CN107037031A - 反射式差动共焦cars显微光谱测试方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于显微光谱成像探测技术领域，涉及一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法及装置。本发明的核心思想是双激光器作为光源激发瑞利光和载有被测样品光谱特性的CARS光，利用二向色分光系统对瑞利光和CARS光进行无损分离，其中瑞利光进行几何探测与定位，CARS光进行光谱探测。本发明利用差动共焦曲线过零点与焦点位置精确对应这一特性，精确捕获和定位激发光斑焦点位置，实现高精度的几何探测和高空间分辨的光谱探测，构成一种可实现样品微区高空间分辨光谱探测的方法和装置。通过结合CARS显微技术，激发出的载有样品信息的拉曼散射光的时间比传统自发拉曼效应要短，能快速无损对样品进行检测。本发明具有定位准确、高空间分辨、无损探测、光谱探测灵敏度高等优点，为微区光谱探测和几何测量提供了一种新的途径。

Description

反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法及装置

技术领域

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法及装置，可用于快速检测各类样品的微区反斯托克斯散射(CARS)光谱，可实现高空间分辨成像与探测。

技术背景

光学显微镜在生物医学领域和材料科学领域被广泛应用，而随着现代科学的快速发展，对显微成像的要求也从结构成像转向功能成像。1990年，共焦拉曼光谱显微技术的成功应用，极大的提高了探索微小物体具体组织成分及形貌的可能。它将共焦显微技术和拉曼光谱技术相结合，具备共焦显微术的高分辨层析成像特征，又兼有无伤检测和光谱分析能力，已成为一种重要的材料结构测量与分析的技术手段，广泛应用于物理、化学、生物医学、材料科学、石油化工、食品、药物、刑侦等领域。

传统的自发拉曼散射成像技术由于拉曼散射本身特性导致其发射信号极弱，即便用高强度的激光激发，要得到一副对比度好的光谱图像，依然需要很长的作用时间。这种长时间作用限制了拉曼显微技术在生物领域的应用。基于相干拉曼效应的相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)过程能够很大程度上增强拉曼信号，从而实现快速检测。相干拉曼效应是通过受激激发的光将分子锁定在振动能级上，这种方法产生的振动信号的强度与激发光的强度成非线性关系，可以产生很强的信号，也称为相干非线性拉曼光谱。它具有很强的能量转换效率，曝光时间短，对样品的损害也比较小，同时它的散射具有一定的方向性，容易与杂散光分离。

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)的产生是一个三阶非线性光学过程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探测光。一般而言，为了减少光源的数量，简化过程，常用泵浦光代替探测光，它们之间的关系如图2所示，当泵浦光(w_p)和斯托克斯光(w_s)的频率之差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，将激发出CARS光w_as，其中w_as＝2w_p-w_s。CARS光的产生过程包含特定的拉曼活性分子的振动模式和导致分子从基态至激发态振动跃迁的入射光场的相互作用过程，它的能级示意图如图3所示。图3(a)表示拉曼共振和非共振单光子增强对CARS过程的贡献，图3(b)表示拉曼共振和非共振双光子增强对CARS过程的贡献；当Ep和Es之间的频差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，激发出的信号得到共振增强；

传统CARS显微术大多采用两个单波长激光器，只能获得特定频谱的光谱信息，而且传统CARS显微术没有强调系统的定焦能力，导致实际光谱探测位置往往处于离焦位置。即便离焦位置也能激发出样品的拉曼光谱并被针孔后的光谱仪探测，但是强度并不能合理表征该点正确的光谱信号强度。在CARS显微系统中，只有当系统精确定焦，才能获得最佳空间分辨力和最好的光谱探测能力。

上述原因限制了CARS显微系统探测微区光谱的能力，制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用。基于上述情况，本发明提出将系统收集到的样品表面散射的强于样品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光进行高精度探测，使其与光谱探测系统有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同步探测，以实现高空间分辨的、高光谱分辨的差动共焦CARS图谱成像和探测。

本发明专利的核心思想是选用超连续谱脉冲激光器和单波长脉冲激光器作为激发光源，扩大激发光谱范围，提高光谱激发强度；将共焦探测光路分成两个部分，两个探测光路的光电点探测器分别置于焦前焦后等距位置来实现差动探测，根据差动的原理，实现双极性绝对零点跟踪测量，精确定焦，实现高空间分辨；精确定焦后，进行光谱探测，获得最佳光谱分辨能力。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种高空间分辨的反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法及其装置。

