CN1070500C - 甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽：合成和治疗骨质疏松症的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的合成多肽类似物，及其药学上可接受的盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂Laa

它们能用于预防和治疗哺乳动物的骨质疏松症。还提供了生产该多肽的固相合成方法和重组方法。

Description

甲状旁腺激素类似物和甲状旁腺激素相关肽：合成和治疗骨质疏松症的用途

                      发明背景

a)发明领域

本发明涉及新颖的甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关肽的类似物、它们的固相合成和重组技术、以及它们在哺乳动物中增加骨质的用途。

b)相关技术领域的描述

骨质疏松症是最常见的代谢性骨疾病形式，而且可以认为是骨丧失(骨质减少)的有症状的、断裂阶段。尽管骨质疏松症可以继发于许多原发性疾病出现，但是90％的病例是自发性的。绝经后的妇女尤其容易得自发性的骨质疏松症(绝经后或Ⅰ型骨质疏松症)。另一个自发性骨质疏松症的高发病组是高龄人(男性或女性)(老年性或Ⅱ型骨质疏松症)。已发现，骨质疏松症与下列情况有关：使用皮质类固醇、制动术或长期卧床休息、酗酒、糖尿病、对性腺有毒性的(go-nadotoxic)的化疗、血催乳素过多、神经性厌食症、原发性和继发性闭经、和卵巢切除。

在各种形式的骨质疏松症中，经常发生骨折，这是骨丧失达到机械性衰竭点所造成的结果。绝经后骨质疏松症的特征是腕部和脊柱的骨折，而股骨颈的骨折似乎是老年性骨质疏松症的主要特征。

骨质疏松症中骨丧失的机制认为是涉及骨骼自我更新过程的失调。该更新过程被称为骨重塑过程。该过程在一系列的各种活性袋中进行。这些袋似乎是作为骨吸收部位自发性地位于骨质中和一定的骨表面上。破骨细胞(骨溶解或吸收细胞)负责吸收一般恒定大小部分的骨质。该吸收过程之后是出现成骨细胞(骨形成细胞)，然后由新的骨质重新填满破骨细胞留下的孔隙。

在健康的成年人中，破骨细胞和成骨细胞的形成速度是使骨形成和骨吸收的过程处于平衡状态。然而，在骨质疏松症中由于骨重塑过程的不平衡导致骨丧失的速度快于骨形成速度。尽管在大多数人中随年龄增大都可能存在某种程度的失衡，但是在绝经后骨质疏松症或在卵巢切除后这种失衡严重得多，而且出现的年龄更小。

已经有许多治疗骨质疏松症方面的尝试以减慢进一步的骨丧失或者更合乎需要地使骨质有净增长。某些药剂，如雌激素和二磷酸盐，可以减缓骨质疏松症中骨质的进一步丧失。由于骨吸收和骨形成的时期不同，所以减缓骨丧失的药剂似乎可以增加骨质(约3-7％)。但是，这种表观增长受时间的限制，不是渐进的，而且是由于“重塑空间”的减少而造成的。此外，因为骨吸收和形成之间紧密相关，阻止骨吸收的治疗最终也会阻止骨形成。

已有人提出，用甲状旁腺激素(PTH)治疗可以促进骨周转并导致正钙平衡。但是，人体临床试验表明，小梁骨的任何增加被皮层骨(cortical bone)的减少所抵销，因此没有总骨质的净增长。

Hefti,et al．在Clinical Science 62,389-396(1982)中报道，给于正常的和患骨质疏松症的成年雌性大鼠每天皮下剂量的bPTH(1-84)或hPTH(1-34)可以增加全身的钙质和各种骨的灰重。

Liu,et al．在J.Bone Miner.Res.6:10,1071-1080(1991)中指出，成年雌性大鼠切除卵巢后会诱发近胫骨干骺端小梁骨丧失47％，同时伴有成骨细胞和小梁破骨细胞数目的明显增加。每天皮下注射hPTH(1-34)能够完全逆转小梁骨的丧失从而导致小梁骨的数量超过模拟操作的对照组。成骨细胞的数目增加而破骨细胞的数目下降。

Hock et al．在J.Bone Min.Res.7:1,65-71(1992)中报道，对健康雄性大鼠每天皮下注射hPTH(1-34)12天，导致小梁和皮层骨钙质和干重的增加。总骨质、小梁骨体积、小梁厚度和数目以及成骨细胞表面都增加了。

哺乳动物甲状旁腺激素，如人的(hPTH)、牛的(bPTH)和猪的(pTTH)，是具有84个氨基酸残基的单一多肽链，分子量约为9500。生物活性于N-末端部分有关，其中残基(1-34)明显是所需的最小长度。

人PTH的N-末端片段与牛和猪的激素的N-末端片段的不同之处分别只有3个和2个氨基酸残基：hPTH(1-34)Ser   Val   Ser   Glu   Ile   Gln   Leu   Met   His   Asn   Leu   Gly   Lys   His   Leu1                       5                             10                            15Asn   Ser   Met   Glu   Arg   Val   Glu   Trp   Leu   Arg    Lys   Lys   Leu   Gln  Asp

                    20                            25                            30Val   His   Asn   Phe   (SEQ ID NO:1)；bPTH(1-34):Ala   Val   Ser   Glu   Ile   Gln   Phe   Met   His   Asn   Leu   Gly   Lys   His   Leu1                       5                             10                            15Ser   Ser   Met   Glu   Arg   Val   Glu   Trp   Leu   Arg   Lys   Lys   Leu   Gln   Asp

                    20                            25                            30Val   His   Asn   Phe   (SEQ ID NO:2)；pPTH(1-34) :Ser   Val   Ser   Glu   Ile   Gln   Leu   Met   His   Asn   Leu   Gly   Lys   His   Leu1                       5                             10                            15Ser   Ser   Leu   Glu   Arg   Val   Glu   Trp   Leu   Arg   Lys   Lys   Leu   Gln   Asp

                    20                            25                            30Val   His   Asn   Phe   (SEQ ID NO:3)．

PTH的主要功能是引发适应性的变化，以维持胞外液中Ca²⁺的恒定浓度。PTH作用于肾脏，增加肾小管对尿中Ca²⁺的重吸收，并且刺激25-羟胆骨化醇转变成1,25-二羟胆骨化醇。该化合物负责Ca²⁺的小肠吸收。一个显著效果是促进骨中Ca²⁺的移动。PTH作用于骨时，增加Ca²⁺和磷酸盐的吸收。PTH刺激破骨细胞的骨吸收速度，增加间质细胞向破骨细胞的分化速度，以及延长破骨细胞的半衰期。由于PTH的延长作用，骨形成的成骨细胞的数目也增加；因此，提高了骨周转和重塑的速度。但是，各个成骨细胞的活性似乎低于正常细胞。

Rosenblatt,et al．在U.S．专利No.4,423,037,4,968,669和5,001,223中公开了通过缺失N-末端(1-6)氨基酸和选择性地置换Phe7,Met8,18，和Gly12而获得的PTH拮抗剂。据报道，Tyr34-NH₂可以增加这些化合物的活性和稳定性。

甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)，一种140多个氨基酸的蛋白质及其片段可模拟PTH的主要生物功能。PTHrp可以通过许多人和动物的肿瘤以及其他组织合成，它可在恶性高钙血症中发挥作用。hPTHrp(1-34)的序列如下：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Phe  Phe  Leu  His  His  Leu  Ile  Ala  Glu

           20                            25                       30Ile  His  Thr  Ala (SEQ ID NO:4)．

hPTH和hPTHrp之间的序列同源性主要局限于13个N-末端残基，其中8个是相同的；在hPTH的受体结合区域(25-34)中10个氨基酸中只有1个氨基酸在hPTHrp中是保守的。构象相似性可能是具有共同活性的原因。Cohen,et al．在J.Biol.Chem.266:3,1997-2004(1991)中指出，PTH(1-34)和PTHrp(1-34)的大部分序列，尤其是区域(5-18)和(21-34)，呈现α-螺旋构象。同时他还指出，该构象是否普遍存在于生理条件下羧基端还有疑问。这种二级结构对于脂类相互作用、受体相互作用和/或结构稳定性是至关重要的。

我们已经合成了PTH和PTHrp的类似物以便开发出改良的、用于包括患骨质疏松症的哺乳动物中恢复骨质的治疗剂。

                  发明概述

本发明提供甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的合成多肽类似物及其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(hy-drophilic amino acids,Haa)和亲脂氨基酸(lipophilic amino acids,Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)2Laa

当该序列类型的具体阐述性例子插入PTH,PTHrp，以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物时，获得的多肽是有效的骨重塑剂。

一方面，本发明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)的序列选自：a)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁶ Xaa⁹ Xaa¹⁰其中1                   5                       10Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自独立地为Leu或Ile；Xaa⁸是Ala,Arg，或Glu；和Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ ID NO:26)；b)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu Xaa⁸ Arg Leu其中1                  5                    10Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO：27)；c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

1                   5                        10e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30)．

1                   5                        10

另一方面，本发明提供具有下式结构的PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐：Xaa¹ Xaa² Xaa³ Xaa⁴ Xaa⁵ Xaa⁶ Xaa⁷ Leu His Xaa¹⁰ Xaa¹¹ Gly Xaa¹³Ser Ile Gln Xaa¹⁷ Leu Xaa¹⁹ Xaa²⁰ Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴Xaa³⁵ Xaa³⁶ Xaa³⁷ Xaa³⁸ Term,其中：Xaa¹缺失或是Ala；Xaa²缺失或是Val；Xaa³缺失或是Ser；Xaa⁴缺失或是Glu或Glu(OCH₃)；Xaa⁵缺失或是His或Ala；Xaa⁶缺失或是Gln；Xaa⁷缺失或是Leu；Xaa¹⁰和Xaa¹⁷各自独立地为Asp或Asp(OCH₃)；Xaa¹¹是Lys,Arg，或Leu；Xaa¹³是Lys,Arg,Tyr,Cys,Leu,Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(生物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙酰基)，或Lys(二氢肉桂酰基)；Xaa²⁰是Arg或Leu；Xaa¹⁹和Xaa²¹各自独立地为Lys,Ala，或Arg；Xaa^22-31选自(SEQ ID NOS:26,27,28,29，或30)；Xaa³²是His,Pro，或Lys；Xaa³³缺失，或是Pro,Thr,Glu，或Ala；Xaa³⁴缺失，或是Pro,Arg,Met,Ala,hSer,hSer内酯，Tyr,Leu,或1,4-二氨基丁酰内酰胺；Xaa³⁵缺失或是Pro,Glu,Ser,Ala，或Gly；Xaa³⁶缺失或是Ala,Arg，或Ile；Xaa³⁷缺失或是Arg,Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala；Xaa³⁸缺失或是Ala或hSer或Xaa38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；和Term是OR或NR₂其中每个R各自独立地为H,(C₁-C₄)烷基或苯基(C₁-C₄)烷基；及其药学上可接受的盐。

另一方面，本发明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自：a)  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Xaa  Lys  Leu其中

1                   5                        10Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO:26)；b)  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Xaa  Arg  Leu其中

1                    5                       10Xaa²⁹是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)；c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

1                   5                        10e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30)．

1                   5                        10

还提供了用于预防或治疗骨质减少状况的药物组合物，它包括与药学上可接受的载体以及骨质增加有效量的甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素相关肽(PTHrp)以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物及其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa．

还提供了制备药物组合物的方法，它包括将上述化合物与药学上可接受的载体相混合。

另外，本发明还提供了用于治疗哺乳动物骨质减少状况的方法，该方法包括向需要的哺乳动物施用骨质增加有效量的PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

             Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa

更具体地，本发明提供了用于治疗哺乳动物骨质减少状况的方法，该方法包括向需要的哺乳动物施用骨质增加有效量的PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自：SEQ ID NO:26,27,28,29，和30。

本发明还包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物，或多肽类似物的盐的固相合成方法，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa，该方法包括按次序将被保护的氨基酸偶连于合适的树脂载体，去除侧链和N^α-保护基团，以及将多肽从树脂上分开。

本发明还包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物或其盐的固相合成方法，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自：SEQ ID NO:26,27,28,29，和30。该方法包括按次序将被保护的氨基酸偶连于合适的树脂载体，去除侧链和N^α-保护基团，以及将多肽从树脂上分开。

还包括PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物或其盐的的重组合成方法，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自按下列序列排列的亲水氨基酸(Haa)和亲脂氨基酸(Laa)：

Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa

本发明还包括用于重组合成这种多肽类似物的DNA序列、载体和质粒。具体地，本发明提供了用于重组合成PTH、PTHrp以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的多肽类似物或其盐的DNA序列、载体和质粒，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自：SEQ ID NO:26,27,28,29,和30。

                      附图简述

图1为编码本发明的PTHrp(1-34)类似物的合成基因的DNA序列和限制性酶切位点(hPTH PCR扩增图)。

图2概括了整合有PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的制备(Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1构建图)。

图3概括了整合有两个拷贝PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的制备(Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2构建图)。

图4概括了整合有4个拷贝PTHrp(1-34)类似物基因的质粒的制备(Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4构建图)。

