CN107058350A - 基于体外定点突变获得的油菜抗多种als抑制剂类除草剂基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用，属于生物技术领域。该基因mALS3是在抗除草剂油菜M342的ALS3基因序列中引入一个新的突变位点，该位点位于ALS3基因的第560位，原来是C碱基，编码187位的丙氨酸，经突变成T碱基后则在187位变成了缬氨酸。本发明应用体外定点突变技术获得一个具有双突变位点即A187V和W556L的油菜mALS3基因，该双突变位在油菜基因组中尚未见文献报道。经过转基因拟南芥初步的功能验证，结果表明含此双突变位点的油菜mALS3基因对除草剂咪唑乙酰胺、苯磺隆、双氟磺酰胺和双草醚等多种ALS抑制剂类除草剂具有明显的抗性。该抗性基因可用于抗除草剂农作物的培育。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因及应用，属于生物技术领域。
二、背景技术
田间杂草的生长一方面与农作物竞争养分和生长空间，给农作物正常生长发育带来严重影响；另一方面人工除草费时费工增加劳动成本。而现代农业生产中越来越多的依靠化学除草剂来防除杂草。然而，除草剂在杀死杂草的同时往往也对农作物带来不同程度的危害。因此，培育抗除草剂作物新品种对除草剂的推广应用和农作物的轻简化栽培均具有重要的现实意义。
除草剂主要是通过抑制或干扰植物关键的代谢过程而抑制植物生长或杀死植物。以氨基酸生物合成过程中的关键酶为靶标，是研发新型高效除草剂的一个重要方向和热点，已成功开发的除草剂的靶酶有乙酰乳酸合成酶、5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和谷氨酰胺合成酶(GS)等。美国孟山都(Monsanto)公司以EPSPS为靶酶开发的有机磷除草剂草甘膦，自1974年在美国注册登记以来，因其广谱、高效、低毒、易分解、低残留和对环境相对安全等优点在全球100多个国家得到应用。德国Hoechst公司以GS为靶酶开发的有机磷除草剂草铵膦在欧洲及北美被广泛使用。
而以乙酰乳酸合成酶(ALS)为靶酶开发的除草剂，己经成为新型高效除草剂的主流产品。ALS是催化分支氨基酸如缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成第一步的酶。ALS抑制剂类除草剂能抑制植物细胞内的ALS酶活性，阻碍支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)生物合成，从而抑制植物细胞的分裂和生长。1961年美国杜邦(Du Pont)公司首先报道了嘧啶类化合物的活性及对植物体内ALS酶的抑制作用，1982年该公司成功研发了第一个磺酰脲类除草剂氯磺隆(Chlorsulfuron)。继氯磺隆研发成功以来众多国际化学公司以ALS为靶酶相继开发成功了咪唑啉酮类、磺酰胺类、嘧啶水杨酸类和三唑嘧啶磺酰胺类除草剂，具体的除草剂品种和商品名更是不计其数。以ALS为靶酶开发的除草剂具有选择性强、杀草谱广，活性高、使用剂量低，对哺乳动物毒性小等优点，既可作土壤处理剂也可茎叶喷施，因其除草效率高、使用方便深得广大用户欢迎。该类除草剂作用位点单一，长期使用极易让杂草产生抗药性，但同时也为诱变作物产生抗性、为选育非转基因抗除草剂品种提供了便利。
利用传统诱变技术如化学诱变剂处理种子可以诱导植物细胞ALS基因的碱基发生点突变，进而导致ALS酶蛋白的氨基酸发生替换，而变得对除草剂不在敏感。而更多的抗ALS类除草剂基因是来自一些杂草。由于大量使用这类除草剂，使得抗该ALS类除草剂的抗性生物型杂草数量急剧增加，据不完全统计全球30多个国家已经发现抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型有98种，其中双子叶杂草68种，单子叶杂草30种，已成为产生抗性杂草最为严重的一类除草剂。研究表明抗ALS抑制剂类除草剂的杂草生物型中绝大多数是有靶标基因发生位点突变产生的。
如ALS酶蛋白第122位点(均以模式植物拟南芥ALS氨基酸位点计算)的丙氨酸被缬氨酸取代，对咪唑啉酮类除草剂产生抗性；第197位点的脯氨酸被组氨酸、或苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺取代，对磺酰脲类除草剂产生
迄今为止，在已经发现的ALS基因中，有8个位点，总计约26个氨基酸的替换突变会对相应的除草剂产生抗性。这8个位点分别是：Ala 122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654，这些位点所标注的数值均是相对于模式植物拟南芥的ALS酶蛋白氨基酸序列的位置。
除草剂抗性基因在培育抗除草剂农作物中得到广泛的应用。人们通过各种途径或技术手段分离获得除草剂抗性基因并转入到各种经济农作物中，以获得抗除草剂的农作物新品种。
目前在油菜中报道的ALS基因突变位点比较少，仅限于197位、574和653位的氨基酸替换。Swanson等通过诱变剂乙基亚硝基脲诱变油菜小孢子，选择获得了对咪唑啉酮类除草剂具有抗性的油菜Pl(或记为PMl)和P2(或记为PM2)。P1的抗性突变位点为BnALSl的Ser653Asp，P2的抗性突变位点是BnALS3的Trp574Leu，P2的抗性水平比P1高。目前国外已商业化的抗咪唑啉酮Clearfield油菜都是由这2个突变体转育而成。
