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CN107072163A - 转基因玉米事件mon87419及其使用方法 - Google Patents

转基因玉米事件mon87419及其使用方法 Download PDF

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CN107072163A CN201580025678.8A CN201580025678A CN107072163A CN 107072163 A CN107072163 A CN 107072163A CN 201580025678 A CN201580025678 A CN 201580025678A CN 107072163 A CN107072163 A CN 107072163A
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M·E·戈莱
黄晋台
M·C·麦卡恩
绍爱华
O·C·斯帕克斯
M·A·斯托伊克尔
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Abstract

本发明提供了对玉米MON 87419事件是独特的重组DNA分子和含有MON 87419事件的转基因玉米植物、植物部分、种子、细胞和农产品，以及使用和检测玉米MON 87419事件的方法。含有MON 87419事件的转基因玉米植物表现出对麦草畏和草铵膦除草剂的耐受性。

Description

转基因玉米事件MON87419及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年3月20日提交的美国临时申请序列号61/968,342的优先权的权益。
序列表的并入
序列表包含在名为“MONS362WO.txt”的文件中，其大小为29.4KB(在MS-Windows中测量)并创建于2015年3月9日，该文件通过电子呈交同此一起提交并且通过引用并入本文中。
发明领域
本发明涉及对转基因玉米事件MON 87419是独特的重组DNA分子。本发明还涉及含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物、部分、种子、细胞和农产品以及使用它们的方法。含有玉米MON87419事件的转基因玉米植物表现出对麦草畏(dicamba)和草铵膦除草剂的耐受性。
发明背景
玉米(Maize；Zea mays)是世界上许多区域中的重要作物。已经将生物技术的方法应用于这种作物以生产具有理想性状的玉米。一种这样的理想性状是除草剂耐受性。在植物中表达对于除草剂耐受性的异源基因(也被称为转基因)可以赋予植物除草剂耐受性。然而，转基因的表达以及因此其效力可能受到许多不同因素的影响，包括驱动转移到植物染色体的个别转基因的表达的表达盒的取向和组成以及转基因插入的染色体位置和基因组结果。这在具有多个以分子方式连接的转基因(每个转基因赋予单独的性状)的转基因植物中进一步复杂化。在这种情况下，植物中每个以分子方式连接的转基因的适当表达必须由相同的转基因插入(也称为多基因事件)引起。在这种情况下，有必要设计和测试多个表达盒，每个表达盒具有转基因和表达元件的不同配置；然后通过多代的植物产生且分析大量单个植物转化事件以选择转基因事件，所述转基因事件具有相对于理想性状的每一个的优异性质和使其适于商业目的所需的最佳表型和农业特性。这种选择需要广泛的分子表征以及在多个地点和在多种条件下进行多年的温室和田间试验，以便可以收集显著量的农艺、表型和分子数据。所得数据和观察结果然后必须由科学家和农学家的团队进行分析，目标是选择适于在各种各样的种质间以及各种田间条件下的商业化农业用途的事件。一旦选择，就可以使用植物育种方法将赋予理想性状的商业事件渗入到其它遗传背景中，由此产生许多不同的作物品种，所述作物品种含有理想的性状并且针对特定的局部生长条件经适当调整。
为了生成含有单一转化事件的转基因植物，使用植物转化技术将重组DNA构建体的一部分转移到玉米细胞的基因组中。随后将该玉米细胞用于产生独特的R0植物，然后可将所述R0植物用于产生转基因后代植物。后代植物的基因组含有独特事件，并且这些植物可以针对所需性状以及农艺性状进行试验。事件的有效性可以受相对于转化事件中的整合位点的顺式和/或反式因子的影响。由事件所赋予的表型还可以受DNA构建体的大小和设计的影响，其可以随着表达盒中的遗传元件、转基因数量、表达盒数量以及此类元件和此类盒的配置的组合而变化。给定事件的性状可进一步复杂化，因诸如转基因表达的植物发育、昼夜、时间或空间模式的因素；或因外在因素，例如，植物生长的环境条件、水可利用性、氮可利用性、热或应激。因此，创造赋予一组理想的表型性状的事件的能力是不容易预测的。
发明概述
本发明提供了一种重组DNA分子，其含有选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的序列。本发明还提供了源自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物或种子的重组DNA，包含玉米MON 87419事件的种子的代表性样品已被保藏为ATCC登录号PTA-120860。本发明还提供了一种重组DNA分子，其为诊断源自于玉米MON 87419事件的DNA的存在的扩增子。本发明还提供了一种DNA分子，其在源自于包含玉米MON 87419事件的转基因玉米的玉米植物、细胞、种子、后代植物或植物部分中。
本发明提供了一种DNA分子，其具有SEQ ID NO:10的足够长度的连续DNA序列以用作DNA探针，所述DNA探针在严格杂交条件下与包含选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的DNA序列的DNA分子杂交，并且在严格杂交条件下不与不包含选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的DNA序列的DNA分子杂交。本发明还提供了一对DNA分子，其包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中第一DNA分子是SEQ ID NO:9的片段且第二DNA分子是玉米MON 87419事件的玉米基因组DNA的片段，并且其中第一和第二DNA分子各自包含具有足够长度的连续核苷酸的DNA序列以用作DNA引物，当与含有玉米MON 87419事件的DNA在扩增反应中一起使用时，所述DNA引物产生诊断样品中的玉米MON 87419事件的扩增子。
本发明提供了一种检测DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在的方法，通过使样品与DNA探针接触；使样品和DNA探针经受严格杂交条件；以及检测DNA探针与样品中的DNA分子的杂交，其中DNA探针与DNA分子的杂交表明DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在。
本发明提供了一种检测DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在的方法，通过使样品与一对DNA引物接触；进行足以产生包含选自由SEQ ID NO:1-8和SEQ ID NO:10组成的组的序列的DNA扩增子的扩增反应；以及检测反应中DNA扩增子的存在，其中反应中DNA扩增子的存在表明DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在。
本发明提供了一种DNA检测试剂盒，其包含至少一种DNA分子，所述DNA分子包含具有SEQ ID NO:10的足够长度的连续核苷酸的DNA序列以用作特异性用于检测DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在的引物或探针。
本发明提供了重组玉米植物、种子、细胞、植物部分或商业产品，其包含具有选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的DNA序列的DNA分子。本发明还提供了耐受草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂的转基因玉米植物、种子或细胞。本发明还提供了含有玉米MON87419事件的转基因玉米植物、种子、细胞、植物部分或商业产品。本发明还提供了转基因玉米植物或种子，其为具有至少一个包含玉米MON 87419事件的亲本植物的杂种。
本发明提供了一种用于控制区域内的杂草的方法，其包括在区域内种植包含玉米MON 87419事件的转基因玉米并施用有效剂量的麦草畏或草铵膦或麦草畏和草铵膦除草剂以控制区域内的杂草而不伤害转基因玉米。本发明还提供了一种通过在生长季节施用有效剂量的草铵膦除草剂来控制杂草的方法，所述有效剂量的草铵膦除草剂为约0.1磅酸当量/英亩至约16磅酸当量/英亩的草铵膦除草剂。本发明还提供了一种通过在生长季节施用有效剂量的草铵膦除草剂来控制杂草的方法，所述有效剂量的草铵膦除草剂为约0.4磅酸当量/英亩至约1.59磅酸当量/英亩的草铵膦除草剂。本发明还提供了一种通过在生长季节施用有效剂量的麦草畏除草剂来控制杂草的方法，所述有效剂量的麦草畏除草剂为约0.1磅酸当量/英亩至约16磅酸当量/英亩的麦草畏除草剂。本发明还提供了一种通过在生长季节施用有效剂量的麦草畏除草剂来控制杂草的方法，所述有效剂量的麦草畏除草剂为约0.5磅酸当量/英亩至约2磅酸当量/英亩的麦草畏除草剂。