                    发明详述

缩写和定义

对于各种常见核苷酸碱基和氨基酸的单字符和三字符缩写按Pure Appl.Chem.31,639-645(1972)和40,277-290(1974)中所建议的而且符合37 CFR§1.822(55FR 18245,1990年5月1日)和PCT规则(WIPO Standard ST.23:Recommendation forthe Presentation of Nucleotide and Amino Acid Sequences inPatent APPlications and in Published Patent Documents)。单字符和三字符缩写如下：氨基酸缩写

       氨基酸             三字符    单字符

       丙氨酸              Ala         A

       精氨酸              Arg         R

       门冬酰胺            Asn         N

       门冬氨酸            Asp         D

       Asn+Asp             Asx         B

       半胱氨酸            Cys         C

       谷氨酰胺            Gln         Q

       谷氨酸              Glu         E

       Gln+Glu             Glx         Z

       甘氨酸              Gly         G

组氨酸             His           H

异亮氨酸           Ile           I

亮氨酸             Leu           L

赖氨酸             Lys           K

甲硫氨酸           Met           M

苯丙氨酸           Phe           F

脯氨酸             Pro           P

丝氨酸             Ser           S

苏氨酸             Thr           T

色氨酸             Trp           W

酪氨酸             Tyr           Y

缬氨酸             Val           V缩写代表L-氨基酸，除非另外用D-或D,L-标明。某些天然和非天然氨基酸如甘氨酸是非手性的。所有肽序列的表示方法都是N-端氨基酸位于左边和C-端氨基酸位于右边。

此处所用的其他氨基酸和化合物的缩写如下：

hSer        高丝氨酸

hSerlac     高丝氨酸内酯

Nle         正亮氨酸

PEG2        二乙二醇甲基醚的残基，又称甲氧基二(乙烯氧

           基)，CH₃O(CH₂CH₂O)₂-，(分子量=119)

PEG5000     聚(乙二醇甲基醚)的残基，又称甲氧基聚(乙烯

           氧基)，CH₃O(CH₂CH₂O)₁₁₀-，(平均分子量

           =5000)

PEGX        聚(乙二醇甲基醚)的残基，CH₃O

           (CH₂CH₂O)_n-9,n=2-225，(平均分子量

           =100-10,000)

“亲水氨基酸(Haa)”指除了形成肽键所需的基团之外，具有至少一个亲水官能团的氨基酸，例如精氨酸、门冬酰胺、门冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、及其同系物。

“亲脂氨基酸(Laa)”指不带电荷的、脂族或芳族氨基酸，例如异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、及其同系物。

在本发明中，丙氨酸被归为“两性氨基酸”，即它既可以用作亲水氨基酸也可以用作亲脂氨基酸。

“PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物”指具有小于在PTH或PTHrp发现的全长的氨基酸对应序列、但是能够引发类似的生理应答的多肽。截短的PTH或PTHrp不必与PTH或PTHrp完全同源才能引发类似的生理应答。PTH(1-34)和PTHrp(1-34)是该组别中的优选例子但不排除其他例子。

“两亲性α-螺旋”指氨基酸采取α-螺旋构型的某些多肽所表现的二级结构，其中沿着螺旋的长轴具有相对的极性和非极性面。在感兴趣的多肽中存在α-螺旋结构的可能性在某种程度上可以通过构建具有合适螺距的“Schiffer-Edmundson轮”(M.Schiffer和A.B.Edmundson,Biophys.J.7,121(1967))，和观察亲水和亲脂残基是否分开位于与螺旋外切的圆柱体的相对面而进行探测。或者，也可通过获得的经验证据例如园二色性或X射线衍射数据表明在给定的多肽中存在α-螺旋区域。理想的α-螺旋每圈具有3.6个氨基酸，其中相邻侧链分开100度。Eisenberg et al．在Nature 299:371-374(1982)和Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81:140-144(1984)中将疏水性数值和螺旋结合，以定量确定两亲性螺旋的概念。平均疏水矩被定义为构成螺旋的各组成氨基酸疏水性的矢量和。Eisen-berg(1984)将下列氨基酸的疏水性作为“一致性”的标度：Ile 0.73；    Phe 0.61；    Val 0.54；    Leu 0.53；    Trp 0.37；Met 0.26；    Ala 0.25；    Gly 0.16；    Cys 0.04；    Tyr 0.02；Pro-0.07；    Thr-0.18；    Ser-0.26；    His-0.40；    Glu-0.62；Asn-0.64；    Gln-0.69；    Asp-0.72；    Lys-1.10；    Arg-1.76。

对于每圈具有3.6个残基(即侧链间隔100弧度=(360°/3.6))的理想α-螺旋的疏水矩_μH，可以用下式进行计算：

μH=[(ΣH_Nsinδ(N-1))2+(ΣH_Ncosδ(N-1))2]^1/2，其中，H_N是N_th氨基酸的疏水性值，而和为在频率δ=100°的序列中N个氨基酸的和。疏水矩可以用μ_H除以N而获得的商<μ_H>表示为每个残基的平均疏水矩。在100°±20°范围内<μ_H>值为约0.20或更大就表示存在两亲性螺旋。对于hPTHrp(22-31)和hPTH(22-31),100°的<μ_H>值分别为0.19和0.37。

Cornett,et al.，在J.Mol.Biol.,195:659-685(1987)中进一步扩展了两亲性α-螺旋的研究，引入了作为两亲性预报因子的“两亲性指数”。他们得出结论，约有一半所有已知的α-螺旋是两亲性的，而且主要频率为97.5°而不是100°，每圈的残基数目更接近3.7而不是3.6。尽管这种精确程度在科学上是令人感兴趣的，但是Eisenberg等人的基本方法已经足够用于确定给定的序列是否是两亲性的，尤其当人们从头开始设计序列以形成两亲性α-螺旋时。

取代的两亲性α-螺旋氨基酸序列可以不与天然存在的多肽的给定片段序列同源，但是在生理状态下应具有类似的二级结构，即具有相对的极性和非极性面的α-螺旋。用其他序列置换天然存在的氨基酸序列对于改变的母体多肽的生理活性、稳定性或其他性能可能产生有利的影响。在J.L.Krstenansky,et al.,FEBS Letters 242:2,409-413(1989)，和J.P.Segrest,et al.Proteins:Structure,Function，和Genetics 8:103-117(1990)等中有设计和选择这种序列方面的指导。

本发明的10个氨基酸的两亲性α-螺旋具有下式：

           Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa其中，Haa选自如上所述亲水氨基酸，而Laa选自上述亲脂氨基酸。假定理想的α-螺旋，残基1,4,5,8，和9分布于螺旋的一个面(A)上，相互之间约140°之内，而残基2,3,6,7，和10则占据螺旋的另一面(B)的140°。较佳地，位于同一面的所有残基都是相同极性的，而位于另一面的所有残基都是相反极性的，即如果A面都是亲水性的，那么B面都是亲脂性的，反之亦然。熟练技术人员知道，尽管本发明的螺旋是用

             Haa(Laa Laa Haa Haa)₂ Laa表示的，但是相反序列

             Laa(Haa Haa Laa Laa)₂ Haa也符合残基分布标准，因此是本发明的螺旋的另一种等同的描述方式。

丙氨酸可以取代亲水氨基酸或亲脂氨基酸，因为丙氨酸可以毫无困难地位于两亲性α-螺旋的任何一面，尽管Ala₁₀不能形成两亲性α-螺旋。一般情况下，不使用脯氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；在序列中它们的存在和其他随机错误是可以容忍的，例如在亲脂面存在亲水残基，只要片段中的其余氨基酸基本上符合亲水-亲脂面的划分。用于确定某一序列是否具有足够的两亲性从而可成为本发明的序列的简便方法是如上所述计算其平均疏水矩。如果在100°±20°范围中每个残基的平均矩峰值超过约0.20，那么该序列会形成两亲性螺旋即为本发明的序列。

例如，对于SEQ ID NO:26,Xaa=Glu,100°处每个残基的平均疏水矩的计算如下：A.A.H_N         δ(N-1)  H sinδ(N-1)    H cosδ(N-1)E    -.62   0      0       -.62L    .53    100    .52     -.17L    .53    200    -.18    -.50E    -.62   300    .34     -.31K    -1.1   400    -.70    -.85L    .53    500    .34     -.41L    .53    600    -.46    -.27E    -.62   700    .21     -.58K    -1.1   800    -1.08   -.19L    .53    900    0       -.53

              ∑=0.81 Σ=-4.43

μ_H=[(0.81)²+(-4.43)²]^1/2=4.50

    <μ_H>=4.50/10=0.45

对于该序列，平均疏水矩的峰值出现在92°，其值为0.48。

将此概念应用于甲状旁腺激素和甲状旁腺激素相关肽时，可以假设区域(7-16)和(22-31)中的一个区域或两个区域是具有α-螺旋二级结构的，并且可以用具有类似结构倾向的非同源序列置换而不会丧失生物活性或诱导免疫反应的性能。优选例子

一方面，本发明提供PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐，其中氨基酸残基(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)序列选自：a)  Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰其中

1                  5                       10Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自独立地为Leu或Ile；Xaa⁸是Ala,Arg，或Glu；和Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ ID NO:26)；b)  Xaa¹  Xaa²  Leu  Xaa⁴  Arg  Leu  Leu  Xaa⁸  Arg  Leu    其中

1                      5                         10Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)；c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

 1                  5                        10e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30).

1                   5                        10

另一方面，本发明提供具有下式结构的PTH、PTHrp、以及PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物的类似物或其盐：Xaa¹ Xaa² Xaa³ Xaa⁴ Xaa⁵ Xaa⁶ Xaa⁷ Leu His Xaa¹⁰ Xaa¹¹ Gly Xaa¹³Ser Ile Gln Xaa¹⁷ Leu Xaa¹⁹ Xaa²⁰ Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴Xaa³⁵ Xaa³⁶ Xaa³⁷ Xaa³⁸ Term，其中：Xaa¹缺失或是Ala；Xaa²缺失或是Val；Xaa³缺失或是Ser；Xaa⁴缺失或是Glu或Glu(OCH₃)；Xaa⁵缺失或是His或Ala；Xaa⁶缺失或是Gln；Xaa⁷缺失或是Leu；Xaa¹⁰和Xaa¹⁷各自独立地为Asp或Asp(OCH₃)；Xaa¹¹是Lys,Arg，或Leu；Xaa¹³是Lys,Arg,Tyr,Cys,Leu,Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(生物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙酰基)，或Lys(二氢肉桂酰基)；Xaa²⁰是Arg或Leu；Xaa¹⁹和Xaa²¹各自独立地为Lys,Ala，或Arg；Xaa^22-31选自(SEQ ID NOS:26,27,28,29，或30)；Xaa³²是His,Pro，或Lys；Xaa³³缺失，或是Pro,Thr,Glu，或Ala；Xaa³⁴缺失，或是Pro,Arg,Met,Ala,hSer,hSer内酯，Tyr,Leu，或1,4-二氨基丁酰内酰胺；Xaa³⁵缺失或是Pro,Glu,Ser,Ala，或Gly；Xaa³⁶缺失或是Ala,Arg，或Ile；Xaa³⁷缺失或是Arg,Trp，或3-(-2-萘基)-L-Ala；Xaa³⁸缺失或是Ala或hSer或Xaa^38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；和Term是OR或NR₂其中各R各自独立地为H,(C₁-C₄)烷基或苯基(C₁-C₄)烷基；及其药学上可接受的盐。

另一方面，本发明包括如式(Ⅰ)所示的、具有生理活性的hPTHrp(1-34)短同系物的多肽类似物：Ala  Val  Ser  Glu  Xaa⁵  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Xaa¹¹  Gly  Xaa¹³  Ser  IleGln  Asp  Leu  Xaa¹⁹  Arg  Xaa²¹  Xaa^22-31  Xaa³²  Xaa³³  Xaa³⁴  Term，其中：Xaa⁵是His或Ala；Xaa¹¹和Xaa¹³各自独立地为Lys,Arg，或Leu；Xaa¹⁹和Xaa²¹各自独立地为Ala或Arg；Xaa^22-31选自：a)  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Xaa  Lys  Leu其中

1                   5                        10Xaa是Glu或Arg(SEQ ID NO:26)；b)  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Xaa  Arg  Leu其中

1                   5                        10Xaa是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)；c)  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  (SEQ ID NO:28)；

1                   5                        10d)  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  (SEQ ID NO:29)；

1                   5                        10e)  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys  Leu  (SEQ ID NO:30)；

1                   5                        10Xaa³²是His或Lys；Xaa³³是Thr,Glu，或Ala；Xaa³⁴是Ala,hSer,Tyr，或Leu；和Term是Gly Arg Arg，内酯，OH或NR₂，其中各R是H或(C₁-C₄)烷基；及其药学上可接受的盐(式Ⅰ)。

本发明的另一个具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:26)的式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μ_H>超过0.45。本发明的一个更具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:26)、Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys、和Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg的式(Ⅰ)多肽。

代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Arg  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  OH   (SEQ ID NO:5);Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:6)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:7)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  hSer  NH2  (SEQ ID NO:8)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  hSerlac      (SEQ ID NO:9)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  Gly  Arg  Arg  OH  (SEQ ID NO:10)；和35Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  lle1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                    25                    30Leu  Lys  Glu  Leu  NH₂  (SEQ ID NO:11).

