合物存在下增加时，该化合物诱导TSLP。

(c)组合物的组分

本公开还提供了药物组合物。该药物组合物包含作为活性成分的细胞毒性剂和TSLP诱导剂，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。

药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、pH调节剂、崩解剂、分散剂、防腐剂、润滑剂或着色剂。用于形成药物组合物的赋形剂的量和类型可以根据制药学的已知原理选择。

在一个实施方案中，赋形剂可以是稀释剂。稀释剂可以是可压缩(即，塑性变形)的或是磨蚀变脆的。适合的可压缩稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素(MCC)、纤维素衍生物、纤维素粉、纤维素酯(即，乙酸酯和丁酸酯混合酯)、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸钙、羟基乙酸淀粉钠、葡萄糖、果糖、乳糖、乳糖单水合物、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糊精及海藻糖。适合磨蚀变脆稀释剂的非限制性实例包括磷酸氢二钙(无水或二水合物)、磷酸三钙、碳酸钙及碳酸镁。

在另一实施方案中，赋形剂可以是粘合剂。适合粘合剂包括但不限于，淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C₁₂-C₁₈脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖、多肽、寡肽及其组合。

在另一实施方案中，赋形剂可以是填充剂。适合填充剂包括但不限于，碳水化合物、无机化合物及聚乙烯吡咯烷酮。在非限制性实施例中，填充剂可以是硫酸钙、二碱式和三碱式(di-and tri-basic)、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、磷酸二钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇。

在又另一实施方案中，赋形剂可以是缓冲剂。适合缓冲剂的代表性实例包括但不限于，磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、tris缓冲剂及缓冲生理盐水盐(例如，Tris缓冲生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水)。

在各种实施方案中，赋形剂可以是pH调节剂。在非限制性实施例中，pH调节剂可以是碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸或磷酸。

在另一实施方案中，赋形剂可以是崩解剂。崩解剂可以是不起泡或起泡的。不起泡崩解剂的适合实例包括但不限于，淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉；甜味剂；粘土，如膨润土；微晶纤维素；海藻酸盐；羟基乙酸淀粉钠；树胶，如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶及黄芪胶。适合起泡崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合物以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在又另一实施方案中，赋形剂可以是分散剂或分散增强剂。适合分散剂可以包括但不限于，淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木质纤维、羟基乙酸淀粉钠、同晶型硅酸盐及微晶纤维素。

在另一替代性实施方案中，赋形剂可以是防腐剂。适合防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，如BHA、BHT、维生素A、维生素C、维生素E或棕榈酸视黄酯、柠檬酸、柠檬酸钠；螯合剂，如EDTA或EGTA；及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇或苯酚。

在另一实施方案中，赋形剂可以是润滑剂。适合润滑剂的非限制性实例包括矿物质，如滑石或硅石；及脂肪，如植物硬脂精、硬脂酸镁或硬脂酸。

在又另一实施方案中，赋形剂可以是着色剂。适合的有色添加剂包括但不限于，食品、药品及化妆品用色素(FD&C)、药品和化妆品用色素(D&C)，或外用药品和化妆品用色素(Ext.D&C)。

以组合物的总重量计，组合物中赋形剂或赋形剂组分的重量份可以是约99％或更低，约97％或更低，约95％或更低，约90％或更低，约85％或更低，约80％或更低，约75％或更低，约70％或更低，约65％或更低，约60％或更低，约55％或更低，约50％或更低，约45％或更低，约40％或更低，约35％或更低，约30％或更低，约25％或更低，约20％或更低，约15％或更低，约10％或更低，约5％或更低，约2％，或约1％或更低。

该组合物可以被配制成各种剂型并且通过多种不同方式表面施用，这些方式将递送治疗有效量的活性成分。必要时，这些以剂量单位配制物形式表面施用的组合物可以含有常规无毒药学上可接受的载剂、佐剂及媒剂。表面施用还可以涉及使用透皮施用，如透皮贴片或离子导入装置。药物配制物论述于例如Gennaro，A.R.，Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(第18版，1995)，以及Liberman，H.A.和Lachman，L.编辑，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker Inc.，New York，N.Y.(1980)中。

对于表面(例如透皮或透粘膜)施用，制剂中一般包括适于透过屏障的渗透剂。适于表面施用的药物组合物可以被配制为油膏、乳膏、混悬液、洗液、散剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂或油形式。在一些实施方案中，该药物组合物是以表面油膏或乳膏形式施用。当配制成油膏时，活性成分可以与石蜡或可与水混溶的油膏基质一起使用。或者，活性成分可以用水包油乳膏基质或油包水基质配制成乳膏形式。适于表面施用于眼部的药物组合物包括滴眼液，其中将活性成分溶解或悬浮于适合载剂，尤其是水性溶剂中。适于在口中表面施用的药物组合物包括锭剂、软锭剂及漱口水。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾、气雾剂喷雾、片剂或栓剂实现，而透皮施用可以经由本领域中一般已知的油膏、敷药膏、凝胶、贴片或乳膏实现。