本发明提供了一种产生耐受草铵膦和麦草畏除草剂的转基因玉米植物的方法，通过使包含玉米MON 87419事件的转基因玉米植物与第二玉米植物有性杂交；收集产生的种子；使种子生长以产生后代植物；用草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂处理后代植物；以及选择耐受草铵膦和麦草畏除草剂的后代植物。本发明还提供了一种产生耐受草铵膦和麦草畏除草剂的转基因玉米植物的方法，通过使包含玉米MON 87419事件的转基因玉米植物自交；收集产生的种子；使种子生长以产生后代植物；用草铵膦或麦草畏、或麦草畏和草铵膦除草剂处理后代植物；以及选择耐受草铵膦和麦草畏除草剂的后代植物。
附图简述
图1：说明了包含玉米事件MON 87419的玉米植物的基因组中的转基因插入物的组织。水平线对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10的相对位置；粗箭头标记的SQ26644和SQ26645表示用于鉴定含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的一对引物的大致位置；编号为14至22的短粗线表示DNA插入物(SEQ ID NO:9)内的独特重组构建体序列的相对位置并且数字分别是指每个的对应SEQ ID NO；细的水平箭头表示玉米MON 87419事件的异源转基因插入DNA的两个独立的表达盒的相对组织并且方框指示两个表达盒的独立的元件；引导词“P”代表启动子元件，引导词‘L’代表前导子元件，引导词“I”代表内含子，引导词“TS”代表叶绿体转运肽，引导词“T”代表3’转录终止和聚腺苷酸化元件(3’UTR)，pat代表草铵膦乙酰转移酶(PAT)蛋白的编码区，且dmo代表麦草畏单加氧酶(DMO)蛋白的编码区。
序列简述
SEQ ID NO:1是代表玉米基因组DNA与转基因插入物的5’连接的30个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:1对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置1232至1261。
SEQ ID NO:2是代表玉米基因组DNA与转基因插入物的3’连接的30个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:2对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置7994至8023。
SEQ ID NO:3是代表玉米基因组DNA与转基因插入物的5’连接的60个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:3对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置1217至1276。
SEQ ID NO:4是代表玉米基因组DNA与转基因插入物的3’连接的60个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:4对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置7979至8038。
SEQ ID NO:5是代表玉米基因组DNA与转基因插入物的5’连接的100个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:5对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置1197至1296。
SEQ ID NO:6是代表玉米基因组DNA与转基因插入物的3’连接的100个核苷酸的DNA序列。SEQ ID NO:6对应于SEQ ID NO:10的核苷酸位置7959至8058。
SEQ ID NO:7是代表5’侧翼玉米基因组DNA的1246个核苷酸和转基因插入物的5’端的525个核苷酸的1771个核苷酸的DNA序列。
SEQ ID NO:8是代表转基因插入物的3’端的516个核苷酸和3’侧翼玉米基因组DNA的1251个核苷酸的1767个核苷酸的DNA序列。
SEQ ID NO:9是对应于玉米MON 87419事件的转基因插入物的6762个核苷酸的DNA序列。
SEQ ID NO:10是对应于玉米MON 87419事件的9259个核苷酸的DNA序列；该序列含有从位置1到1246的5’侧翼基因组DNA序列、从位置1247到8008的转基因DNA插入物以及从位置8009到9259的3’侧翼基因组DNA序列。
SEQ ID NO:11是对应于被称为SQ26644并用于鉴定样品中的玉米MON 87419事件DNA的引物的33个核苷酸的DNA序列；其对应于SEQ ID NO:10的位置7966至7998。
SEQ ID NO:12是对应于被称为SQ26645并用于鉴定样品中的玉米MON 87419事件DNA的引物的24个核苷酸的DNA序列；其对应于SEQ ID NO:10的位置8022至8045。
SEQ ID NO:13是对应于被称为PB11207并用于鉴定样品中的玉米MON 87419事件DNA的探针的19个核苷酸的DNA序列；其对应于SEQ ID NO:10的位置8002至8020。
SEQ ID NO:14-22是对应于玉米MON 87419事件的转基因插入物内的独特序列的DNA序列。
发明详述
提供以下定义和方法以更好地定义本发明并指导本领域一般技术人员实施本发明。除非另有说明，否则术语可以根据相关领域的一般技术人员的常规用法来理解。
现代植物转化技术被用来产生基因改造的植物。术语‘转基因’也可以用来指基因改造的植物。在产生转基因植物的过程中，将外源DNA随机插入植物细胞的基因组中。在转化程序期间，许多个别细胞被转化。由于随机整合，单独和独特的DNA重组事件将在每个单独的转化植物细胞的基因组内发生。完整的转基因植物然后从单个转基因细胞产生，这必然导致转基因植物的每一个细胞含有独特插入的DNA作为其基因组的稳定部分。含有玉米MON 87419事件的转基因耐受除草剂的玉米包含单一插入玉米种质的染色体/基因组中的转基因DNA。玉米MON 87419事件通过以下步骤产生：(i)用包括目标转基因的核酸构建体转化数千个玉米植物细胞；(ii)使各自含有独特转基因事件的玉米植物的群体再生；以及(iii)进行多年的试验、筛选和选择以选择具有理想的农艺性状的事件，即玉米MON 87419事件。玉米MON 87419事件的特征在于转基因的独特DNA序列插入玉米植物的基因组中的特定位置。
将转基因DNA插入玉米植物的基因组中的行为是由植物转化行为实现并且导致产生新的转基因型基因组分子序列，其被称为“事件”。这个序列对事件是独特和特异的，并且当与原始玉米基因组序列或其它转基因玉米事件相比时可以容易地鉴定。玉米MON 87419事件的分子分析鉴定插入的DNA(SEQ ID NO:9)的基因组插入位点和紧邻插入的DNA的任一侧的侧翼玉米基因组DNA序列(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)。插入的DNA相对于周围的玉米植物基因组DNA的这种排列因此对于包含玉米MON 87419事件的转基因耐除草剂玉米是特异和独特的。这个新的基因组分子序列(SEQ ID NO:10)也是包含玉米MON 87419事件的转基因耐除草剂玉米植物的染色体的整体部分，因此在植物中是静态的并且可以传递至植物的后代。
本发明还提供了包含玉米MON 87419事件的原始转化株的后代。这样的后代可以通过包含玉米MON 87419事件的玉米植物的自交或通过包含玉米MON 87419事件的玉米植物与含有或不含玉米MON 87419事件的另一种植物间的有性杂交而产生。该另一种植物可以是包含相同或不同事件的转基因植物；或非转基因植物，诸如来自不同品种的植物。即使在重复回交至轮回亲本后，来自转化亲本的玉米MON 87419事件仍存在于杂交后代的相同基因组位置。
如本文所使用，术语“玉米(maize)”意指玉米(Zea mays)(也称为玉米(corn))，并且包括可以与玉米繁育的所有植物品种。
本发明提供了含有玉米MON 87419事件的转基因耐受除草剂的玉米植物，其耐受麦草畏(3,6-二氯-2-甲氧基苯甲酸)除草剂和草铵膦(2-氨基-4-(羟甲基氧膦基)丁酸)除草剂。麦草畏是一种可用于控制阔叶杂草的合成植物生长素除草剂。草铵膦是一种用于控制广泛的一年生和多年生杂草和阔叶杂草的有机磷除草剂。玉米MON 87419事件含有来自嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)的脱甲基酶(dmo)基因，其表达麦草畏单加氧酶(DMO)蛋白以赋予对麦草畏除草剂的耐受性；以及来自绿产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的双丙氨膦抗性(pat)基因，其表达草铵膦N-乙酰转移酶(PAT)蛋白以赋予对草铵膦除草剂的耐受性。
