CN107056887B - 一种多肽及其在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性结合TRB3的多肽及其在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用。所述多肽的氨基酸序列如将序列表SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为使其他侧链相连的非天然氨基酸所示。所述多肽能够特异性地与TRB3结合，从而阻断TRB3和P62蛋白的相互作用，因此应用于治疗和预防肿瘤的药物的制备中。所制备的药物在治疗肿瘤疾病中，具有疗效显著，毒副作用少，使用安全的优点。

Description

一种多肽及其在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多肽及其在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用。

背景技术

TRB3(Tribbles Homologue 3)是Tribbles同源蛋白家族成员之一，参与调节发育过程中细胞的增殖、迁移及形态形成。TRB3作为假激酶蛋白家族成员，具有接头蛋白样的功能，参与多种蛋白复合体的组装。多项研究认为，TRB3可以与多种转录因子、泛素连接酶、细胞膜上II型BMP受体以及MAPK、PI3K信号通路成员蛋白发生相互作用，参与糖脂代谢、脂肪细胞分化、凋亡和应激等的调控。近来，多种证据表明，TRB3在多种肿瘤细胞系和人肿瘤组织中呈现高表达，并且在肿瘤的发展过程中发挥重要的促进作用。研究发现，TRB3通过与自噬货车蛋白p62发生相互作用，抑制细胞的自噬活性，促进肿瘤细胞的增殖和转移。由此可见，靶向TRB3与p62之间的相互作用是治疗肿瘤的一个潜在靶点。因此，研究和开发阻断TRB3与P62蛋白相互作用的物质，具有很好的抑制肿瘤发生和发展的成药前景。

蛋白-蛋白相互作用(PPIs)在许多生物过程中扮演着重要的角色，例如细胞的增殖、生长、分化及程序性死亡。人类疾病中许多潜在的治疗靶标主要是蛋白-蛋白相互作用。在蛋白-蛋白相互作用的过程中，α螺旋和β折叠二级结构是参与PPIs的主要接触面单元。近年来，用化学合成方式得到高活性、高选择性的合成多肽类药物已经成为新的研究热点。然而，多肽与作用蛋白的结合能力非常弱，普通的线性多肽不能透过细胞膜且易被蛋白酶水解。因此，多肽类靶点药物目前还有很多不足。由上可知，亟待获得靶向TRB3与p62之间的相互作用的，高活性、高选择性的合成多肽类药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前缺乏靶向TRB3与p62之间的相互作用的，高活性、高选择性的合成多肽类药物的现状，提供一种特异性结合TRB3的多肽及其在制备治疗和预防肿瘤的药物中的应用。

本发明的发明人经过深入的研究和反复的试验发现，靶向TRB3与p62蛋白相互作用的多肽A2(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.8)与TRB3的特异性结合能力和生物稳定性都比较低。而其与多肽A2在溶液中不能稳定形成活性所需的α螺旋构象直接相关。由此，发明人进行了针对性的研究和试验，发现如果将多肽A2中特定位置的氨基酸残基替换为侧链可以相连的非天然氨基酸，如S-戊烯丙氨酸(S5)，则改造后的多肽具有稳定的α螺旋的二级结构，使改造后的多肽具有极高的亲和力、抗酶解稳定性以及细胞穿膜性，即提高其α螺旋稳定性、TRB3结合能力和代谢稳定性，抑制多种肿瘤细胞增殖和转移。经实验验证，改造后的多肽能够应用于制备治疗和预防肿瘤的药物中。基于发明人的研究工作，本发明提供下述的技术方案。

本发明提供的技术方案之一是：一种特异性结合TRB3的多肽，所述多肽的氨基酸序列如将序列表SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中的两个或两个以上的氨基酸替换为侧链可相连的非天然氨基酸所示。

所述的使其他侧链相连的非天然氨基酸为本领域常规的非天然氨基酸，较佳的为S-戊烯丙氨酸(S5)。

较佳的，所述的多肽中，所述替换的氨基酸的数目为两个且所述替换的氨基酸的位置分别为第i位和第i+3位，或者，为第i位和第i+4位，其中1≤i≤7，i为正整数。

更佳的，所述的多肽的氨基酸序列如将序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7中任一项所示。

其中，上述SEQ ID No.1-SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中可进行适当地氨基酸替换、缺失或添加，只要使改造后的氨基酸序列仍然能够与TRB3特异性结合并且保持改造前的活性即可。

