CN107034305A

CN107034305A - 恶性胶质瘤的一种诊断标志物

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Publication number: CN107034305A
Application number: CN201710465242.1A
Authority: CN
Inventors: 符达; 马雨水; 吕中伟; 卢改霞
Original assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai Tenth Peoples Hospital
Priority date: 2017-06-19
Filing date: 2017-06-19
Publication date: 2017-08-11

Abstract

本发明涉及恶性胶质瘤的一种诊断标志物，属于分子生物学技术领域，具体地说，该标志物为NES基因及其表达产物。其优点表现在：本发明对GBM进行了综合的基因组学及蛋白组学分析，通过基于基因芯片及RNA测序的基因表达分析及LC‑MS/MS的蛋白质谱分析，发现NES基因在mRNA水平及蛋白水平上调。对NES做了生存分析，发现它的过表达与GBM病人预后不良有关，说明NES可作为GBM生物标志物及潜在的治疗靶点。NES基因编码神经巢蛋白，主要在神经细胞表达，可作为GBM的生物标志物及潜在的治疗靶点。

Description

恶性胶质瘤的一种诊断标志物

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体地说，是恶性胶质瘤的一种诊断标志物。

背景技术

GBM最初命名为多形性胶质母细胞瘤，就是在试图描述肿瘤内不同细胞的显著差异，这也反映了分子的异质性。早在基因组技术能够明确GBM分子特征的情况下，一个简单的临床现象就重塑了GBM作为一种单一的疾病这种概念。临床上，大多数胶质母细胞瘤(约90％)为原发性，仅少数是从低级别胶质瘤进展而来(继发性GBM)。原发性和继发性GBMs表现出完全不同的分子特征，例如，表皮生长因子受体(EGFR)和磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)常在原发性GBMs中异常，而TP53在继发性GBMS中异常。虽然继发性GBMs很罕见的，仅占GBMs的5％到10％，但其独特的分子特征和临床过程让我们认识到GBM是一种异质性的疾病。

GBM是癌症基因组图谱(TCGA)项目首选研究的癌症，2008年nature杂志发表了TCGA发出的第一篇研究结果，其从拷贝数变异，基因表达，DNA甲基化等方面对GBM分子特征进行了多角度大规模的分析。除了常见的体细胞突变，包括TP53,PTEN,NF1,EGFR,ERBB2,RB1,PIK3R1,PIK3CA等，TCGA还发现了一些新的显著性变异，如NF1、PARK2的纯合子缺失，以及AKT3的扩增等，并且发现这些遗传变异主要富集在三条信号通路：(a)受体酪氨酸激酶/RAS/磷脂酰肌醇3激酶(RTK/RAS/PI3K)信号通路(在88％的GBM病人中异常)；(b)p53信号通路(在87％的GBM病人中异常)；and(c)RB信号通路(在78％的GBM病人中异常)。

TCGA及其他研究小组的研究成果描绘了一幅GBM的分子景观图：EGFR,MET,PDGFRA,MDM4,MDM2,CCND2,PIK3Cad等基因的扩增及CDKN2A/B,CDKN2C,PTEN,RB1,NFKB1A等基因的缺失；及p53、PTEN、NF1、Rb1、IDH1和IDH2在体细胞中有不同频率的突变，如EGFR胞外域的突变，包括EGFR变异III(EGFRvIII)。随着基因组技术的进步，一些新的遗传改变被发现，包括Wnt信号调节器FAT1在20％胶质母细胞瘤中出现体细胞突变，和FGFR3/TACC融合基因的发现。尽管这些新的遗传改变可能并不常见，但是他们可以扩展我们的生物信息认知并且可能具有很大临床应用价值。

通过对TCGA基因表达数据的分析，Verhaak等人将GBM分为四个亚型，即Neural,proneural,mesenchymal,classical亚型，每个亚型均有完全不同的分子改变。Proneural亚型特点是有丰富的PDGFRA，CDK6，CDK4和MET改变，并且伴有频繁的IDH1突变；Classical亚型特点是具有EGFR扩增，及PTEN和CDKN2A缺失；Mesenchymal亚型特点是NF1、TP53和CDKN2A的突变和/或缺失。最后是neural亚型，其遗传特征尚不明确。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供NES基因的一种新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：NES基因作为诊断标志物在制备恶性胶质瘤诊断产品中的应用。