如本文所使用，术语“重组”是指通常不会在自然界中发现并且通过人为干预产生的非天然DNA、蛋白质或生物体。如本文所使用，“重组DNA分子”是包含不会自然地一起存在并且是人为干预的结果的DNA分子组合的DNA分子，例如由至少两种彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，诸如包含转基因和紧邻该转基因的植物基因组DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例是包含选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子。如本文所使用，“重组植物”是在通常不会存在于自然界中，是人为干预的结果并且含有转基因DNA分子的植物。由于这样的基因组改变，重组植物是一些新鲜的事物并且与相关的野生型植物明显不同。重组植物的实例是含有玉米MON 87419事件的玉米植物。
如本文所使用，术语“转基因”是指由于人为干预如通过植物转化方法而人工并入生物体基因组中的DNA分子。转基因对于生物体可以是异源的。如本文所使用，术语“转基因插入物”是指通过植物转化技术插入到玉米基因组中以产生玉米事件MON 87419的转基因。该转基因插入物的序列作为SEQ ID NO:9提供。术语“转基因”是指包含转基因，例如“转基因植物”是指包含转基因的植物。
如本文所使用，术语“异源的”是指第一分子在自然界中通常不与第二分子或生物体结合。例如，DNA分子可以源自第一物种并插入第二物种的基因组中。因此，该DNA分子对于基因组和生物体将是异源的。
如本文所使用，术语“嵌合的”是指通过将第一DNA分子与第二DNA分子融合而产生的单一DNA分子，其中无论第一DNA分子还是第二DNA分子通常都不会以这种彼此融合的构造被发现。因此，嵌合DNA分子是一种在自然中通常不存在的新的DNA分子。嵌合DNA分子的实例是包含选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子。
本发明提供了DNA分子及其相应的DNA序列。如本文所使用，术语“DNA”和“DNA分子”是指脱氧核糖核酸(DNA)分子。DNA分子可以是基因组或合成来源的，并且按照惯例是从5’(上游)端至3’(下游)端。如本文所使用，术语“DNA序列”是指DNA分子的核苷酸序列。所用的命名法是美国联邦法规(United States Code of Federal Regulations)§1.822的第37条所要求的命名法，并且记述于WIPO标准ST.25(1998)的附录2的表1和表3中。按照惯例，仅参照两条互补DNA序列链中的一条链公开了本发明的DNA序列及其片段。通过暗示和有意，本文所提供的序列的互补序列(即互补链的序列，在本领域中也被称为反向互补序列)也在本发明的范围内并且明确地旨在落在要求保护的标的物的范围内。因此，如本文所使用，提及SEQ ID NO:1-10和SEQ ID NO:14-22及其片段包括并且是指互补链的序列及其片段。
如本文所使用，术语“片段”是指整体中的较小片段。例如，SEQ ID NO:10的片段将包括SEQ ID NO:10的完整序列的至少约20个连续核苷酸、至少约25个连续核苷酸、至少约30个连续核苷酸、至少约35个连续核苷酸、至少约40个连续核苷酸、至少约45个连续核苷酸、至少约50个连续核苷酸、至少约60个连续核苷酸、至少约70个连续核苷酸、至少约80个连续核苷酸、至少约90个连续核苷酸或至少约100个连续核苷酸的序列。
对应于转基因插入物的完整DNA序列和位于转基因插入物的任何一端的侧翼的玉米基因组DNA的大部分区段的DNA序列是作为SEQ ID NO:10提供。通过磷酸二酯键与转基因插入物的5’端物理连接并因此位于其侧翼的玉米基因组DNA的DNA序列是作为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7提供。通过磷酸二酯键与转基因插入物的3’端物理连接并因此位于其侧翼的玉米基因组DNA的DNA序列是作为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8提供。
含有玉米MON 87419事件的转基因玉米包含被称为连接的两个区域。“连接”是转基因插入物的一端已与基因组DNA连接的地方。连接横跨或延伸跨越转基因插入物和相邻的侧翼基因组DNA的一部分，且因此是作为一个连续分子的这两个的连接点。一个连接在转基因插入物的5’端，且一个在转基因插入物的3’端，在本文中分别被称为5’连接和3’连接。“连接序列”是指横跨事件的5’或3’连接的任何长度的DNA序列。本领域技术人员利用SEQID NO:10容易了解玉米MON 87419事件的连接序列。玉米MON 87419事件的连接序列的实例作为SEQ ID NO:1-8提供。图1说明了从5’至3’排列的SEQ ID NO:1-10的物理排列。因此，本发明提供了含有SEQ ID NO:1-8中所列出的DNA序列中的至少一个的DNA分子。
玉米MON 87419事件的连接序列可以作为含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物、种子或细胞的基因组的部分而存在。在源自转基因玉米植物、植物部分、种子或细胞的样品中鉴定出SEQ ID NO:1-8中的任何一个或多个表明DNA是从含有玉米MON 87419事件的转基因玉米获得并且诊断出玉米MON 87419事件的存在。
玉米MON 87419事件含有对转基因插入物是独特的序列，明确来说是SEQ ID NO:14-22。这些序列对事件的转基因插入物内的各种启动子、内含子、叶绿体靶向肽(CTP)、3’终止信号、pat和dmo基因的特定嵌合配置是独特的。图1说明了这些独特的转基因插入序列中的每一个相对于SEQ ID NO:9的相对位置。
提供了示例性DNA分子，所述DNA分子可以用作引物或探针用于诊断样品中源自玉米MON 87419事件的DNA的样品的存在。此类引物或探针对靶标核酸序列是特异性的，且因此可用于通过本文所述的方法鉴定玉米MON 87419事件。
“引物”是被设计用于涉及扩增反应的退火或杂交方法中的DNA分子。扩增反应是扩增模板DNA以产生扩增子的体外反应。如本文所使用，“扩增子”是已使用扩增技术合成的DNA分子。本发明的扩增子具有包含SEQ ID NO:1-10中的一个或多个或其片段的DNA序列。在扩增反应(如聚合酶链式反应(PCR))中可以使用一对引物和模板DNA(如玉米基因组DNA的样品)以产生扩增子，其中所产生的扩增子将具有这样的DNA序列，其对应于位于引物与模板杂交处的两个位点之间的模板DNA的序列。引物通常被设计来与互补的靶标DNA链杂交以在引物和靶标DNA链之间形成杂交链。引物的存在是聚合酶使用靶标DNA链作为模板开始引物延伸的识别点。引物对是指使用结合双链核苷酸片段的相反链的两个引物，其目的在于扩增它们之间的核苷酸片段。引物序列的实例作为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12提供。作为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12提供的引物对可用作第一DNA分子和第二DNA分子，其中第一DNA分子是SEQ ID NO:9的片段且第二DNA分子是SEQ ID NO:10的玉米基因组DNA序列的片段，并且各自具有足够长度以用作DNA引物，当与含有玉米MON 87419事件的DNA在扩增反应中一起使用时，所述DNA引物产生诊断样品中的玉米MON 87419事件的扩增子。玉米MON87419事件的玉米基因组DNA序列作为SEQ ID NO:10的位置1-1246和位置8009-9259提供。
“探针”是与靶标核酸的链互补并且可用于杂交检测方法中的核酸分子。本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括特异性地结合靶标DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且检测这种结合可用于检测靶标DNA序列的存在或不存在。“探针”可以附接至常规的可检测标记或报道分子，诸如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。可用作检测玉米MON 87419事件的探针的示例性DNA序列作为SEQ ID NO:13提供。
设计和使用引物和探针的方法是本领域中熟知的，且包含SEQ ID NO:1-10的片段并可用作检测玉米MON 87419事件的引物和探针的DNA分子可以由本领域技术人员容易地设计出。
因此，本文所提供的DNA分子和对应的DNA序列可用于鉴定转基因玉米植物、细胞、种子或部分中的玉米MON 87419事件；选择包含玉米MON 87419事件的玉米品种或杂种；以及检测样品中玉米MON 87419事件的存在或不存在。
如本文所使用，术语“分离的”是指分离一种分子与在天然或自然状态下通常与其结合的其它分子。因此，术语“分离的”可以指这样的DNA分子，其已经与在原始或天然状态下与其结合的其它DNA分子分离。这样的DNA分子可以以重组状态存在，诸如重组DNA分子。因此，由于例如重组技术而与通常不与其结合的调控或编码序列融合的DNA分子被认为是分离的，即使当所述DNA分子作为转基因整合到细胞的染色体中或与其它DNA分子一起存在时。