本发明的又一个方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:26)、Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys、以及Xaa¹⁹和Xaa²¹中一个为Arg而另一个为Ala的式(Ⅰ)多肽。该亚类的代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Ala  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:12)和Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Ala  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  NH₂  (SEQ ID NO:13).

本发明的另一个具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:26)、Xaa¹¹和Xaa¹³中一个为Leu而另一个为Lys、和Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg的式(Ⅰ)多肽。该亚类的代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  Ala  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Leu  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Ala  Leu  OH  (SEQ ID NO:14).

本发明的另一个具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:27)的式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μ_H>超过0.50。本发明的进一步方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:27)、Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys或都是Arg、和Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg的式(Ⅰ)多肽。该亚类代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Glu  Arg

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:15)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Glu  Arg

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:16)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu  Lys  Arg

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:17)；Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu

                20                       25Lys(COCH:PEG2)      Arg  Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:18);和

                30Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Arg  Gly  Arg  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Arg  Leu  Leu

                20                       25Lys(COCH:PEG5000)        Arg  Leu  His  Thr  Ala  OH  (SEQ ID NO:19).

                     30

本发明的另一个具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:28)的式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μ_H>约为0.25。该亚类代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala  Leu  Ala  Glu  Ala

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:20).

本发明的另一个具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:29)的式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μ_H>约为0.28。该亚类代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser  Leu  Leu  Ser  Ser

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  NH  (SEQ ID NO:21).

本发明的另一个具体方面包括Xaa^22-31是(SEQ ID NO:30)的式(Ⅰ)多肽，这些多肽在100°的<μ_H>约为0.29。该亚类代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  His  Gln  Leu  Leu  His  Asp  Lys  Gly  Lys  Ser  Ile1                   5                        10                       15Gln  Asp  Leu  Arg  Arg  Arg  Ala  Phe  Tyr  Asp  Lys  Val  Ala  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Thr  Ala  NH2  (SEQ ID NO:22).

本发明的又一个方面包括如式(Ⅱ)所示的、具有生理活性的bPTH(1-34)短同系物的多肽类似物：Xaa¹ Val Ser Glu Ile Gln Xaa⁷ Xaa⁸ His Asn Leu Gly Lys His LeuXaa¹⁵ Ser Xaa¹⁸ Xaa¹⁹ Arg Xaa²¹ Xaa^22-31 His Asn Xaa³⁴ Term，其中：Xaa¹是Ser或Ala；Xaa⁷是Leu或Phe；Xaa⁸是Met或Nle；Xaa¹⁶是Asn或Ser；Xaa¹⁸是Leu,Met，或Nle；Xaa¹⁹是Glu或Arg；Xaa²¹是Val或Arg；Xaa^22-31选自(SEQ ID NO:26,27,28,29，和30)；Xaa³⁴是Phe或Tyr；Term是OH或NR₂，其中每个R是H或(C₁-C₄)烷基；及其药学上可接受的盐(式Ⅱ)。代表性的多肽包括，但并不限于：Ala  Val  Ser  Glu  Ile  Gln  Phe  Nle  His  Asn  Leu  Gly  Lys  His  Leu1                   5                        10                       15Ser  Ser  Nle  Glu  Arg  Val  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Asn  Tyr  NHz  (SEQ ID NO:23)和Ala  Val  Ser  Glu  Ile  Gln  Phe  Nle  His  Asn  Leu  Gly  Lys  His  Leu1                   5                        10                       15Ser  Ser  Nle  Arg  Arg  Arg  Glu  Leu  Leu  Glu  Lys  Leu  Leu  Glu  Lys

                20                       25                       30Leu  His  Asn  Tyr  NH2  (SEQ ID NO:24).

在本发明的又一方面，惊奇地发现，少于34个氨基酸的PTH和PTHrp的同系物和类似物也是有效的骨重塑剂。这些化合物具有下列通式：Ala Val Ser Glu Xaa⁵ Gln Leu Leu His Asp Xaa¹¹ Gly Xaa¹³ Ser IleGln Asp Leu Xaa¹⁹ Arg Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³ Xaa³⁴Term，代表性的多肽包括，但并不限于：化合物41:AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEKLHP-NH2(SEQ ID NO:55)物理数据m.p.142.8-166.1℃[α]²⁵ _D-53.80(c 0.38,H₂O)FAB(C₁₇₃H₂₉₅N₅₅O₉):[M+H]⁺3929AAA:AsX2.0(2)Glx5.7(6)Ser1.8(2)

His3.0(3)Gly1.1(1)Ala0.9(1)

Arg2.8(3)Val1.2(1)Ile0.9(1)

Leu7.4(8)Lys4.4(4)Pro0.9(1)化合物42:AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH2(SEQ ID NO:56)物理数据m.p.161.0-177.0℃[α]²⁵ _D-61.97(c 0.19,H₂O)FAB(C₁₆₇H₈₈N₅₂O₄₈):[M+H]⁺3792.0AAA:Asx2.2(2)Glx5.9(6)Serl.9(2)

His2.1(2)Gly1.1(1)Ala1.0(1)

Arg3.0(3)Val1.1(1)Ile1.0(1)

Leu7.9(8)Lys4.3(4)Pro0.9(1)

熟练技术人员知道，可以合成大量多肽类似物的改变形式。这些改变形式具有此处所述的类似物的有用性能，只要将在100°±20°范围内每个残基的平均疏水矩大于约0.20的氨基酸序列插入位置(22-31)。多肽的经典合成

本发明的多肽可以用例如下列方法合成：J.M.Stewart和J.D.Young,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.,PierceChemical Co.,Rockford,Illinois(1 984)和J.Meienhofer,Hor-monal Proteins and Peptides,Vol.2,Academic Press,NewYork,(1973)等的固相合成以及E.Schroder和K.Lubke,ThePeptides,Vol.l,Academic Press,New York,(1965)等的溶液合成。

一般，这些方法涉及向合成中的肽链依次添加被保护的氨基酸。通常，第一个氨基酸的氨基或羧基以及所有反应性的侧链都被保护。接着将保护的氨基酸连于惰性固体载体，或者用于溶液，然后在适合形成酰胺键的条件下加入被适当保护的序列中的下一个氨基酸。在所有所需的氨基酸都以适当的序列相连之后，除去保护基团和固体载体从而得到粗多肽。该多肽经脱盐和纯化(最好是通过色谱法)，从而获得最终产品。

一种制备小于约40个氨基酸的、具有生理活性的短多肽的优选方法是固相多肽合成。在该方法中，α-氨基酸(N^α)官能团和任何反应性的侧链都用酸敏或碱敏(acid-or base-sensitive)基团保护。保护基团在形成肽键的条件下应是稳定的，同时又能被毫无困难地除去而不影响已形成的多肽链。合适的α-氨基保护基团包括，但并不限于：叔-丁氧基羰基(Boc)、苄氧基羰基(Cbz)、邻-氯苄氧基羰基、二苯基异丙氧基羰基、叔-戊氧基羰基(Amoc)、异冰片氧基(isoborny-loxy)羰基、α,α-二甲基-3、5-二甲氧基苄氧基-羰基、邻-硝基苯基亚磺酰基(nitrophenylsulfenyl)、2-氰基-叔-丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)等，优选叔-丁氧基羰基(Boc)。合适的侧链保护基团包括，但并不限于：乙酰基、苄基(Bzl)、苄氧基甲基(Bom)、邻-溴苄氧基羰基、叔-丁基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、2-氯苄基(Cl-z)、2,6-二氯苄基、环己基、环戊基、异丙基、新戊酰基、四氢吡喃-2-基、甲苯磺酰基(Tos)、三甲基甲硅烷基、和三苯甲基。

在固相合成中，C-末端氨基酸被首先连于合适的树脂载体。合适的树脂载体是那些对逐步的缩合反应和去保护反应中的试剂和反应条件呈惰性、而且不溶于所用介质。可商购的树脂的例子包括用活性基团改性的苯乙烯/二乙烯基苯树脂，例如氯甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)、羟甲基化的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)等。优选苄基化的、羟甲基化的苯基乙酰胺甲基(PAM)树脂。当化合物的C末端为酰胺时，优选的树脂是对-甲基二苯甲基氨基-共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂。

可以通过在乙醇、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等中作为铵盐、铯盐、三乙基铵盐、1,5-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-5-烯，四甲基铵盐或类似盐(最好是位于DMF中的铯盐)的N^a保护的氨基酸，优选Boc-氨基酸，与树脂在高温如约40-60℃，较佳为约50℃下反应约12-72小时，较佳约48小时，而将其连于PAM树脂。

可以在如二氯甲烷或二甲基甲酰胺，较佳为二氯甲烷之类的溶剂中，通过如N,N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)/l-羟基苯并三唑(HOBt)介导的偶连反应，在约10-50℃，较佳为约25℃，反应约2-24小时，较佳为约2小时而将N^a-Boc-氨基酸连于二苯甲基胺树脂。

随后的受保护氨基酸的连续偶连可以用本领域熟知的方法进行，典型地是通过自动肽合成仪。在用三乙胺或类似的碱中和之后，较佳地是加入约1.5-2.5倍摩尔过量的每种保护氨基酸，并且偶连反应是在惰性的、非水性的、极性溶剂如二氯甲烷、DMF或其化合物(优选二氯甲烷)中于室温下进行。代表性的偶连剂是N,N′-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N,N′-二异丙基碳化二亚胺(DIC)或其他碳化二亚胺，它们可以单独使用或者在1-羟基苯并三唑(HOBt)、O-酰基脲、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧代三(吡咯烷基)-鏻(PyBop)、N-羟基琥珀酰亚胺、其他N-羟基酰亚胺或肟存在下使用。也可以使用受保护的氨基酸的活性酯(例如对-硝基苯基，五氟苯基等)或对称的酸酐。

在固相合成的最后，将全保护的肽从树脂上除去。当与树脂载体相连的键是苄酯类型时，对于具有烷基酰胺C-末端的肽，可以用烷基胺或氟代烷基胺进行氨解反应而达到裂解；对于具有未取代的酰胺C-末端的肽，可以用例如氨/甲醇或氨/乙醇进行氨解反应而达到裂解，这些反应可以在约-10℃和50℃之间，较佳为约25℃下进行约12-24小时，较佳为约18℃。具有羟基C-末端的肽可以用HF裂解切断或用其他强酸性去保护方式或者通过皂化反应而裂解。或者，可以通过转酯化从树脂上除去肽，例如用甲醇进行转酯化，然后再通过氨解或皂化而进行。被保护的肽可以通过硅胶色谱法纯化。

可以使用下列方法将侧链保护基团从肽上去除：用例如无水液态氟化氢在苯甲醚或其他碳鎓离子清除剂存在下处理氨解产物，用氟化氢/吡啶复合物进行处理，用三(三氟乙酰基)硼和三氟乙酸进行处理，用氢气和碳上的钯或聚乙烯基吡咯烷酮进行还原，或者用液态氨中的钠进行还原，最好是用液态氟化氢和苯甲醚处理。这些反应是在约-10℃和10℃之间，较佳约0℃进行约15分钟至2小时，较佳为约1.5小时。

对于在二苯甲基胺树脂上的肽，从树脂上裂解反应和去保护步骤可以用上述的液态氟化氢和苯甲醚合并为一个步骤。

溶液可以脱盐(例如用BioRad AG-3^_阴离子交换树脂)，而肽可以用下列方法中一种或几种进行一系列的色谱步骤而得以纯化：在弱碱性乙酸盐形式树脂上进行离子交换；在非衍生型的共聚(苯乙烯-二乙烯基苯)例如Amberlite^_XAD上进行疏水吸附色谱；硅胶吸附色谱；在羧甲基纤维素上进行离子交换色谱；在例如Sephadex^_G-25上进行分配色谱；逆流分配；或高效液相色谱(HPLC)，尤其是在辛基-或十八烷基甲硅烷基氧化硅(ODS)键合相柱上的反向高效液相色谱。

因此，本发明另一方面涉及制备多肽及其药学上可接受的盐的方法，这些方法包括在合适的树脂载体上依次缩合保护的氨基酸，去除保护基团和树脂载体，以及纯化产物从而获得PTH和PTHrp具有生理活性的短同系物和类似物、尤其是H(1-34)和PTHrp(1-34)的类似物，其中位于位置(22-31)的氨基酸形成如上所述的两亲性α-螺旋肽序列。多肽的重组合成

另外，本发明的多肽的制备也可以通过对所需多肽的编码基因进行克隆和表达。在该方法中，制备含有所需DNA序列的质粒，然后将其插入合适的宿主微生物，典型地为细菌如大肠杆菌，或酵母如酿酒酵母。诱导宿主微生物产生多拷贝的质粒以及多拷贝的本发明多肽类似物的编码cDNA。