NES基因的表达产物作为诊断标志物在制备恶性胶质瘤诊断产品中的应用。

进一步地，NES基因的表达产物为nestin蛋白。

检测NES基因或其表达产物的试剂在制备恶性胶质瘤诊断产品中的应用。

进一步地，所述的恶性胶质瘤为多形性胶质母细胞瘤。

进一步地，所述的恶性胶质瘤诊断产品用于恶性胶质瘤的诊断或预后判断。

进一步地，所述的诊断产品为试剂盒、芯片或试纸。

本发明优点在于：

1、本发明对GBM进行了综合的基因组学及蛋白组学分析，通过基于基因芯片及RNA测序的基因表达分析及LC-MS/MS的蛋白质谱分析，发现NES基因在mRNA水平及蛋白水平上调。对NES做了生存分析，发现它的过表达与GBM病人预后不良有关，说明NES可作为GBM生物标志物及潜在的治疗靶点。

2、NES基因编码神经巢蛋白，主要在神经细胞表达，可作为GBM的生物标志物及潜在的治疗靶点。

附图说明

附图1：15个LGGs中45个5倍差异改变的mRNA的聚类分析(p<0.01)。

附图2：7个GBM中20个5倍差异改变的基因的聚类分析(p<0.01)。

附图3：22个LGGs中21个5倍差异改变基因(p<0.01)的聚类分析。

附图4：27个GBM中25个5倍差异改变基因(p<0.01)。

附图5：148个基因的GO分析。主要的生物过程是：生物过程正向调控，代谢过程正向调控，细胞过程正向调控，生物过程负向调控，单一生物体定位；主要的分子功能是：核定位，受体结合，蛋白质转运活性，mRNA3’-非翻译区AU-富集区结合，细胞周期过程；主要的细胞组件是：胞浆部分，细胞浆，胞内细胞器，高分子复合物，细胞器。

附图6：KEGG Pathway分析。五条主要信号通路为：催产素信号转导通路，逆行大麻信号通路，昼夜夹带，血管平滑肌收缩，谷氨酸神经突触。

附图7：SRING在线分析。重要的蛋白包括PLK4,CDK6,PRDM10和MEF2C。

附图8：15个显著失调的蛋白。上调的包括HEXB,NES；下调的包括MBP,HSPA12A。

附图9：16个在基因和蛋白层面上下调趋势一致的分子。

附图10：GBM中NES、HEXB和HSPA12A、MBP的相对表达量。qRT-PCR结果显示NES、HEXB表达显著上调；HSPA12A、MBP表达显著下调。

附图11：NES的IHC染色结果示意图。

附图12：693个蛋白的GO分析。主要生物过程是：能量和代谢前提的产生，通过氧化作用派生能量，细胞呼吸，嘌呤核苷酸的代谢，ATP的代谢过程；主要分子功能是：NADH氧化还原酶活性，NADH脱氢酶活性，氧化还原活性，催化活性，阳离子运输ATP酶活性；主要细胞组分是：髓鞘，细胞外囊,外泌体，有界膜囊，线粒体。

附图13：KEGG分析。主要通路是：氧化磷酸化，亨丁顿舞蹈症，帕金森病，阿尔茨海默病，代谢通路。

附图14：STRING蛋白质相互作用分析。重要的蛋白包括NDUFV2,ENO2 and ATP2A1。

附图15：10个与693个差异蛋白为共同差异基因/蛋白的分子。

附图16：14个共同分子。包括HSPA12A，SNCA，GNAO1，SERPINA3，CAPG，ANXA1，SOD2，TNC，PYGL，CD44，TGFBI，GBP1，SERPINH1，NES。其中上调的NES，TGFBI及下调的HSPA12A，SNCA也同时出现在图15及图9中。

附图17：基因表达联合质谱分析。总共得到36个差异分子，其中25个上调，11个下调。

附图18：GO分析。主要生物过程包括：电子传递链，化学平衡，创伤反应，细胞呼吸，药物反应；主要分子功能包括：蛋白结合，蛋白复合物结合，结合，结构分子活性，胶原蛋白结合；主要细胞组成包括：外泌体，部分胞外区，有界膜囊，胞外区，肌动蛋白细胞骨架。