本发明是通过以下技术方案实现的。一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法，包括以下步骤：

a)超连续谱激光由超连续谱激光器(3)发出，经过带通滤光片(4)后通过一个二向色镜(5)与单波长激光器(2)发出的单波长激光汇合，通过调整光路使两束光束时序一致、空间重合(单波长激光包络于连续谱激光)；混合光束经过半反半透棱镜(6)由显微物镜(8)会聚在被测样品(9)上，激发出瑞利光和载有被测样品(9)光谱特性的CARS光；

b)CARS光和瑞利光经过二向色镜(11)后分成两束，其中包含CARS光的光束进入光谱探测单元(12)，另一束包含瑞利光的光束进入差动共焦探测单元(18)；在光谱探测单元(12)中，包含CARS光的光束先经过带通滤光片(13)，滤除光束中的非CARS干扰光，然后通过第一聚光镜(14)会聚进入光谱仪(17)，获得CARS光谱信息I(λ)；另一束载有瑞利光的光束通过半反半透棱镜(19)分成两束，分别进行焦前、焦后探测，其中一束光通过第三聚光镜(20)后通过位于焦前的第二针孔(21)滤除杂散光后被第一光电探测器(22)探测，获得前焦信号I(u₀-u_M)，另一束光通过第四聚光镜(23)后通过位于焦后的第三针孔(24)滤除杂散光后被第二光电探测器(25)探测，获得后焦信号I(u₀+u_M)，其中u_M为第一针孔和第二针孔相对于物镜焦点的偏移距离。

c)将前焦信号I(u₀-u_M)与后焦信号I(u₀+u_M)归一化相减后，得到差动共焦曲线I(u_M)，利用差动共焦响应曲线的“过零点”与测量物镜焦点位置精确对应特性，通过“过零点”触发来精确捕获激发光斑焦点位置，实现高空间分辨的几何探测和空间定位。

d)通过计算机处理得到被测样品(9)表面位置(激发光斑焦点)，控制Z向平移台(7)带动显微物镜(8)移动，使激光聚焦在被测样品(9)上，通过光谱探测单元(12)获取该点的CARS光谱信息。

e)单独处理瑞利光的信号，可实现高空间分辨的三维尺度层析成像；单独处理CARS光谱信号，可获得光谱图像；同时处理瑞利信号和CARS光谱信号，可实现高空间分辨的图谱层析成像，即实现被测样品几何位置信息和光谱信息的图谱合一成像与探测。

特别的，在本发明方法中，激发光束由两束频率相同，时间一致的脉冲激光组成，其中一束是单波长脉冲激光，作为泵浦光和探测光，另一束是超连续谱脉冲激光，作为斯托克斯光。

特别的，在本发明方法中，光谱仪(17)前添加针孔(15)可过滤杂散光，提高光谱探测的信噪比。

特别的，在本发明方法中，激发光束包括线偏光、圆偏光、径向偏振光等偏振光束和由光瞳滤波等技术生成的结构光束，由此提高系统光谱信号信噪比和系统横向分辨率。

特别的，在本发明方法中，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，可以实现不同谱段的光谱探测；其中，带通滤光片(4)与带通滤光片(13)的滤光谱带关于单波长激光器(2)的中心波长对称。

特别的，在本发明方法中，激光发射单元(1)还可以用单波长激光器(2)加光子晶体光纤(34)进行光谱展宽实现，此外，将光谱探测单元(12)中的光谱仪(17)替换成光电点探测器，旋转偏振片(38)可以实现光谱扫描输出，进而激发CARS光谱并由光电点探测器探测得到CARS光谱信号；

本发明提供了一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试装置包括：光谱激发单元、位于光谱激发单元入射方向的激光发射单元(1)、位于光谱激发单元出射方向的二向色单元(11)、位于二向色单元(11)透射方向的光谱探测单元(12)、位于二向色单元(11)反射方向的差动共焦探测单元(18)、控制整个系统的计算机(39)。激光发射单元(1)由单波长脉冲激光器(2)、超连续谱脉冲激光器(3)、带通滤光片(4)和二向色镜(5)组成；光谱激发单元由半反半透棱镜(6)、光瞳滤波器(32)、Z向平移台(7)、显微物镜(8)、待测样品(9)和X-Y平移台(10)组成；二向色单元(11)即二向色镜(11)；光谱探测单元(12)由带通滤光片(13)、第一聚光镜(14)、第一针孔(15)、第二聚光镜(16)和光谱仪(17)组成；激光差动共焦探测单元(18)由半反半透棱镜(19)、第三聚光镜(20)、第二针孔(21)、第一光电探测器(22)、第四聚光镜(23)、第三针孔(24)、第二光电探测器(25)组成，其中，第二针孔(21)位于第三聚光镜(20)焦前，距离为S1，第三针孔(24)位于第四聚光镜(23)焦后，距离为S2，S1＝S2。

