CN107056922A - 一种具有降血糖作用的pacap多肽类似物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法。其是解决现有PACAP天然结构稳定性差的问题。其先是根据PACAP基因以及对基因中重要位点的分析，设计出既具有降糖活性，又能延长半衰期的PACAP类似物，采用全合成的方法获得该种类似物的基因，再通过扩增克隆入表达载体进行原核表达，获得了PACAP多肽类似物。本发明采用原核表达的方法获取PACAP多肽类似物的原核表达产物，其价格低廉，易于操作，降低生产成本；所获得的PACAP多肽类似物稳定性好，同时具有降糖作用，可用于后期产品加工利用。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法。
背景技术
糖尿病是人体营养代谢障碍导致的内分泌疾病，以持续高血糖为其基本生化特征，因胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用，以及胰岛素供给不足，使蛋白质、脂肪和单糖转化失调，导致患者的水、电解质代写紊乱的全身性疾病。分为Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。Ⅱ型糖尿病是最常见的一类，多发于成年人。目前，区别于之前完全使用药物治疗的单一方式，2015年，采用药物和保健复合治疗的糖尿病患者人数比2012年增加了一倍，2015年的中国糖尿病保健品市场比2012年增加了3倍多。
垂体腺苷酸环化酶激活肽（Pitui tary Adenylate Cyclase Activiting Poly-peptide PACAP）是Miy ata等于1989年在寻找新的下丘脑促激素时从羊下丘脑发现的神经肽，因其对大鼠垂体细胞腺苷酸环化酶（AC）的高激活作用而得名，包括PACAP38和PACAP27两种，分别由38和27个氨基酸组成，后者的氨基酸顺序与PACAP38的N末端1～27个氨基酸残基完全相同。此两种多肽广泛分布于许多动物的下丘脑、中枢神经系统、周围神经系统以及非神经组织内肝脏、肾脏、胰腺、呼吸系统和消化系统等组织或系统中，其中肾上腺含量最高，并具有多种生物活性。垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）及其受体在这些组织或系统中，通过Ca2+、Na+、腺苷酸环化酶或磷酸肌醇等作用通路，PACAP发挥神经递质/调质、更发挥着神经营养因子等生物学功能。PACAP不仅是一种新的下丘脑促垂体激素，还是一种新的神经递质和神经调质，PACAP通过作用于PACAP受体，激活腺苷酸环化酶，进而引起初细胞内cAMP水平的增高。此外，它在某些类型细胞的旁分泌和自分泌调节中也发挥作用。近年来有研究表明，PACAP能够通过促进胰岛素分泌，刺激胰岛β细胞增生、阻止胰岛β细胞凋亡、抑制胰高血糖素的释放、抑制胃肠蠕动和胃液分泌、延迟胃排空、产生饱胀感和食欲下降等多重途径来控制血糖。但是，PACAP自身稳定性差，造成体内半衰期短。
发明内容
为了克服现有PACAP天然结构稳定性差存在的体内半衰期短的不足，本发明提供一种步骤合理、易于操作的具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法，该方法通过点突变获得一种PACAP类似物，以达到与PACAP类似的辅助降血糖功能。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、基因设计与合成
全合成点突变后的PACAP类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点；其中，
上述类似物基因序列如下：
5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；
（2）、酶切
将步骤（1）中合成得到的PACAP类似物基因和PGEX-6P-1载体分别采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用2～4h；
（3）、连接
将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用PROMEG公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；
（4）、转化
将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取单克隆并测序；
（5）、原核表达
将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取菌落，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.2～0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s；再用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心30～60s，取上清液，即得PACAP多肽类似物的原核表达粗产物；
（6）、凝胶过滤
将步骤（5）中得到的PACAP多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得PACAP多肽类似物的原核表达产物。
本发明先是根据PACAP基因以及对基因中重要位点的分析，设计出既具有降糖活性，又能延长半衰期的PACAP类似物，采用全合成的方法获得该种类似物的基因，通过扩增克隆入表达载体进行原核表达，获得了PACAP多肽类似物。本发明采用基因合成的方法，免去了基因突变的可能性，为后续步骤提供了前提；其所采用了PGEX-6P-1载体，因为pGEX载体带有一个tac起动子，可作诱导表达用，可以适用于任何大肠杆菌，可以用温和的洗脱条件从亲和介质上洗脱下来，最大限度地减少对抗活性的损伤；其所采用BL21菌种，用于高效表达克隆。本发明采用原核表达的方法获取PACAP多肽类似物的原核表达产物，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的PACAP多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用，可用于后期加工利用，其具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、基因设计与合成
全合成点突变后的PACAP类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点；其中，
上述类似物基因序列如下：
5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；
（2）、酶切
将步骤（1）中合成得到的PACAP类似物基因和PGEX-6P-1载体分别采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用3h；
（3）、连接
将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用PROMEG公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；
（4）、转化
将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取单克隆并测序；
（5）、原核表达
将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取菌落，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养10h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养10h；将500ml菌液接种至60L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.5，向其中加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心45s；再用发酵液体积15%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心45s，取上清液，即得PACAP多肽类似物的原核表达粗产物；