本发明提供的技术方案之二是：一种特异性结合TRB3的多肽在制备治疗和/或预防肿瘤的药物中的应用。

所述的肿瘤为本领域常规的肿瘤。较佳地是肝癌、肺癌、乳腺癌、肠癌或白血病。其中，所述肝癌为本领域常规的肝癌，较佳的为原发性肝癌或继发性肝癌。所述肺癌为本领域常规的肺癌，较佳的为小细胞肺癌或非小细胞肺癌。所述乳腺癌为本领域常规的乳腺癌，较佳的为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌。所述肠癌为本领域常规的肠癌，较佳的为结肠癌或直肠癌。所述白血病为本领域常规的白血病，较佳的为淋巴细胞型白血病或非淋巴细胞型白血病。

所述预防是本领域常规的预防，较佳的指存在可能的肿瘤因素时，使用后防止或降低肿瘤的产生。所述治疗是本领域常规的治疗，较佳的指减轻肿瘤的程度，或者治愈肿瘤使之正常化，或者减缓肿瘤的进程。

本发明提供的技术方案之三是：一种抗肿瘤的药物组合物，其含有所述的特异性结合TRB3的多肽作为活性成分。

所述的活性成分是指具有预防或治疗肿瘤功能的化合物。在所述药物组合物中，所述特异性结合TRB3的多肽可以单独作为活性成分或和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。

本发明所述的药物组合物的给药途径较佳的为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳的包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型，较佳的为固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液或混悬液，更佳的为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。

较佳地，本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体，所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料，较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地，所述的药物组合物包括0.01-99.99％的上述蛋白质和0.01-99.99％的药用载体，所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。

较佳地，所述的药物组合物的施用量为有效量，所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定，并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的多肽能够特异性地与TRB3结合，阻断TRB3和P62蛋白的相互作用，从而应用于治疗和预防肿瘤的药物的制备中。所制备的药物在治疗肿瘤疾病中，具有疗效显著，毒副作用少，使用安全的优点。

附图说明

图1为表面等离子共振方法验证多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7与TRB3蛋白的结合能力。其中图1(A)为多肽A2与TRB3蛋白的动力学曲线；图1(B)为多肽S1与TRB3蛋白结合动力学曲线；图1(C)为多肽S2与TRB3蛋白结合动力学曲线；图1(D)为多肽S3与TRB3蛋白结合动力学曲线；图1(E)为多肽S4与TRB3蛋白结合动力学曲线；图1(F)为多肽S5与TRB3蛋白结合动力学曲线；图1(G)为多肽S6与TRB3蛋白结合动力学曲线；图1(H)为多肽S7与TRB3蛋白结合动力学曲线。图1中的横坐标为反应时间，单位为秒。纵坐标为反应芯片表面与多肽的反应强度，单位为RU。

图2为多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7干扰TRB3与p62蛋白相互作用图谱。其中A显示A2、S1、S2和S3干扰TRB3与P62蛋白的相互作用；其中B显示S4、S5、S6和S7干扰TRB3与P62蛋白的相互作用。“一”表示输入，即细胞裂解液内TRB3蛋白与P62蛋白的蛋白量；“二”表示输出，即经过P62抗体沉淀之后所含TRB3蛋白与P62蛋白的蛋白量。

图3为多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肝癌细胞HepG2生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为多肽A2。

图4为多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肺癌细胞A549生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为多肽A2。

图5为多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为多肽A2。

图6为多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肠癌细胞HCT-8生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为多肽A2。

图7为多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制白血病细胞K562生长结果图。横坐标为给药时间，单位为天。纵坐标为细胞数量，单位为万。对照为多肽A2。

图8为多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肝癌细胞HepG2迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为多肽A2。***表示p<0.001。

图9为多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肺癌细胞A549迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为多肽A2。***表示p<0.001。

图10为多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为多肽A2。***表示p<0.001。

图11为多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肠癌细胞HCT-8迁移结果图。纵坐标为细胞划痕后修复面积比，单位为百分数。对照为多肽A2。***表示p<0.001。