本发明提供了含有玉米MON 87419事件的玉米植物、后代、种子、植物细胞和植物部分以及使用这些所产生的商业产品。包含MON 87419事件的转基因耐除草剂玉米种子的代表性样品已经根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养物保藏中心ATCC资源库已将专利保藏号PTA-120860分配给含有玉米MON 87419事件的转基因耐除草剂玉米植物的种子。本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品含有可检测量的DNA，其具有作为SEQ ID NO:1-10和SEQ ID NO:14-22提供的序列中的至少一个。本发明的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分还可以含有一种或多种另外的转基因性状，特别是那些通过使含有玉米MON 87419事件的玉米植物与含有另外的转基因性状的另一种植物杂交所引入的性状。此类性状包括但不限于：增强的昆虫抗性、增加的用水效率、增加的产量表现、增强的抗旱性、增强的种子质量、改善的营养质量、杂种生产和/或增强的除草剂耐受性，其中所述性状是相对于缺乏这种转基因性状的玉米植物而测量。
本发明的植物可以用于产生含有玉米MON 87419事件的后代。如本文所使用，“后代”包括包含遗传自祖先植物的玉米MON 87419事件的任何植物、种子和植物细胞，它们由包含具有选自SEQ ID NO:1-10的至少一个序列的DNA分子的植物指示。植物、后代和种子对于玉米MON 87419事件而言可以是纯合的或杂合的。后代植物可以由含有玉米MON 87419事件的玉米植物所产生的种子或用含有玉米MON 87419事件的花粉受精的玉米植物所产生的种子生长而成。
如本文所使用，本发明的“植物部分”是源自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物的任何部分。植物部分包括但不限于：花粉、胚珠、荚、花、根、茎、纤维和叶。植物部分可以是有活力的或无活力的。
本发明提供了从含有玉米MON 87419事件的转基因玉米生产出的商业产品。本发明的商业产品含有可检测量的DNA，其包含选自由SEQ ID NO:1-10组成的组的DNA序列。如本文所使用，“商业产品”是指由源自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物、玉米种子、玉米植物细胞或玉米植物部分的材料组成的任何组合物或产品。商业产品包括但不限于加工的种子、谷粒、植物部分和膳食。含有玉米MON 87419事件的转基因玉米可用于生产通常是从玉米获得的任何商业产品。本发明的商业产品将含有可检测量的对应于玉米MON87419事件的DNA。检测样品中的一个或多个该DNA可以用于确定商业产品的含量或来源。可以使用DNA分子的任何标准检测方法，包括本文公开的检测方法。
本发明提供了与含有玉米MON 87419事件的转基因玉米一起使用草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂来控制杂草的方法。提供了一种控制区域内(如田间)的杂草的方法，其由以下组成：在区域内种植含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物以及对所述区域施用除草有效剂量的草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂以控制所述区域内的杂草而不伤害含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物。这种草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂的施用可以在萌芽前(在种植含有玉米MON 87419事件的转基因玉米种子后以及含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物萌芽前的任何时间)或萌芽后(在含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物萌芽后的任何时间)进行。在区域内用来控制杂草的除草有效剂量的草铵膦应该由在整个生长季节内为约0.1磅酸当量/英亩(ae/ac)至多达约16磅ae/ac草铵膦的范围组成。在区域内用来控制杂草的除草有效剂量的麦草畏应该由在整个生长季节内为约0.1磅ae/ac至多达约16磅ae/ac麦草畏的范围组成。在整个生长季节内可以使用草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂的多次施用，例如两次施用(诸如种植前施用和萌芽后施用或萌芽前施用和萌芽后施用)或三次施用(诸如种植前施用、萌芽前施用和萌芽后施用)。
如本文中所使用，“活性成分”或“ai”是除草剂制剂的负责除草活性的组分，通常以磅/加仑计量或以磅/英亩施用。对于酸除草剂(例如，具有羧基作为其结构的一部分的分子)而言，酸性基团在配制过程中经常转化为(可以被所需离子取代以形成)盐或(与醇反应以形成)酯。这可能不仅会改变特定除草剂分子的化学特性，而且还会改变质量。然而，相应的酸是制剂的除草活性部分并且不同的活性成分之间的除草活性的等价性可以使用酸当量作为标准计量单元来计算。术语“酸当量”或“ae”意指制剂中的活性成分的理论上可以被转化回相应酸的部分。除草剂施用率可以表示为“酸当量/英亩”(简写为“ae/ac”)或“活性成分/英亩”(简写为“ai/ac”)。
提供了用于产生含有玉米MON 87419事件的耐除草剂转基因玉米植物的方法。由这些方法所产生的后代可以是变种或杂种植物；可以由含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物所产生的种子或由用来自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物的花粉受精的玉米植物所产生的种子生长而成；并且对于玉米MON 87419事件而言可以是纯合或杂合的。植物可以是自花授粉的(又称为“自交”)或异花授粉的(又称为“杂交”)。含有玉米MON87419事件的转基因玉米植物可以自花授粉以产生对于玉米MON 87419事件而言纯合的真实育种品系的植物。自交产生被称为“近交”的后代并且被用于产生遗传上一致的近交系。或者，含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物可以异型杂交(与另一种转基因或非转基因的植物繁育)而产生变种或杂种种子。由本发明的方法生成的种子和后代植物将含有玉米MON 87419事件并且随后可以用草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂进行处理。用草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂进行处理可以用于选择耐受的后代。或者，可以使用诊断方法分析这些后代植物以选择含有玉米MON 87419事件的植物或种子。
本发明的植物、后代、种子、植物细胞和植物部分还可以含有一种或多种另外的玉米转基因性状，特别是那些通过使含有玉米MON 87419事件的玉米植物与含有另外的转基因性状的另一种玉米植物杂交所引入的性状。此类玉米转基因性状包括但不限于：增强的昆虫抗性、增加的用水效率、增加的产量表现、增强的抗旱性、增强的种子质量、改善的营养质量、杂种生产和除草剂耐受性，其中所述性状是相对于缺乏这种转基因性状的玉米植物而测量。此类玉米转基因性状是本领域技术人员已知的；例如，一系列此类性状由美国农业部(USDA)动植物卫生检查处(APHIS)提供并且可以在其网站http://www.aphis.usda.gov.上找到。因此，两种转基因植物可以杂交产生含有两种或更多种独立分离的转基因性状的后代。还预期了与亲本植物回交以及与非转基因植物异型杂交，以及无性繁殖。常用于不同性状和作物的育种方法的描述可以见于若干参考文献中的一个，例如，Fehr,BreedingMethods for Cultivar Development,Wilcox J.编辑，American Society of Agronomy,Madison WI(1987)。
本发明的植物、种子、细胞、植物部分和商业产品可以用于检测指示玉米MON87419事件的存在的DNA和蛋白质分子。这种检测将会利用本文所提供的DNA序列和由作为SEQ ID NO:9提供的转基因插入物编码的DMO和PAT蛋白序列来完成。检测玉米MON 87419事件的存在可以通过使用本领域中已知的方法诸如核酸的热扩增、核酸杂交技术(如northern印迹法和southern分析)、蛋白质检测技术(如western印迹法、免疫沉淀法和酶联免疫吸附分析(ELISA)技术)或通过使用本文所提供的检测方法和/或检测试剂盒来完成。一种方法包括使DNA样品与能够从含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的DNA产生扩增子的引物对接触，进行扩增反应并由此产生包含作为SEQ ID NO:1-10和SEQ ID NO:14-22提供的DNA序列中的至少一个的DNA扩增子，且然后检测扩增子分子的存在或不存在以及任选地在扩增子的序列中确认包含作为SEQ ID NO:1-10和SEQ ID NO:14-22提供的序列中的至少一个的序列。这种扩增子的存在诊断出特异于含有玉米MON 87419事件的转基因玉米且因此特异于源自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的样品中的生物材料的DNA的存在。另一种方法包括使DNA样品与DNA探针接触，使探针和DNA样品经受严格的杂交条件，且然后检测探针和靶标DNA样品间的杂交。杂交的检测可诊断DNA样品中特异于含有玉米MON87419事件的转基因玉米的DNA的存在。