在某些实施方案中，包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物被包封于适合媒剂中以帮助将化合物递送至目标细胞、增加组合物稳定性或使该组合物的潜在毒性减到最小。熟练技术人员应理解，多种媒剂适于递送本发明的组合物。适合结构化流体递送系统的非限制性实例可以包括纳米粒子、脂质体、微乳液、微胞、树状聚合物及其它含磷脂系统。将组合物并入递送媒剂中的方法是本领域中已知的。

在一个替代性实施方案中，可以利用脂质体递送媒剂。取决于实施方案，就结构和化学性质来说，脂质体适于递送细胞毒性剂和TSLP诱导剂。一般来说，脂质体是具有磷脂双层膜的球状囊泡。脂质体的脂质双层可以与其它双分子层(例如细胞膜)融合，由此将脂质体的内含物递送到细胞。以此方式，细胞毒性剂和TSLP诱导剂可以通过包封于与目标细胞膜融合的脂质体中来选择性递送到细胞。

脂质体可以包含烃链长度不同的多种不同类型的磷脂。磷脂一般包含通过甘油膦酸酯连接至多个极性基团之一的两个脂肪酸。适合磷脂包括磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰胆碱(PC)及磷脂酰乙醇胺(PE)。包含磷脂的脂肪酸链可以是约6至约26个碳原子长度，并且脂质链可以是饱和或不饱和的。适合脂肪酸链包括(括号中提供常用名)正十二烷酸酯(月桂酸酯)、正十四烷酸酯(肉豆蔻酸酯)、正十六烷酸酯(棕榈酸酯)、正十八烷酸酯(硬脂酸酯)、正二十烷酸酯(花生酸酯)、正二十二烷酸酯(山嵛酸酯)、正二十四烷酸酯(木蜡酸酯)、顺-9-十六碳烯酸酯(棕榈油酸酯)、顺-9-十八烷酸酯(油酸酯)、顺，顺-9，12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)、全顺式-9，12，15-十八碳三烯酸酯(亚麻酸酯)及全顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(花生四烯酸酯)。磷脂的两个脂肪酸链可以是相同或不同的。可接受的磷脂包括二油酰基PS、二油酰基PC、二硬脂酰基PS、二硬脂酰基PC、二肉豆蔻酰基PS、二肉豆蔻酰基PC、二棕榈酰基PG、硬脂酰基、油酰基PS、棕榈酰基、亚油酰基PS等。

磷脂可以来自任何天然来源，并因此可以包含磷脂混合物。举例来说，蛋黄富含PC、PG及PE，大豆含有PC、PE、PI及PA，并且动物脑或脊髓富含PS。磷脂也可以来源于合成来源。可以使用个别磷脂比率不同的磷脂混合物。不同磷脂的混合物可以产生具有有益活性或活性特性稳定性的脂质体组合物。以上提到的磷脂可以按最佳比率与阳离子型脂质混合，如N-(1-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵、1，1’-二-十八烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸盐、3，3’-二庚基氧化碳菁碘化物、1，1’-二-十二烷基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸盐、1，1’-二油酰基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁甲烷磺酸盐、N-4-(二亚油酰基氨基苯乙烯基)-N-甲基碘化吡啶或1，1，-二亚油酰基-3，3，3’，3’-四甲基吲哚菁高氯酸盐。

脂质体可以任选地包含鞘磷脂，其中鞘氨醇是甘油的结构对应物以及磷脂酰甘油或胆固醇(动物细胞膜的主要组分)的脂肪酸之一。脂质体可以任选含有聚乙二醇化脂质，这些脂质是共价连接至聚乙二醇(PEG)聚合物的脂质。PEG的大小可以在约500至约10,000道尔顿范围内。

脂质体可以另外包含适合溶剂。该溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。适合溶剂包括但不限于，二甲亚砜(DMSO)、甲基吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其组合。

带有细胞毒性剂和TSLP诱导剂的脂质体可以利用例如美国专利号4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,077,211及5,264,618中详述的制备供药物递送的脂质体的任何已知方法制备，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文中。举例来说，可以通过在水性溶液声波处理脂质、溶剂注入、脂质水合、逆相蒸发或利用反复地冷冻和解冻进行的冷冻干燥来制备脂质体。在一个优选实施方案中，脂质体是通过声波处理形成。脂质体可以是多层的，像洋葱一样具有许多层，或者是单层的。脂质体可以较大或较小。连续高剪切力声波处理往往会形成较小的单层脂质体。

普通技术人员应显而易见，管理脂质体形成的所有参数都可以变化。这些参数包括但不限于，温度、pH、甲硫氨酸化合物的浓度、脂质的浓度和组成、多价阳离子的浓度、混合速率、溶剂的存在和浓度。