附图19：KEEG Pathway分析。主要通路：帕金森病，代谢通路，逆行大麻信号通路，氧化磷酸化，神经信号传递通路。

附图20：蛋白质相互作用分析。重要的分子包括STAT3,CD44。

附图21：14个蛋白质的14条肽段在正常脑组织和GBM中出现突变的情况。

附图22：不同突变数的蛋白质的比例。MYH11，FN1，SYNM出现10个以上突变数。

附图23：3个蛋白(MYH11，FN1，SYNM)出现SAAVs的氨基酸位点的示意图。

附图24：19个突变蛋白(9.5％)富集在Focal adhesion通路上，突变的蛋白质用红框标出。

附图25：SOAT1和NES为我们GEO基因表达芯片、TCAG基因表达芯片和质谱突变鉴定共同的分子；APOB为TCAG测序、TCGA基因表达芯片和质谱突变鉴定共同的分子。

附图26：生存曲线表明NES的上调与较短的OS有关，预示着较差的预后。

附图27：生存曲线表明TNC的上调与较短的OS有关，预示着较差的预后。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

本领域已知的各种技术检测NES基因的表达情况。

实施例2

本领域已知的各种技术检测NES基因的表达产物(例如nestin蛋白)。

实施例3

1.材料与方法

1.1病人组织样本

我们收集了8对经外科切除并根据最新的WHO分类的胶质母细胞瘤(GBM)及配对的正常脑组织的新鲜组织样本；样本均来自赣州市人民医院。所有患者均签署知情同意书，该项操作受赣州市人民医院伦理委员会许可。

1.2试剂配制

UA buffer配方：Urea48.048g,Tris 1.2114g,加入100ml水，调节pH＝8.5

IAA：0.005M IAA溶解于UA中(13.875mg IAA溶解于1.5mlUA中)

200mM DTT:30.86mg DTT溶解于1ml 100mM NH₄HCO₃中

ABC/碳酸氢铵：0.05M ABC溶解于H₂O中(395.3mg溶于100ml ddH₂O)

50mM NH₄HCO₃：50ul 1M NH₄HCO₃(79.06mg溶于1ml ddH₂O)加入950ul ddH₂O

SDT裂解液配方:SDS4g,DTT 1.54g,Tris 1.21g,HCl调pH＝7.6

2.1 LC-MS/MS蛋白质谱分析

2.1.1样品准备(以下操作均在冰上进行)

1. 8对GBM及正常脑组织样本被切成小碎块(约1mm³)，并用PBS清洗；

2. 20-50mg组织(约含2-5mg蛋白)，加入SDT裂解液(4％SDS,0.1MDTT,0.1MTris-HCl,pH7.6)400ul，4℃低温均浆90s；

3. 100℃水浴煮3min；

4.超声10次，条件：80w,每次超声10s，间隔15s；

5. 16,000g离心10min，取上清(不要吸到沉淀，宁少勿多)；

6.荧光分光光度法测定蛋白质浓度；

2.1.2质谱样品前处理(FASP method，在10K超滤管中进行)

1.20-200ug蛋白加30ul SDT裂解液(不要加大于30ul SDT，有可能堵塞滤芯，如浓度低，可分次加入SDT裂解液和UA，不可一次加入超过30ul)；加入100ul UA，600rpm，混匀仪混匀1min，14,000g离心15min,具体离心时间视情况而定，离干，注意离心管中液体不可过多；

2.再加入200ul UA，14,000g离心15min,去除离心管中液体；

3.加入100ul IAA，600rpm混匀仪混匀1min，暗处孵育20min；

4.14,000g离心10min；

5.加入100uL Urea buffer，14000g离心10min，重复两次；

6.加入100uL 50mM的ABC到超滤管中，14000g离心10min，重复两次；

7.加入40uL 50mM含1-4μg胰酶的ABC(胰酶：蛋白为1:50-1:100)，振荡1min；

8.超滤管放入37℃的水浴锅中酶解16-18h；

9.将超滤管转移到新的收集管中，14,000g离心10min收集超滤下来的肽段；

10.往超滤管中再加入50uLABC，14,000g离心10min收集超滤下来的肽段；

11.多肽混合物-80℃冷冻后冻干；

12.多肽混合物经固相萃取柱脱盐处理；

2.1.3nano-LC-MS/MS分析

冻干的多肽混合物重溶于0.1％甲酸溶液中，使用LTQ Orbitrap Velos专业质谱仪鉴定多肽混合物。Easy nano LC system仪器参数设置为：全扫描范围为300-2000amu(1个微扫描)，之后为20个信号依赖二级扫描(扫描宽度为3amu，35％标准化能量碰撞，动态排除1min)。