首先，设计选定PTH or PTHrp的合成基因编码，用简便的限制性酶切位点来协助随后的改变。可以使用Mullis在U.S.专利No.4,683,195 and 4,683,202中所述的聚合酶链反应(PCR)来扩展序列。

然后分离扩展的合成基因并将其连于合适的质粒，例如Trp LE质粒，在该质粒中可以串联式地插入4个拷贝的基因。Trp LE质粒的制备在美国专利No.4,738,921以及欧洲专利出版物No.0212532中有描述。Trp LE质粒通常比Trp E质粒产生8-10多倍的蛋白质。然后多拷贝基因可以在合适的宿主中如大肠杆菌或酿酒酵母中进行表达。

在此处使用的具体表达载体是含有下列单元的Trp LE18 Prot(Ile3,Pro5)：含有氨苄青霉素抗性基因和复制质粒起点的pBR322片段(EcoRⅠ-BamHⅠ)；含有trp启动子和trpE基因的EcoRⅠ-SacⅡ片段；HIV蛋白酶(Ile3,Pro5)基因片段(SacⅡ-HindⅢ)；bGRF基因片段(HindⅢ-BamHⅠ)；和来自大肠杆菌rpoc基因的转录终止子。HIV蛋白酶和bGRF基因片段不是至关重要的，如果需要可以被其他编码序列替换。

表达的融合蛋白多聚体在细胞内稳定的包涵体中积聚，可以通过离心将其与其他细胞蛋白质分开。分离的然后蛋白质被转变成单体PTH or PTHrp类似物，并且可以用阳离子交换和/或反向HPLC进行纯化。

对于熟练的技术人员而言，其他的克隆、扩展、表达和纯化方法是显而易见的。代表性的方法公开于Maniatis,et al.,MolecularCloning,A LaboratoryManual,2nd Ed.,Cold Spring HarborLaboratory(1989)中。应用和施用

本发明的多肽能用于预防和治疗各种哺乳动物骨质丧失症状。尤其，已表明本发明的化合物能用于预防和作为治疗剂治疗人的骨质疏松症和骨质减少。

通常，本发明的多肽或其盐的施用量为每天约0.002-1微克/千克体重，较佳为每天约0.04-0.2微克/千克体重。对于一个50千克体重的女性，每天的活性成分剂量为约0.1-50微克，较佳为约2.0-10微克。对于其他的哺乳动物，例如马、狗、和牛，需要更高的剂量。该剂量可以以常规的药物组合物形式，按需要通过单次施用、通过多次施用或者通过控释形式而供药从而达到最佳的药效，其中较佳的是每天注射一次或多次。

确切剂量和组合物以及最佳给药方案的选择受许多因素的影响，特别是：选定多肽的药理性质、待治疗的病症的性质和严重程度以及病人的身体状况和精神敏度(mental acuity)。

代表性的给药方案包括：口服、胃肠外给药(包括皮下、肌内和静脉注射)、直肠给药、口腔给药(包括舌下给药)、肺部给药、经皮和鼻内给药。

药学上可接受的盐保留了原多肽的有用的生物活性而不产生毒副作用。这种盐的例子是：(a)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、单宁酸、双羟萘酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等形成的盐；(b)与多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或与N,N′-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形成的碱加成盐；或(c)(a)和(b)的结合形式如单宁酸锌盐等。

本发明的另一方面涉及药物组合物，它们含有本发明的多肽、或其药学上可接受的盐作为活性组份以及药学上可接受的、无毒的载体。如上所述，制备的此组合物可以用于胃肠外给药(皮下、肌内和静脉注射)，尤其是以液态溶液或混悬液形式；用于口服或口腔给药，尤其是以片剂或胶囊剂聚形式；用于肺和鼻内给药，尤其是以粉剂、滴鼻剂或气雾剂形式；以及用于直肠或经皮给药。

组合物可以方便地以单元剂量形式施用，而且可以用制药领域中任何熟知的方法进行制备，例如在Remington′s PharmaceuticalSciences,17th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA.,(1985)中所述的方法。对于胃肠外给药的处方，可以含有无菌水或生理盐水、亚烷基二醇(alkylene glycols)如丙二醇、聚亚烷二醇如聚乙二醇、植物油、氢化萘等作为赋形剂。对于口服给药，处方可以通过添加胆盐或酰基肉碱增加药效。用于鼻内给药的制剂可以是固体的并且含有赋形剂例如乳糖或葡聚糖，或者可以是水性或油性溶液以滴鼻剂或计量喷雾剂的形式施用。对于口腔给药，典型的赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶凝淀粉等。

当为鼻内给药进行配制时，可以通过添加酸性表面活性剂例如谷氨胆酸、胆酸、牛磺胆酸、乙胆酸(ethocholic acid)、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、脱氢胆酸、谷氨脱氧胆酸、环糊精等增加鼻粘膜吸收，添加量约为0.2-15重量百分比，较佳为约0.5-4重量百分比，最佳为约2重量百分比。

通过含有足够量有效成分的控释系统(对于所需释放时期而言)单次给药，可以在长时间内例如一周至一年中将本发明的化合物供给服药者。各种控释系统例如单层或储库型微囊、储库型植入剂、渗透泵、囊泡、胶囊、脂质体、透皮贴剂，离子电渗器以及其他注射剂型都可以用于该目的。将施用局限于需要活性组份的部位是某些控释给药器的另一特征，对于治疗某些疾病这是有利的。

一种控释制剂是将多肽或其盐分散或包裹于缓慢降解的、无毒的、非抗原性的聚合物如共聚(乳酸/乙醇酸)中，如在Kent,Lewis,Sanders，和Tice的美国专利4,675,189中开创性的工作中所述的那样。也可以将化合物或更佳其相对不溶的盐配制入胆固醇或其他脂类基质小丸中，或硅塑料基质植入剂中。其他的缓释剂、储库型植入剂或可注射制剂是熟练技术人员所熟知的。参见例如，Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinsoned.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978，和R.W.Baker,Controlled Release of Biologically Active Agents,John Wiley＆Sons,New York,1987。

下列的具体实施例是用于阐述本发明代表性化合物的合成和测试，它们并不用于限制本发明的范围。在实施例中，“m.p.”表示熔点，“[α]25D”是在25℃时，在所示溶剂、给定浓度下的旋光度，“FAB”是快原子轰击质谱，和“AAA”是氨基酸分析，其中在测量值后括号中的是预期值。氨基酸分析在Hewlett-Packard AminoQuant Ana-lyzer上按照制造商建议的方案进行。一级氨基酸用邻苯二醛进行衍生，二级氨基酸用Fmoc进行衍生。对衍生氨基酸进行荧光检测定量分析。被保护的氨基酸得自Applied Biosystems Inc.(Foster City,CA)。

实施例Ⅰ采用固相合成方法，在4-甲基二苯甲基胺树脂上，用AppliedBiosystems Model 430A肽自动合成仪合成0.5mmol左右的化合物1(SEQ ID NO:7)。α-氨基用叔丁基羰基(Boc)保护。侧链保护基团如下：对Asp,Glu,and Ser用苄基(Bzl)；对Arg用甲苯磺酰基(Tos)；对His用苄氧基甲基(Bom)；对Lys用2-氯苄基(Cl-z)。按Stewart和Young(出处如上)的方法，用N,N-二环己基碳化二亚胺(DCC)/1-羟基苯并三唑(HOBt)将这些氨基酸依次相连。将每个氨基酸偶连之后，用乙酸酐和二异丙基乙胺在N-甲基吡咯烷酮中的混合物使肽乙酰化。用无水HF(25mL)在苯甲醚存在下，在-10℃处理30分钟和0℃处理60分钟，从而将合成的肽从树脂上裂解并且同时脱去侧链保护基团。真空蒸去HF之后，用无水醚洗涤残留物，粗肽用10％乙酸进行萃取。将10％乙酸萃取物冻干，得到900毫克粗产品。用中等压力的ODS反向柱色谱，采用0.1％TFA中22-45％CH₃CN梯度纯化肽。产品被洗脱出3个部分，浓缩和冻干后，得到130毫克，纯度＞98％的白色固体。

                        化合物1

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-NH2(SEQ ID NO:7)物理数据：m.p.150-159℃[α]²⁵ _D-34.88*(c0.16,H₂O)FAB(C₁₇₅H₃₀₀N₅₆O₅₁):[M+H]+4005.5AAA:Asp,1.9(2)；Glu,5.6(6)；Ser,1.6(2)；His,2.7(3)；Gly,1.0(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.8(3)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.3(8)；Lys,4.0(4).

类似地，制备化合物2,5-18，和21-70，并确定这些化合物的特性。其中对于合成末端为羟基的多肽，按需要替换PAM树脂。

                     化合物2

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTA-OH(SEQ ID NO:6)物理数据：m.p.154-170℃    [α]²⁵ _D-49.35°(c0.46,H₂O)FAB(C₁₇₅H₃₀₁N₅₇O₅₀):[M+H]⁺4005.0AAA:Asp,2.1(2)；Glu,5.9(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Glyl.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,3.0(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.8(8)；Lys,4.2(4).

                         化合物5

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO:15)物理数据：m.p.147-165℃[α]²⁵ _D49.17°(c0.66,H₂O)FAB(C₁₇₅H₂₉₉N₅₉O₅₂):[M+H]⁺4061AAA:Asp,2.1(2)；Gly,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,5.0(5)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.7(8)；Lys,1.9(2).

                         化合物6

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLERLHTA-OH(SEQ ID NO:16)物理数据：m.p.150-170℃    [α]²⁵ _D-48.65°(c0.54,H₂O)FAB(C₁₇₅H₂₉₉N₆₃O₅₂):[M+H]⁺4118.0AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.2(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,6.9(7)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.8(8).

                         化合物7

AVSEHQLLHDRGRSIQDLRRRELLERLLKRLHTA-OH(SEQ ID NO:17)物理数据：m.p.177-182℃    [α]²⁵ _D-46.17°(c0.14,H₂O)FAB(C₁₇₆H₃₀₄N₆₀O₅₀):[M+H]⁺4117AAA:Asp,2.0(2)；Glu,4.8(5)；Ser,1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,6.7(7)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Lys,7.7(8)；Lys,0.9(1).

                          化合物8

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLRKLHTA-OH(SEQ ID NO:5)物理数据：m.p.147-165℃    [α]²⁵ _D-49.17°(c0.66,H₂O)FAB(C₁₇₆H₃₀₅N₅₉O₄₉):[M+H]⁺4033.0AAA:Asp,2.0(2)；Glu,4.8(5)；Ser,1.8(2)；His,2.7(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.9(4)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.9(8)；Lys,4.0(4).

                            化合物9

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTAGRR-OHSEQ ID NO:10)物理数据：m.p.158-160℃    [α]²⁵ _D-44.76°(c0.1,H₂O)FAB(C₁₈₉H₃₂₆N₆₄O₅₅):[M]⁺4375.0AAA:Asp,2.0(2)；Glu,5.9(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,2.3(2)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,5.0(5)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.8(8)；Lys,4.3(4).

                         化合物10

AVSEAQLLHDLGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHAL-OH(SEQ ID NO:14)物理数据：m.p.170-175℃    [α]²⁵ _D-31.59°(c0.54,H₂O)FAB(C¹⁷⁴H³⁰⁰N⁵²O⁵¹):[M+H]⁺3936.0AAA:Asp,2.0(2)；Glu,6.0(6)；Ser,1.8(2)；His,2.0(2)；Gly,1.2(1)；Ala,3.0(3)；

Arg,2.8(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.9(10)；Lys,3.0(3).

                        化合物11

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLELLKEL-NH₂(SEQ ID NO:11)物理数据：m.p.172-174℃    [α]²⁵ _D-43.29°(c0.2,H₂O)FAB(C₁₇₉H₃₁₁N₅₅O₅₂):[M+H]⁺4065.8AAA:Asp,2.2(2)；Glu,7.7(7)；Ser,1.7(2)；His,2.0(2)；Gly,1.0(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.3(9)；Lys,5.1(5).

                     化合物12AVSEIQFXHNLGKHLSSXERVELLEKLLEKLHNY-NH₂(X=Nle,SEQ ID NO:23)物理数据：m.p.178℃    [α]²⁵ _D-36.88°(c0.4,H₂O)FAB(C₁₈₂H₂₉₅N₅₀O₅₁):[M+H]⁺4001.6AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.5(6)；Ser,2.7(3)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,1.0(1)；Tyr,0.8(1)；Val,2.0(2)；Phe,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu+Nle,

8.5(7+2)；Lys,3.1(3).

                               化合物13AVSEIQFXHNLGKHLSSXRRRELLEKLLEKLHNY-NH₂(X=Nle,SEQ ID NO:24)物理数据：m.p.260℃    [α]²⁵ _D-37.02°(c0.2,H₂O)FAB(C₁₈₄H₃₀₄N₅₆O₄₉):[M+H]⁺4084AAA:Asp,2.1(2)；Glu,5.5(5)；Ser,2.6(3)；His,3.1(3)；Ala,1.0(1)；Gly,1.1(1)；

Arg,3.2(3)；Tyr,1.0(1)；Val,1.0(1)；Phe,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.0(9)；

Lys,3.0(3).