江苏省农业科学院在油菜和大豆多年轮作的试验田中发现了1株抗咪唑啉酮类除草剂油菜，培育出抗性稳定的株系M9，该抗性株系的突变位点是BnALSl基因的Ser653Asp突变。华中农业大学报道从油菜EMS突变后代群体中鉴定出几株抗除草剂苯磺隆的突变体，测序表明它们的突变位点均为BnALS3的Pro197Ser/Leu突变。胡胜武等报道通过EMS诱变甘蓝型油菜中双9，获得3株抗除草剂突变体K1、K4、K5。发现抗除草剂突变体K1和K4是由于ALS基因中第535位C碱基突变为T，导致其编码的BnALS3蛋白第197位氨基酸由Pro突变为Ser；而K5则是BnALSl基因序列第544位C突变为T，导致其编码的BnALSl蛋白发生了Pro197Ser的改变。
这些部位的改变仅赋予油菜对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂的抗性，对其它ALS抑制剂类除草剂则不具抗性。油菜ALS基因突变多是利用化学诱变剂处理油菜种子，然后筛选抗除草剂突变体，并进一步鉴定抗除草剂突变体的基因型。鉴于诱变具有随机性，需要筛选大量的种子，工作量比较大。如果能在体外进行定点突变，并通过转基因途径验证突变基因功能，再利用现代的基因编辑技术将突变基因敲入到油菜染色体组中，这样就可以较快且较精准地获得新的抗除草剂油菜。
本课题组曾育成抗除草剂油菜种质系M342,抗除草剂油菜M342的ALS3基因上，存在一个突变位点，即位于核苷酸序列第1667位碱基由G突变成T，导致其编码的ALS蛋白氨基酸序列在556位由色氨酸(W)变成亮氨酸(L)，因此，M342对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂具有明显抗性。
三、发明内容
1、技术问题
本发明旨在油菜已知ALS3基因序列的基础上，通过设计PCR引物在特殊位点上引入碱基突变，再利用重叠PCR技术，最终目的是创造新的点突变位点，探讨体外突变在创造油菜新的抗除草剂基因的可行性。
2、技术方案
一种基于体外定点突变获得油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因，其特征在于，该基因mALS3是利用体外定点突变技术获得的，是在已经克隆的抗除草剂油菜M342的ALS3基因序列中引入一个新的突变位点，该位点位于ALS3基因的第560位，原来是C碱基，编码187位的丙氨酸，经突变成T碱基后则在187位变成了缬氨酸，该基因mALS3序列为：SEQ ID NO.1。
所述一种基于体外定点突变获得油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3的应用，是指所述油菜抗多种ALS除草剂基因mALS3在植物抗ALS除草剂方面的应用，尤其是指所述油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3在植物抗ALS抑制剂类除草剂方面的应用。ALS抑制剂类除草剂是指所述ALS抑制剂类除草剂，是指咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑嘧啶磺酰胺类或嘧啶水扬酸类除草剂，尤其是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、双氟磺酰胺或双草醚除草剂。
所述的应用，具体是指所述油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3在拟南芥抗ALS抑制剂类除草剂方面的应用，具体为：
1)引物设计：
2)抗除草剂油菜ALS3基因克隆：以抗除草剂油菜M342基因组DNA为模板，用引物对ALSF/ALSR及高保真DNA聚合酶扩增油菜的ALS3基因；
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer 10μl,基因组DNA 1μl，10μM 35-S-ALSF 1μl，10μM ALSR 1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，3min，95℃，30sec，58℃，30sec，72℃2min，35个循环后，72℃，5min，琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，胶回收纯化2Kb的PCR产物并克隆到peasy-T1载体上经测序确定，获得克隆有抗除草剂油菜M342 ALS3基因的peasy-T1质粒；
3)利用重叠PCR引入碱基突变
以克隆有抗除草剂油菜M342的ALS3基因的peasy-T1质粒为模板，分别用引物对ALSF/ALSRm和ALSFm/ALSR扩增出上游片段大小为572bp和下游片段大小为1412bp；
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35个循环后，72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约572bp和1412bp的上、下游PCR产物。后以上、下游产物的混合物为模板，用引物对ALSF/ALSR扩增出全长的ALS3基因序列。
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35个循环，72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约2000bp的片段，然后克隆到peasy-T1上，并测序分析，该产物序列除了在560处引入了点突变C/T外，其余碱基序列与M342的ALS3基因序列完全一致，定名为mALS3；
4)植物表达载体构建：以载体pCAMBIA2300质粒DNA为模板，分别用引物对p0390-35SF/35SR和ALS-nosF/nosp0390R扩增35S启动子序列(约450bp)和nos终止子序列(约250bp)，胶回收相应大小的PCR产物；