提供了用于玉米MON 87419事件的DNA检测试剂盒。还可以使用本文所公开的组合物和方法以及DNA检测领域中熟知的方法开发此类试剂盒的变型。DNA检测试剂盒可以应用于与含有玉米MON 87419事件的转基因玉米植物繁育的方法。此类试剂盒含有包含SEQ IDNO:1-10的片段的DNA引物或探针。这种试剂盒的一个实例包含SEQ ID NO:10的足够长度的连续核苷酸的至少一种DNA分子以用作DNA探针，其可用于检测样品中源自含有玉米MON87419事件的转基因耐受除草剂的玉米植物的DNA的样品的存在和/或不存在。足以用作DNA探针的DNA分子被作为SEQ ID NO:13提供，其可用于确定、检测或诊断样品中含有玉米MON87419事件DNA的转基因耐除草剂玉米的存在和/或不存在。其它探针可以由本领域技术人员容易地设计，并且应该包含SEQ ID NO:10中的至少约十五个核苷酸且对于含有玉米MON87419事件DNA的转基因耐除草剂玉米足够独特，以便鉴定源自玉米MON 87419事件的DNA。另一种类型的试剂盒包含引物对，其可用于产生用于检测样品中玉米MON 87419事件的存在或不存在的扩增子。这样的试剂盒将采用以下方法，其包括使靶标DNA样品与引物对接触，然后进行足以产生包含具有至少一个选自SEQ ID NO:1-10的序列的DNA分子的扩增子的核酸扩增反应，且然后检测所述扩增子的存在或不存在。这样的方法还可以包括对扩增子或其片段进行测序。其它引物对可以由本领域技术人员容易地设计，并且应该包含SEQID NO:10中的至少二十个核苷酸且对于含有玉米MON 87419事件DNA的转基因耐除草剂玉米足够独特，以便检测玉米MON 87419事件。本发明的试剂盒还可以任选地包含用于进行本文所述的检测或诊断反应的试剂或使用所述试剂盒和其内容物的说明书。
如本文中所使用，术语“包含”意指“包括但不限于”。
保藏信息
包含玉米MON 87419事件的转基因玉米种子的代表性样品已经根据布达佩斯条约保藏于美国模式培养物保藏中心(ATCC)，其地址为10801University Boulevard，Manassas，Virginia USA，邮编20110。包含玉米MON 87419事件的种子的ATCC专利保藏命名(登录号)是PTA-120860，且保藏日期是2014年1月17日。所述保藏物将在保藏机构保存30年或最后一次请求后的5年或专利的有效期，无论哪个时间更长。
实施例
包括下列实施例以更充分地描述本发明。本领域技术人员应当理解，许多修改可以在公开的具体实施例中进行并且仍然获得类似的结果。化学上和生理上相关的某些试剂可以代替本文所描述的试剂，同时实现相同或相似的结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类替代和修改被认为是在本发明的范围内。
实施例1：MON 87419事件产生和选择
本实施例描述了含有事件MON 87419(可以提供耐受麦草畏和草铵膦除草剂的事件)的转基因玉米的产生、分析和选择。汇总了在多年内经过玉米MON 87419事件的最终选择所需的严格的分子、表型和田间试验的数万个单个植物的产生和分析。
设计了含有多种不同的表达盒的转化载体并进行测试以确认其用于表达dmo和pat基因的效用。使用该数据，选择表达元件的组合并且构建八个不同的转化载体并转化至玉米中。这些载体测试启动子和终止子与pat基因和dmo基因的两个编码区的各种组合(表1)。分析所得植物的蛋白质表达并且选择用于商业性玉米转化的两个载体(在表1中示出为A和B)。
表1.转化载体的盒配置。
使用所选的两个载体(A和B)产生超过13,000个独特的转化玉米植物。在植物中，所引入的基因的表达水平在单个事件之间经常有广泛的变化，并且基因表达可以直接与含有事件的植物的表型正相关或负相关。已知外源基因在植物中的表达尤其受其染色体位置的影响。出于这个原因，有必要通过多个年份和地点筛选大量含有随机插入事件的个体植物以鉴别最佳事件。转基因玉米MON 87419事件是通过LH244玉米未成熟胚的农杆菌介导的转化产生。用于转化玉米的方法是本领域中已知的。使玉米细胞转化并再生为完整的玉米植物。选择具有正常表型特征的有根植物。然后将数千个单独的独立事件转移至土壤中用于生长和进一步评估。
表2.事件选择过程
在整个事件选择过程中，进行分子分析以及田间试验(经常同时进行)以评估事件的表型、农艺学和药效(表2)。首先通过PCR分析13,000个单独和独特的转化玉米R0植物以选择具有转基因插入物的单拷贝(第一轮单拷贝)的事件。这导致2,998个事件的推进。下一选择是在温室中进行的R0除草剂喷洒耐受性。通过使用在V1/V2生长阶段喷洒的草铵膦(0.9lb ai/ac)和麦草畏(2.0lb ae/ac)的桶混剂来测试植物对草铵膦(280除草剂)和麦草畏(除草剂)的耐受性。表现出>15％损伤的植物被丢弃，并且选择1,440个事件用于进一步分析。进行初步的详细分子分析，并且包括序列鉴定和确认，以及拷贝数和骨架缺乏的第二次检查。该分析导致仅含有转基因插入物的单拷贝的184个事件被选择用于推进。对从R0事件提取的DNA进行Southern分析以进一步确认转基因插入物的拷贝数并确认不存在转化骨架。在此基础上，选择112个事件来推进至R1作进一步分析。使R0植物自花授粉并收集种子用于R1试验。
在进行所有田间试验的同时，另外的分子分析正在进行中。进行Northern分析以检测和测量pat和dmo基因的mRNA转录物。进行从含有选择事件的转基因植物纯化得到的PAT和DMO蛋白质的N端蛋白测序以确认重组蛋白质序列。对转基因植物的样品进行Western分析以检测PAT和DMO蛋白质。进行整个转基因和插入物的5’端和3’端的测序，且测序结果随后用于开发检测个别事件的方法。对R1植物进行深入的Southern分析以确认拷贝数和骨架缺乏。
对于R1田间试验的早期筛选，基于种子返回和苗圃大小的考虑从由R0筛选选出的112事件中选择82个事件。R1植物分离，因此对于事件而言为空、半合子或纯合的。在具有高施用率除草剂的田间药效筛选中评价R1植物中的82个事件。在使用草铵膦(Ignite 280)和麦草畏(Clarity)的各种组合(高达20X草铵膦和高达16X麦草畏标记的田间施用率)并在从V1/V2至V8/V10的不同生长阶段的施用时间下进行处理后评估植物损伤。在施用除草剂后10至14天进行损伤评级。标准损伤评级包括对萎黄百分比、畸形和繁殖的评分。含有相同事件的多个植物的总平均值被用来选择用于推进的事件。以2X比率施用除草剂通常产生小于10％的损伤，且以16X和20X比率施用除草剂产生超过10％的损伤评级。除了药效试验以外，收集每个植物的农艺评分并与其所含有的事件进行关联。被评价的农艺评分标准包括株高、穗高、水分百分比、试验重量、至50％授粉的天数和至50％长须的天数。基于对从R1田间试验和分子分析收集的数据进行的分析，44个事件被选择用于推进至R2作进一步分析。使R1植物自花授粉并收集种子用于R2试验。
在R2田间试验早期筛选中，R2和F1事件(来自R1异型杂交)在三个地点(两个州和波多黎各)的田间药效筛选中进行评估。在用草铵膦和麦草畏施用率以及施用时间安排的各种组合处理之后评估植物损伤。R2植物对于所述事件是纯合的，并且除草剂施用后的除草剂耐受失败率低，这确认了R1结果。收集农艺数据并如在R1田间试验中一样进行评分。另外的分子分析(包括基因表达分析)也被用来选择含有最佳事件的植物。基于对从R2和F1田间试验和分子分析收集的数据进行的分析，42个事件被选择用于推进至R3作进一步分析。使R2植物自花授粉并收集种子用于R3试验。
对于推进的田间试验，进行杂种和近交系药效以及杂种和近交系农艺田间试验。农艺田间试验与药效田间试验在相同的季节中运行。所有的田间试验采用完全随机区组设计，并在多个地点进行。对于药效和农艺田间试验二者而言，在整个田间试验季节收集农艺评分，并在季末测定产量(药效产量或农艺产量)。进行药效田间试验以评估除草剂施用后10至14天的作物损伤、作物损伤评级和产量。靶标作物损伤评级为针对事件推进的小于10％的评分。对于农艺田间试验，地块保持没有杂草并且在生长季节期间不施用草铵膦或麦草畏除草剂。杂种农艺田间试验包括使用用于进行转基因杂种杂交但不含有转基因事件的同一亲本玉米系产生的可比较杂种(杂种对照)的对照。近交系对照是转基因近交系相当的近交系。
使用多季节、多地点田间试验数据的集合进行荟萃分析。表3说明了针对含有事件中的任一个的植物的特定田间试验类型进行重复观察的重复数。对于两个事件中每一个，针对杂种农艺表现记录了135个数据点，针对杂种药效记录了933个数据点，针对近交系农艺性状记录了179个数据点，针对近交系药效记录了30个数据点，并且针对含有事件的玉米的除草剂施用率的基于事件的压力测试记录了16个数据点。
表3.两个最终事件的田间试验重复
描述 每个事件的重复
杂种农艺性状 135个重复
杂种药效 933个重复
近交系农艺性状 179个重复
近交系药效 30个重复
基于事件的压力测试 16个重复
每个事件的总重复 1293