在本发明装置中，二向色镜(11)与分光棱镜(6)反射光束轴线的夹角可变，可选择适当的角度以满足本装置的结构设计，从而提高系统的灵活性。

在本发明装置中，可通过计算机(39)控制切换不同倍数的显微物镜，辅助测量和观测。

在本发明装置中，Z向平移台(7)、X-Y平移台(10)、光谱探测单元(12)、差动共焦探测单元(18)均由计算机(39)实现联动控制与测量。

有益效果

本发明方法，对比已有技术具有以下创新点：

1、本发明将激光差动共焦显微技术与CARS光谱探测技术有机结合，利用差动共焦曲线“零点”位置与显微物镜焦点位置精确对应的特性，精确捕捉激发光斑焦点位置并探测光谱信息，从而实现高空间分辨的光谱层析成像与探测。

2、本发明中利用二向色镜将瑞利光和载有样品信息的CARS光进行分离，其中瑞利光进入差动共焦探测单元实现几何位置探测，CARS光进入光谱探测单元实现CARS光谱探测，通过精准定焦捕获激发光斑焦点的光谱信息，提高了系统光谱探测灵敏度。此外，二向色分光装置可以根据需要调整角度，方便结构装调。

3、本发明将差动共焦显微系统和CARS光谱成像系统在结构上和功能上结合，可实现样品微区几何参数的层析成像，又可实现样品微区的光谱探测，还可实现图谱层析成像。

本发明方法，对比已有技术具有以下显著优点：

1、本发明采用的差动共焦探测方式，利用差动相减噪声相消的特性，抗环境干扰能力强。

2、本发明利用差动共焦技术对测量聚焦光斑进行高精度定位，并对焦点位置进行实时跟踪测量，消除温度和扰动等环境影响，实现CARS谱探测始终精确对应最小激发聚焦光斑区域的样品光谱，大幅提高现有CARS显微镜的微区光谱探测能力和几何位置探测能力。

3、本发明采用超连续激光匹配单波长激光作为激发光源，可以实现宽谱带CARS光谱探测。

附图说明

图1为摘要附图，即本发明基本实施图；

图2为相干反斯托克斯(CARS)光激发原理图；

图3为CARS光与泵浦光、斯托克斯光的关系图；

图4为反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图；

图5为差动共焦响应曲线图；

图6为改进光谱探测的反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图；

图7为加光瞳滤波器的反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图；

图8为二向色镜方向可调整的反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图；

图9为单激光器的反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图；

图10为时域扫描的反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图；

图11为反射式差动共焦CARS显微测试装置图，即实施例用图；

图中，1-激光发射单元、2-单波长激光光源、3-超连续谱激光光源、4-带通滤光片、5-二向色镜、6-分光棱镜、7-Z向平移台、8-显微物镜、9-被测样品、10-X-Y平移台、11-二向色镜、12、光谱探测单元、13-带通滤光片、14-第一聚光镜、15-第一针孔、16-第二聚光镜、17-光谱仪、18-差动共焦探测单元、19-分光棱镜、20-第三聚光镜、21-第二针孔、22-第一光电探测器、23-第四聚光镜、24-第三针孔、25-第二光电探测器、26-减法电路、27-前焦光斑、28-前焦曲线、29-后焦光斑、30-后焦曲线、31-差动曲线、32-光瞳滤波器、33-偏振分光棱镜、34-光子晶体光纤、35-第一反射镜、36-光学延时器、37-第二反射镜、38-偏振片、39-光电点探测器、40-计算机；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

图4是反射式差动共焦CARS显微光谱探测方法示意图。首先，选用一个单波长脉冲激光器(2)作为泵浦光源和探测光源，由它发出泵浦光(探测光)，然后选用一个频率与之一致的超连续谱脉冲激光器(3)作为斯托克斯光源，在经过带通滤光片(4)后得到要求波长范围内的连续谱激光，通过调节光学结构，使两束激光通过二向色镜(5)时间一致，空间重合；混合后的光先经过一个分光棱镜(6)，后通过一个固定在Z向平移台(7)上的高倍显微物镜(8)聚焦在被测样品(9)上；由于在紧聚焦的情况下，相位匹配的条件易满足，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的CARS光；CARS光和瑞利光经二向色镜(11)后分别到达光谱探测单元(12)和差动共焦探测单元(18)；其中，光谱探测单元(12)对CARS光进行光谱探测，差动共焦探测单元(18)对瑞利光进行几何位置探测。