2.1.4数据分析

原始数据使用Maxquant软件(version1.3.0.5)分析，检索数据库为Swissprot人蛋白质数据库(www.uniprot.org)。检索参数为：胰蛋白酶，1％误切率，误切位点为2，母离子质量误差为0.05Da，固定修饰为脲甲基化修饰Carbamidomethy(C)，无可变修饰。

搜索条件：胰酶消化，最大遗漏酶切位点1个，肽段质量精确度±0.1，MS/MS质量精确度±0.1，固定修饰Carbamidomethyl(C)。人工测序获得的肽序列通过EMBL(http://dove.embl-heidelber.de/blast2/)搜索非冗余蛋白质序列数据库nrdb95，参数设置为默认值。

2.2 Quantitative Real-time PCR

2.2.1总RNA抽提

1.每50mg-100mg组织加1ml Trizol裂解，组织的体积不应超过加入Trizol体积的10％，使用匀浆器充分匀浆；匀浆液在室温(15℃～30℃)放置5min；

2.RNA分离：按1:0.2(TRIzol:氯仿)的体积比加入氯仿，盖严，用力剧烈震荡15秒，在室温放置3-5min，12000rpm、4℃条件下离心15分钟；离心后上述混合液可以分为三相，下层的为苯酚-氯仿相，中间层及上层无色的水相层。小心取出EP管，将上层含RNA的透明水相转移至新的EP管中；

3)RNA沉淀：按照每1mlTrizol加0.5ml异丙醇的比例，加入异丙醇，混匀，室温放置10min。12,000rpm、4℃条件下离心10min，RNA沉淀形成胶状物沉在管底。

4.RNA洗涤：弃上清，按照Trizol与乙醇比例为1：1加入75％乙醇，进行洗涤，涡旋混合；4℃、7500rpm条件下离心5min，弃上清；置于室温干燥沉淀。注意不要让RNA完全干燥，因RNA完全干燥后很难溶解。

5.RNA再溶解：用DEPC处理过的水重新溶解RNA。

注意：提取RNA时需戴上口罩、手套，使用专用的RNase free的枪头和离心管，离心机需要提前预冷。

2.2.2 RNA定量及纯度检测

使用微量分光光度计对上述RNA进行定量分析，检测其浓度及纯度。A260/A280比值是纯度检测的重要指标，一般在1.8-2.0，低于此值表示有RNA或其他杂质的污染，定量后的RNA样本可以进行RT-PCR或保存在-80℃冰箱备用。

2.2.3 cDNA的合成

按TaKaRa公司PrimeScript TM RT-PCR试剂盒说明书进行逆转录合成cDNA,下列组分配制RT反应体系(冰上操作)：

反转录反应条件：42℃10min；95℃2min；16℃forever

反应结束后即得到的cDNA溶液加80μlH₂O(20μl→100μl)，使终浓度为10ng/μl，继续进行qRT-PCR反应或-20℃冻存备用。

2.2.4 qRT-PCR

本实验所有mRNA引物及内参均由上海生工生物公司设计合成。

实时荧光定量PCR引物序列

按TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq Kit说明书上的操作步骤，进行实时荧光定量PCR检测。冰上加样，反应体系如下：

反应条件如下：

熔解曲线分析，判断产物纯度：反应结束后，RQ manager分析软件统计处理，获取Ct值，并根据熔解曲线判断产物的纯度。

2.2.5数据分析及处理

获取每次试验目的基因及内参的Ct值(C代表Cycle，T代表Threshold)，Ct值代表每个反应孔内的荧光强度达到设定的阈值时所经历的循环数。具体计算方法如下：