在另一实施方案中，本发明的组合物可以呈微乳液形式递送至细胞。微乳液一般是包含水溶液、表面活性剂及“油”的澄清的热力学稳定溶液。在此情形中，“油”是超临界流体相。表面活性剂保持在油-水界面处。多种表面活性剂适用于微乳液配制物中，包括本文中所描述或本领域另外已知的那些。适用于本发明中的水性微区一般具有约5nm至约100nm的特征性结构尺寸。这种大小的聚集物是可见光的不良散射物，并因此，这些溶液是光学透明的。熟练技术人员应理解，微乳液可以并且将具有多种不同的微观结构，包括球体、杆状或盘状聚集体。在一个实施方案中，该结构可以是微胞，微胞是大体呈球形或圆柱形物体的最简单的微乳液结构。微胞如同水中的油滴，而反微胞如同油中的水滴。在一个替代性实施方案中，微乳液结构是薄层状的。它包含由表面活性剂层隔开的连续水层和油层。微乳液中的“油”最佳地包含磷脂。以上关于脂质体详述的任何磷脂都适于针对微乳液的实施方案。细胞毒性剂和TSLP诱导剂可以通过本领域中一般已知的任何方法包封于微乳液中。

在又另一实施方案中，细胞毒性剂和TSLP诱导剂可以通过树状大分子或树状聚合物递送。一般来说，树状聚合物是一种分支树状分子，其中每个分支是在某一长度后分成两个新分支(分子)的互连分子链。此分支持续到各分支(分子)紧密填充使得顶盖层(canopy)形成球体。一般来说，树状聚合物的特性是由其表面处的官能团决定。举例来说，亲水性端基，如羧基，将典型地产生水溶性树状聚合物。或者，可以将磷脂并入树状聚合物的表面中以促进跨皮肤吸收。详述的用于脂质体实施方案中的任何磷脂都适用于树状聚合物实施方案中。本领域中一般已知的任何方法都可以用于制备树状聚合物并且将本发明的组合物包封于其中。举例来说，可以利用一系列累接反应步骤来制造树状聚合物，在这些步骤中，每一次额外的累接都会产生更高级的树状聚合物。因此，它们具有高度分支的规则3D结构，以及大致均一的大小和形状。此外，树状聚合物的最终大小典型地由合成期间使用的累接步骤的数目控制。多种树状聚合物大小适用于本发明中。一般来说，树状聚合物的大小可以在约1nm至约100nm范围内。

II.方法

本发明人意外地发现，包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物在治疗癌前皮肤病变方面明显比单独细胞毒性剂有效，并且具有较短疗程。此意外的发现还有一个附加益处，即，减少不良事件，由此潜在地改善患者的顺应性。TSLP诱导剂用于诱导TSLP的表达，由此调节皮肤中的免疫环境。细胞毒性剂诱导细胞中的细胞凋亡，由此释放增大由TSLP诱导剂引起的免疫反应的抗原。

在一个方面，本公开涵盖一种治疗癌前皮肤病变的方法，该方法包括向所述病变表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达7天。在另一个实施方案中，本公开涵盖一种防止癌前皮肤病变发生的方法，该方法包括向有发生癌前皮肤病变的风险的受试者表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达7天。如本文所使用，“癌前皮肤病变”是有可能发展成皮肤癌但不是癌症的皮肤病变。癌前病变类型的非限制性实例可以包括光化性角化病(日光性角化病)、光化性唇炎(农夫唇(Farmer’s lip))、皮角、痣(黑痣)及发育不良痣。在一个具体实施方案中，癌前皮肤病变是光化性角化病。鉴别癌前皮肤病变的方法是本领域中已知的。举例来说，皮肤活检或皮肤镜可以鉴别癌前皮肤病变。有关皮肤镜及其在诊断癌前皮肤病变方面的应用的评述提供于Giacomel等人，Dermatol Clin 2013，31：649-678中，以引用的方式整体并入本文中。举例来说，在皮肤镜上，面部非色素性光化性角化病(AK)典型地显示黄白色表面鳞屑和草莓状图案，后者由红斑(粉红至红色)性假网络包围毛囊组成。毛囊开口被白色晕圈包围并且被泛黄色的角栓填充，形成特有的靶样外观。此外，在毛囊的周围通常会见到线性-波状细小血管。另外，有时会在AK的面部见到盘状小血管。也可以使用组织学来诊断癌前病变。举例来说，在组织学水平上，光化性角化病(AK)是由发育不良定义并且由表现增大、不规则及染色质过多的非典型性核的角化细胞组成。AK还展示无组织生长，由此破坏分化并产生保留有核的增厚的角质层。为了对表皮发育不良的程度进行分层，推荐对AK采用三层分级量表，该量表同时用于评价子宫颈发育不良。表皮内角化细胞瘤I(keratinocytic intraepidermal neoplasia I，KIN I)的组织学特征是局限于表皮下部三分之一处的基底角化细胞的细胞异型性。KIN II显示非典型性角化细胞占据表皮下部三分之二处，而KIN III显示非典型性角化细胞遍布整个表皮；这后一阶段相当于原位癌。AK中的局部表皮异型性反映分化程序部分破坏，而分化程序的更完全破坏伴随原位SCC(SCCIS)。KIN分级标准评价了AK的宏观和微观特征。另外，临床表现、患者病史(如UV暴露)及病变外观可以鉴别癌前病变。举例来说，光化性角化病(AK)典型地出现在日光照射的区域，如面部、光秃的头皮、唇及手背。光化性角化病病变可以是平坦或略微突起的，通常直径小于1英寸，质地粗糙、干燥、有鳞屑并且类似于疣。大部分泛红，但有一些会呈棕褐色、粉色、红色和/或肉色。在一个具体实施方案中，本发明的方法可以用于治疗KIN I、KIN II和/或KIN III型AK病变。