以克隆有mALS3基因的peasy-T1质粒为模板，用引物对35S-ALSF/ALSR扩增mALS3基因，胶回收大小约2000bp的PCR产物，通过重组反应克隆到smalI酶切线性化的pCAMBIA0390载体上。反应体系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS3PCR产物2μl，35S PCR产物2μl，nos PCR产物2μl，ExnaseTM 2μl，线性化载体4μl,ddH2O 2μl，于37℃下反应30min，后取5-10μl反应液转化大肠杆菌DH5α，挑克隆PCR鉴定，抽提质粒酶切鉴定，最终经测序确定后，由此获得的质粒定名为p0390-mALS3；
5)拟南芥转化:用上述获得的植物表达载体质粒p0390-mALS3转化农杆菌GV3101，采用农杆菌液浸花的方法转化拟南芥；
6)抗除草剂拟南芥植株的筛选：播种经农杆菌GV3101(含质粒p0390-mALS3)转化处理的拟南芥T0代种子，在苗期进行ALS抑制剂类除草剂的抗性鉴定，经过除草剂筛选，获得抗除草剂植株。其中所述ALS抑制剂类除草剂是指所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑嘧啶磺酰胺类或嘧啶水扬酸类除草剂，尤其是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、双氟磺酰胺或双草醚除草剂。
3、有益效果
迄今为止，在已经发现的ALS基因中，有8个位点，总计约26个氨基酸的替换突变会对相应的除草剂产生抗性。这8个位点分别是：Ala 122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654，这些位点所标注的数值均是相对于模式植物拟南芥的ALS酶蛋白氨基酸序列的位置。目前在油菜中报道的ALS基因突变位点比较少，仅限于197位、574和653位的氨基酸替换。这些部位的改变仅赋予油菜对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂的抗性，对其它ALS抑制剂类除草剂则不具抗性。油菜ALS基因突变多是利用化学诱变剂处理油菜种子，然后筛选抗除草剂突变体，并进一步鉴定抗除草剂突变体的基因型。鉴于诱变具有随机性，需要筛选大量的种子，工作量比较大。如果能筛选到位点进行体外突变，并通过转基因途径验证确定突变基因功能，再利用现代的基因编辑技术将突变基因敲入到油菜染色体组中，这样就可以较快地获得新的抗除草剂油菜。
抗除草剂油菜M342的ALS3基因上，存在一个突变位点，即位于核苷酸序列第1667位碱基由G突变成T，导致其编码的ALS蛋白氨基酸序列在556位由色氨酸(W)变成亮氨酸(L)，因此，M342对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂具有明显抗性。本发明在抗除草剂油菜M342的ALS3基因上，引入第二个突变位点，探讨体外突变在创造油菜新的抗除草剂基因的可行性，通过引物设计在特殊位点上引入碱基突变，再利用重叠PCR技术，最终目的是创造新的点突变位点。
本发明通过大量试验筛选到抗除草剂油菜M342的ALS3基因的核苷酸序列第560处，将碱基C突变为T，使其编码的蛋白质序列在第187位的丙氨酸(A)突变成缬氨酸(V)。通过转基因技术验证突变基因对ALS抑制剂类除草剂的抗性。我们发现突变后的ALS3基因具有2个突变位点，分别是A187V和W556L。除了对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂具有抗性外，该双突变位点的基因对三唑嘧啶磺酰胺类和嘧啶水扬酸类除草剂也不再敏感，本发明为创造油菜新的抗除草剂基因提供了一种途径，并获得一个具有2个突变位点的抗ALS抑制剂类除草剂的基因，也为新的抗除草剂基因的应用奠定了实验基础。
本发明应用体外定点突变技术获得一个具有双突变位点即A187V和W556L的油菜mALS3基因，该双突变位在油菜基因组中尚未见文献报道。经过转基因拟南芥初步的功能验证，结果表明含此双突变位点的油菜mALS3基因对除草剂等多种ALS抑制剂类除草剂咪唑啉酮类(咪唑乙酰胺)、磺酰脲类(苯磺隆)、三唑嘧啶磺酰胺类(双氟磺酰胺)和嘧啶水扬酸类(双草醚)具有明显的抗性。该抗性基因可用于抗除草剂农作物的培育。
四、附图说明
图1.突变位点示意图。
Mutated ALS、M342和Z11526.1分别指定点突变后的ALS基因、M342的ALS基因和序列号为Z11526.1的ALS3基因的局部碱基序列；Mutated protein和Wild ALS protein为点突变后翻译的ALS蛋白的氨基酸序列。其中靠近5’端的突变位点是新引入的突变位点，3’端的突变位点是M342原来具有的突变位点。
图2.重叠PCR的电泳结果。
第1栏为分子量标记(MKD2000:1500bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp)，第2栏为基因5’端的大小约为570bp的PCR产物，第3栏为3’末大小约为1400bp的PCR产物，第4栏重叠PCR的最终产物也即为全长的PCR产物，大小约为1960bp的目标片段。
图3.所克隆的经点突变的BnmALS3基因核甘酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列。
其中红色部分为编码ALS蛋白质的突变位点。
图4.转基因抗除草剂拟南芥的分子鉴定PCR产物。
第1栏是DNA标记M GenStar,D2000plus(5000,3000,2000,1000,750,500,250,100)，第2、3、4栏分别是ALS3和35S、和nos终止子的PCR产物。
图5.pp0390-ALSm NcoI和SmaI酶切图谱。
M GenStar,D2000plus(5000,3000,2000,1000,750,500,250,100)
