CN107058217A - 一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法。该增殖培养基包括L‑谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必须氨基酸、鸡胚提取物、青霉素、链霉素和高糖DMEM液体培养基。本发明研究发现将鸡胚提取物添加入本发明增殖培养基可显著促进软骨细胞增殖；本发明提供的培养方法细胞获得周期短、数量多，获得细胞的活率高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法。
背景技术
关节软骨是一种由软骨细胞、软骨基质和II型胶原组成的透明软骨，关节的创伤和炎症均可引起关节软骨的损伤。由于关节软骨再生能力有限，如果人软骨先天缺损或者后天损伤或缺损时，通常不会再生，难以自行修复。关节软骨的损伤会导致患者的关节反复疼痛和活动受限，严重影响了患者的日常生活。作为治疗人软骨疾病的现有方法，有从自身的其他部位采集软骨组织移植到缺损部位的方法，但存在采集部位和数量有限的问题。因此，关节软骨的损伤修复一直是骨科研究的重要课题之一。
软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部位，完成组织的修复和重建。软骨组织工程的最终目的就是得到高质量的修复组织和长期有效的功能，为病人最终解决痛苦。从这种意义上看，组织工程方法是目前治疗关节软骨损伤最有希望的方法，是目前软骨损伤修复研究的主要方面。
近年来，研究者致力于应用组织工程学治疗修复关节软骨损伤的研究，但其前提条件是获取足够数量的软骨细胞，即关节软骨细胞的体外培养及扩增问题。使用软骨细胞移植的方法存在三个问题，即：侵袭采集部位的问题、细胞数量及增殖的问题与维持形态时间的问题。针对第一个问题，侵袭采集部位的问题，是指采集用于培养软骨的软骨时，导致该部位缺损、凹陷等畸形或功能障碍，现有常用解决方案是采集肋软骨组织用于后续细胞分离培养。针对第三个问题，长期维持形态的问题，是指由培养的软骨再生的组织长期未被吸收，是否可以持续维持其形态的问题，这取决于第二个问题的解决。目前的研究者或医务人员认为，如果能获得足够量的软骨细胞，就能够解决第三个问题或者至少能够缓解患者疼痛，因为软骨的缺损导致骨与骨之间相互碰撞摩擦从而刺激或损伤神经，产生剧烈疼痛，但是在骨与骨之间存在足够量的细胞就会显著缓解上述问题。因此，需要提供一种可显著促进软骨细胞增殖的培养基及其方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法。该增殖培养基可显著促进软骨细胞增殖；该培养方法细胞获得周期短、数量较多，获得细胞的活率也较高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种软骨细胞的增殖培养基，包括L-谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必须氨基酸、鸡胚提取物、青霉素、链霉素和高糖DMEM液体培养基。
作为优选，增殖培养基中各组分用量为：
在本发明提供的实施例中，增殖培养基中各组分用量为：
作为优选，增殖培养基的pH值为7.2～7.4。
作为优选，非必须氨基酸为甘氨酸(Glycine)、L-丙氨酸(L-Alanine)、L-天门冬酰胺(L-Asparagine)、L-天冬氨酸(L-Aspartic acid)、L-谷氨酸(L-Glutamic Acid)、L-脯氨酸(L-Proline)或L-丝氨酸(L-Serine)中的一种或几种。
在本发明提供的实施例中，非必须氨基酸为甘氨酸、L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸或L-丝氨酸的混合物。
在本发明提供的实施例中，甘氨酸的浓度为0.01mM，L-丙氨酸的浓度为0.01mM，L-天门冬酰胺的浓度为0.01mM，L-天冬氨酸的浓度为0.01mM，L-谷氨酸的浓度为0.01mM，L-脯氨酸的浓度为0.01mM，L-丝氨酸的浓度为0.01mM。
作为优选，鸡胚提取物的制备方法为：去除鸡胚中的鸡眼，然后将去除鸡眼的鸡胚进行匀浆，用等体积的DMEM稀释，在15～30℃、10～100rpm/min条件下摇动1～3h，而后转移至-80～-70℃条件下冻存48h以上，解冻后离心，收集上清液，经过滤除菌，得到鸡胚提取物。