在另一方面，本公开还涵盖一种防止癌前病变转变成皮肤癌的方法，该方法包括鉴别具有一个或多个癌前皮肤病变的受试者并且向癌前皮肤病变表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中所述癌前皮肤病变的大小减小，由此防止发展成皮肤癌。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达7天。在另一具体实施方案中，皮肤癌是非黑色素瘤型皮肤癌。未治疗的光化性角化病会发展成鳞状细胞癌(SCC)。因此，本公开涵盖一种防止光化性角化病病变转变成鳞状细胞癌的方法，该方法包括鉴别具有一个或多个光化性角化病病变的受试者并且向光化性角化病病变表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中所述光化性角化病病变的大小减小，由此防止发展成鳞状细胞癌。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达7天。

在另一方面，本发明涵盖一种治疗非癌性皮肤病变的方法。该方法包括鉴别具有一个或多个非癌性皮肤病变的受试者并且向非癌性皮肤病变表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中所述非癌性皮肤病变的大小减小。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达10天。适合的非癌性皮肤病变可以包括疣和类似的皮肤病毒感染。疣的非限制性实例可以包括跖疣、皮肤疣、肛门生殖器疣、寻常疣、扁平疣、丝状疣及与皮肤病毒感染有关的疣状病变，如人乳头瘤病毒和传染性软疣。诊断疣的方法是本领域中所知的。一般来说，熟练技术人员能够通过检查诊断疣。不过，也可以使用活检诊断疣。疣可以出现在身体任何地方，不过面部、手、手指、脚、腿及生殖器最常见。疣可以看起来是粗糙、光滑、平坦、突起的，含有黑色“种子”，呈圆形、椭圆形，而且颜色比周围皮肤浅或深。

在又另一方面，本发明涵盖一种治疗非黑色素瘤型皮肤癌的方法。该方法包括鉴别患有非黑色素瘤型皮肤癌的受试者，并且向非黑色素瘤型皮肤癌表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中该非黑色素瘤型皮肤癌的大小减小。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达10天。非黑色素瘤型皮肤癌类型的非限制性实例可以包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、Bowen病、角化棘皮瘤、Merkel细胞癌、皮肤淋巴瘤、Kaposi肉瘤、皮肤附属器肿瘤、皮脂腺癌及肉瘤。约80％的皮肤癌发生于基底细胞并且称为基底细胞癌。基底细胞癌最长在头颈部发生。它主要由日光照射引起或发生于在儿童期接受放射疗法的人。这一类皮肤癌通常生长缓慢并且很少转移(扩散)至身体其它部位。约20％的皮肤癌发生于鳞状细胞并且称为鳞状细胞癌。这一类癌症主要由日光照射引起，但它也可能出现在烧伤、化学品损伤或暴露于x射线的皮肤上。慢性炎症性皮肤病、粘膜(口、鼻、肛门及女性的阴道内衬的皮肤)及唇部位易患鳞状细胞癌。鳞状细胞癌很少转移，但它扩散的可能性大于基底细胞癌。鉴别非黑色素瘤型皮肤癌的方法是本领域中已知的。一般来说，熟练技术人员能够经由检查诊断非黑色素瘤型皮肤癌。不过，也可以使用活检诊断非黑色素瘤型皮肤癌。

在又另一方面，本发明涵盖一种治疗黑色素瘤皮肤癌的方法。该方法包括鉴别患有黑色素瘤皮肤癌的受试者，并且向黑色素瘤皮肤癌表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中该黑色素瘤皮肤癌的大小减小。在一个具体实施方案中，该组合物可以施用长达10天。当癌细胞在称为黑素细胞的皮肤细胞中形成时，发生黑色素瘤。确切地说，本发明的方法可以用于治疗原位黑色素瘤(MIS)。MIS又称为0期黑色素瘤。在0期中，在表皮中发现异常黑素细胞。一般来说，MIS仅影响皮肤顶层。这些异常黑素细胞可能变成癌症并扩散至邻近的正常组织中。诊断和鉴别黑色素瘤的方法是本领域中已知的。一般来说，可以基于家族史、患者病史、临床表现，和/或针对大小、形状或颜色改变，具有不规则边界或边缘，具有超过一种颜色、不对称、发痒或渗液、出血或溃烂、色素沉积的皮肤或卫星痣改变的痣的皮肤检查活检来诊断黑色素瘤。