在差动共焦探测单元(18)中，第二针孔(21)位于第三聚光镜(20)焦点前距离为s₁的位置，由第一光电探测器(22)获得前焦信号(28)；第三针孔(24)位于第四聚光镜(23)焦点后距离为s₂位置(s₁＝s₂)，由第二光电探测器(25)获得后焦信号(30)；将前焦信号和后焦信号做差处理，即得到差动共焦曲线(31)，即图5。

如图6所示，在光谱探测单元(12)中，添加第一针孔(15)过滤杂散光，再由第二聚光镜(16)将CARS光会聚进入光谱仪(17)，由此提高光谱探测的信噪比；

在分光棱镜(6)和显微物镜(8)之间添加光瞳滤波器(32)产生结构光束，将获得更高空间分辨力的光谱探测效果，即图7。

在本发明基本实施方法中，二向色镜(11)与分光棱镜(6)反射光束轴线的夹角可变，相对应的共焦探测单元(18)的位置可以调整，即图8，这种结构设计有利于本发明方法的实现。

图9是单激光器的反射式差动共焦CARS显微测试方法示意图，目的是将激光发射单元的双激光器输入改为单激光器输入，降低成本；单波长脉冲激光器(2)发出单波长激光，经偏振分光棱镜(33)分光，透射部分进入光子晶体光纤(34)进行谱带展宽并用带通滤波片(4)进行特定要求波长截取，反射部分经第一反射镜(35)、光学延时器(36)和第二反射镜(37)后与展宽后的连续谱激光在二向色镜(5)处进行耦合，输出空间一致、时间一致的混合光束，对被测样品进行CARS光谱激发。其中，光学延时线(36)的作用是保证两束激光时序重合。

将图9中光谱探测单元(12)中的光谱仪(17)替换成光电点探测器(39)，在偏振分光棱镜(33)和光子晶体光纤(34)之间添加偏振片(38)，即构成图10；通过旋转偏振片(38)，改变光束的偏振态，使光子晶体光纤(34)输出的光束实现光谱扫描输出，结合光学延时线(36)可以实现时域扫描CARS光谱激发，进而实现宽谱带的CARS光谱测量。

实施例

在本实施例中，采用波长为532nm的皮秒激光器作为泵浦光源和探测光源，采用重复频率与之一致的超连续谱皮秒激光器添加550～650nmm带通滤光片作为斯托克斯光源，在满足空间重合，时间一致的条件下混合出射，通过光瞳滤波器获得结构光束后通过高倍显微物镜紧聚焦在样品上，此时满足相位匹配条件，激发出波长范围在450～515nm的反斯托克斯光(CARS)和波长为532nm的瑞利光。

如图11所示,为反射式差动共焦CARS显微光谱测试装置，其测试步骤如下：

首先，在激光发射单元(1)中，超连续谱激光器(3)发出的连续谱激光通过带通滤光片(4)滤光后得到550～650的宽带激光，然后与单波长(532nm)激光器(2)发出单色激光在二向色镜(5)处汇合,形成混合光束，其中，这两束激光重复频率一致，到达二向色镜(5)时间一致，光束汇合后能够完全重合(泵浦光斑完全包络于斯托克斯光斑)；混合光束经过分光棱镜(6)后，到达光瞳滤波器(32)，产生结构光束；结构光束通过位于Z向平移台(7)上的显微物镜(8)紧聚焦在被测样品(9)上，激发出瑞利光和载有被测样品(9)光谱特性的CARS光。

此时，对样品扫描可通过以下方式完成：由位于显微物镜(8)上的PZT(7)实现Z向扫描，由位于样品(9)下的载物台(10)实现x-y方向位移扫描，或在激光出射后的光路中添加振镜扫描结构，实现x-y方向扫描。