                        化合物14

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRALAEALAEALHTA-NH₂(SEQ ID NO:20)物理数据：m.p.190-225℃    [α]²⁵ _D-56.58°(c0.36,H₂O)FAB(C₁₆₁H₂₇₂N₅₄O₄₉):[M+H]⁺3747.0AAA:Asp,2.1(2)；Glu,4.9(5)；Ser,1.7(2)；His,2.6(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；Ala,7.6(7)；Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,6.6(6)；Lys,1.9(2).

                              化合物15

AVSEHQLLHDKGKSIQDLARRELLEKLLEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO:12)物理数据：m.p.170-180℃    [α]²⁵ _D-48.19°(c0.2,H₂O)FAB(C₁₇₂H₂₉₃N₅₃O₅₁):[M+H]⁺3919.0AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.7(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,3.0(3)；Arg,2.1(2)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.4(4).

                              化合物16

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRAELLEKLLEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO:13)物理数据：m.p.190-195℃    [α]²⁵ _D-50.50°(c0.4,H₂O)FAB(C₁₇₂H₂₉₃N₅₃O₅₁):[M+H]⁺3919.0AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.0(6)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,3.0(3)；Arg,2.1(2)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.5(8)；Lys,4.2(4).

                        化合物17

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRSLLSSLLSSLHTA-NH₂(SEQ ID NO:21)物理数据：m.p.195-204℃    [α]²⁵ _D-67.11°(c0.3,H₂O)FAB(C₁₆₃H₂₈₀N₅₄O₅₀):[M+H]⁺3796.0AAA:Asp,2.1(2)；Glu,2.9(3)；Ser,6.8(7)；His,3.1(3)；Gly,1.2(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.0(3)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.2(8)；Lys,2.0(2).

                           化合物18

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRAFYDKVAEKLHTA-NH₂(SEQ ID NO:22)物理数据：m.p.200-207℃    [α]²⁵ _D-60.26°(c0.6,H₂O)FAB(C₁₇₄H₂₈₄N₅₆O₅₀):[M+H]⁺3960.0AAA:Asp,2.9(3),Glu,3.5(4)；Ser,1.4(2)；His,2.6(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,4.0(4)；Arg,3.0(3)；Tyr,0.9(1)；Val,1.9(2)；Phe,1.1(1)；Ile,0.9(1)；

Leu,3.6(4)；Lys,4.1(4).

                         化合物21

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNY-NH₂(SEQ ID NO:35)物理数据：m.p.148-155℃    [α]²⁵ _D-45.97(c0.26,H₂O)FAB(C₁₈₄H₃₀₄N₅₆O₄₉):[M+H]⁺4084AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.0(5)；Ser,2.7(3)；His,3.0(3)；Gly,1.0(1)；Ala,0.9(1)；

Arg,3.1(3)；Tyr,0.9(1)；Val,1.0(1)；Phe,0.9(1)；Ile,0.9(1)；Leu 9.3(9)；

Lys,3.2(3).

                          化合物22

AVSEIQFLHN LGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH₂(SEQ ID NO:36)

                          (X=高丝氨酸)物理数据：m.p.69.4-128℃    [α]²⁵ _D-43.93(c0.15,H₂O)FAB(C₁₇₉H₃₀₂N₅₆O₄₉):[M+H]⁺4022.9AAA:Asx,2.0(2)；Glx,4.9(5)；Ser,2.6(3)；His,2.8(3)；Gly,1.0(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,3.0(3)；Val,1.0(1)；Phe,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.8(9)；Lys,3.4(3)；

                            化合物23

AVSEIQFLHN KGKHLSSLRR RELLEKLLEK LHNX-NH₂(SEQ ID NO:37)

                        (X=高丝氨酸)物理数据：m.p.87.1-142.1℃    [α]²⁵ _D-52.14(c0.41,H₂O)FAB(C₁₇₉H₃₀₃N₅₇O₄₉):[M+H]⁺4038AAA:Asx,2.1(2)；Glx,4.9(5)；Ser,2.7(3)；His,2.8(3)；Gly,1.0(1)；

hSer,1.0(1)；Ala,1.0(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Phe,0.9(1)；

Ile,0.9(1)；Leu,7.9(8)；Lys,3.7(4).

                      化合物24

AVSEHQLLHD KGKSIQDLKL KELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:38)物理数据：m.p.175-182℃    [α]²⁵ _D-49.99(c0.47,H₂O)FAB(C₁₇₅H₂₉₉N₄₉O₅₁):[M+H]⁺3906.5AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.5(6)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,9.1(9)；Lys,6.5(6).

                           化合物25

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTA-NH₂(SEQ ID NO:39)物理数据：m.p.136.5-153.5℃    [α]²⁵ _D-32.57(c0.13,H₂O)FAB(C₁₇₅H₃₀₀N₆₀O₅₁):[M+H]⁺4060.8AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.2(6)；Ser,1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,5.2(5)；Val,1.1(1)；Ile,1.1(1)；Leu,8.4(8)；Lys,2.2(2).

                         化合物26

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAP-OH(SEQ ID NO:40)物理数据：m.p.125.8-127.2℃    [α]²⁵ _D-54.62(c0.23,H₂O)FAB(C₁₈₀H₃₀₆N₆₀O₅₃):[M+H]⁺4158.0AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.2(6)；Ser,1.8(2)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,5.1(5)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Lys,2.1(2)；

Pro,1.1(1).

                        化合物27AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRR-OH(SEQ ID NO:41)物理数据：m.p.106-137.3℃    [α]²⁵ _D-39.55(c0.67,H₂O)FAB(C₁₈₉H₃₂₆N₆₈O₅₅):[M+H]⁺4430.5AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.6(2)；His,2.7(3)；Gly,2.2(2)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.8(2)；Arg,7.3(7)；Val,0.8(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,2.1(2).

                         化合物28AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRX-NH₂(SEQ ID NO:42)

                          (X=高丝氨酸)物理数据：m.p.80℃    [α]²⁵ _D-48.64(c0.09,H₂O)FAB(C₁₉₃H₃₃₄N₇₀O₅₆):[M+H]⁺4530.0AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.1(6)；Ser,1.7(2)；His,3.0(3)；Gly,1.9(2)；

hSer,1.0(1)；Thr,1.0(1)；Ala,2.1(2)；Arg,7.2(7)；Val,0.8(1)；

Ile,1.0(1)；Leu,8.4(8)；Lys,2.1(2).

                   化合物29

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTY-NH₂(SEQ ID NO:43)物理数据:m.p.160-172℃    [α]²⁵ _D-49.85(c0.34,H₂O)FAB(C₁₈₁H₃₀₄N₅₆O₅₂):[M+H]⁺4096.9AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,1.7(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,3.0(3)；Tyr,0.9(1)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.7(8)；

Lys,4.4(4).

                         化合物30

AVSEHQLLHD KGYSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:44)物理数据:m.p.130-171℃    [α]²⁵ _D-40.65(c0.34,H₂O)FAB(C₁₇₈H₂₉₇N₅₅O₅₂):[M+H]⁺4039.4AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.5(6)；Ser,1.8(2)；His,3.4(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,2.9(3)；Tyr,0.8(1)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.9(8)；

Lys,3.4(3).

                       化合物31

AVSEHQLLHD KG℃SIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:45)物理数据：m.p.140-160℃    [α]²⁵ _D-44.48(c0.25,H₂O)FAB(C₁₇₂H₂₉₃N₅₅O₅₁S₁):[M+H]⁺3979AAA:Asx+Cys,3.0(2+1)；Glx,5.6(6)；Ser,1.7(2)；His,3.0(3)；Gly,1.0(1)；

Thr,0.9(1)；Ala,1.9(2)；Arg,2.5(3)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；

Lys,3.3(3).

                     化合物32

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:46)

           (X=Cys(CH₂ONH(CH₂)₂NH(生物素基)))物理数据：m.p.(未测出)    [α]²⁵ _D(未测出)FAB(C₁₈₆H₃₁₆N₅₉O₅₄S₂):[M+H]⁺4306.6AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.8(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.3(3)；Lys,3.3(3),

                          化合物33

AVSEHQLLHD KGXSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:47)

(X=Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1｜苯并吡喃-4-乙酰基))物理数据：m.p.135-205℃    1][α]²⁵ _D-26.92(c 0.104,50％HOAc水溶液)FAB(C₁₈₈H₃₁₁N₅₇O₅₄):[M+H]⁺4233AAA:Asx,1.9(2)；Glx,6.3(6)；Ser,1.7(2)；His,3.2(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.1(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.2(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.2(8)；Lys,4.5(4).

                        化合物34

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAG-OH(SEQ ID NO:48)物理数据：m.p.92.1-146.6℃    [α]²⁵ _D-40.76(c0.34,H₂O)FAB(C₁₇₇Hc₃₀₂N₅₆O₅₃):[M+H]⁺4062.0AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.7(6)；Ser,1.8(2)；His,3.0(3)；Gly,2.2(2)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,4.2(4).

                     化合物35

AVSXHQLLHZ KGKSIQZLRR RXLLXKLLXK LHA-OH(SEQ ID NO:49)

               (X=Glu(OCH₃)；Z=Asp(OCH₃))物理数据：m.p.(未测出)    [α]²⁵ _D-21.96(c0.132,H₂O)FAB(C₁₈₁H₃₁₁N₅₅O₅₂):[M+H]⁺4089.0AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.3(6)；Ser,1.8(2)；His,3.3(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.2(4).

                    化合物36

AVSXHQLLHZ KGKSIQZLRR RXLLXKLLXK LHA-OCH₃(SEQ ID NO:50)

(X=Glu(OCH₃)；Z=Asp(OZCH₃))物理数据：m.p.(未测出)    [α]²⁵ _D-46.80(c0.07,H₂O)FAB(C₁₈₂H₃₁₃N₅₅O₅₂):[M+H]⁺4103AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.2(6)；Ser,1.4(2)；His,3.0(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.1(1)；

Ala,1.7(2)；Arg,3.2(3)；Val,0.6(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.1(4).

                        化合物37

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-OH(SEQ ID NO:51)

                      (X=高丝氨酸)物理数据：m.p.(未测出)    [α]²⁵ _D(未测出)FAB(C₁₇₆H₃₀₁N₅₅O₅₃):[M+H]⁺4035.1AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.9(6)；Ser,2.0(2)；His,3.1(3)；Gly,0.8(1)；

hSer,0.8(1)；Thr,1.0(1)；Ala,1.0(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.3(1)；

Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,3.8(4).

                  化合物38

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAP-OH(SEQ ID NO:52)物理数据：m.p.152.1-186.5℃    [α]²⁵ _D-55.91(c0.33,H₂O)FAB(C₁₈₀H₃₀₆N₅₆O₅₃):[M+H]⁺4102.6AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.9(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.7(8)；Lys,4.3(4).

                    化合物39

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-OH(SEQ ID NO:53)物理数据：m.p.120-148.2℃    [α]²⁵ _D-52.78(c0.47,H₂O)FAB(C₁₇₇H₃₀₁N₅₅O₅₂):[M+H]⁺4031.0AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.5(6)；Ser,1.8(2)；His,2.9(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,2.9(3)；Val,1.2(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,3.6(3)；

Pro,0.9(1).

                       化合物40

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTP-NH₂(SEQ ID NO:54)物理数据：m.p.133.9-155.1℃    [α]²⁵ _D-54.22(c0.37,H₂O)FAB(C₁₇₇H₃₀₂N₅₆O₅₁):[M+H]⁺4030.7AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,1.9(2)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,1.1(1)；Leu,7.8(8)；Lys,4.2(4)；

Pro,0.9(1).

                            化合物41

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHP-NH₂(SEQ ID NO:55)物理数据：m.p.142.8-166.1℃    [α]²⁵ _D-53.80(c0.38,H₂O)FAB(C₁₇₃H₂₉₅N₅₅O₄₉):[M+H]⁺3929AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.7(6)；Ser,1.8(2)；His,3.0(3)；Gly,1.1(1)；Ala,0.9(1)；

Arg,2.8(3)；Val,1.2(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.4(8)；Lys,4.4(4)；Pro,0.9(1).

                    化合物42

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LP-NH₂(SEQ ID NO:56)物理数据：m.p.161.0-177.0℃    [α]²⁵ _D-61.97(c0.19,H₂O)FAB(C₁₆₇H₂₈₈N₅₂O₄₈):[M+H]⁺3792.0AAA:Asx,2.2(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.9(2)；His,2.1(2)；Gly,1.1(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.9(8)；Lys,4.3(4)；Pro,0.9(1).

                    化合物43AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-OH(SEQ ID NO:57)物理数据：m.p.181-202℃    [α]²⁵ _D-45.14(c0.19,H₂O)FAB(C₁₉₅H₃₂₆N₆₂O₅₆):[M+H]⁺4435.2AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.8(6)；Ser,2.8(3)；His,2.8(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,3.7(4)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,4.3(4)；Trp,0.9(1).