施用本发明的组合物可以使病变大小相对于标准护理减小超过50％。举例来说，施用本发明的组合物可以使病变大小相对于标准护理减小超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或100％。举例来说，包含5-FU和维生素D类似物的组合物可以使病变大小相对于包含5-FU作为唯一活性剂的组合物减小超过50％。在一些实施方案中，施用包含5-FU和维生素D类似物的组合物可以使病变大小相对于包含5-FU作为唯一活性剂的组合物减小超过55％、超过60％、超过65％、超过70％、超过75％、超过80％、超过85％、超过90％、超过95％或100％。在病变大小减小100％的实施方案中，可以认为病变被清除。

本发明的方法可以使不良事件发生率和/或严重程度相对于在标准护理治疗期间常见的不良事件发生率和/或严重程度有所降低。在表面使用细胞毒性剂期间的不良事件的非限制性实例包括：局部疼痛、瘙痒、发痒、烧灼感、刺痛、结痂、渗液、皮炎、光过敏、头痛、失眠、易怒、皮疹、白细胞增多、血小板减少、出生缺陷、炎症、流产、单纯性疱疹、过敏性接触性皮炎、毛细管扩张、色素过度沉着或色素沉着不足及瘢痕形成。确切地说，可以使发红、起屑、结痂、发痒及烧灼感的发生率和/或严重程度相对于标准护理治疗有所降低。举例来说，可以使不良事件的发生率和/或严重程度相对于标准护理治疗降低30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

(a)施用

在某些方面，可以向受试者施用治疗有效量的本发明组合物。施用是使用标准有效技术执行。在一个优选实施方案中，表面施用组合物。本发明的组合物可以呈油膏、乳膏、混悬液、洗液、散剂、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气雾剂、敷药膏、贴片或油形式表面施用。在一些实施方案中，本发明的组合物是以表面油膏或乳膏形式施用。

对于治疗应用，向受试者施用治疗有效量的本发明组合物。“治疗有效量”是足以产生可测量的反应(例如，病变大小减小；病变数量减少；毒性降低和治疗耐受性改善；TSLP诱导；与病变有关的症状如发红、起屑、结痂、发痒、烧灼感及变厚减轻；角化细胞分化和基因表达正常化；具有适合屏障功能的表皮完整性的恢复；异常细胞增殖和炎症的减少)的治疗组合物的量。本发明的治疗组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用在特定受试者中有效获得希望的治疗反应的活性化合物量。所选剂量水平将取决于多种因素，包括治疗组合物的活性、配方、施用途径、与其它药物或治疗的组合、年龄、癌前病变、非黑色素瘤型皮肤癌、黑色素瘤皮肤癌、疣、症状和身体状况，以及所治疗的受试者的先前医疗史。在一些实施方案中，施用最低剂量，并在无剂量限制性毒性存在下递增剂量。治疗有效剂量的确定和调整，以及有关何时和如何作出此类调整的评价是医学领域的普通技术人员所了解的。

相对于疾病本身施用治疗的时序及治疗持续时间将由个别病例决定。治疗可以在医院或诊所本身中开始，或在离开医院之后或在去过门诊之后一段时间开始。

在一个方面，施用本发明的组合物可以使治疗持续时间相对于标准护理有所缩短。举例来说，标准护理可以使每天两次，持续2周。然而，申请人意外地发现，缩短治疗持续时间会使病变大小相对于标准护理明显减小。因此，治疗持续时间可能不超过14天。举例来说，治疗持续时间可以是约13天、约12天、约10天、约9天、约8天、约7天、约6天、约5天、约4天、约3天、约2天或约1天。在某些实施方案中，治疗持续时间可以是10天、7天、6天、5天、4天、3天或2天。在一个实施方案中，治疗持续时间可以是至多7天。在另一实施方案中，治疗持续时间可以在4天至6天之间。在一个具体实施方案中，治疗持续时间可以是4天。在另一具体实施方案中，治疗持续时间可以是6天。

标准护理的给药频率是每天两次。因此，本发明组合物的给药频率可以是每天两次。或者，预期可以改变给药频率。举例来说，给药频率可以是每天一次、两次或三次。增加给药频率可能引起治疗持续时间缩短。或者，减小给药频率可能引起治疗持续时间增加。

(b)受试者

受试者可以是啮齿动物、人类、家畜、宠物或动物园动物。在一个实施方案中，受试者可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一实施方案中，受试者可以是家畜。适合家畜的非限制性实例可以包括猪、牛、马、山羊、绵羊、骆驼及羊驼。在又另一实施方案中，受试者可以是宠物。宠物的非限制性实例可以包括宠物，如狗、猫、兔及鸟。在又另一实施方案中，受试者可以是动物园动物。如本文所使用，“动物园动物”是指可以在动物园发现的动物。这些动物可以包括非人类灵长类动物、大型猫科动物、狼及熊。在一个优选实施方案中，受试者是人类。