在本发明提供的实施例中，鸡胚提取物的制备方法为：去除鸡胚中的鸡眼，然后将去除鸡眼的鸡胚进行匀浆，用等体积的DMEM稀释，在室温、50rpm/min条件下摇动2h，而后转移至-70℃条件下冻存48h以上，解冻后离心，收集上清液，经过滤除菌，得到鸡胚提取物。
在本发明提供的实施例中，离心为在15000g下离心10min。
在本发明提供的实施例中，在收集上清液与过滤除菌之间还包括离心的步骤。
在本发明提供的实施例中，在收集上清液与过滤除菌之间的离心为在700g下离心10min。
在本发明提供的实施例中，过滤除菌为分别采用0.45μm、0.22μm的滤膜进行过滤除菌。
作为优选，过滤除菌之后还包括纯化的步骤。在本发明中，获得的鸡胚提取物可以适当脱盐后直接使用。此外，也可以通过使用超滤膜、凝胶过滤、各种柱色谱、膜滤器、等电点的方法等进行精制、分级后使用。
作为优选，鸡胚为10～12d的鸡胚。
本发明还提供了一种软骨细胞的增殖培养方法，采用本发明提供的增殖培养基培养软骨细胞。
在本发明提供的实施例中，增殖培养方法包括：将软骨细胞接种于含5％FBS的高糖DMEM培养基培养1天；然后接种到本发明提供的增殖培养基培养3～10天。
作为优选，软骨细胞的接种密度为(0.3～5)×104个/cm2。
在本发明提供的实施例中，培养的条件为5％CO2、37℃。
在本发明提供的实施例中，增殖培养方法包括：将软骨细胞以2×104个/cm2的密度接种到培养容器中，添加含5％FBS的高糖DMEM培养基，于5％CO2、37℃条件下进行培养。在培养1天后，用不含血清的高糖DMEM培养基洗涤1次，添加与含5％FBS的高糖DMEM培养基等体积的本发明增殖培养基，在37℃下继续培养3～10天。
在本发明中，鸡胚提取物具有软骨细胞增殖促进作用、软骨障碍的预防治疗或改善作用、关节痛的预防治疗或改善作用等，因此能够适合作为软骨细胞增殖促进剂、软骨障碍的预防治疗或改善剂、及关节痛的预防治疗或改善剂等的有效成分使用。其中，软骨障碍，可以列举例如变形性关节症、软骨的缺损、软骨损伤、半月板损伤等。
本发明提供了一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法。该增殖培养基包括L-谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必须氨基酸、鸡胚提取物、青霉素、链霉素和高糖DMEM液体培养基。本发明具有如下有益效果：
本发明研究发现将鸡胚提取物添加入本发明增殖培养基可显著促进软骨细胞增殖；
本发明提供的培养方法细胞获得周期短、数量多，获得细胞的活率高。
具体实施方式
本发明公开了一种软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的软骨细胞的增殖培养基及增殖培养方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
以下实施例中使用的非必须氨基酸购自Gbico公司，为100×非必须氨基酸，在使用时为1×非必须氨基酸，即99mL培养基中添加1mL 100×非必须氨基酸，使用浓度换算为0.01mM。
L-谷氨酰胺购自Sigma公司，胎牛血清购自Gibco公司，脯氨酸购自Sigma公司，青霉素-链霉素混合溶液购自Gibco公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：鸡胚提取液的制备
取10-12d的鸡胚，消毒，于气室位置，小心剪开蛋壳，剥除膜，用镊子挑出鸡胚置入无菌玻璃皿，去除鸡眼后经PBS充分清洗血液、卵黄，回收空蛋壳，重复以上步骤直至制备完足够数量的鸡胚为止。提取物经组织捣碎机捣碎匀浆，用等体积的DMEM稀释，盛放于其1.5倍大体积的玻璃瓶中，并于室温条件下，于摇床内50rpm/min摇动2h，而后转移至–70℃冰箱中冻存48h以上，随后解冻，分装，于15000g下离心10min，收集上清液，分装保存。在临用前，将提取物再于700g下，离心10min，去除絮状物，并分别用0.45μm和0.22μm滤膜过滤除菌，获得的滤液即为鸡胚提取液。
实施例2：增殖培养基的配制
本实施例增殖培养基的配方与制备方法如下：
高糖DMEM 液体培养基，2％L-谷氨酰胺，20％胎牛血清，0.4mM脯氨酸，1×非必须氨基酸，0.5％实施例1制备的鸡胚提取液，5×104U/L青霉素，5×104U/L链霉素，pH：7.2～7.4，用0.45μm、0.22μm双滤膜过滤除菌，分装后置于4℃冷藏柜中保存备用。