                      化合物44

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQID NO:58)物理数据：m.p.130-132.2℃    [α]²⁵ _D-46.66(c0.195,H₂O)FAB(C₂₁₆H₃₆₅N₈₁O₆₂):[M+H]⁺5088.8AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.0(6)；Ser,2.7(3)；His,3.0(3)；Gly,2.2(2)；Thr,2.1

(2)；Ala,3.0(3)；Arg,10.5(10)；Val,0.9(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.2(8)；Trp,

1.0(1).

                          化合物45

AVSEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-NH₂(SEQ ID NO:59)物理数据：m.p.158-174℃    [α]²⁵ _D-43.57(c0.53,H₂O)FAB(C₂₁₆H₃₆₅N₈₂O₆₁):[M+H]⁺5087.4AAA:Asx,1.9(2)；Glx,5.6(6)；Ser,2.6(3)；His,3.3(3)；Gly,2.1(2)；Thr,2.0(2)；

Ala,2.9(3)；Arg,10.1(10)；Val,0.9(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.3(8)；Trp1.1(1).

                    化合物46

AVSEHQLLHD RGXSIQDLRR RELLERLLER LHTAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO:60)

                      (X=Lys(二氢肉桂酰基))物理数据：m.p.165.4-175.2℃    [α]²⁵ _D-40.43(c0.20,H₂O)FAB(C₂₂₅H₃₇₄N₈₀O₆₂):[M+H]⁺5191AAA:Asx,2.1(2),Glx,6.3(6)；Ser,2.8(3)；His,3.2(3)；Gly,2.1(2),Thr,2.0

(2)；Ala,3.2(3)；Arg,9.9(9)；Val,1.0(1),Ile,0.9(1)；Leu,8.6(8)；Lys,1.1

(1)；Trp,1.1(1).

                    化合物47

AVSEIQFXHN LGKHLSSXTR SAWLRKKLQD VHNY-NH₂(SEQ ID NO:61)

                    (X=正亮氨酸)物理数据：m.p.140-160℃    [α]²⁵ _D-56.88(c0.16,H₂O)FAB(C₁₈₀H₂₈₇N₅₆O₅₈)；[M+H]⁺3989.8AAA:Asx,3.0(3)；Glx,2.9(3)；Ser,3.7(4)；His,2.8(3)；Gly,1.1(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.9(2)；Arg,2.0(2)；Tyr,1.0(1)；Val,1.7(2)；Phe,0.9(1)；Ile,0.9(1)；

Leu+Nle5.8(2+4)；Lys,3.4(3)；Trp,1.1(1).

                    化合物48

AVSEHQLLHD KGKSJQDLRR RELLSEKLLEK LHTMA-NH₂(SEQ ID NO:62)物理数据：m.p.140-210℃    [α]²⁵ _D-47.75(c0.178,H₂O)FAB(C₁₈₀H₃₀₉N₅₇O₅₂S₁):[M+H]⁺4135.0AAA:Asx,2.3(2)；Glx,6.6(6)；Ser,1.4(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,0.9(1)；Met,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.8(8)；

Lys,4.4(4).

                          化合物49

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX(SEQ ID NO:63)

                    (X=1,4-二氨基丁内酰胺)物理数据：m.p.161-181℃    [α]²⁵ _D-48.38(c0.25,H₂O)FAB(C₁₇₆H₃₀₀N₅₆O₅₁):[M+H]⁺4016.8AAA:Asx,2.1(2)；Glx,6.3(6)；Ser,1.7(2)；His,3.3(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,2.9(3)；Val,0.9(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,3.8(4)

                      化合物50

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RFFLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:64)物理数据：m.p.136.5-156.8℃    [α]²⁵ _D-49.89(c0.24,H₂O)FAB(C₁₈₂H₃₀₀N₅₆O₄₉):[M+H]⁺4056.0AAA:Asx,2.2(2)；Glx,5.0(5)；Ser,1.9(2)；His,3.3(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.0(1)；Phe,2.0(2)；Ile,0.9(1)；Leu,7.2(7)；

Lys,3.5(4).

                          化合物51

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLHKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:65)物理数据：m.p.80.7-141.0℃    [α]²⁵ _D-55.38(c0.23,H₂O)FAB(C₁₇₆H₃₀₀N₅₈O₄₉):[M+H]⁺4012.8AAA:Asx,2.2(2)；Glx,4.9(5)；Ser,1.8(2)；His,4.3(4)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)：

Ala,2.0(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,3.9(4).

                    化合物52

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEHLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:66)物理数据：m.p.134.3-157.9℃    [α]²⁵ _D-50.72(c0.45,H₂O)FAB(C₁₇₅H₂₉₅N₅₇O₅₁):[M+H]⁺4012.8AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.8(2)；His,4.2(4)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.0(2)；Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.1(8)；Lys,3.1(3).

                            化合物53

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLIAK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:67)物理数据：m.p.142.7-159.8℃    [α]²⁵ _D-54.01(c0.21,H₂O)FAB(C₁₇₃H₂₉₈N₅₆O₄₉):[M+H]⁺3946.0AAA:Asx,2.2(2)；Glx,4.9(5)；Ser,1.8(2)；His,3.1(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,3.1(3)；Arg,3.1(3):Val,1.0(1)；Ile,1.9(2)；Leu,7.0(7)；Lys,4.3(4).

                      化合物54

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEE 1HTA-NH₂(SEQ ID NO:68)物理数据：m.p.138-185℃    [α]²⁵ _D-50.17(c0.14,H₂O)FAB(C₁₇₄H₂₉₅N₅₅O₅₃):[M+H]⁺4005AAA:Asx,2.2(2)；Glx,7.1(7)；Ser,1.7(2)；His,2.8(3)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,2.1(2)；Arg,3.1(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.7(2)；Leu,7.1(7)；Lys,2.7(3).

                    化合物55AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH₂CH₃(SEQ ID NO:69)

                    (X=高丝氨酸)物理数据：m.p.(未测出)    [α]²⁵ _D(未测出)FAB(C₁₇₈H₃₀₆N₅₆O₅₂):[M+H]⁺4063.0AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.8(6)；Ser,1.7(2)；His,3.1(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.0(1);

Ala,0.9(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.4(8)；Lys,3.7(4)；

hSer,0.9(1).

                         化合物56

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTX-NHCH₂CH₂C₆H₅(SEQID NO:70)

                    (X=高丝氨酸)物理数据：m.p.(未测出)    [α]²⁵ _D(未测出)FAB(C₁₈₄H₃₁₀N₅₆O₅₂):[M+H]⁺4138.8AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.9(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,0.9(1)；Arg,3.0(3)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.1(4)；

hSer,0.9(1).

                      化合物57

物理数据：m.p.142.5-163.5℃    [α]²⁵ _D-34.31(c0.17,H₂O)FAB(C₁₇₅H₂₉₈N₅₆O₅₀):[M+H]⁺3986.4AAA:Asx,1.9(2)；Glx,5.9(6)；Ser.1.8(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,3.0(3)；Thr,1.0(1):Val,1.1(1)；1le,0.9(1)；Leu,8.0(8)；Lys,4.0(4).

                  化合物58AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAW-NH₂(SEQ ID NO:72)物理数据：m.p.158-163℃    [α]²⁵D-46.06(c0.17,H₂O)FAB(C₁₉₅H₃₂₇N₆₃O₅₅):[M+H]⁺4434.8AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.5(6)；Ser,2.7(3)；His,3.1(3)；Gly,1.0(1)；Ala,1.8(2)；

Arg,4.0(4)；Thr,0.9(1)；Val,0.9(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.5(8)；Lys,3.9

(4)；Trp,1.0(1).

                  化合物59AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTRSAX-OH(SEQ ID NO:73)

            (X=Nal(2)=3-(2-萘基)-L-丙氨酸)物理数据：m.p.156-162℃    [α]²⁵ _D-44.44(c0.189,H₂O)FAB(C₁₉₇H₃₂₈N₆₂O₅₅):[M+H]⁺4445.6AAA:Asx,2.1(2)；Glx,5.5(6)；Ser,2.8(3)；His,2.9(3)；Gly,1.0(1);Ala,2.0(2)；

Arg,4.0(4)；Thr,0.9(1)；Val,1.0(1)；Ile,0.9(1)；Leu.7.5(8)；Lys,4.2(4)；

Nal,1.1(1).

                    化合物60AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTASAW-OH(SEQ ID NO:74)物理数据：m.p.159-164℃    [α]²⁵ _D-50.94(c0.29,H₂O)FAB(C₁₉₂H₃₂₀N₆₀O₅₅):[M+H]⁺4349.0AAA:Asx,2.0(2)；Glx,5.6(6)；Ser,2.7(3)；His,3.2(3)；Gly,1.0(1)；Ala,3.1(3)；

Arg,2.8(3)；Thr,1.0(1)；Val,1.1(1)；Ile,0.9(1)；Leu,7.6(8)；Lys,4.0(4)；

Trp,1.0(1).

                        化合物61AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIRA-OH(SEQ ID NO:75)物理数据：m.p.155-210℃    [α]²⁵ _D-46.15(c0.12,H₂O)FAB(C₁₉₅H₃₃₄N₆₂O₅₈):[M+H]⁺4475.8AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.9(7)；Ser,1.7(2)；His,3.2(3)；Gly,1.1(1)；Ala,3.1(3)；

Arg,4.0(4)；Thr,0.9(1)；Val,1.1(1)；Ile,1.9(2)；Leu,8.1(8)；Lys,4.1(4).

                      化合物62

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEIR-OH(SEQ ID NO:76)物理数据：m.p.186-218℃    [α]²⁵ _D-52.73(c0.265,H₂O)FAB(C₁₉₂H₃₂₉N₆₁O₅₇):[M+H]⁺4404.4AAA:Asx,2.0(2)；Glx,6.6(7)；Ser,1.9(2)；His,3.4(3)；Gly,1.1(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,3.8(4)；Thr,1.0(1)；Val,1.1(1)；Ile,1.7(2)；Leu,7.9(8)；Lys,4.0(4).

                         化合物63AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAEI-OH(SEQ ID NO:77)物理数据：m.p.169-205℃    [α]²⁵ _D-50.78(c0.51,H₂O)FAB(C₁₈₆H₃₁₇N₅₇O₅₆):[M+H]⁺4248.0AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.8(7)；Ser,1.8(2)；His,3.3(3):Gly,1.0(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,3.0(3)；Thr,1.0(1)；Val,1.0(1)；Ile,1.8(2)；Leu,7.8(8)；Lys,3.6(4).

                   化合物64

AVSEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTAE-OH(SEQ ID NO:78)物理数据：m.p.199-205℃    [α]²⁵ _D-52.47(c0.41,H₂O)FAB(C₁₈₀H₃₀₆N₅₆O₅₅):[M+H]⁺4135.0AAA:Asx,2.0(2)；Glx,6.6(7)；Ser,1.9(2)；His,3.3(3)；Gly,1.1(1)；Ala,2.0(2)；

Arg,2.9(3)；Thr,1.0(1)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.2(8)；Lys,3.8(4).

                      化合物65

AVSEIQFX₁HN KGKHLSSX₁ER VEWLRKKLQD VHNX₂(SEQ ID NO:79)

               (X₁=L-正亮氨酸；X₂=高丝氧酸内酯)物理数据：m.p.166-176℃    [α]²⁵ _D-52.22(c0.25,H₂O)FAB(C₁₈₀H₂₈₈N₅₄O₅₀):[M+H]⁺4008.6AAA:Asx,3.1(3)；Glx,4.8(5)；Ser,2.9(3)；His,2.9(3)；Gly,1.1(1)；Ala,1.1(1)；

Arg,2.0(2)；Val,2.7(3)；Phe,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu+Nle 5.9(4+2)；

Lys,2.8(3).

                      化合物66

SEHQLLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:80)物理数据：m.p.134.2℃    [α]²⁵ _D-48.12(c0.36,H₂O)FAB(C₁₆₇H₂₈₆N₅₄O₄₉):[M+H]⁺3834.4AAA；Asx,2.0(2)；Glx,5.7(6)；Ser,1.7(2)；His,2.9(3)；Gly,1.0(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.0(1)；Arg,2.8(3)；Ile,0.9(1)；Leu,7.4(8)；Lys,4.3(4).

                     化合物67

LLHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:81)物理数据：m.p.128.5-184.5℃    [α]²⁵ _D-6.53(c0.69,MeOH)FAB(C₁₄₈H₂₅₉N₄₇O₄₁):[M+H]⁺3353AAA:Asx,2.0(2)；Glx,4.1(4)；Ser,0.9(1)；His,2.1(2)；Gly,1.0(1)；Thr,0.9(1)；

Ala,1.0(1)；Arg,3.0(3)；Ile,1.0(1)；Leu,8.1(8)；Lys,4.2(4).

                     化合物68

LHD KGKSIQDLRR RELLEKLLEK LHTA-NH₂(SEQ ID NO:82)物理数据：m.p.165-210℃    [α]²⁵ _D-36.05(c0.12,H₂O)FAB(C₁₄₂H₂₄₈N₄₆O₄₀):[M+H]⁺3239.0AAA:Asx,2.0(2)；Glx,3.9(4)；Ser,0.9(1)；His,1.9(2)；Gly,1.0(1)；Thr,1.0(1)；

Ala,1.0(1)；Arg,2.9(3)；Ile,0.9(1)；Leu,6.8(7)；Lys,4.2(4).