人类受试者可以是任何年龄。然而，由于黑色素瘤、非黑色素瘤型皮肤癌和癌前皮肤病变一般与年龄相关，故人类受试者可以是老年人类受试者。在一些实施方案中，人类受试者可以是约20岁、25岁、30岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁或更大年龄。在一些优选实施方案中，人类受试者是30岁或更大年龄。在其它优选实施方案中，人类受试者是40岁或更大年龄。在其它优选实施方案中，人类受试者是45岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是50岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是55岁或更大年龄。在其它优选实施方案中，人类受试者是60岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是65岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是70岁或更大年龄。在其它优选实施方案中，人类受试者是75岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是80岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是85岁或更大年龄。在又其它优选实施方案中，人类受试者是90岁或更大年龄。

又另外，受试者可以是有发生癌前皮肤病变的风险的受试者。熟练技术人员将能够确定有发生癌前皮肤病变的受试者。举例来说，可以基于家族史、患者病史、临床表现、皮肤检查活检、皮肤镜、日光照射和/或皮肤暴露于化学品或x射线来确定有发生癌前皮肤病变的受试者。有风险的具体区域可以包括太阳照射的区域，如面部、光秃的头皮、唇及手背。

实施例

包括以下实施例以展示本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术表示发明人发现的在本发明实践中良好起作用的方法，并因此可以被认为构成其优选的实践模式。然而，依据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围内的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行许多修改，并且仍然获得相同或类似的结果。

实施例1.用于评估卡泊三醇治疗癌前皮肤病变的作用的临床试验.

目标：

本发明人假定，卡泊三醇可以用于在人类皮肤中产生抗肿瘤免疫环境，由此消除光化性角化病。因此，本发明人进行了临床试验来验证此假说。该临床试验旨在确定卡泊三醇治疗人类光化性角化病的治疗潜力。卡泊三醇至少部分通过调节皮肤的免疫环境来发挥其抗肿瘤作用。因此，为了优化攻击皮肤肿瘤的免疫细胞的抗原暴露，将研究卡泊三醇增大当前诊所中用于治疗光化性角化病的表面用化学治疗剂5-氟尿嘧啶的作用的能力。5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞凋亡的诱导作用将释放抗原，由此可以增大由卡泊三醇引起的免疫反应。因此，将比较在连续4天每天两次的治疗期内患有多处光化性角化病的患者对表面用卡泊三醇+5-氟尿嘧啶的反应与对单独5-氟尿嘧啶的反应。治疗组将基于光化性角化病病变的解剖部位(头皮、面部、右上肢和左上肢)分组，以便进一步描绘这些治疗的部位特异性作用。该研究的主要终点是比较表面用5-氟尿嘧啶+卡泊三醇与单独5-氟尿嘧啶在治疗患有多处光化性角化病的患者的四个解剖部位(头皮、面部、右上肢和左上肢)中的每一个处的光化性角化病的功效。所关注的结果是在治疗后8周时，在头皮、面部、右上肢和左上肢上的目标治疗部位中光化性角化病的数量自基线的变化百分比。该研究的次要终点包括：在治疗后8周时，确定光化性角化病完全和部分(＞75％)清除；在4天的疗程结束时，确定表面用5-氟尿嘧啶+卡泊三醇与单独5-氟尿嘧啶在治疗光化性角化病方面的毒性和耐受性；在4天的疗程结束时，检查在光化性角化病部位处卡泊三醇对角化细胞中TSLP表达的诱导作用；在治疗后8周时，确定四个解剖部位之间对表面用5-氟尿嘧啶+卡泊三醇与对单独5-氟尿嘧啶的反应的任何差异。

入选标准：

在这一随机双盲临床试验中，将患有光化性角化病的参与者随机分配成接受5-FU+卡泊三醇(测试组)或5-FU+凡士林(对照组)表面制剂，每天两次自施用，持续4天。

登记程序：

在这一随机双盲研究中，募集到132位光化性角化病患者，因为他们出现在Washington University的皮肤病门诊。在WUSM的皮肤病学临床试验单元(DermatologyClinical Trials Unit)是美国知名的开发和参与临床治疗试验的机构。该临床试验单元源自于Division的大型患者基地，该基地每年接待超过50,000患者。这些就诊者中有15％是治疗光化性角化病[11]。根据IRB指导原则，满足本研究的入选标准的超过50岁的患者参与本研究。如果自愿并且能够参与，则使患者同意并基于治疗的解剖部位登记进行研究。如果参与者有两个或更多个合格的解剖部位，则由治疗医师选取一个作为主要解剖部位，而其它部位视为次要部位。主要解剖部位的指定按头皮＞面部＞左上肢＞右上肢区分优先次序。在所有情形中，参与者都接受一种药物，参与者将该药物施加于其受影响的所有部位以避免任何混淆。使用四个随机药物清单，每一主要解剖部位(头皮、面部、右上肢和左上肢)各一个。