图12为多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制白血病细胞K562克隆形成结果图。纵坐标为克隆形成数，单位为个。对照为多肽A2。***表示p<0.001。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

若无特别说明，实施例中所用的PBS溶液，指浓度为0.1M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液。

实施例中的室温为本领域常规的室温，较佳的为15-30℃。

实验结果用均值±标准误表示，经参数或者非参数方差检验，经比较p<0.05认为有显著性差异，p<0.01认为有极其显著性差异。

实施例1多肽的合成

多肽A2的氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.8。多肽A2由北京赛百盛基因技术有限公司合成并纯化。

引入两个非天然氨基酸S-戊烯丙氨酸(S5)进行固相多肽链合成。固相多肽链合成完成后采用钌作为催化剂进行烯烃复分解反应(RCM)环化即得目标多肽。最后将目标多肽从树脂上切割下来进行纯化。上述固相多肽链合成及纯化的步骤由中肽生化有限公司公司完成。其中，两个S-戊烯丙氨酸插入在多肽A2氨基酸序列中的第i、i+3位或者i、i+4位，由此得到不同序列的改造后的多肽(氨基酸序列参见序列表SEQ ID No.1-SEQ ID No.7)，其具体插入位点如下所示：

S1：S5-Gly-Trp-S5-Thr-Arg-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys；插入位点第i、i+3位，i＝1；

S2：Gly-S5-Trp-Leu-Thr-S5-Leu-Leu-Gln-Thr-Lys；插入位点第i、i+4位，i＝2；

S3：Gly-Gly-S5-Leu-Thr-Arg-S5-Leu-Gln-Thr-Lys；插入位点第i、i+4位，i＝3；

S4：Gly-Gly-Trp-S5-Thr-Arg-Leu-S5-Gln-Thr-Lys；插入位点第i、i+4位，i＝4；

S5：Gly-Gly-Trp-Leu-S5-Arg-Leu-Leu-S5-Thr-Lys；插入位点第i、i+4位，i＝5；

S6：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-S5-Leu-Leu-Gln-S5-Lys；插入位点第i、i+4位，i＝6；

S7：Gly-Gly-Trp-Leu-Thr-Arg-S5-Leu-Gln-Thr-S5；插入位点第i、i+4位，i＝7。

实施例2用表面等离子共振的方法检测多肽与TRB3蛋白的结合能力

表面等离子共振实验在表面等离子共振仪Biacore T200中进行，操作步骤按照等离子共振仪Biacore T200的说明书进行。具体步骤如下：

1.将纯化的TRB3蛋白(购自RD公司)通过氨基偶联到CM5芯片上(购自GE公司)，按10μL/min的流速洗脱除去未结合的蛋白，并且平衡芯片表面2小时。其中，氨基偶联、洗脱和平衡的具体步骤参见GE公司CM5芯片的相关说明书。

2.自动进样250μL不同浓度(800、400、200、50、12.5、6.25和3.125nM)的实施例1所制备的S1-S7和A2多肽片段，整个表面等离子共振实验在25℃进行。所使用的缓冲液为HBS-EP缓冲液[0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA和0.005％(w/w)表面活性剂]。用BiacoreT200自带分析软件模拟不同浓度多肽与TRB3的结合曲线，结果如图1(A)-(H)和表1所示。图1(A)-(H)和表1说明，肽段S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7与TRB3蛋白的亲和力明显高于多肽A2与TRB3蛋白的亲和力。

表1多肽S1-S7和A2与TRB3蛋白的亲和力测试

实施例3圆二色谱法检测多肽的α螺旋率

用圆二色谱仪(购自日本Jasco公司)检测多肽的α螺旋率。将实施例1所制备的多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7溶解到PBS溶液中，将圆二色谱仪的上机浓度调整为1mg/mL，结果如表2所示。表2说明，多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7的α螺旋率明显高于多肽A2，由于多肽的α螺旋二级结构介导多肽与TRB3蛋白结合，因此，多肽S1-S7的α螺旋率的提高与其和TRB3蛋白结合能力的增加，以及多种肿瘤细胞的增殖和转移有关。其中，α螺旋率指保持二级结构α螺旋的肽段数量占总肽段数量的百分比。