图6.除草剂筛选获得的转基因拟南芥。
图7.转基因拟南芥植株的PCR鉴定结果。
图8.转基因拟南芥核酸杂交验证结果。
第1栏是DNA分子量标记，第2栏为阴性对照,第3-10是转基因拟南芥植株基因组DNA，第11栏是质粒。
图9.喷咪唑啉酮类除草剂咪唑乙酰胺效果。
图10.喷磺酰脲类除草剂苯磺隆效果。
图11.喷三唑咪啶磺胺类除草剂双氟磺草胺效果。
图12.喷嘧啶水扬酸类除草剂双草醚效果。
五、具体实施方式
(一)材料与方法：
1材料：
1.1抗除草剂甘蓝型油菜品系M342(见授权专利ZL201310111739.5一种甘蓝型油菜抗磺酰脲类除草剂基因及其应用)，系江苏省农科院经济作物研究所油菜研究室通过EMS诱变获得，研究证明该品系对磺酰脲类除草剂具有抗性。因其ALS3基因在1667位的碱基发生点突变，由原来的G碱基突变成了T碱基，导致编码的蛋白质序列在556位点由色氨酸(W)突变为亮氨酸(L)，即W556L。(见授权专利ZL201310111739.5)
1.2 Fast Pfu DNA聚合酶、克隆载体Peasy-T1、Tag DNA聚合酶、质粒提取、胶回收试剂盒购自南京百斯凯生物技术有限公司，重组克隆试剂盒ClonExpressTM，PCR mix购自南京诺唯赞生物科技有限公司。Southern杂交试剂盒PCR DIG Probe Synthesis kit和地高辛杂交检测试剂盒II均购自Roche公司。农杆菌GV3101系公知公用。
1.3.pCAMBIA0390(GenBank No.AF234291.1)和pCAMBIA2300(GenBankNo.AF234315.1)质粒系澳大利亚PCAMBIA公司惠赠。(均为公开序列，可以购买。)
2方法
2.1引物设计：应用Primer Premier 5.0软件分别依据模板序列设计各类引物。用于构建植物表达载体的引物则根据ClonExpressTM快速克隆原理，在扩增引物5’末端添加15个bp与连接片段末端同源的序列(小写字母为同源序列)(见引物序列表1)。通过重组酶反应将目的基因序列整合到载体中。
2.2.抗除草剂油菜ALS基因克隆：以抗除草剂油菜M342基因组DNA为模板，用引物对ALSF/ALSR及高保真DNA聚合酶扩增油菜的ALS3基因；扩增体系：5×Trans StartFastPfu Buffer 10μl,基因组DNA 1μl，10μM 35-S-ALSF 1μl，10μM ALSR 1μl，2.5mMdNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；温度程序：95℃，3min，95℃，30sec，58℃，30sec，72℃2min，35个循环后，72℃，5min，琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，胶回收纯化2Kb的PCR产物并克隆到peasy-T1载体上经测序确定，获得克隆有抗除草剂油菜M342 ALS3基因的peasy-T1质粒；
2.3利用重叠PCR引入碱基突变：
迄今为止，在已经发现的ALS基因中，有8个位点，总计约26个氨基酸的替换突变会对相应的除草剂产生抗性。这8个位点分别是：Ala 122、Pro197、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654，这些位点所标注的数值均是相对于模式植物拟南芥的ALS酶蛋白氨基酸序列的位置。目前在油菜中报道的ALS基因突变位点比较少，仅限于197位、574和653位的氨基酸替换。这些部位的改变仅赋予油菜对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂的抗性，对其它ALS抑制剂类除草剂则不具抗性。油菜ALS基因突变多是利用化学诱变剂处理油菜种子，然后筛选抗除草剂突变体，并进一步鉴定抗除草剂突变体的基因型。鉴于诱变具有随机性，需要筛选大量的种子，工作量比较大。如果能在体外进行定点突变，并通过转基因途径验证突变基因功能，再利用现代的基因编辑技术将突变基因敲入到油菜染色体组中，这样就可以较快地获得新的抗除草剂油菜。
抗除草剂油菜M342的ALS3基因上，存在一个突变位点，即位于核苷酸序列第1667位碱基由G突变成T，导致其编码的ALS蛋白氨基酸序列在556位由色氨酸(W)变成亮氨酸(L)，因此，M342对咪唑啉酮类、磺酰脲类除草剂具有明显抗性。本发明在抗除草剂油菜M342的ALS3基因上，引入第二个突变位点，探讨体外突变在创造油菜新的抗除草剂基因的可行性，通过引物设计在特殊位点上引入碱基突变，再利用重叠PCR技术，最终目的是创造新的点突变位点。
经过与多种植物的ALS基因的核酸序列和编码的氨基酸序列比对分析，本发明尝试找到油菜的ALS3基因的核苷酸序列第560位碱基由C突变成T，对应的ALS酶蛋白第187位点，该位点原来编码的是丙氨酸(A)，现通过生物技术实验将其突变成缬氨酸(V)。
根据序列测定结果，设计2对特异性引物旨在ALS基因编码区的560位将C碱基替换成T碱基。以克隆有抗除草剂油菜M342的ALS3基因的peasy-T1质粒为模板，分别用引物对ALSF/ALSRm和ALSFm/ALSR扩增出上游片段(大小为572bp)和下游片段(大小为1412bp)；
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35个循环后，72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约572bp和1412bp的上、下游PCR产物。后以上、下游产物的混合物为模板，用引物对ALSF/ALSR扩增出全长的ALS3基因序列。