在南美州(SA)第1年反季节药效田间试验和农艺田间试验中评价各含有23个选定事件(来自R2田间试验的42个事件的子集)之一的杂种植物。试验以完全随机区组设计在六个地点进行，具有4个处理，每个处理2次重复。在药效田间试验中，麦草畏制剂是4SL除草剂，且草铵膦制剂是1.67SL。除草剂处理由以下组成：(1)未处理的对照；(2)2lb ae/英亩(ac)PRE(其中PRE被定义为在种植时或作物萌芽前)的麦草畏，在VE-V2中的每个下、随后在V4下随后在V8下施用1lb ae/ac麦草畏；(3)在VE-V2下、随后在V4下随后在V8下施用0.8lb ai/ac草铵膦；和(4)在VE-V2下、随后在V4下随后在V8下施用0.8lb ai/ac草铵膦加施用1lb ae/ac麦草畏。在施用除草剂后10至14天进行损伤评级。含有相同事件的多个植物的总平均值被用来选择用于推进的事件。靶标作物损伤评级为小于10％的评分，并且观察到的损伤评级低于1％。基于杂种损伤评分、农艺评分、药效产量、农艺产量和另外的分子分析，17个事件被选择用于推进。
随后在美国(US)第1年药效田间试验和农艺田间试验中进一步评价来自从南美洲第1年反季节田间试验推进的17个事件的近交和杂种植物。这些试验是在2012年进行，该年份在美国是严重干旱的一个季节。杂种药效田间试验以完全随机区组设计在2个州的12个地点进行，具有6个处理，每个处理3次重复。含有转基因事件的杂种植物从杂交中的父本产生草甘膦耐受性。在这些药效田间试验中，草甘膦制剂为Roundup4.5SL，麦草畏制剂为Clarity 4SL，且草铵膦制剂为Ignite 280 2.34SL。除草剂处理由以下组成：(1)未处理的对照；(2)在V4下随后在V8下施用3lb ae/ac草甘膦；(3) 在V2下、随后在V4下随后在V8下施用0.8lb ai/ac草铵膦；(4)在PRE下施用2lb ae/ac麦草畏，然后在V4下随后在V8下再次施用；(5)在V2下、随后在V4下随后在V8下施用3lb ae/ac草甘膦加1.5lb ae/ac麦草畏；(6)在V2下施用2lb ae/ac麦草畏，随后在生长阶段V4下施用0.8lb ai/ac草铵膦加1lb ae/ac麦草畏，随后在生长阶段V8下施用3lb ae/ac草甘膦加1.5lb ae/ac麦草畏。在施用除草剂后10至14天进行损伤评级。含有相同事件的多个植物的总平均值被用来选择用于推进的事件。靶标作物损伤评级为小于10％的评分，并且观察到的损伤评级低于1％。基于杂种损伤评分、农艺评分、药效产量、农艺产量和另外的分子分析，11个事件被选择用于推进。
然后用含有这11个事件的植物进行南美洲(SA)第2年反季节田间试验以评估杂种药效和近交系农艺产量。含有转基因事件的杂种植物从杂交中的父本产生草甘膦耐受性。基本上如针对南美州(SA)第1年反季节田间试验所描述但使用下列除草剂处理进行杂种药效田间试验：(1)未处理的对照；(2)在V4下随后在V8下施用3lb ae/ac草甘膦；(3)在V4下随后在V8下施用0.8lb ai/ac草铵膦；(4)在PRE下施用2lb ae/ac麦草畏，然后在V4下随后在V8下再次施用；(5)在V4下随后在V8下施用3lb ae/ac草甘膦加1.5lb ae/ac麦草畏；(6)在V4下施用0.8lb ai/ac草铵膦加1lb ae/ac麦草畏，随后在V8下施用3lb ae/ac草甘膦加1.5lb ae/ac麦草畏。在施用除草剂后10至14天进行损伤评级。含有相同事件的多个植物的总平均值被用来选择用于推进的事件。基于杂种损伤评分、农艺评分、杂种药效产量、近交系农艺产量和另外的分子分析，5个事件被选择用于推进。
然后针对这5个事件完成另外的分子分析。接着，审查5个事件中每个的多年田间和分子数据，包括杂交性状药效田间试验、杂种和近交系产量测量、农艺评分和分子信息，且两个事件被选择用于进一步分析。这两个事件都是使用相同的转化载体而产生，并且因此具有相同的转基因插入物，但不具有相同的基因组位置或侧翼序列。
进行美国(US)第2年杂种和近交系药效田间试验以及杂种和近交系农艺田间试验以评价这两个事件。杂种药效试验的进行类似于第1年美国田间试验，但包括不同的喷洒方案。通过损伤评级和杂种药效产量来测定药效。同样对事件进行另外的分子分析。含有转基因事件的杂种植物从杂交中的父本产生草甘膦耐受性。杂种药效1和2田间试验在两个州的十二个地点进行，且杂种药效3田间试验在四个州的三十三个地点进行。在这些田间试验中，草甘膦制剂为Roundup PowerMAX 4.5SL，麦草畏制剂为Clarity 4SL，且草铵膦制剂为Ignite 280 2.34SL。用于药效1和药效2试验(与两个不同的近交系杂交)的除草剂施用为：(1)未处理的对照；(2)先后在VE-V2和V6下施用0.4lb ai/ac草铵膦；(3)先后在VE-V2和V6下施用0.8lb ai/ac草铵膦；(4)在V4下随后在V8下施用0.5lb ae/ac麦草畏；(5)在V4下随后在V8下施用1.0lb ae/ac麦草畏；以及(6)在V4下随后在V8下施用2.25lb ai/ac草甘膦加1.0lb ae/ac麦草畏。用于药效3试验(代表来自与第三近交系杂交的杂种)的除草剂施用为：(1)未处理的对照；(2)在VE-V2下施用0.5lb ae/ac麦草畏，随后在V6下施用0.4lb ai/ac草铵膦；以及(3)在VE-V2下施用1.0lb ae/ac麦草畏，随后在V6下施用0.8lb ai/ac草铵膦。损伤评级在施用除草剂后10至14天进行，且对于含有相同事件的多个植物而言被用来选择用于推进的事件。收集产量和农艺数据。
为了比较所述两个事件的杂种损伤评级，完成了多个杂种药效田间试验的荟萃分析。(表4)在V8下对损伤评级进行评分(其中V8分析包括来自V2、V4、V6和V8除草剂施用的累积损伤)，其具有统计学最小显著差异(LSD，p<0.05)。试验品1、试验品2和试验品3代表与被用来产生用于指定田间试验的杂种的3个独立近交玉米亲本系杂交。对于每一个试验，在利用含有两个事件中任一个的转基因玉米亲本产生的杂种之间没有发现损伤评级的统计差异。
表4.来自杂种药效田间试验的损伤评级的荟萃分析。
完成了来自多个药效田间试验的杂种药效产量(蒲式耳/英亩)的荟萃分析，其比较来自含有两个事件中每一个的杂种的产量。(表5)对于每一个试验，在利用含有两个事件中任一个的转基因玉米亲本产生的杂种之间没有发现杂种药效产量的统计差异。
表5.杂种药效田间试验的产量荟萃分析。
还利用含有两个事件中任一个的杂种转基因玉米进行了压力测试田间试验。在压力测试中，以非商业化的高比率施用草铵膦(Ignite 280,2.34SL)或麦草畏(Clarity 4SL)除草剂。对于典型的田间试验，草铵膦的1X比率为0.4lb ai/ac，且麦草畏的1X比率为0.5lbae/ac。对于草铵膦压力测试田间试验，按下列比率在VE-V2下、随后在V4下随后在V8下施用草铵膦：(1)1lb ai/ac(2.5X)；(2)2lb ai/ac(5X)；(3)4lb ai/ac(10X)；和(4)8lb ai/ac(20X)。对于麦草畏压力测试田间试验，按下列比率在VE-V2下、随后在V4下随后在V8下施用麦草畏：(1)2lb ae/ac(4X)；(2)4lb ae/ac(8X)；(3)8lb ae/ac(16X)；和(4)16lb ae/ac(32X)。在季末时，收获杂种压力测试田间试验并测定产量(蒲式耳/英亩或bu/ac)。产量数据的分析比较了含有两个事件中任一个的杂种。对于每一个试验，在利用含有两个事件中任一个的转基因玉米亲本产生的杂种之间没有发现在任何除草剂施用率下的产量的统计差异。
表6.来自杂种压力测试药效田间试验的产量。
杂种农艺田间试验在3个州的21个地点分3组(每组15个地点)进行，并与杂种药效田间试验在同一季节运行。在整个田间试验季节中收集农艺学测量结果，并在季末测定农艺产量。横跨多季节、多地点杂种农艺田间试验的荟萃分析被用来比较杂种对照和含有两个事件中任一个的杂种的产量。在转基因杂种之间或相比于杂种对照没有发现杂种农艺产量的统计差异(表7)。
表7.杂种农艺田间试验的产量荟萃分析。
在1个州的6个地点利用完全随机区组设计进行近交系药效田间试验。在这些田间试验中，麦草畏制剂为Clarity 4SL，且草铵膦制剂为Ignite 280 2.34SL。用于近交系药效田间试验的除草剂施用是在VE-V2下施用0.8lb ai/ac草铵膦和2.0lb ae/ac麦草畏，接着在V8下施用0.8lb ai/ac草铵膦和2.0lb ae/ac麦草畏。在季末测定产量。对于每一个试验，当比较在这些试验中收获自含有两个事件中任一个的转基因玉米的近交系产量时，观察到近交系药效产量的统计差异(表8)。这些数据表明含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的优越表现。
表8.近交系药效田间试验的产量荟萃分析。
在与美国第1年药效田间试验、南美洲第1年药效田间试验以及美国第2年药效田间试验相同的季节期间进行近交系农艺田间试验(1个州，11个地点)。以在多个地点进行的完全随机区组设计来设置地块，并且试验包括转基因玉米近交系的可比较自交系的对照。进行横跨多季节、多地点近交系农艺田间试验的荟萃分析，以比较配对对照和使用两个事件中任一个所产生的转基因近交系的产量。在对照和含有MON 87419事件的转基因玉米之间没有发现近交系农艺产量的统计差异(表9)。与此相反，当与对照或含有MON 87419事件的转基因玉米相比较时，含有事件2的转基因玉米在产量上出现统计显著的降低。这些数据进一步表明含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的优异表现。