表2圆二色谱法测定多肽α螺旋率

多肽名称

A2

S1

S2

S3

S4

S5

S6

S7

α螺旋率

0.87％

42.1％

39.6％

50.2％

47.8％

46.0％

41.6％

45.0％

实施例4免疫共沉淀的方法验证多肽在细胞水平抑制蛋白p62与TRB3的结合

其中，免疫共沉淀有关试剂如下：

裂解液A液：0.6057g Tris碱、1.7532g NaCl、0.1017g MgCl₂·6H₂O、0.0742gEDTA、10mL甘油和10mL 10％(v/v)NP40，加去离子水至150mL，用HCl调pH值至7.6，定容至191mL，充分混匀，0.45μm滤膜过滤，4℃储存。

裂解液B液：200μL 2Mβ-磷酸甘油、4mL 2.5M NaF、2mL 100mM PMSF、200μL 1M DTT和1mg/mL的Leu、Pep及Apr各200μL，总体积9mL，于-20℃储存。其中，2Mβ-磷酸甘油、2.5MNaF、100mM PMSF、1M DTT和1mg/mL的Leu、Pep及Apr均以母液形式储存，除PMSF的母液以甲醇为溶剂配制以外，其余均以水为溶剂。使用时，将裂解液B液解冻，按裂解液B液:裂解液A液1:100体积比将裂解液B液加入裂解液A液中并混匀。

免疫共沉淀洗液：1％(v/v)NP40、150mM NaCl、20mM Hepes、pH 7.510％(v/v)甘油和1mM EDTA。

Protein A/G Plus-Agarose购自美国Santacruz公司。

具体操作步骤如下：

1.将肝癌HepG2细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所)铺90mm²培养皿，待细胞贴壁后分别加入1mg/mL的实施例1制得的多肽A1、S1、S2、S3、S4、S5、S6或S7，在37℃孵育箱中孵育12小时后收集细胞。

2.以100:1的体积比将裂解液A液和裂解液B液配置成10mL裂解液，加550μl裂解液裂解步骤1收集的细胞，收获细胞中总蛋白，将各组蛋白调整至相同浓度。每组蛋白各取200μg，作为对照。

3.分别取200μg步骤2所得的各组蛋白，加入2μg P62抗体(购自Sigma公司)，同时加入10μL Protein A/G Plus-Agarose(购自Santa Cruze公司)充分重悬，4℃缓慢旋转摇动过夜。4℃、3000rpm离心5min，小心吸除上清。加入0.5mL免疫共沉淀洗液，混匀，冰浴静置1min后4℃、3000rpm离心30秒，小心吸除上清。重复洗涤5次，最后一次离心前静置5min。小心吸除上清，加入30μL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀，95℃变性3min，迅速转移至冰浴冷却。12000rpm室温离心2min，上清即为沉淀的蛋白样品，取部分或全部进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。结果如图2所示。图2的结果说明，多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7干扰TRB3/p62蛋白相互作用能力明显高于多肽A2。

实施例5细胞计数实验验证多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7可以抑制肿瘤细胞的生长

具体操作步骤如下：

1.收集对数生长期的肝癌细胞HepG2(购自中国医学科学院基础医学研究所)、肺癌细胞A549(购自中国医学科学院基础医学研究所)、结肠癌细胞HCT-8(购自中国医学科学院基础医学研究所)、乳腺癌细胞MDA-MB-231(购自中国医学科学院基础医学研究所)和白血病细胞K562(购自中国医学科学院基础医学研究所)，调整细胞浓度，制成15万个/mL的细胞悬液。

2.将1mL步骤1所制得的细胞悬液加入12孔板进行培养(其中HepG2、A549、HCT-8和MDA-MB-231细胞所用培养基为DMEM培养基，K562细胞所用培养基为1640培养基，均购自Invitrogen公司；培养温度为37℃，培养基体积为1mL)，12小时后换成新的培养基，并且加入1μg/mL实施例1所制得的多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7。每隔一天进行传代一次，并进行计数。培养12天后绘制出生长曲线。实验结果见图3-7。图3-7说明多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7相比于A2更能够抑制肿瘤细胞的生长。其中，多肽S1相对于多肽A2对肺癌细胞的生长的抑制水平高达4倍，多肽S2相对于多肽A2对肝癌和结肠癌细胞的生长的抑制水平高达3倍，多肽S3相对于多肽A2对肺癌细胞的生长的抑制水平高达3倍，多肽S4相对于多肽A2对乳腺癌细胞的生长的抑制水平高达3倍，多肽S5相对于多肽A2对肺癌细胞的生长的抑制水平高达3倍，多肽S6相对于多肽A2对白血病细胞的生长的抑制水平高达3倍，多肽S7相对于多肽A2对乳腺癌细胞的生长的抑制水平高达3倍。