△Ct＝目的基因Ct值-管家基因GAPDHCt值

△△Ct＝目的基因△Ct-参照样本(即对照组)目的基因△Ct

相对表达量＝2^-△△Ct

2.3免疫组化染色

1.脱蜡和水化：常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；

2.PBS冲洗3次，每次5min；

3.抗原修复：以0.01M柠檬酸缓冲液(pH6.0)高压2min修复抗原，冷却至室温；

4.PBS洗3次，每次5min；

5.在3％H₂0₂-甲醇溶液中孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性；

6.PBS洗3次，每次5min；

7.封闭：滴加正常5％山羊血清，室温孵育30min，甩去多余液体；

8.PBS冲洗3遍除去血清，滴加一抗(PBS代替一抗作为阴性对照)，4℃冰箱过夜；

9.次日PBS洗3次，每次5min；

10.滴加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育30min；

11.PBS洗3次，每次5min；

12.滴加SP(链霉亲和素-过氧化酶)，室温孵育10min；

13.PBS洗3次，每次5min；

14.显色：DAB显色5-10min，显微镜下判断染色程度，蒸馏水洗终止显色；

15.复染：苏木精复染，1％盐酸酒精分化几秒；

16.自来水冲洗5min；

17.常规脱水透明、中性树胶封片、镜检。

2.4生物信息学分析

我们从GEO数据库下载了两组胶质瘤的全基因组表达谱数据(GSE45921和GSE51146`，并用MeV4.7.1软件对差异基因做了分层聚类分析。基因本体(Gene Ontology，GO)((http://www.geneontology.org/)按照生物途径(Biology Process)，分子功能(Molecular Function)和细胞定位(Cellular Location)对基因进行注释和分类，被用来评价差异基因富集在GBM中哪些功能类群。KEEG Pathway记录了细胞之中的分子相互作用网络以及具体生物所特有的变化形式，被用来评价差异基因富集在哪些信号通路。蛋白质相互作用通过STRING进行在线分析(http://string-db.org/)。

2.5统计学分析

所有的统计分析采用IBM SPSS Statistics20(IBMCorp.；Armonk,NY,USA)统计软件包进行数据处理。表达量用均数±标准偏差呈现。独立样本t检验进行组间差异比较，卡方检验进行组间率的差异比较。Kaplan-Meier曲线来确定各组的总生存率，结果与对数秩检验比较。P＜0.05被认为有统计学意义。

3.结果

3.1 GEO数据库基因芯片的分析

我们分析了利用Affymetrix U133 plus 2.0芯片对22个胶质瘤及配对正常脑组织进行的全基因组表达谱分析的数据(GEO dataset:GSE45921),其中包括15个低级别的胶质瘤(LGGs)和7个胶质母细胞瘤(GBM)。

结果发现：相对于配对的正常脑组织，15个LGGs中有492个2倍以上差异改变(Foldchange≥2；P<0.05)的mRNA，其中367个上调，125个下调；相对于配对的正常脑组织，15个LGGs中有45个5倍以上差异改变(Fold change≥5；P<0.01)的mRNA，其中35个上调，包括SFRP2,RPE65,CD44，MYC等；10个下调，包括ARG1,ENC1,PSG5等。用MeV4.7.1软件做聚类分析(图1)。

相对于配对的正常脑组织，7个GBM中有657个1.5倍以上差异改变(Fold change≥1.5；P<0.05)的差异基因，其中133个上调，524个下调；相对于配对的正常脑组织，7个GBM中有20个5倍以上差异改变(Fold change≥5；P<0.01)的mRNA，其中8个上调，12个为下调。上调的包括TOP2A,GFAP,SOD2,CDCA7L,GDF8,ID3,XIST,CDC2；下调的包括VIPR1,CAMK2A,GJB6,RYR2,CNTNAP2,SCEL,SLC8A2,CREG2,MFSD4,CACNG3,NEUROD6,CABP1。用MeV4.7.1软件做聚类分析(图2)。

此外，我们还分析了另外一组利用上海博星公司BiostarH-140s×32芯片进行的全基因组表达谱芯片数据(GEO dataset:GSE51146)，包括49个胶质瘤及配对的正常脑组织，其中22个低级别胶质瘤(LGGs)，27个胶质母细胞瘤(GBM)。

结果发现：相对于配对的正常脑组织，22个LGGs中有399个2倍以上差异改变(Foldchange≥2；P<0.05)的mRNA，其中332个上调，67个为下调；相对于配对的正常脑组织，22个LGGs中有21个5倍以上差异改变(Foldchange≥5；P<0.01)的mRNA，其中17个上调，包括ITSN2,RPS6KC1,SB92,KCMF1,THAP3,WIPI49,SND1,ITGA5,YES1,BHMT2,PP1553,LRRTM2,COL1A2,SNX16,SLCO1B1,PAF400,UVRAG；4个为下调，包括RTN1，ATXN10，NAP1L3，DMBT1。用MeV4.7.1软件做聚类分析(图3)。