表9.近交系农艺田间试验的产量荟萃分析。
实施例2：玉米MON 87419事件的DNA序列的表征
本实施例描述了对玉米MON 87419事件进行的广泛分子表征。玉米MON 87419事件的转基因插入物从5’到3’取向含有：(i)来自大须芒草(Andropogon gerardii)的泛素基因(Ubq)的启动子(P-ANDge.Ubq1)、前导子和内含子(L-I-ANDge.Ubq1)；可操作地连接至编码赋予草铵膦除草剂耐受性的草铵膦N-乙酰转移酶(PAT)的来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的pat基因(CR-STRvi.pat)；可操作地连接至来自水稻(Oryza sativa)的RA5B前体基因的聚腺苷酸化信号(也称为指导mRNA的聚腺苷酸化的终止子)(T-Os.Ara5)，以及(ii)具有复制增强子区域的花生褪绿条纹病毒的全长转录物(PClSV)的启动子；可操作地连接至来自小麦(Triticum aestivum)的捕光复合体b1基因的前导子(L-Ta.Lhcb1)；可操作地连接至来自水稻的肌动蛋白1基因的第一内含子(I-Os.Act1)；可操作地连接至来自矮牵牛(Petunia x hybrida)5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的N末端叶绿体转运肽(TS-Ph.ShkG-CTP4)；可操作地连接至来自嗜麦芽寡养单胞菌的被优化来用于单子叶植物表达的dmo基因(CR-STEma.DMO)，其编码赋予麦草畏除草剂耐受性的麦草畏单加氧酶(DMO)；可操作地连接至来自小麦的热休克蛋白17聚腺苷酸化信号(T-Ta.Hsp17)。转基因插入物的5’端的侧翼为根癌农根菌(Agrobacterium tumifaciens)的右边界，且转基因插入物的3’端的侧翼为根癌农根菌的左边界。
进行Southern印迹分析以证实含有玉米MON 87419事件的转基因玉米含有整个转基因插入物的单一完整拷贝而不含任何载体骨架。从插入物的5’端和3’端分离侧翼序列，并使用反向PCR和/或基因组步行技术确定了各自的连接。使用反向PCR来扩增目标位点以外的基因组DNA，从而确定玉米MON 87419事件的插入物的染色体位置。玉米MON 87419事件的侧翼序列被映射到已知的玉米基因组的物理装配物，并且玉米MON 87419事件被证实为不在任何已知的基因内。该序列信息被用来设计事件特异性端点分析以鉴定样品中玉米MON 87419事件的存在。插入位点序列信息还被用于所述事件的染色体位置的生物信息学分析。使用特异于玉米MON 87419事件的侧翼区的引物，通过穿过野生型等位基因的PCR来确定插入位点完整性。野生型插入位点被用来将玉米MON 87419事件的转基因整合的独特位点映射到玉米参照基因组。为了确保在转化期间没有将改变或突变引入到转基因的任何区域，从植物中分离出玉米MON 87419事件的整个转基因插入物并对其测序。
使用来自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米籽粒的免疫纯化蛋白质提取物进行表达的PAT和DMO蛋白质的N末端蛋白测序。该序列随后被用来确认真实的N末端氨基酸序列。对从含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的籽粒获得的蛋白质提取物进行Western分析。该分析确认对于PAT和DMO各自产生单一的预期大小的蛋白质。ELISA被开发来确定由玉米MON 87419事件表达的PAT或DMO蛋白质在各种转基因玉米组织类型(叶、种子、根和花粉)中的蛋白水平。对从含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的籽粒分离的poly-A RNA进行Northern分析。该分析确认pat和dmo mRNA产物的转录物大小和数量。还使用来自含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的样品通过实时PCR测量了RNA表达水平。
实施例3：事件特异性端点分析
本实施例描述了被开发来鉴定样品中含有玉米MON 87419事件的转基因玉米的事件特异性端点热扩增方法。在端点分析中使用的DNA引物是引物SQ26644(SEQID NO:11)、SQ26645(SEQ ID NO:12)和6-FAMTM标记的探针PB11207(SEQ ID NO:13)。6-FAMTM是连接在DNA探针上的Applied Biosystems(Foster City,CA)的荧光染料产品。对MGBTM探针而言，Taq DNA聚合酶的5'外切核酸酶活性从5'端使探针在荧光团与猝灭剂之间裂解。当与靶标DNA链杂交时，猝灭剂和荧光团充分分离以产生荧光信号，从而释放荧光。SQ26644和SQ26645在与这些反应方法和PB11207一起使用时产生诊断玉米MON87419事件的DNA扩增子。用于此分析的对照应该包括含有玉米MON 87419事件的阳性对照、来自非转基因玉米的阴性对照和不含有模板DNA的阴性对照。另外，PCR反应的对照最佳应包括特异于玉米基因组中的单拷贝基因的内部对照引物和内部对照探针。这些分析被优化来与Applied BiosystemsPCR System 9700(在最大速度下运行)或MJResearch DNA Engine PTC-225热循环仪一起使用，但也可以使用其它设备。
在用于检测玉米MON 87419事件的端点分析方法中有用的条件的实例如下。步骤1：将18兆欧姆水调节至10μl的最终体积。步骤2：5.0μl 2X Universal MasterMix(dNTP、酶、缓冲液)至1X最终浓度。步骤3：0.5μl事件引物-1(SQ26644)和事件引物-2(SQ26645)。混合(再悬浮于18兆欧姆水中至每个引物的浓度为20uM)至1.0μM的最终浓度(例如在微离心管中，应加入以下物质以获得最终浓度为20uM的500μl体积：浓度为100μM的100μl引物SQ26644；浓度为100μM的100μl引物SQ26645；300μl 18兆欧姆水)。步骤4：0.2μl事件6-FAMTMMGB探针PB11207(10uM)(再悬浮于18兆欧姆水中至10μM的浓度)至0.2μM最终浓度。步骤5：0.5μl 内部对照引物-1和内部对照引物-2混合物(再悬浮于18兆欧姆水中至每个引物的浓度为20mM)至1.0μM最终浓度。步骤6：0.2μl内部对照VICTM探针(10uM)至0.2μM最终浓度(再悬浮于18兆欧姆水中至10mM的浓度)。步骤7：针对每个样品为3.0μl提取的DNA(模板)以及下列中各一个，包括：1.待分析的叶片样品；2.阴性对照(非转基因DNA)；3.阴性水对照(无模板)；4.含有玉米MON 87419事件DNA的阳性对照转基因玉米。步骤8：热循环仪条件如下：在50℃下持续2分钟的1个循环；在95℃下持续10分钟的1个循环；在95℃下持续15秒，然后在64℃下持续1分钟的10个循环(-1℃/循环)；在95℃下持续15秒，然后在54℃下持续1分钟的30个循环，任选的另外的10至20个循环(在95℃下持续15秒，然后在64℃下持续1分钟(-1℃/循环))可以在端点分析期间提供更明显的群体分离)；最后的10℃循环。
实施例4：接合性分析
可以利用接合性分析来确定包含玉米MON 87419事件的植物对于该事件或野生型等位基因是否为杂合或纯合的。可以使用本文提供的序列信息来设计扩增反应分析。例如，这样的PCR分析将包括至少三种引物的设计：引物1、引物2和引物3，其中引物1特异于玉米MON 87419事件的3’侧翼上的玉米基因组DNA；引物2特异于玉米MON 87419事件的转基因插入物；且引物3特异于野生型等位基因。当在扩增反应中用作引物对时，引物1将与引物2一起产生特异于玉米MON 87419事件的PCR扩增子。当在扩增反应中用作引物对时，引物1将与引物3一起产生特异于野生型等位基因的PCR扩增子。在对玉米基因组DNA进行的PCR反应中，从(引物1+引物2)和(引物1+引物3)产生的相应的PCR扩增子将具有不同的扩增子序列和大小。当在PCR反应中包括三个引物以及从就玉米MON 87419事件而言纯合的植物提取的DNA时，将只产生引物1+引物2扩增子。当在PCR反应中包括三个引物以及从就玉米MON87419事件而言杂合的植物提取的DNA时，将产生引物1+引物2扩增子以及引物1+引物3扩增子两者。当在PCR反应中将三个引物与从就玉米MON 87419事件而言为空(即野生型)的植物提取的DNA混合在一起时，将只产生引物1+引物3扩增子。