被测样品反射回的光束包含斯托克斯光λ_s、泵浦光λ₀、瑞利光λ₀、CARS光λ_as；其中，CARS光λ_as和斯托克斯光λ_s进入光谱探测单元(12)，532nm的泵浦光和瑞利光经二向色镜(11)反射进入差动共焦探测单元(18)。在光谱探测单元(12)中，由斯托克斯光λ_s和CARS光λ_as混合的光先经过450～515nm的带通滤光片(13)后只保留CARS光，然后通过第一聚光镜(14)会聚通过第一针孔(15)，过滤环境光后再由第二聚光镜(16)会聚进入光谱仪(17)，从而探测得到CARS光谱I(λ)，其中λ为被测样品(9)受激发光所激发出CARS光的波长。在差动共焦探测单元(18)中，瑞利光λ₀先经过一个半反半透分光棱镜(19)分光，一半光通过第三聚光镜(20)会聚通过位于焦前的针孔(21)，最终被第一光电探测器(22)所探测，得到前焦信号I(u₀+u_M)；另一半光通过第四聚光镜(23)会聚通过位于焦后的针孔(24)，最终被第二光电探测器(25)所探测，得到后焦信号I(u₀-u_M)。差动相减模块26是一个减法电路，能够将前焦信号与后焦信号做差，获得差动信号:

I(u_M)＝I(u_o+u_M)-I(u_o-u_M)

其中，I(u₀+u_M)为前焦响应，I(u_o-u_M)为后焦响应，I(u_M)为差动共焦响应；u_o为轴向偏移，u_M为针孔轴向偏移量。激光差动共焦响应曲线(31)的“零点”与激发光束的聚焦焦点精确对应，通过响应曲线(31)的“零点”获得被测样品(9)表面的高度信息，结合连接平移台(10)的位移传感器反馈的位置信息通过计算机(40)重构出被测样品(9)的表面三维形貌I(x,y,z)。

计算机(40)控制Z向平移台(7)使激光精确聚焦在被测样品(9)表面，激发出能正确表征被测样品光谱特性的CARS光谱I(λ)，被光谱探测单元(12)采集，通过计算机(40)将位置信息I(x,y,z)和光谱信息I(λ)融合，完成被测样品(9)的三维重构及光谱信息融合I(x,y,z,r)。此外，计算机系统还贯穿于整个系统，计算机(40)用于实现对Z向平移台(7)、X-Y平移台(10)的位移控制、差动共焦信号和CARS光谱信号的采集处理以及数据融合处理。

以上，沿激光出射方向，依次放置激光发射单元(1)，分光棱镜(6)，在分光棱镜(6)透射方向放置光瞳滤波器(32)、Z向平移台(7)、显微物镜(8)、被测样品(9)、X-Y平移台(10)，在分光棱镜(6)反射方向放置二向色镜(11)，在二向色镜(11)透射方向放置光谱探测单元(12)，在二向色镜(11)反射方向放置差动共焦探测单元(18)。激光发射单元(1)包括位于二向色镜(5)透射方向的超连续谱激光器(3)、带通滤光片(4)和二向色镜(5)反射方向的单波长脉冲激光器(2)；光谱探测单元(12)中依次放置带通滤光片(13)、第一聚光镜(14)、第一针孔(15)、第二聚光镜(16)、光谱仪(17)；在差动共焦探测单元(18)中，在分光棱镜(19)透射方向依次放置第三聚光镜(20)、第二针孔(21)、第一光电探测器(22)，在分光棱镜(19)反射方向依次放置第四聚光镜(23)、第三针孔(24)、第二光电探测器(25)；在整个系统中，单波长脉冲激光器(2)、超连续谱激光器(3)、X-Y平移台(10)、Z向平移台(7)、光谱仪(17)、第一光电探测器(22)、第二光电探测器(25)、减法电路(26)均受计算机(40)控制，系统得到的三维位置信息和光谱信息也由计算机(40)进行融合处理。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法及装置，其特征在于包括以下步骤：

a)超连续谱激光由超连续谱激光器(3)发出，经过带通滤光片(4)后通过一个二向色镜(5)与单波长激光器(2)发出的单波长激光汇合，通过调整光路使两束光束时序一致、空间重合(单波长激光包络于连续谱激光)；混合光束经过半反半透棱镜(6)由显微物镜(8)会聚在被测样品(9)上，激发出瑞利光和载有被测样品(9)光谱特性的CARS光；