（6）、凝胶过滤
将步骤（5）中得到的PACAP多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得PACAP多肽类似物的原核表达产物。
本实施例采用原核表达的方法获取PACAP多肽类似物的原核表达产物，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的PACAP多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用，可用于后期加工利用，其具有广阔的市场前景。
实施例2
一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、基因设计与合成
全合成点突变后的PACAP类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点；其中，
上述类似物基因序列如下：
5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；
（2）、酶切
将步骤（1）中合成得到的PACAP类似物基因和PGEX-6P-1载体分别采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用4h；
（3）、连接
将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用PROMEG公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；
（4）、转化
将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取单克隆并测序；
（5）、原核表达
将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取菌落，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；将500ml菌液接种至80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心60s；再用发酵液体积20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心60s，取上清液，即得PACAP多肽类似物的原核表达粗产物；
（6）、凝胶过滤
将步骤（5）中得到的PACAP多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得PACAP多肽类似物的原核表达产物。
本实施采用原核表达的方法获取PACAP多肽类似物的原核表达产物，技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的PACAP多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用。
实施例3
一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、基因设计与合成
全合成点突变后的PACAP类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点；其中，
上述类似物基因序列如下：
5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；
（2）、酶切
将步骤（1）中合成得到的PACAP类似物基因和PGEX-6P-1载体分别采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用2h；
（3）、连接
将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用PROMEG公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；
（4）、转化
将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取单克隆并测序；
（5）、原核表达
将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取菌落，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8h；将500ml菌液接种至50L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4，向其中加入IPTG至终浓度为0.2mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30s；再用发酵液体积10%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心30s，取上清液，即得PACAP多肽类似物的原核表达粗产物；
（6）、凝胶过滤
将步骤（5）中得到的PACAP多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得PACAP多肽类似物的原核表达产物。
本实施采用原核表达的方法获取PACAP多肽类似物的原核表达产物，因原核表达技术成熟，价格低廉，易于操作，降低生产成本。本发明获得的PACAP多肽类似物稳定性好，同时也具有降糖作用。
本发明利用实施例1获得的PACAP多肽类似物对糖尿病小鼠血糖的影响作用进行测定，其具体结果如下：
| 组别 | N | 实验前 | 实验后 |
| 正常对照组 | 10 | 3.72±1.21 | 3.69±0.90 |
| 糖尿病对照组 | 10 | 25.72±5.11 | 23.25±3.32 |
| 实验组 | 10 | 25.44±5.61 | 18.05±3.27# |
试验结果表明，本发明所得多肽类似物对实验性糖尿病小鼠具有显著的降糖作用。#与实验前相比P<0.01。
Claims (1)
1.一种具有降血糖作用的PACAP多肽类似物的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、基因设计与合成
全合成点突变后的PACAP类似物基因，全长为84bp；其两端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点；其中，
上述类似物基因序列如下：
5’-cactcagacgctgttttcactgacaactacactcgactccgaaagcagatggcagtaaagaagtacctcaactcaatcctaaac-3’；
（2）、酶切
将步骤（1）中合成得到的PACAP类似物基因和PGEX-6P-1载体分别采用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切温度为37℃，作用2～4h；
（3）、连接
将步骤（2）中得到的酶切片段与载体采用PROMEG公司的回收试剂盒回收后，16℃连接过夜；
（4）、转化
将步骤（3）得到的连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue，挑取单克隆并测序；
（5）、原核表达
将步骤（4）中得到的测序正确的克隆转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取菌落，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.2～0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s；再用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎，12000g离心30～60s，取上清液，即得PACAP多肽类似物的原核表达粗产物；
（6）、凝胶过滤
将步骤（5）中得到的PACAP多肽类似物的原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白，即得PACAP多肽类似物的原核表达产物。
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