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35个循环，72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约2000bp的片段，然后克隆到peasy-T1上，并测序分析，该产物序列除了在560处引入了点突变C/T外，其余碱基序列与M342的ALS3基因序列完全一致，定名为mALS3；
分别用引物对ALSF/ALSRm和ALSFm/ALSR扩增出上游和下游2个片段，分别回收后，以上、下游PCR产物混合物为模板，用全长引物ALSF/ALSR扩增出全长序列ALSm，然后克隆到peasy-T1上，并测序分析。
2.4植物表达载体构建：以载体pCAMBIA2300质粒DNA为模板，分别用引物对p0390-35SF/35SR和ALS-nosF/nosp0390R扩增35S启动子序列(约450bp)和nos终止子序列(约250bp)，胶回收相应大小的PCR产物；以克隆有mALS3基因的peasy-T1质粒为模板，用引物对35S-ALSF/ALSR扩增mALS3基因，胶回收大小约2000bp的PCR产物，通过重组反应克隆到smalI酶切线性化的pCAMBIA0390载体上。
反应体系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS3PCR产物2μl，35S PCR产物2μl，nos PCR产物2μl，ExnaseTM 2μl，线性化载体4μl,ddH2O 2μl，于37℃下反应30min，后取5-10μl反应液转化大肠杆菌DH5α，挑克隆PCR鉴定，抽提质粒酶切鉴定，最终经测序确定后，由此获得的质粒定名为p0390-mALS3；
2.5拟南芥转化采用农杆菌液浸花的方法转化拟南芥。具体步骤首先用p0390-mALS3质粒转化农杆菌GV3101，挑取转化农杆菌GV3101单克隆于5ml添加了利福平10mg/L、庆大霉素50mg/L、卡那霉素25mg/L的YEB液体培养基中，28℃摇床培养过夜。取1ml菌培养液于50ml相同培养基中再培养过夜至OD600为0.8～1.0，离心，收集菌体，用MS液体培养基洗涤菌体1次，离心，菌体重新悬浮于MS液体培养基中，OD600值在0.8左右。并加入SilwetL-77至0.01％，混匀。每株花序浸泡1分钟，处理10株，一周后，重复处理一次。成熟时收获种子，日光下晒干。
2.6抗除草剂拟南芥植株的筛选将收获到的种子播种于含有蛭石和营养土(2：1)的小盆钵中，于光照培养箱中培养。培养条件光照16h,温度22℃，黑暗8h，温度18℃。待种子萌发至子叶展平时，于叶面喷施15μg/ml的苯磺隆溶液，由此筛选转基因抗除草剂苯磺隆的T0代植株。让T0植株继续生长至开花结籽。将收获到的T0代植株上的种子播种在盆钵中，即为T1代植株。待子叶展平后，再用15μg/ml的苯磺隆溶液喷施，筛选抗除草剂植株。让抗性植物继续生长至10余片真叶时，分别喷施咪唑乙酰胺(166.67μg/ml)、苯磺隆(15μg/ml)、双氟磺酰胺(4.15μg/ml)和双草醚(10μg/ml)，进行各种ALS抑制剂类除草剂的抗性鉴定。
2.7转基因抗除草剂拟南芥的分子鉴定：取抗除草剂转基因拟南芥植株的叶片用CTAB方法提取基因组DNA，进行PCR鉴定和Southern杂交鉴定。PCR鉴定的扩增体系是：2×PCR Mix 10μl，引物SAF和SAR各1l，去离子水7μl，DNA模板1μl。温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃35sec，35个循环后，72℃，5min。1％琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物。Southern杂交鉴定探针为荧光标记的35S启动子序列，探针长度为454bp。杂交实验按照试剂盒说明书进行。
3.结果
3.1.体外定点突变ALS3基因克隆与分析
本实验目的是利用体外定点突变技术在已经克隆的抗除草剂油菜M342的ALS3基因序列中引入一个新的突变位点。如图1所示。该位点位于ALS3基因的第560位，原来是C碱基，编码187位的丙氨酸，经突变成T碱基后则在187位变成了缬氨酸。我们通过在相应区域设计特定的含有突变碱基T的PCR引物扩增目的基因片段引入突变，使其突变后的碱基由C变成T。经体外突变的ALS3基因定名为mALS3。
经克隆、测序，mALS3序列除了在560处引入的点突变(C/T)外其它的碱基序列与M342的ALS3基因序列完全一致。利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析mALS3基因的序列结构，结果显示，该基因编码区全长由1959bp组成，编码652个氨基酸(图3)。其中mASL3基因序列与Z11526.1的基因序列亦显示高度同源，但存在4个SNP位点的差异：其中2个SNP导致编码蛋白质序列的改变,分别是560碱基序列由C变为T，导致187位的丙氨酸突变成了缬氨酸(A187V)该位点为新引入的突变位点，和第1667位碱基G变为T，导致ALS蛋白质第556位的色氨酸突变为了亮氨酸(W556L)，为M342原有的突变位点。
3.2植物表达载体构建
为进一步验证经过体外突变获得的双位点突变基因抗ALS抑制剂类除草剂的功能，本研究将PCR获得的mALS3基因序列(1959bp)、35S启动子序列(454bp)和nos终止子序列(253bp)(图4)，利用重组克隆技术，克隆到了pCAMBIA0390的smalI位点，获得的植物表达载体，初步命名为p0390-mALS3。该质粒DNA经限制性内切酶smalI切可以获得由35S、mALS编码序列nos终止子组成的大小为2993bp的片段，见图5。并经过测序进一步验证各目的片段连接正确。
3.3转基因拟南芥筛选与鉴定