实施例3：增殖培养基的配制
本实施例增殖培养基的配方与制备方法如下：
高糖DMEM液体培养基，2％L-谷氨酰胺，20％胎牛血清，0.4mM脯氨酸，1×非必须氨基酸，2％实施例1制备的鸡胚提取液，5×104U/L青霉素，5×104U/L链霉素，pH：7.2～7.4，用0.45μm、0.22μm双滤膜过滤除菌，分装后置于4℃冷藏柜中保存备用。
实施例4：增殖培养基的配制
本实施例增殖培养基的配方与制备方法如下：
高糖DMEM液体培养基，2％L-谷氨酰胺，20％胎牛血清，0.4mM脯氨酸，1×非必须氨基酸，5％实施例1制备的鸡胚提取液，5×104U/L青霉素，5×104U/L链霉素，pH：7.2～7.4，用0.45μm、0.22μm双滤膜过滤除菌，分装后置于4℃冷藏柜中保存备用。
试验例1：增殖培养基对软骨细胞增殖的效果的研究
本试验例使用来自小鼠胚细胞的软骨细胞样分化的ATDC5(RIKENBANK、RBC0565)培养细胞株。将ATDC5以2×104个/cm2的密度接种到96孔板，每孔添加100μL含5％FBS(胎牛血清)的高糖DMEM培养基，于5％CO2、37℃条件下进行培养。培养1天后，用不含血清的高糖DMEM培养基洗涤1次。对照组各孔添加不含鸡胚提取液的100μL的高糖DMEM培养基。试验组各孔添加含不同浓度的鸡胚提取液的高糖DMEM培养基(实施例2-4培养基)。在37℃下继续培养3天，培养结束后，用MTT法测定细胞数。以％值(增殖值)形式计算出将鸡胚提取液无添加组的细胞数设为100％时的不同添加量组的细胞数。各组培养基配方见表1，试验结果见表2。
表1：试验组和对照组增殖培养基配方
表2：细胞获得率及增值率
| 分组 | 3天细胞获得率 | 增值率(％) |
| 对照组 | 3.49×104个/孔 | 100 |
| 实验组1 | 4.51×104个/孔 | 129.2 |
| 实验组2 | 5.35×106个/孔 | 153.3 |
| 实验组3 | 6.53×106个/孔 | 187.1 |
如上表所示，鸡胚提取液使ATDC5细胞用量依赖性地增加，即表明其对软骨细胞具有显著的增殖促进作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种软骨细胞的增殖培养基，其特征在于，包括L-谷氨酰胺、胎牛血清、脯氨酸、非必须氨基酸、鸡胚提取物、青霉素、链霉素和高糖DMEM液体培养基。
2.根据权利要求1所述的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基中各组分用量为：
3.根据权利要求1或2所述的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基中各组分用量为：
4.根据权利要求1至3中任一项所述的增殖培养基，其特征在于，所述增殖培养基的pH值为7.2～7.4。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的增殖培养基，其特征在于，所述鸡胚提取物的制备方法为：去除鸡胚中的鸡眼，然后将去除鸡眼的鸡胚进行匀浆，用等体积的DMEM稀释，在15～30℃、10～100rpm/min条件下摇动1～3h，而后转移至-80～-70℃条件下冻存48h以上，解冻后离心，收集上清液，经过滤除菌，得到鸡胚提取物。
6.根据权利要求5所述的增殖培养基，其特征在于，所述过滤除菌之后还包括纯化的步骤。
7.一种软骨细胞的增殖培养方法，其特征在于，采用如权利要求1至6中任一项所述增殖培养基培养软骨细胞。
8.根据权利要求7所述的增殖培养方法，其特征在于，所述增殖培养方法包括：将软骨细胞接种于含5％FBS的高糖DMEM培养基培养1天；然后接种到如权利要求1至6中任一项所述增殖培养基培养3～10天。
9.根据权利要求7或8所述的增殖培养方法，其特征在于，所述软骨细胞的接种密度为(0.3～5)×104个/cm2。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的增殖培养方法，其特征在于，所述培养的条件为5％CO2、37℃。
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