实施例6细胞划痕实验验证多肽A1、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肿瘤细胞划痕后的愈合

具体操作步骤如下：

1.先用记号笔在6孔板背后，用直尺比着划横线，横穿过孔。

2.在每个孔中分别加入5×10⁵个肿瘤细胞，在DMEM培养基中37℃孵育箱培养过夜后细胞贴壁。该肿瘤细胞为对数生长期的肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8和乳腺癌细胞MDA-MB-231。

3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线进行划痕，枪头要垂直。

4.用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入新的培养基，同时加入1μg/mL实施例1所制备的多肽A1、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7。

5.然后放入37℃5％(v/v)CO₂培养箱培养，24小时后取样拍照。实验结果见图8-11和表3-6，其中损伤修复面积比指修复后的损伤面积与修复前的损伤面积的比值，单位为百分数。表3-6的结果说明，损伤修复面积比越大说明肿瘤细胞的迁移能力越强，细胞划痕后愈合能力越强。因此多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7可以降低肿瘤细胞划痕后的愈合能力。

表3多肽S1-S7和A2抑制肝癌细胞HepG2迁徙

多肽名称	损伤修复面积比
		A2(对照)	79.4±1.05
S1	22.6±0.33
		S2	18.7±0.51
S3	19.8±0.69
		S4	12.1±0.47
S5	13.3±0.31
		S6	29.1±0.41
S7	20.0±0.35

表4多肽S1-S7和A2抑制肺癌细胞A549迁徙

表5多肽S1-S7和A2抑制结肠癌细胞HCT-8迁徙

多肽名称	损伤修复面积比
		A2(对照)	67.7±2.33
S1	24.5±1.97
		S2	18.2±2.30
S3	12.7±2.37
		S4	12.6±2.29
S5	12.5±2.60
		S6	12.1±1.92
S7	11.2±1.01

表6多肽S1-S7和A2抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231迁徙

多肽名称	损伤修复面积比
		A2(对照)	91.3±3.22
S1	36.7±2.91
		S2	20.3±2.11
S3	10.5±1.92
		S4	21.7±3.35
S5	20.4±4.47
		S6	10.4±1.96
S7	17.9±1.05

实施例7克隆形成实验验证多肽A1、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制白血病细胞的克隆形成

其操作步骤如下：

1.铺下层琼脂：5％(w/w)琼脂沸水浴至完全融化，冷却至50℃，加9倍体积37℃预温的1640培养液(购自Invitrogen公司)，混匀，加入24孔板，每孔0.8mL，室温凝固备用。

2.铺上层琼脂：9.4mL细胞悬液中加入0.6mL 50℃5％(w/w)琼脂，混匀，加入已铺好下层琼脂的24孔板，每孔0.8mL。室温凝固。每孔细胞数100个。其中，细胞悬液的制备方法为：将白血病细胞K562用1640培养液稀释，调整浓度为132个细胞/mL。

3.将步骤2所得的细胞用1640培养液在37℃孵育箱中孵育培养3周，计算克隆形成数量。

其结果如图12和表7所示。表7的结果说明，多肽S1-S7相对于多肽A2对白血病细胞克隆形成的抑制水平显著提高。

表7多肽S1-S7和A2抑制白血病细胞的克隆形成

多肽名称	克隆形成数(个)
		A2(对照)	110±2.94
S1	53±5.7
		S2	47±2.3
S3	27±5.5
		S4	30±5.4
S5	34±6.1
		S6	29±5.3
S7	19±2.1

实施例8肿瘤皮下生长实验验证多肽A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7抑制肿瘤细胞在小鼠体内的生长