用于测定玉米植物的针对玉米MON 87419事件的接合性的另一种方法是端点热扩增反应。对于这种类型的分析，除了上述引物之外，该分析还将包括两个荧光标记的探针。探针1将特异于玉米MON 87419事件，且探针2将特异于就玉米MON 87419事件而言为空(野生型)的玉米植物，并且其中这两个探针含有不同的荧光标记，例如6-FAMTM标记或VICTM标记。当在端点热扩增反应中使用引物1+引物2+探针1时，将产生特异于玉米MON87419事件的第一荧光信号。当在端点热扩增反应中使用引物1+引物3+探针2时，将产生特异于野生型玉米的第二荧光信号。当在端点热扩增反应中包括三个引物和两个探针以及从就玉米MON 87419事件而言纯合的植物提取的DNA时，将只产生第一荧光信号(特异于引物1+引物2+探针1)。当在端点热扩增反应中包括三个引物以及从就玉米MON 87419事件而言杂合的植物提取的DNA时，将产生第一荧光信号(特异于引物1+引物2+探针1)和第二荧光信号(特异于引物1+引物3+探针2)两者。当在端点热扩增反应中将三个引物与从就玉米MON87419事件而言为空(野生型)的植物提取的DNA混合在一起时，将只产生第二荧光信号(特异于引物1+引物3+探针2)。
用于测定植物的针对玉米MON 87419事件的接合性的另一种方法将是Southern分析。本领域技术人员将理解如何设计特异于玉米MON 87419事件的Southern杂交探针，以及特异于就玉米MON 87419事件而言为空(野生型)的玉米植物的第二southern杂交探针。利用Southern分析，只检测到来自第一Southern杂交探针的信号将指示就玉米MON 87419事件而言纯合的植物；检测到来自第一Southern杂交探针和第二Southern杂交探针两者的信号将指示就玉米MON 87419事件而言杂合的植物；且只检测到来自第二Southern杂交探针的信号将指示DNA是提取自就玉米MON 87419事件而言为空(野生型)的植物。

Claims (25)

1.一种重组DNA分子，其包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9和SEQ ID NO:10。
2.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA分子来自包含所述玉米MON 87419事件的转基因玉米植物或种子，包含所述事件的种子的代表性样品已被保藏为ATCC登录号PTA-120860。
3.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA分子是诊断来自所述玉米MON87419事件的DNA的存在的扩增子。
4.根据权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述DNA分子是在来自包含所述玉米MON87419事件的转基因玉米的玉米植物、细胞、种子、后代植物或植物部分中，包含所述事件的种子的代表性样品已被保藏为ATCC PTA-120860。
5.一种DNA分子，其包含SEQ ID NO:10的足够长度的连续DNA序列以用作DNA探针，所述DNA探针在严格杂交条件下与选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的组的DNA序列杂交，其中所述DNA分子在所述严格杂交条件下不与不包含选自由SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10组成的组的序列的DNA序列杂交，且其中所述DNA分子包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
6.一对DNA分子，其包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述第一DNA分子是SEQ IDNO:9的片段且所述第二DNA分子是所述玉米MON 87419事件的玉米基因组DNA的片段，并且其中所述第一和第二DNA分子各自包含足够长度的连续核苷酸的DNA序列以用作DNA引物，当与含有所述玉米MON 87419事件的DNA在扩增反应中一起使用时，所述DNA引物产生诊断样品中的所述玉米MON 87419事件的扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2。
7.一种检测DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与权利要求5所述的DNA分子接触；
b)使所述样品和所述DNA分子经受严格杂交条件；以及
c)检测所述DNA分子与所述样品中的靶标DNA分子的杂交，
其中所述DNA分子与所述靶标DNA分子的杂交表明所述DNA的样品中所述玉米MON87419事件的存在。
8.一种检测DNA的样品中玉米MON 87419事件的存在的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与权利要求6所述的DNA分子对接触；
b)进行足以产生包含选自由以下组成的组的序列的DNA扩增子的扩增反应：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8；以及
c)检测所述反应中所述DNA扩增子的存在，
其中所述反应中所述DNA扩增子的存在表明所述DNA的样品中所述玉米MON 87419事件的存在。
9.一种DNA检测试剂盒，其包括：
a)包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的DNA分子；或
b)一对DNA分子，其包含第一DNA分子和第二DNA分子，其中所述第一DNA分子是SEQ IDNO:9的片段且所述第二DNA分子是所述玉米MON 87419事件的所述玉米基因组DNA的片段，并且其中所述第一和第二DNA分子各自包含足够长度的连续核苷酸的DNA序列以用作DNA引物，当与含有所述玉米MON 87419事件的DNA在扩增反应中一起使用时，所述DNA引物产生诊断样品中的所述玉米MON 87419事件的扩增子，其中所述扩增子包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2。
10.一种转基因玉米植物、种子、细胞、植物部分或商业产品，其包含具有选自由以下组成的组的DNA序列的DNA分子：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
11.根据权利要求10所述的转基因玉米植物、种子或细胞，其中所述植物、种子或细胞耐受草铵膦或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂。
12.一种包含玉米MON 87419事件的转基因玉米植物、种子、细胞、植物部分或商业产品，包含所述事件的种子的代表性样品已被保藏为ATCC登录号PTA-120860。
13.根据权利要求12所述的转基因玉米植物或种子，其中所述玉米植物或种子是具有至少一个包含所述玉米MON 87419事件的亲本植物的杂种。
14.一种用于控制区域内的杂草的方法，其包括在区域内种植包含所述玉米MON 87419事件的转基因玉米并施用有效剂量的麦草畏、或草铵膦、或麦草畏和草铵膦除草剂以控制所述区域内的所述杂草而不伤害所述转基因玉米。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述有效剂量的草铵膦除草剂是在整个生长季节总计约0.1磅酸当量/英亩至约16磅酸当量/英亩的草铵膦除草剂。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述有效剂量的草铵膦除草剂是在整个生长季节总计约0.4磅酸当量/英亩至约1.59磅酸当量/英亩的草铵膦除草剂。
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述有效剂量的麦草畏除草剂是在整个生长季节总计约0.1磅酸当量/英亩至约16磅酸当量/英亩的麦草畏除草剂。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述有效剂量的麦草畏除草剂是在整个生长季节总计约0.5磅酸当量/英亩至约2磅酸当量/英亩的麦草畏除草剂。
19.一种产生耐受草铵膦和麦草畏除草剂的转基因玉米植物的方法，所述方法包括：
a)使包含所述玉米MON 87419事件的转基因玉米植物与自身或第二玉米植物有性杂交；
b)收集产生的所述种子；
c)使所述种子生长以产生后代植物；
d)用草铵膦、或麦草畏、或草铵膦和麦草畏除草剂处理所述后代植物；以及
e)选择耐受草铵膦和麦草畏除草剂的后代植物。
20.一种使耐受草铵膦和麦草畏除草剂的转基因玉米植物生长的方法，所述方法包括：
a)种植包含事件MON 87419的玉米种子；
b)允许植物从所述种子生长；以及
c)用草铵膦、或麦草畏、或麦草畏和草铵膦除草剂处理所述植物。
21.一种产生耐受草铵膦和麦草畏除草剂的施用的植物的方法，所述方法包括：
a)提供包含图1中所示的所述转基因插入物的DNA构建体；
b)将所述DNA构建体引入玉米植物细胞中；以及
c)使所述玉米植物细胞再生以产生玉米植物，使得所述植物耐受草铵膦和麦草畏除草剂的施用。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述转基因插入物包含SEQ ID NO:9。
23.根据权利要求21所述的方法，其中将所述DNA构建体引入所述玉米植物细胞中产生选自SEQ ID NO:1-8和10的序列作为所述玉米细胞的基因组的部分。
24.一种玉米植物，其通过权利要求21所述的方法产生。
25.一种权利要求24所述的玉米植物的后代植物、种子或部分。
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