治疗医师选择进行治疗的主要和次要解剖部位(如适用)，记录临床上可见的光化性角化病的数量，在透明片上标记这些病变并分别拍摄治疗区域的照片。参考关于主要解剖部位的随机化清单随机分配参与者接受5-FU+卡泊三醇(测试组)或5-FU+凡士林(对照组)表面用制剂。如果关于解剖部位的随机化清单已满(每个部位40个)，则医师选取另一合格的解剖部位作为主要部位(如果存在的话)。从第一次就诊的次日开始，连续4天，参与者每天两次将研究药物涂覆于所有其合格的治疗区域。在初次就诊时，向参与者无偿提供表面用制剂。参与者被要求在第5天(即，最后一次用药的次日)、第2周和第4周(推荐但非必需)及第8周返回进行随访。在每次随访时，针对任何刺激症候(包括红斑、结痂或溃疡(使用红斑量表，表2))评价治疗的皮肤，并且在临床上测定光化性角化病的数量并拍照。在最后一次就诊时(8周)，在透明片上标记残留的光化性角化病。在第2周和第4周时间点电话联系未选择参加第2周和/或第4周就诊的任何参与者，询问其治疗的皮肤的情况、任何不良事件的存在、活检部位的彻底愈合，并要求通过电子邮件(如果同意进行电子邮件通信)传送照片。所有记录都保存在上锁的办公室或设置密码的计算机中，只有研究组的成员能够接近。

研究/治疗程序：

在初次就诊时(第0天)，画出合格光化性角化病治疗区域的轮廓，计算病变数量，在透明片上标记，拍照并基于对应参与者的主要解剖部位的随机化清单指定研究药物(图1)。从第一次就诊的次日开始，参与者将其指定药物涂覆于所有其合格的解剖部位。告知参与者连续四天，一天两次(早晨和就寝时)用手将薄薄一层药物涂覆于受影响皮肤以覆盖整个区域，并完全擦进皮肤中。在每次涂覆后，参与者应彻底洗手。在4天治疗期间，参与者应避免暴露于天然或人造阳光(包括室内日晒机、日光灯等)并且每天在早晨涂覆药物之后使用SPF 50+防晒霜(向参与者提供防晒霜)。向参与者提供日记本以记录其治疗的时间和日期、防晒霜使用情况并记录下任何副作用。参与者在第5天、第2周(可选)、第4周(可选)及第8周返回诊所进行再评价。在每次就诊时，由治疗医师在临床上测定参与者的光化性角化病计数并拍照。在最后一次(第8周)就诊时，在透明片上标记残留的光化性角化病。另外，使用标准红斑量表对其红斑和刺激进行评价(表2；[12])。在这些时间点电话联系未参加第2周和/或第4周就诊的参与者以确定其治疗皮肤的情况、活检部位及任何不良事件的存在。要求参与者通过电子邮件(如果同意进行电子邮件通信)传送其治疗皮肤的照片。本研究的主要终点是在8周时每一解剖部位处光化性角化病总数相对于基线减少的百分比。为了证实卡泊三醇治疗对TSLP的诱导作用，在治疗前后测量4mm的光化性角化病穿刺活检组织中TSLP的表达情况。治疗医师收集这些皮肤样品并基于参与者独有的三位数ID(例如“201”)标记，以免影响其不知情状况。使用标准方法处理这些组织以进行组织学分析。

药细制备及储存：将5-氟尿嘧啶5％表面用乳膏(Efudex；Taro PharmaceuticalsU.S.A.Inc.，Hawthorne，NY)与卡泊三醇0.005％表面用油膏(calcitrene，calcipotriene，Dovonex；Taro Pharmaceuticals；测试组)或凡士林(对照组)以1∶1重量比混合。在皮肤病研究所的分部，根据USP 795关于非无菌混配条件的指导方针，在Sitemann Cancer CenterInvestigational Drug Pharmacy的监督下混合这两种药物。另外，根据MO法规要求标记产品。5-FU+卡泊三醇和5-FU+凡士林容器用唯一的三位数代码(例如“201”)标记。

每一个别研究药物容器还将标记以下常规信息：参与者的研究ID编号；短语“仅外用”；短语“在控制室温15-25℃(59-77°F)下储存”；短语“注意：新药-仅限研究用；不适于眼用或阴道内使用”；及短语“避免儿童接触”。药物将被储存于Washington University皮肤病诊所的控制室温(15-25℃)的带锁橱柜中。治疗医师对于容器的内含物(用唯一的三位数代码标记)不知情。