操作步骤如下：

1.实验耗材及试剂：灭菌EP管1.5mL，15mL离心管，枪头，滤网(100目)，脱脂棉球，镊子数把，酒精棉球，无菌1mL注射器，500mL烧杯(灭菌，用前照紫外)，PBS(过滤)，胰酶，血清。

2.实验动物及分组：4-6周龄雄性裸鼠80只(购自北京维通利华实验动物有限公司)，随机分为8组：A2、S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7组，每组10只。

3.细胞制备：将贴壁培养的肿瘤细胞用胰酶消化，到达胰酶消化时间后(此时细胞状态应为单细胞且刚好贴壁不掉)，吸掉胰酶。用含有1％血清的PBS按2mL/皿终止，将细胞吹下，移至15mL离心管中，1200转离心5min。弃上清，PBS重悬，过100目滤网一次；细胞计数，调整细胞终浓度至2.5×10⁷/mL。该肿瘤细胞为对数生长期的肝癌细胞HepG2、肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT-8和乳腺癌细胞MDA-MB-231。悬浮的白血病细胞K562直接收集至15mL离心管，1200转离心5min。弃上清，PBS重悬，过100目滤网一次；细胞计数，调整细胞终浓度至2.5×10⁷/mL。

4.肿瘤细胞接种：接种5×10⁶个肿瘤细胞(细胞悬液200μl)于裸鼠左上腹部近腋下皮下。

5.肿瘤生长观察：皮下注射肿瘤细胞后一周用多肽进行治疗(5mg/kg体重，每周两次)，游标卡尺纪录肿瘤大小。

其结果如表8-表12所示，各表中多肽S1-S7与对照组A2比较的p值均小于0.001。肿瘤体积越大表明肿瘤生长越快，因此多肽S1、S2、S3、S4、S5、S6和S7可以抑制肿瘤细胞在小鼠体内生长。

表8多肽S1-S7和A2抑制肝癌细胞HepG2在小鼠体内生长

表9多肽S1-S7和A2抑制结肠癌细胞HCT-8在小鼠体内生长

多肽名称	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)
		A2(对照)	1754±107.9
S1	583.4±68.2
		S2	501.8±81.9
S3	488.8±62.4
		S4	496.5±81.7
S5	606.4±74.3
		S6	511.1±54.6
S7	619.8±75.5

表10多肽S1-S7和A2抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231在小鼠体内生长

多肽名称	肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)
		A2(对照)	2379.4±165.4
S1	666.1±74.3
		S2	718.7±67.5
S3	570.8±69.4
		S4	730.1±84.7
S5	737.3±83.1
		S6	629.5±54.1
S7	598.8±75.9

表11多肽S1-S7和A2抑制肺癌细胞A549在小鼠体内生长

表12多肽S1～S7和A2抑制白血病细胞K562在小鼠体内生长

多肽名称	肿瘤体积(mm3)
		A2(对照)	1996.4±1.05
S1	572.6±63.9
		S2	638.9±75.1
S3	699.8±69.0
		S4	722.1±94.7
S5	703.3±73.6
		S6	693.1±54.8
S7	589.9±75.2

上述实施例结果表明，本发明的多肽具有显著的抗肿瘤作用，可作为活性成份用于制备抗肿瘤的药物。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种特异性结合TRB3的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如序列表SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ IDNo.7中任一项所示。

2.如权利要求1所述的特异性结合TRB3的多肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌、肺癌、乳腺癌、肠癌或白血病。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的肝癌为原发性肝癌或继发性肝癌；所述肺癌为小细胞肺癌或非小细胞肺癌；所述乳腺癌为非浸润性乳腺癌、早期浸润性乳腺癌、浸润性特殊类型乳腺癌或浸润性非特殊类型乳腺癌；所述肠癌为结肠癌或直肠癌；所述白血病为淋巴细胞型白血病或非淋巴细胞型白血病。

5.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1所述的特异性结合TRB3的多肽。

6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，其还包括一种或多种药用载体。

7.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，其含有如权利要求1所述的特异性结合TRB3的多肽单独作为活性成分；或者，其含有如权利要求1所述的特异性结合TRB3的多肽和其他具有抗肿瘤活性的化合物一起作为活性成分。

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