                        化合物69SEHQLLHD RGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRTRSAW-OH(SEQ ID NO:83)物理数据：m.p.150-210℃    [α]²⁵ _D-18.0(c0.64,H₂O)FAB(C₂₀₈H₃₅₁N₇₉O₆₀):[M+H]⁺4918.6AAA:Asx,2.2(2)；Glx,6.2(6)；Ser,2.8(3)；His,3.1(3)；Gly,2.2(2)；Thr,2.2

(2)；Ala,2.2(2)；Arg,10.4(10)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Trp,1.1(1).

                    化合物70

LLHDRGRSIQDLRR RELLERLLER LHAGRRT RSAW-OH(SEQ ID NO:84)物理数据：m.p.150-210℃    [α]²⁵ _D-41.70(c0.36,H₂O)FAB(C₁₈₉H₃₂₄N₇₂O₅₂):[M+H]⁺4437.14AAA:Asx,2.1(2)；Glx,4.1(4)；Ser,1.9(2)；His,2.0(2)；Gly,2.1(2)；Thr,2.0(2)；

Ala,2.1(2)；Arg,9.7(10)；Ile,0.9(1)；Leu,7.4(8).

                   实施例Ⅱ

按照实施例Ⅰ的步骤制备和纯化[Met³⁴,Ala³⁵]化合物1,AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK-LLEKLHTMA-NH₂,(SEQ ID NO:25)。并用如下方法将该多肽转变成高丝氨酸内酯。将纯化的肽(160毫克)溶解于44％甲酸(4毫升)中。将该溶液于0℃与预先混合的、溴化氰(700毫克)和苯酚(1.6毫克)在44％甲酸(4毫升)的溶液合并。溶液在0℃搅拌2小时,然后在室温下搅拌2小时。产物的形成用HPLC(Vydac^_C-18,300埃，4.6×250mm，流速1.2mL/min,0.1％TFA中梯度为25-45％乙腈，10分钟)监测。反应在4小时内完成。一半样品被浓缩并且用制备性RP-HPLC(Vydac^_C-18,0.1％TFA中梯度为25-45％乙腈)。收集高丝氨酸内酯肽部分并冻干，得到28毫克纯度＞95％的白色固体，即化合物4。

                          化合物4

AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEK LLEKLHTX(X=hSerlac,SEQ ID NO:9)物理数据：m.p.138-142℃    [α]²⁵ _D-50.66°(c0.1,H₂O)FAB(C₁₇₆H₂₉₉N₅₅O₅₂):[M+H]⁺4017.61AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.8(2)；His,3.0(3)；

Thr,1.1(1)；Ala,1.1(1)；Arg,2.7(3)；Val,1.0(1)；Ile,

1.0(1)；Leu,8.2(8)；Lys,3.8(4)；Gly1.09(1)；hSer,

1.09(1).

                   实施例Ⅲ

为了制备高丝氨酸酰胺，浓缩粗高丝氨酸内酯(hSerlac)类似物化合物4，然后用25毫升饱和NH₃的甲醇溶液处理。溶液在0℃搅拌2小时，然后在室温下搅拌16小时。反应用HPLC(Vydac^_C-18,300埃，4.6×250mm，流速1.2mL/min,0.1％TFA中梯度为20-45％乙腈)监测，并且在18小时内完成。溶液浓缩并用制备性RP-HPLC(Vydac^_C-18,0.1％TFA中梯度为20-45％乙腈)纯化。收集高丝氨酸酰胺肽部分并冻干，得到30毫克纯度＞98％的白色固体，即化合物3。

                     化合物3AVSEHQLLHDKGKSIQDLRRRELLEKLLEKLHTX-NH₂(X=hSer,SEQ ID NO:8)物理数据：m.p.138-142℃    [α]²⁵ _D-45.97°(c0.25,H₂O)FAB(C₁₇₆H₃₀₂N₅₆O₅₂):[M+H]⁺4033.9AAA:Asp,2.1(2)；Glu,6.1(6)；Ser,1.6(2)；His,2.8(3)；

Gly,0.97(1)；hSer,0.97(1)；Thi,1.0(1)；Ala,1.0(1)；

Arg,2.9(3)；Val,1.0(1)；Ile,1.0(1)；Leu,7.6(8)；Lys,

3.9(4).

                   实施例Ⅳ

按照实施例Ⅰ的方法，制备0.35mmol左右的被保护的肽-树脂BocAVS(Bzl)E(OBz)H(Bom)QLLHD(OBzl)R(Ts)GR(Ts)S(Bzl)IQD(OBz)-LR(Ts)R(Ts)E(OBz)LLE(OBzl)R(Ts)LLK(Fmoc)R(Ts)LH(Bom)T(Bzl)A-O-PAM。所有的N^a基团用叔丁氧基羰基(Boc)保护；侧链保护基团已标出。在合成结束之后，用50毫升20％哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)在室温下处理肽树脂30分钟，从而除去赖氨酸上的芴基甲氧基羰基(Fmoc)保护基团。随后依次用DMF,MeOH，和CH₂Cl₂洗涤树脂，并干燥，得到1.6克部分保护的肽。于20毫升DMF中，在0.16g(0.3mmol)六氟磷酸苯并三唑基-三(吡咯烷基)磷鎓盐和0.067g(0.525mmol)二异丙基乙胺(DIEA)存在下，用0.44克(0.3mmol)甲氧基二(乙烯氧基)乙酸[PEG(2)CH₂COOH]使0.8g(0.175mmol)部分保护的肽在赖氨酸处进行乙酰化反应5小时。5小时后，过滤树脂，然后依次用DMF,MeOH和CH₂Cl₂洗涤。重复乙酰化步骤两次，直至在树脂上获得阴性茚三酮结果。将最终的肽从树脂上裂解，并且如实施例Ⅰ那样移去侧链保护基团和进行纯化。获得100毫克化合物19。

                   化合物19

物理数据：m.p.145-195℃    [α]²⁵ _D-44.60°(c0.2,

H₂O)FAB(C₁₈₃H₃₁₆N₆₄O₅₄):[M+H]⁺4276.2AAA:Asp,2.1(2)；Glu,5.0(5)；Ser,1.6(2)；His,2.9(3)；Gly,0.9(1)；Thr,1.9

(2)；Arg,7.1(7)；Val,1.1(1)；Ile,1.0(1)；Leu,8.0(8)；Lys,0.9(1).

                      实施例Ⅴ

按实施例Ⅳ那样合成、切取和纯化肽,除了使用2-甲氧基聚(乙烯氧基)乙酸[PEG(5000)CH₂CO₂H]作为乙酰化剂。用0.8g(0.175mmol)部分保护的肽获得300毫克纯化合物20.

                  化合物20

物理数据：m.p.105℃    [α]²⁵ _D-22.95°(c0.1l,50％HOAc水溶液)AAA:Asp,2.0(2)；Glu,4.8(5)；Ser,1.6(2)；His,2.6(3)；Gly,1.1(1)；Thr,1.1

(1)；Arg,7.3(7)；Val,0.8(1)；Ile,0.9(1)；Leu,8.3(8)；Lys,1.1(1)；Ala,

1.8(2)．

                    实施例Ⅵ

             合成hPTHrp(1-34)类似物基因

设计编码hPTHrp(1-34)类似物化合物4(SEQ ID NO:9)的合成基因,它具有如图1所示的核苷酸序列和限制性酶切位点。必需寡核苷酸用DNA合成仪(Milligen/Biosearch),并采用Sinha,etal.,Nucleic Acid Research 12,4539-4557(1984)的氨基磷酸酯(phosphoramidite)法制备。去保护后，粗寡核苷酸在制备性15％聚丙烯酰胺凝胶上通过凝胶电泳而纯化。用UV照射确定寡核苷酸的位置，然后将其从凝胶中切取出来，在Waters c18 Sep-pak_柱上脱盐，接着冻干。

通过聚合酶链反应的扩增反应是在Perkin-Elmer Cetus热循环仪上进行，条件为：94℃1分钟，50℃2分钟和72℃3分钟，共25个循环，其中使用包括Taq聚合酶在内的″GeneAmp″DNA扩增试剂盒(Perkin-Elmer Cetus)。

制备两种重迭的寡核苷酸，即88聚物(2微克)的PTH3和反义的、90聚物(2微克)的PTH4作为hPTHrp(1-34)类似物基因的模板DNA序列。PTH3,(SEQ ID NO:31):CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAGC ATG GCT GTT TCT GAA CAT CAG 45

                        Met Ala Val Ser Glu His Gln

                            1               5CTG CTT CAT GAC AAA GGT AAA TCG ATT CAA GAT CTG AGA CGT C

                                                    88Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile Gln Asp Leu Arg Arg

        10                  15                  20PTH4(SEQ ID NO:32):CCTCGAAGCT   TATGCATCAT   TATCTAGA CAT AGT ATG CAG CTT TTC 46

                               Met Thr His Leu Lys Glu

                                               30AAG CAG TTT CTC CAG CAG CTC GCG ACG TCT CAG ATC TTG AAT 88Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Arg Arg Arg Leu Asp Gln Ile

        25              20                      15CG 90,采用两侧引物PTHPCRl:CCTCTAGATC TCCGCGGCGC TAG(SEQ ID NO:33)和PTHPCR2:CCTCGAAGCT TATGCATCAT TATC(SEQ IDNO:34)，通过PCR扩增整个基因。扩增的DNA在4％NuSieve_琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳纯化。从凝胶中切取含有合成的约150碱基的hPTHrp(1-34)类似物基因的条带，用Elu-Quik^_玻璃凝胶DNA萃取法(Schleicher＆Schuell,Keene,NH)分离出约200ng DNA。

                   实施例Ⅶ

hPTHrp(1-34)1类似物基因的分子克隆

为了亚克隆实施例Ⅵ的hPTHrp(1-34)类似物基因，分离200ng扩增的DNA，然后用限制性内切酶HinDⅢ和SacⅡ进行酶切。如图2所示，DNA被连于2微克的用HinDⅢ和SacⅡ酶切过的TrpLE 18 Prot(Ile3,Pro5)质粒。

产生的质粒TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1含有单拷贝的hPTHrp(1-34)类似物基因，将该质粒转入活性大肠杆菌HB 101细胞(CLONTECH,Palo Alto,CA)。转化子经PCR分析以证实插入情况。选择转化细胞克隆，在200微升水中煮沸5分钟；用位于插入件两侧的两个引物对2微升样品进行PCR。然后在1％琼脂糖凝胶上分析PCR产物以确定存在单拷贝的hPTHrp(1-34)基因插入件。然后在DNA自动测序仪(Applied Biosystems Model 373A,Foster City,CA)上，使用供应商的Dye Deoxy Terminator测序试剂盒，通过DNA测序而证实TrpLE 18 hPTHrp(1-34)1构建物。

                         实施例Ⅷ构建含有多拷贝hPTHrp(1-34)类似物基因的Trp LE 18载体

在hPTHrp(1-34)类似物基因序列的开头和末端附近具有唯一的Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ限制性位点。可以使用这两个识别不同序列但产生相同单链粘性末端的位点在Trp LE 18载体构建多拷贝hPTHrp(1-34)基因。

在图3中概括了构建串联式排列的多重hPTHrp(1-34)序列的方案。在各反应中，用Bam HⅠ+NheⅠ和XbaⅠ+Bam HⅠ消化5微克含有单拷贝基因的Trp LE 18 hPTHrp(1-34)1质粒。从各消化物中，分离出约300ng含有hPTHrp(1-34)类似物基因的片段。混合两种片段并连接，从而形成Trp LE 18 hPTHrp(1-34)2质粒。用该质粒转化活性大肠杆菌HB 101细胞。利用转化的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上的大小来确定存在两个拷贝的hPTHrp(1-34)基因插入件。然后通过DNA测序确认含有两个拷贝基因的Tr-pLE 18 hPTHrp(1-34)2。两个hPTHrp(1-34)基因的正确融合会在接头处消除NheⅠ和XbaⅠ位点。这使得XbaⅠ和NheⅠ在串联式排列的基因两侧仍是唯一的。

通过重复该程序，构建含有4个拷贝hPTHrp(1-34)基因的最终质粒Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4，如图4所示。通过DNA序列分析发现Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4序列是正确的。

                 实施例Ⅸ

Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4的表达和纯化

诱导Trp LE 18 hPTHrp(1-34)4

将含有50微克/毫升氨苄青霉素和100微克/毫升色氨酸的50毫升LB培养基起始培养物(J.H.Miller,Experiments in Molecu-lar Genetics,″p.431(1972)，在此引用作为参考)用含有Trp LE 18hPTHrp(1-34)4质粒的大肠杆菌细胞进行接种，然后在37℃剧烈摇动生长过夜，至A₅₅₀为约6。将2升用于生产的LB培养基预热至37℃，然后用20毫升起始培养物进行接种，得到的A₅₅₀为约0.06。然后培养物在剧烈摇动下生长至A₅₅₀为约0.6-0.8，加入2毫升含10mg/mL吲哚丙烯酸(IAA)的溶液。继续在通气良好的条件下生长16小时直至终A₅₅₀为约6(典型地，为4-10)。通过离心浓缩细胞，然后再悬浮于500mL 50mM Tris-HCl,pH7.5,0.1mM EDTA缓冲液中(Tris缓冲液)。