经过除草剂筛选，初步获得9个抗除草剂拟南芥株系(图5)。并进一步用特异性引物对其基因组DNA进行了PCR鉴定。本实验设计了高度特异性引物对，上、下游引物分别取自35S启动子3’末端序列和mALS3基因5’末端序列，PCR扩增产物预期大小为374bp。经检测所有经除草剂苯磺隆筛选到的阳性植株均可以扩增出相应大小的PCR产物(图6)。
3.4转基因拟南芥核酸杂交验证结果
进一步验证转基因抗除草剂拟南芥是真正的转基因拟南芥，本实验对其进行了核酸杂交实验，结果也证明获得的抗除草剂拟南芥均为转基因拟南芥。杂交结果见图8。
3.5转基因拟南芥抗除草剂特性验证
为检验转mALS3基因拟南芥抗除草剂特性，我们在拟南芥苗期(10张叶片期)依此应用4种ALS抑制剂类除草喷雾叶片。结果见图9-12。
喷咪唑啉酮类除草剂效果:见图9,上为转基因苗,下为非转基因对照。左上下为喷水处理，右上下为喷除草剂处理。本实验喷除草剂咪唑乙酰胺，浓度为田间使用浓度，换算成有效浓度为166.67μg/ml。实验结果显示，非转基因拟南芥在喷除草剂后死亡,而转基因拟南芥能正常生长,表明转基因拟南芥对咪唑啉酮类除草剂具有明显抗性。
喷磺酰脲类除草剂效果:见图10,上为转基因苗,下为非转基因对照。左上下为喷水处理，右上下为喷除草剂处理。本实验喷除草剂苯磺隆，浓度为田间使用浓度，换算成有效浓度为15μg/ml。实验结果显示，非转基因拟南芥在喷除草剂后死亡,而转基因拟南芥能正常生长,表明转基因拟南芥对磺酰脲类除草剂具有明显抗性。
喷三唑嘧啶磺酰胺类除草剂效果:见图11,上为转基因苗,下为非转基因对照。左上下为喷水处理，右上下为喷除草剂处理。本实验喷除草剂双氟磺草胺，浓度为田间使用浓度，换算成有效浓度为4.15μg/ml。实验结果显示，非转基因拟南芥在喷除草剂后死亡,而转基因拟南芥能正常生长,表明转基因拟南芥对三唑嘧啶磺酰胺类除草剂具有明显抗性。
喷嘧啶水扬酸类除草剂效果:见图12,上为转基因苗,下为非转基因对照。左上下为喷水处理，右上下为喷除草剂处理。本实验喷除草剂双草醚，该除草剂系嘧啶水扬酸类除草剂，浓度为田间使用浓度，换算成有效浓度为10μg/ml。实验结果显示，非转基因拟南芥在喷除草剂后死亡,而转基因拟南芥能正常生长,表明转基因拟南芥对嘧啶水扬酸类除草剂具有明显抗性。
小结：本发明尝试应用体外定点突变技术获得一个具有双突变位点即A187V和W556L的油菜mALS3基因，该双突变位在油菜基因组中尚未见文献报道。经过转基因拟南芥初步的功能验证，结果表明含此双突变位点的油菜mALS3基因对多种ALS抑制剂类除草剂咪唑啉酮类(咪唑乙酰胺)、磺酰脲类(苯磺隆)、三唑嘧啶磺酰胺类(双氟磺酰胺)和嘧啶水扬酸类(双草醚)具有明显的抗性。该抗性基因可用于抗除草剂农作物的培育。
SEQ ID NO.1:
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS除草剂基因及应用
<130> 0
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1959
<212> DNA
<213> 油菜M342
<220>
<221> mALS3
<222> (1)..(1959)
<400> 1
atggcggcgg caacatcgtc ttctccgatc tccttaaccg ctaaaccttc ttccaaatcc 60
cctctaccca tttccagatt ctcccttccc ttctccttaa ccccacagaa accctcctcc 120
cgtctccacc gtccactcgc catctccgcc gttctcaact cacccgtcaa tgtcgcacct 180
gaaaaaaccg acaagatcaa gactttcatc tcccgctacg ctcccgacga gccccgcaag 240
ggtgctgata tcctcgtgga agccctcgag cgtcaaggcg tcgaaaccgt cttcgcttat 300
cccggaggtg cctccatgga gatccaccaa gccttgactc gctcctccac catccgtaac 360
gtcctccccc gtcacgaaca aggaggagtc ttcgccgccg agggttacgc tcgttcctcc 420
ggcaagccgg gaatctgcat agccacttcg ggtcccggag ctaccaacct cgtcagcggg 480
ttagccgacg cgatgcttga cagtgttcct ctcgtcgcca tcacaggaca ggtccctcgc 540
cggatgatcg gtactgacgt gttccaagag acgccaatcg ttgaggtaac gaggtctatt 600
acgaaacata actatctggt gatggatgtt gatgacatac ctaggatcgt tcaagaagca 660
ttctttctag ctacttccgg tagacccgga ccggttttgg ttgatgttcc taaggatatt 720
cagcagcagc ttgcgattcc taactgggat caacctatgc gcttgcctgg ctacatgtct 780
aggctgcctc agccgccgga agtttctcag ttaggccaga tcgttaggtt gatctcggag 840
tctaagaggc ctgttttgta cgttggtggt ggaagcttga actcgagtga agaactgggg 900
agatttgtcg agcttactgg gatccctgtt gcgagtacgt tgatggggct tggctcttat 960