相对于配对的正常脑组织，27个GBM中有609个1.5倍以上差异改变(Fold change≥1.5；P<0.05)的mRNA，其中481个上调，128个为下调；相对于配对的正常脑组织，27个GBM中有25个5倍以上差异改变(Foldchange≥5；P<0.01)的mRNA，其中23个上调，包括RPS6KC1，YWHAG，RXRB，TRRAP，TOMM22，HTT，SMARCAL1，UTP15，COL3A1，ITGA5，TIMP1，CCL2，TRP2，EHD3，RANBP2，SR140，B3GALNT1，PHF10，UMPS，DHCR7，METTL5，ZDHHC2，TPPP2；2个下调,包括TAF10，PLP1。用MeV4.7.1软件做聚类分析(图4)。

通过对比两组基因芯片中GBM与正常脑组织的1.5倍差异改变的mRNA(Affymetrix芯片中657个与BiostarH芯片中609个)，我们发现了148个共同表达改变的基因。

3.2GO,KEGG Pathway及蛋白质相互作用分析

为了判断差异基因主要富集在哪些功能类群和代谢通路，我们对148个基因进行了GO(图5)和KEGG Pathway(图6)分析及蛋白质相互作用分析(图7)。

3.3蛋白质谱分析

我们利用nano-LC-MS/MS对8个GBM及其配对的正常脑组织进行了全蛋白组测序。每个样品做了3次重复。

结果发现：相对于配对的正常脑组织，8个GBM中有693个1.5倍以上差异改变(Foldchange≥1.5；P<0.05)的差异蛋白，其中500个上调，193个为下调；其中有15个改变最显著的差异蛋白(Foldchange≥10；P<0.01)，6个上调，包括TMX1，ACOX1，HEXB，GORASP2，SYNM，NES；9个下调，包括MBP，CNP，PLP1，MYLPF，TUBA4A，SNCG，HSPA12A，GPD1，DMTN。用MeV4.7.1软件做聚类分析(图8)。

在693个差异蛋白中，与148个差异基因相比有16个共同的分子，并且上下调趋势一致(图9)，包括NES，HEXB，CNN3，H2AFZ，STAT3，RPS28，ELAVL1，ILF3，ARPC5，EIF2S2，MCTS1，NDUFS2，NDUFA10，CALM1，HSPA12A，MBP，说明这些蛋白水平的改变可能是由于基因改变引起的。

在16个共同差异基因/蛋白中，我们选取了最显著上调的NES、HEXB和最显著下调的HSPA12A、MBP进行了qRT-PCR(图10)和IHC(图11，NES的IHC结果)验证，结果证实了这些差异基因/蛋白的上调和下调表达趋势和芯片/质谱结果是一致的。

3.4 GO,KEGG Pathway及蛋白质相互作用分析

接着，我们对上述GBM与正常脑组织的693个1.5倍差异改变的蛋白，进行了GO(图12),KEGG Pathway(图13)和蛋白质相互作用分析(图14)。

3.5 TCGA数据库基因表达分析

我们下载了TCGA数据库的GBM gene expression(IlluminaHiSeq)测序结果，包含了172例样本，其中5例正常脑组织，167例GBM组织。相对于正常脑组织，167个GBM中有2881个1.5倍以上差异改变(Fold change≥1.5；P<0.05)的差异基因。2881个1.5倍差异改变的基因中，有10个与693个1.5倍差异改变蛋白为共同的差异基因/蛋白，包括SNCG，SNCA，SPTB，CKMT1A，MYH1，MYH4，F2，HIST1H1B，TGFBI，LMNB1(图15)。

我们还下载了TCGA数据库中另外一组基因芯片数据GBM gene expression(TCGA_GBM_exp_u133a)，包含了539例样本，其中10例正常脑组织，529例GBM组织。相对于正常脑组织，529个GBM中有298个1.5倍差异改变(Foldchange≥1.5；P<0.05)的基因。298个1.5倍差异改变的基因中，有14个与693个1.5倍差异改变蛋白为共同的差异基因/蛋白(图16)。