出于产品研发目的，可以增加组合乳膏中卡泊三醇的浓度以实现更高的抗肿瘤免疫反应，但基于实验数据，当前配制物中存在的5-FU的浓度(5％)是最佳的。

皮肤活检：在治疗前(第一次就诊时)，利用4mm穿刺活检程序对面部、头皮或上肢的一个光化性角化病病变进行活检。在4天的治疗期之后(第5天就诊时)，利用4mm穿刺活检程序对面部、头皮或上肢上经过治疗的光化性角化病进行活检以便确定涂覆卡泊三醇对基因和蛋白质表达的诱导作用。使用4mm穿刺活检工具取下皮肤并用两根可吸收缝合线闭合皮肤伤口。告知参与者在4天的治疗期间应避开“第0天”的活检部位。将皮肤样品分成两半。一半用于RNA制备，而另一半冷冻于OCT介质中或固定于甲醛介质中，仅用研究ID编号标记，并保持在-80℃的带锁冰箱或带锁办公室中，以待日后处理用于常规H&E染色和免疫组织化学分析[13]。参与者接受口头和书面伤口护理介绍。参与者根据本程序的时间(推荐这些患者第5天就诊进行第一次活检；第2周就诊进行另两次活检)在5-10天内就诊以确保伤口完全愈合，并治疗任何可能的并发症。

病变评估：通过临床检查评估所有光化性角化病并计数。临床诊断标准包括日晒区域的变厚、起屑或结痂的粉红色丘疹。在每次就诊时利用照片记录诊断和计数，并在第一次(第0天)和最后一次(第8周)就诊时在透明片上标记。

结果：

参与者人数统计.

入选患者的数量是175位，进入并完整研究的数量是132位，并且基于其主要解剖部位进行的分配显示于图2中。年龄、性别及每一治疗的解剖部位的药物用量(克)显示于表3中。就所列任何参数来说，测试组与对照组之间无显著差异。

在每一解剖部位处光化性角化病数量减少的百分比.

在8周随访时，相较于标准护理治疗(5-FU+凡士林)，连续四天每天两次用5-FU+卡泊三醇组合治疗引起光化性角化病(AK)的明显较高清除率(对于所有解剖部位，p＜0.0001，Student t检验；RUE：右上肢；LUE：左上肢)(图3)。统计分析详情显示于表4中。

不良事件.

红斑是本研究中所观察到的唯一不良事件，对应于皮肤中免疫活化(即，炎症)的水平。如紧接着在最后一次治疗后(第5天)以及在停止治疗后10天(第2周)所见，连续4天每天两次用5-FU+卡泊三醇治疗的参与者出现集中在光化性角化病部位周围的明显炎症(图4)。基于卡泊三醇诱导免疫系统攻击皮肤中的AK的假说，这一炎症是所预期的。图5中显示每一治疗的解剖部位红斑评分是0分、1分和2分的参与者的百分比。应注意，由于治疗持续时间较短，故没有红斑评分是3分或4分的参与者，而这在连续2-3周每天两次用5-FU治疗(标准护理方案)的患者中较常见。

使用从光化性角化病(AK)部位收集的皮肤样品确定5-FU+卡泊三醇针对AK的作用机制。

图6显示在治疗前后苏木精和伊红(H&E)染色的AK切片。这些图像显示用5-FU+卡泊三醇治疗的参与者在治疗(Tx)后真皮上层中的淋巴细胞主要积累于AK中。治疗前后针对AK的免疫荧光染色也显示，用5-FU+卡泊三醇治疗的参与者在治疗后AK中出现稳固TSLP表达，包括真皮-表皮连接区附近CD3+T细胞的积累。这些T细胞中大部分是CD4+T辅助细胞(插图)。K14指代皮肤角质细胞。

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Claims (20)

1.一种治疗癌前皮肤病变的方法，所述方法包括向所述病变表面施用包含细胞毒性剂和胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)诱导剂的组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞毒性剂是5-氟尿嘧啶(5-FU)。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述TSLP诱导剂是维生素D类似物。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述维生素D类似物是卡泊三醇。

5.如权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含约2％至约5％的5-FU。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述组合物包含约0.002％至约0.005％的卡泊三醇。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述癌前皮肤病变是光化性角化病。

8.如权利要求1所述的方法，其中一天两次施用所述组合物，持续4至6天。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述癌前皮肤病变的大小减小50％或更多。

10.一种预防癌前皮肤病变转变成皮肤癌的方法，所述方法包括：

a)鉴别具有一个或多个癌前皮肤病变的受试者；和

b)向所述癌前皮肤病变表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物，其中所述癌前皮肤病变的大小减小，使得向皮肤癌的进展得到预防。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述癌前皮肤病变是光化性角化病并且所述皮肤癌是鳞状细胞癌。

12.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞毒性剂是5-FU。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述TSLP诱导剂是维生素D类似物。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述维生素D类似物是卡泊三醇。

15.如权利要求12所述的方法，其中所述组合物包含约2％至约5％的5-FU。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述组合物包含约0.002％至约0.005％的卡泊三醇。

17.如权利要求10所述的方法，其中一天两次施用所述组合物，持续4至6天。

18.如权利要求10所述的方法，其中所述癌前皮肤病变的大小减小50％或更多。

19.一种防止癌前皮肤病变发生的方法，所述方法包括向有发生癌前皮肤病变的风险的受试者表面施用包含细胞毒性剂和TSLP诱导剂的组合物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述TSLP诱导剂是维生素D类似物。