ccttgtaacg atgagttgtc cctgcagatg cttggcatgc acgggactgt gtatgctaac 1020
tacgctgtgg agcatagtga tttgttgctg gcgtttggtg ttaggtttga tgaccgtgtc 1080
acgggaaagc tcgaggcgtt tgcgagcagg gctaagattg tgcacataga cattgattct 1140
gctgagattg ggaagaataa gacacctcac gtgtctgtgt gtggtgatgt aaagctggct 1200
ttgcaaggga tgaacaaggt tcttgagaac cgggcggagg agctcaagct tgatttcggt 1260
gtttggagga gtgagttgag cgagcagaaa cagaagttcc cgttgagctt caaaacgttt 1320
ggagaagcca ttcctccgca gtacgcgatt caggtcctag acgagctaac ccaagggaag 1380
gcaattatca gtactggtgt tggacagcat cagatgtggg cggcgcagtt ttacaagtac 1440
aggaagccga ggcagtggct gtcgtcctca ggactcggag ctatgggttt cggacttcct 1500
gctgcgattg gagcgtctgt ggcgaaccct gatgcgattg ttgtggacat tgacggtgat 1560
ggaagcttca taatgaacgt tcaagagctg gccacaatcc gtgtagagaa tcttcctgtg 1620
aagatactct tgttaaacaa ccagcatctt gggatggtca tgcaattgga agatcggttc 1680
tacaaagcta acagagctca cacttatctc ggggacccgg caagggagaa cgagatcttc 1740
cctaacatgc tgcagtttgc aggagcttgc gggattccag ctgcgagagt gacgaagaaa 1800
gaagaactcc gagaagctat tcagacaatg ctggatacac ctggaccgta cctgttggat 1860
gtcatctgtc cgcaccaaga acatgtgtta ccgatgatcc caagtggtgg cactttcaaa 1920
gatgtaataa ccgaagggga tggtcgcact aagtactga 1959
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> ALSF
<222> (1)..(19)
<400> 2
atggcggcgg caacatcgt 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> ALS
<222> (1)..(22)
<400> 3
tcagtactta gtgcgaccat cc 22
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> P0390-35SF
<222> (1)..(39)
<400> 4
caggtcgacg gatccccggg atggtggagc acgacactc 39
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 35-S R
<222> (1)..(25)
<400> 5
agagatagat ttgtagagag agact 25
<210> 6
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 35-S-ALSF
<222> (1)..(34)
<400> 6
tacaaatcta tctctatggc ggcggcaaca tcgt 34
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> ALS-nosF
<222> (1)..(33)
<400> 7
cgcactaagt actgacgttc aaacatttgg caa 33
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> NOSP0390R
<222> (1)..(41)
<400> 8
actcctctta gaattcccgg gcccgatcta gtaacataga t 41
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> ALSRm
<222> (1)..(25)
<400> 9
gtctcttgga acacgtcagt accga 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213>
<220>
<221> ALSFm
<222> (1)..(15)
<400> 10
tcggtactga cgtgttccaa gagac 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213>
<220>
<221> SAF
<222> (1)..(23)
<400> 11
ccatcattgc gataaaggaa agg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213>
<220>
<221> SAR
<222> (1)..(23)
<400> 12