悬浮液用Heat Systems-Ultrasonics,Inc．的220F型超声波仪(装有3/4″扬声器)，在50％满负荷(为了避免过热)下进行超声波处理。

为了确定诱导的程度，用SDS-PAGE分析整个细胞。观察到从TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4构建物衍生而得的基因产物为预计约17,000道尔顿分子量的主条带。该条带对应于约10％的细胞总蛋白质。

分离融合蛋白

在约3600×g下离心细胞Ⅰ裂解液15分钟，使Trp LE 18hPTHrp(1-34)4融合蛋白沉积；弃去上清液。将沉积物重新悬浮于100毫升Tris缓冲液中(典型地为40-80A₅₅₀/mL)

                   实施例Ⅹ

融合蛋白的加工和高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)肽的纯化

用CNBr将位于hPTHrp(1-34)多聚体融合蛋白一侧的甲硫氨酸切下，释放出所需的高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)多肽，然后按下列方法进行纯化。用CNBr处理融合蛋白

将洗涤过的TrpLE 18 hPTHrp(1-34)4融合蛋白沉积物通过轻轻地搅拌重新悬浮于60mL 70％甲酸中(约20mg/mL总蛋白；典型地将来自1000 A₅₀₀单位细胞的原料溶于3毫升中)。加入数滴辛醇，用N₂吹洗溶液20分钟，然后加入5.5g CNBr。接着，于25℃反应6小时，将等体积的50∶50 MeOH∶H₂O与样品混合，随后通过旋转蒸发而除去。重复该过程2-4次，使甲酸和CNBr基本上被去除。然后蒸发样品至干燥，重新溶解于200毫升水中，冻干储存。高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)的纯化

将CNBr裂解的上清液在有所改变的50mM KH₂PO₄pH6.5中透析24小时。在透析中，pH维持在6.5。透析后，高速离心除去沉淀物。上清液通过Gelman0.45μ过滤装置(Acrodisc 4184)澄清化。阳离子交换色谱

最初的纯化通过在Bio-Gel TSK-SP-5PW HPLC柱(21.5×150mm)上的阳离子交换色谱而完成。对应于流速为8mL/min和约12毫克高纯度高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)肽产量的色谱条件如下：

1．用50mM KH₂PO₄,pH 6.5平衡柱

2．装10mL澄清的上清液(约1.5升培养液或2.4g包涵体)。

3．用含有50mM NaCl的50mM KH₂PO₄,pH6.5洗涤柱直至基线稳定

4．用含有90mM NaCl的50mM KH₂PO₄,pH6.5洗脱柱。收集馏分约45分钟。

5．用C18 HPLC分析90mM NaCl馏分中高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)含量，然后收集储存。反向HPLC色谱

用反相Poros R/H 4.6 × 100 mm柱(Perseptive Biosystems,Cambridge,MA)进行最后的纯化步骤。该色谱条件如下：流动相A:0.1％三氟乙酸(TFA)/水

B:0.1％三氟乙酸(TFA)/CH₃CN

   时间        流速       ％B

   0min        4ml/min    15

   5.0min      4ml/min    40

   5.2min      4ml/min    100

   6.8min      4ml/min    100

   7.0min      4ml/min    15

高丝氨酸内酯hPTHrp(1-34)，化合物4的保留时间约为2.943分钟。纯化的肽用质谱法测定纯度为约98％。

实施例Ⅺ

在切除卵巢的大鼠上，大体按照Gunness-Hey和Hock,Metab.Bone Dis.5:177 181(1984)的方法评估本发明的化合物对骨质的作用。

使成年Sprague-Dawley雌性大鼠适应环境，按重量分组(n=9,10 or 12)，然后进行两侧卵巢切除(OVX)或模拟手术。在手术后17天给药，持续20天。每天用2％鼠血清/盐水介质皮下施用测试化合物。

20天后，杀死鼠，取出右股骨。将股骨切成两半，远端的一半股骨(DHF)进一步通过钻出小梁而分成小梁骨(TB)和皮骨(CB)。萃取出钙，通过Calcette钙分析仪进行测定，以平均骨钙表示，单位为mg/DHF/100g体重。

使用两样品t-检验来比较OVX和模拟组。用单向ANOVA 比较OVX组，随后用Fisher的LSD多重比较法将各组与介质进行比较。

卵巢切除会导致严重的总骨质丧失，主要是小梁骨的骨质丧失。与模拟手术的对照组相比，总骨钙质低47-54％。

通过统计表明，80微克/kg/天bPTH(1-34)和hPTHrp(1-34)能够使处理过的OVX鼠的总骨钙质明显增加，分别为53-95％和18-40％；但是皮骨钙质没有明显增加。

本发明的化合物，按80微克/kg/天给药时，会增加总骨钙质约66-138％，增加小梁骨钙质87-128％。对于未处理的OVX对照组，皮骨钙质、小梁厚度和骨体积也明显增加。

在该分析中，测试了下列化合物：化合物             n          小梁骨钙质      总骨钙质编号          (测试数目#)   (％增加，OVX)(％增加，OVX)化合物1             6         101-128％     88-138％化合物2             3         87-102％      66-114％化合物4             3           -           88-114％

在类似的研究中，按40微克/kg/天给切除卵巢的大鼠给药5，10和20天，得到下列结果：化合物              n         给药天数      总骨钙质编号           (测试数目#)      (d)       (％增加，OVX)化合物1             3           20d         73-109％化合物4             5           20d         79-105％化合物4             1           10d           79％化合物49           1         10d          93％化合物4            1         5d           55％化合物42           1         5d           60％

                           实施例Ⅻ

                              毒性

在上面的实施例Ⅺ中，对于本发明的化合物没有观察到毒性作用。

Claims (12)

1．一种甲状旁腺激素PTH、甲状旁腺激素相关肽PTHrp以及PTH和PTHrp的短同系物和类似物的合成多肽类似物，或其盐，其特征在于，PTH和PTHrp的氨基酸(22-31)形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)的序列选自：

a)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰其中

  1                                 5                     10

Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自独立地为Leu或Ile；Xaa⁸是Ala,Arg,或Glu；和Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ IDNO:26)；条件是下列情况不能同时出现：

Xaa¹和Xaa⁴都是Glu；

Xaa²是Leu；

Xaa⁵是Lys；

Xaa⁷和Xaa¹⁰都是Leu；

Xaa⁸是Arg或Glu；和

Xaa⁹是Lys，或者

b)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu Xaa⁸ Arg Leu其中

  1                   5                   10

Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH3),His,或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)；条件是下列情况不能同时出现：

Xaa¹和Xaa⁴都是Glu；

Xaa²是Leu。

2．如权利要求1所述的多肽及其药学上可接受的盐，其特征在于，它具有下式：

Xaa¹ Xaa² Xaa³ Xaa⁴ Xaa⁵ Xaa⁶ Xaa⁷ Leu His Xaa¹⁰ Xaa¹¹ GlyXaa¹³ Ser Ile Gln Xaa¹⁷ Leu Xaa¹⁹ Xaa²⁰ Xaa²¹ Xaa^22-31 Xaa³² Xaa³³Xaa³⁴ Xaa³⁵ Xaa³⁶ Xaa³⁷ Xaa³⁸ Term,

其中：

Xaa¹缺失或是Ala；

Xaa²缺失或是Val；

Xaa³缺失或是Ser；

Xaa⁴缺失或是Glu或Glu(OCH₃)；

Xaa⁵缺失或是His或Ala；

Xaa⁶缺失或是Gln；

Xaa⁷缺失或是Leu；

Xaa¹⁰和Xaa¹⁷各自独立地为Asp或Asp(OCH₃)；

Xaa¹¹是Lys,Arg，或Leu；

Xaa¹³是Lys,Arg,Tyr,Cys,Leu,Cys(CH₂CONH(CH₂)₂NH(生物素基))，Lys(7-二甲基氨基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-4-乙酰基)，或Lys(二氢肉桂酰基)；

Xaa²⁰是Arg或Leu；

Xaa¹⁹和Xaa²¹各自独立地为Lys,Ala，或Arg；

Xaa^22-31如权利要求1中所定义；

Xaa³²是His,Pro，或Lys；

Xaa³³缺失，或是Pro,Thr,Glu，或Ala；

Xaa³⁴缺失，或是Pro,Arg,Met,Ala,hSer,hSer内酯，Tyr,Leu，或1,4-二氨基丁酰内酰胺；

Xaa³⁵缺失或是Pro,Glu,Ser,Ala，或Gly；

Xaa³⁶缺失或是Ala,Arg，或Ile；

Xaa³⁷缺失或是Arg,Trp，或3-(2-萘基)-L-Ala；

Xaa³⁸缺失或是Ala或hSer或Xaa^38-42是Thr Arg Ser Ala Trp；

和Term是OR或NR₂，其中每个R各自独立地为H,(C₁-C₄)烷基或苯基(C₁-C₄)烷基。

3．如权利要求2所述的多肽，其特征在于，Xaa^22-31是权利要求1中的序列a)，和其中Xaa¹¹和Xaa¹³都是Lys；Xaa¹⁹和Xaa²¹都是Arg。

4．如权利要求3所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile GlnAsp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu Glu Lys Leu Leu Glu Lys Leu HisThr Ala NH₂(化合物50)。

5．如权利要求3所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile GlnAsp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu His Lys Leu Leu Glu Lys Leu HisThr Ala NH₂(化合物51)。

6．如权利要求3所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile GlnAsp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu His Leu Leu Glu Lys Leu HisThr Ala NH₂(化合物52)。

7．如权利要求3所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile GlnAsp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Ile Ala Lys Leu HisThr Ala NH₂(化合物53)。

8．如权利要求3所述的多肽，其特征在于，它是Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile GlnAsp Leu Arg Arg Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Leu Glu Glu Ile HisThr Ala NH₂(化合物54)。

9．一种药物组合物，其特征在于，它含有骨质增加有效量的如权利要求1所述的多肽或其盐与药学上可接受的载体。

10．一种PTH、PTHrp或PTH和PTHrp的短同系物和类似物的多肽类似物，或其盐的固相合成方法，其中PTH或PTHrp的氨基酸残基(22-31)被修饰形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自：

a)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰其中

  1                   5                       10

Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自独立地为Leu或Ile；Xaa⁸是Ala,Arg，或Glu；和Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ IDNO:26)；条件是下列情况不能同时出现：

Xaa¹和Xaa⁴都是Glu；

Xaa²是Leu；

Xaa⁵是Lys；

Xaa⁷和Xaa¹⁰都是Leu；

Xaa⁸是Arg或Glu；和

Xaa⁹是Lys，或者

b)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu Xaa⁸ Arg Leu其中

  1                   5                   10

Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)；条件是下列情况不能同时出现：

Xaa¹和Xaa⁴都是Glu；

Xaa²是Leu，

该方法包括按次序将被保护的氨基酸偶连于合适的树脂载体，去除侧链和N^α-保护基团，以及将多肽从树脂载体上裂解。

11．一种PTH、PTHrp或PTH和PTHrp的短同系物和类似物的多肽类似物，或其盐的制备方法，其中PTH或PTHrp的氨基酸残基(22-31)被修饰形成两亲性α-螺旋，该残基(22-31)选自：

a)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Xaa⁵ Leu Xaa⁷ Xaa⁸ Xaa⁹ Xaa¹⁰其中

  1                   5                       10

Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁵是Lys或His；Xaa⁷和Xaa¹⁰各自独立地为Leu或Ile；Xaa⁸是Ala,Arg，或Glu；和Xaa⁹是Lys或Glu(SEQ IDNO:26)；条件是下列情况不能同时出现：

Xaa¹和Xaa⁴都是Glu；

Xaa²是Leu；

Xaa⁵是Lys；

Xaa⁷和Xaa¹⁰都是Leu；

Xaa⁸是Arg或Glu；和

Xaa⁹是Lys，或者

b)Xaa¹ Xaa² Leu Xaa⁴ Arg Leu Leu Xaa⁸ Arg Leu其中

  1                   5                   10

Xaa¹和Xaa⁴各自独立地为Glu,Glu(OCH₃),His，或Phe；Xaa²是Leu或Phe；Xaa⁸是Glu,Lys，或Lys(COCH₂PEGX)和PEGX是分子量为100-10,000的聚(乙二醇甲基醚)残基(SEQ ID NO:27)；条件是下列情况不能同时出现：

Xaa¹和Xaa⁴都是Glu；

Xaa²是Leu，

该方法包括：表达编码该多肽的基因。

12．一种如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，它用于制备治疗哺乳动物骨质减少状况、尤其治疗骨质疏松症的药剂。

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