总之，我们利用基因表达和蛋白质谱联合分析，总共得到了36个共同的差异分子(Fold change≥1.5；P<0.05)包括GNAO1,SNCG,SNCA,SPTB,CKMT1A,MYH1,MYH4,NDUFA10,CALM1,HSPA12A,MBP,SERPINA3,CAPG,ANXA1,SOD2,TNC,PYGL,CD44,TGFBI,GBP1,SERPINH1,NES,F2,HIST1H1B,LMNB1,HEXB,CNN3,H2AFZ,STAT3,RPS28,ELAVL1,ILF3,ARPC5,EIF2S2,MCTS1,NDUFS2，其中25个上调，11个下调。GEO-基因芯片/蛋白质谱16个共同分子，TCGA-基因芯片/蛋白质谱14个，TCGA-测序/蛋白质谱10个。其中两两共同的分子有4个(上调的TGFBI，NES和下调的SNCA，HSPA12A)，没有三种共同的分子(图17)。

3.6 GO,KEGG Pathway及蛋白质相互作用分析

我们对这36个在mRNA水平及蛋白水平均失调的分子做了GO(图18),KEGG Pathway(图19)及蛋白质相互作用分析(图20)。

3.7单氨基酸变异(SAAVs)的鉴定

为了从质谱结果中分析单氨基酸突变，我们利用TCGA_GBM外显子测序的突变结果(http://cbio.mskcc.org/cancergenomics/pancan_tcga/)构建了GBM的单氨基酸变异(SAAVs)数据库。

我们在Swissprot人标准蛋白质数据库中搜索得到的质谱结果，包括4834个蛋白的36858条肽段信息；平均7.6条肽段/每个蛋白。而我们将质谱结果在新构建的SAAVs数据库中进行重新搜索，得到了8对GBM样本的突变肽段数据，其中包括2515个蛋白的23405条肽段信息；平均9.3条突变肽段/每个蛋白。与正常人数据库相比，我们构建的SAAVs数据库搜索得到新的897个蛋白质的3884条突变肽段，平均4.3条突变肽段/每个蛋白。

其中有14个蛋白质的14条肽段在8个正常脑组织中只有一个样本中出现(正常组织中突变概率12.5％)，而在8个GBM中的至少6个GBM中出现了一次突变(GBM中突变概率≥75％)(图21)。

186个蛋白质的335条肽段只在GBM中出现了突变，平均1.8条突变肽段/每个蛋白(从1-48条肽段)；150个蛋白质(80.6％)只有一个GBM样本的一条肽段出现SAAVs，突变数(Numbers of Mutation,NM)等于1(突变数等于出现突变的GBM样本×突变位点)；20个蛋白(10.8％)突变数等于2；18个蛋白(7.0％)突变数为2-10个；3个蛋白(1.6％)(MYH11，FN1，SYNM)出现10个以上突变数，NMs＞10(图22)，分别有48，16和14个NMs；3个蛋白(MYH11，FN1，SYNM)出现SAAVs的氨基酸位点如图所示(图23)。

与正常脑组织相比，上述GBM中总共有200个蛋白质出现了概率≥75％的突变。对这些突变做KEGG pathway分析，发现有19个蛋白质(9.5％)在Focal adhesion的pathway上(图24)。

这200个突变的蛋白质与我们37个GEO数据库中GBM芯片结果(7+27)1.5倍差异基因相比，有6个共同的分子；与TCGA-GBM-U133a的529例GBM表达芯片1.5倍差异基因相比，有3个共同的分子；与TCGA-GBM-U133a的167例GBM组织IlluminaHiSeq测序结果的1.5倍差异基因相比，有8个共同的分子。

质谱突变分析与基因表达差异基因筛选得到的共同分子总共有14个，8个上调，6个下调，包括APOB,RUFY1,CEACAM5,LDB3,KRT82,C1QL3,SOAT1,COL6A3,ACIN1,NES,TNC,CILP,IKBIP,HK3(图25)。

3.8生存分析

我们利用基因表达和蛋白质谱定量联合分析，总共得到了36个差异分子，利用基因表达与氨基酸突变联合分析，得到14个共同分子，其中NES和TNC在两组联合分析中均出现。我们进一步对这两个分子在我们的27个GBM表达谱芯片数据和529个GBM表达谱芯片数据(15个病人失访，只分析了514个GBM)中做了生存分析。