ggttaaggag aagggaaggg aga 23
Claims (8)
1.一种基于体外定点突变获得的油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因，其特征在于，该基因mALS3是利用体外定点突变技术获得的，是在授权专利ZL201310111739.5公开的抗除草剂油菜M342的ALS3基因序列中引入一个新的突变位点，该位点位于ALS3基因的第560位，原来是C碱基，编码187位的丙氨酸，经突变成T碱基后则在187位变成了缬氨酸，该基因mALS3序列为：SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述一种基于体外定点突变获得油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，是指所述油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3在植物抗ALS抑制剂类除草剂方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑嘧啶磺酰胺类或嘧啶水扬酸类除草剂。
5.根据权利要求4所述的应用，所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、双氟磺酰胺或双草醚除草剂。
6.根据权利要求3所述的应用，是指所述油菜抗多种ALS抑制剂类除草剂基因mALS3在拟南芥抗ALS抑制剂类除草剂方面的应用，具体为：
1)引物设计：
2)抗除草剂油菜ALS3基因克隆：以抗除草剂油菜M342基因组DNA为模板，用引物对ALSF/ALSR及高保真DNA聚合酶扩增油菜的ALS3基因：
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA1μl，10μM 35-S-ALSF1μl，10μM ALSR 1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35个循环后，72℃，5min,琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，胶回收纯化2Kb的PCR产物并克隆到peasy-T1载体上经测序确定，获得克隆有抗除草剂油菜M342ALS3基因的peasy-T1质粒；
3)利用重叠PCR引入碱基突变
以克隆有抗除草剂油菜M342的ALS3基因的peasy-T1质粒为模板，分别用引物对ALSF/ALSRm和ALSFm/ALSR扩增出上游片段572bp和下游片段1412bp；
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，3min，95℃，30sec,58℃,30sec,72℃1min,35个循环后，72℃，5min；
琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约572bp和1412bp的上、下游PCR产物后,以上、下游产物的混合物为模板，用引物对ALSF/ALSR扩增出全长的ALS3基因序列；
扩增体系：5×Trans Start FastPfu Buffer10μl,基因组DNA 1μl，10μM引物取1μl，2.5mM dNTPs 5μl,Trans Start FastPfu DNA聚合酶1μl，补足ddH2O到50μl；
温度程序：95℃，1min，55℃30sec,72℃2min,再95℃，30sec,58℃,30sec,72℃2min,35个循环，72℃，5min；
琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物分别回收大小约2000bp的片段，然后克隆到peasy-T1上，并测序分析，该产物序列除了在560处引入了点突变C/T外，其余碱基序列与M342的ALS3基因序列完全一致，定名为mALS3；
4)植物表达载体构建：以载体pCAMBIA2300质粒DNA为模板，分别用引物对p0390-35SF/35SR和ALS-nosF/nosp0390R扩增35S启动子序列450bp和nos终止子序列250bp，胶回收相应大小的PCR产物；
以克隆有mALS3基因的peasy-T1质粒为模板，用引物对35S-ALSF/ALSR扩增mALS3基因，胶回收大小约2000bp的PCR产物，通过重组反应克隆到smalI酶切线性化的pCAMBIA0390载体上:
反应体系如下：5×CE Multis buffer 4μl，mALS3PCR产物2μl，35S PCR产物2μl，nosPCR产物2μl，ExnaseTM 2μl，线性化载体4μl,ddH2O 2μl，于37℃下反应30min，后取5-10μl反应液转化大肠杆菌DH5α，挑克隆PCR鉴定，抽提质粒酶切鉴定，最终经测序确定后，由此获得的质粒定名为p0390-mALS3；
5)拟南芥转化:用上述获得的植物表达载体质粒p0390-mALS3转化农杆菌GV3101，采用农杆菌液浸花的方法转化拟南芥；
6)抗除草剂拟南芥植株的筛选：播种经含质粒p0390-mALS3农杆菌GV3101转化处理的拟南芥T0代种子，在苗期进行ALS抑制剂类除草剂的抗性鉴定，经过除草剂筛选，获得抗除草剂植株。
7.根据权利要求6所述的应用，所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑啉酮类、磺酰脲类、三唑嘧啶磺酰胺类或嘧啶水扬酸类除草剂。
8.根据权利要求7所述的应用，所述ALS抑制剂类除草剂是指咪唑乙酰胺、苯磺隆、双氟磺酰胺或双草醚除草剂。
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