b)CARS光和瑞利光经过二向色镜(11)后分成两束，其中包含CARS光的光束进入光谱探测单元(12)，另一束包含瑞利光的光束进入差动共焦探测单元(18)；在光谱探测单元(12)中，包含CARS光的光束先经过带通滤光片(13)，滤除光束中的非CARS干扰光，然后通过第一会聚镜(14)会聚进入光谱仪(17)，获得CARS光谱信息I(λ)；另一束载有瑞利光的光束通过半反半透棱镜(19)分成两束，分别进行焦前、焦后探测，其中一束光通过第三会聚镜(20)后通过位于焦前的第二针孔(21)滤除杂散光后被第一光电探测器(22)探测，获得前焦信号I(u₀-u_M)，另一束光通过第四会聚镜(23)后通过位于焦后的第三针孔(24)滤除杂散光后被第二光电探测器(25)探测，获得后焦信号I(u₀+u_M)，其中u_M为第一针孔和第二针孔相对于物镜焦点的偏移距离。

c)将前焦信号I(u₀-u_M)与后焦信号I(u₀+u_M)归一化相减后，得到差动共焦曲线I(u_M)，利用差动共焦响应曲线的“过零点”与测量物镜焦点位置精确对应特性，通过“过零点”触发来精确捕获激发光斑焦点位置，实现高空间分辨的几何探测和空间定位。

d)通过计算机处理得到被测样品(9)表面位置(激发光斑焦点)，控制Z向平移台(7)带动显微物镜(8)移动，使激光聚焦在被测样品(9)上，通过光谱探测单元(12)获取该点的CARS光谱信息。

e)单独处理瑞利光的信号，可实现高空间分辨的三维尺度层析成像；单独处理CARS光谱信号，可获得光谱图像；同时处理瑞利信号和CARS光谱信号，可实现高空间分辨的图谱层析成像，即实现被测样品几何位置信息和光谱信息的图谱合一成像与探测。

2.根据权利1所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，激发光束由两束频率相同，时间一致的脉冲激光组成，其中一束是单 波长脉冲激光，作为泵浦光和探测光，另一束是超连续谱脉冲激光，作为斯托克斯光。

3.根据权利1所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，光谱仪(17)前添加针孔(15)可过滤杂散光，提高光谱探测的信噪比。

4.根据权利1所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，激发光束包括线偏光、圆偏光、径向偏振光等偏振光束和由光瞳滤波等技术生成的结构光束，由此提高系统光谱信号信噪比和系统横向分辨率。

5.根据权利1所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，可以实现不同谱段的光谱探测；其中，带通滤光片(4)与带通滤光片(13)的滤光谱带关于单波长激光器(2)的中心波长对称。

6.根据权利1所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试方法，其特征在于，本发明方法中激光发射单元(1)还可以用单波长激光器(2)加光子晶体光纤(34)进行光谱展宽实现，此外，将光谱探测单元(12)中的光谱仪(17)替换成光电点探测器，旋转偏振片(38)可以实现光谱扫描输出，进而激发CARS光谱并由光电点探测器探测得到CARS光谱信号。

7.一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试装置包括：光谱激发单元、位于光谱激发单元入射方向的激光发射单元(1)、位于光谱激发单元出射方向的二向色单元(11)、位于二向色单元(11)透射方向的光谱探测单元(12)、位于二向色单元(11)反射方向的差动共焦探测单元(18)、控制整个系统的计算机(39)。激光发射单元(1)由单波长脉冲激光器(2)、超连续谱脉冲激光器(3)、带通滤光片(4)和二向色镜(5)组成；光谱激发单元由半反半透棱镜(6)、光瞳滤波器(32)、Z向平移台(7)、显微物镜(8)、待测样品(9)和X-Y平移台(10)组成；二向色单元(11)即二向色镜(11)；光谱探测单元(12)由带通滤光片(13)、第一会聚镜(14)、第一针孔(15)、第二会聚镜(16)和光谱仪(17)组成；激光差动共焦探测单元(18)由半反半透棱镜(19)、第三会聚镜(20)、第二针孔(21)、第一光电探测器(22)、第四会聚镜(23)、第三针孔(24)、第二光电探测器(25)组成，其中，第二针孔(21)位于第三会聚镜(20)焦前，距离为S1，第三针孔(24)位于第四会聚镜(23)焦后，距离为S2，S1＝S2。

8.如权利要求6所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试装置，其 特征在于，二向色镜(11)与分光棱镜(6)反射光束轴线的夹角可变。

9.如权利要求6所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试装置，其特征在于，可通过计算机(39)控制切换不同倍数的显微物镜，辅助测量和观测。

10.如权利要求6所述的一种反射式差动共焦CARS显微光谱测试装置，其特征在于，Z向平移台(7)、X-Y平移台(10)、光谱探测单元(12)、差动共焦探测单元(18)均由计算机(39)实现联动控制与测量。