结果表明：NES在我们的27个GBM表达谱芯片数据和514个GBM表达谱芯片数据中，表达越高，GBM病人生存时间越短(P＝0.012和0.018)(图26)；TNC在我们的27个GBM表达谱芯片数据和514个GBM表达谱芯片数据中，表达越高GBM病人生存时间越短(P＝0.036)(图27)。

4.讨论

胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见原发性恶性脑瘤，也是最致命的人类癌症之一。本文对GBM进行了综合的基因组学及蛋白组学分析，为理解GBM的发病机制提供了一点新见解，并且鉴定出了一些潜在的治疗靶点，为开发新的更有效的治疗方法提供了分子基础。

通过基于基因芯片及RNA测序的基因表达分析及基于液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)的蛋白质谱分析，我们鉴定出了36个在mRNA水平及蛋白水平均出现失调的分子，包括上调的TGFBI,NES，及下调的SNCA,HSPA12A。并且我们在分析两组GEO基因芯片数据中发现，GBM与正常脑组织的差异基因，和LGGs与正常脑组织的差异基因重复不多，这说明从正常脑胶质细胞发展为低级别胶质瘤(LGGs)或胶质母细胞瘤(GBM)是两种完全不同的生物学过程，这也符合我们的临床观察，即大部分(约90％)的GBM是原发性的，仅有不到10％是由低级别胶质瘤进展而来。

同时，我们发现的失调的基因，包括TGFBI,NES，SNCA,HSPA12A等已经被发现在GBM及其它肿瘤中起重要作用。转录生长因子诱导基因(TGFBI，Transforming growth factor,beta-induced)，编码一种能够结合I,II和IV型胶原蛋白的含有精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸(RGD，L-arginine,glycine,and L-aspartic acid)序列的蛋白，其在GBM通过TGF-β信号通路表达上调；Nestin(NES)基因，编码中间丝蛋白家族的一个成员，神经巢蛋白，主要在神经细胞表达，被证明是GBM的一个预后标志物；突触核蛋白α(SNCA，synuclein alpha)是突触核蛋白家族的一员，在大脑表达丰富，其过表达能通过肿瘤坏死因子α(TNF-alpha)介导的信号通路来促进人脑胶质瘤细胞系U373细胞的凋亡；HSPA12A(heat shock proteinfamily A(Hsp70)member12A)，是热休克蛋白家族的一员，被报道称与汉族人群中胃癌的发病风险有关，并且其过表达与早期HBV相关的肝细胞癌的预后不良相关。

其它一些通过生物信息学分析预测的重要分子，包括CD6,CD44和STAT3等，也有相关研究表明其在GBM及其它肿瘤的发病中起重要作用。信号传导及转录活化因子3(STAT3，Signal transducer and activator of transcription-3)，是STAT蛋白家族的一员，已被报道在GBM发生，发展及侵袭中起重要作用。CD44基因编码一种有多种异构体的细胞表面糖蛋白，参与细胞间相互作用、细胞黏附与迁移，被证明在包括GBM的多种癌症中过表达，在肿瘤细胞恶性进展中起重要作用，如细胞迁移，肿瘤生长及血管形成。CDK6在GBM中通过小泛素化修饰剂1(SUMO1)的作用驱动肿瘤细胞周期改变，促进肿瘤进展。CDK4和CDK6的选择性靶向抑制剂，如Abemaciclib已被报道在实体性肿瘤，包括乳腺癌，非小细胞肺癌，神经胶质母细胞瘤及其它实体性肿瘤中是安全有效的。

蛋白组学的一个根本问题就是鉴定哪些蛋白编码序列的改变能够引起蛋白表达水平的改变。因为标准数据库不能从质谱结果中鉴定出突变的肽段，我们利用COSMIC数据库中GBM外显子测序结果构建了单氨基酸变异数据库(SAAVs)。通过分析质谱数据，我们鉴定出了200个高突变率的蛋白，结合基因表达分析，我们发现14个分子同时有mRNA水平的改变，其中NES及TNC又同时有蛋白水平的改变。我们进一步对NES及TNC做了生存分析，发现它们的过表达与GBM病人预后不良有关，说明NES及TNC有可能成为GBM生物标志物及潜在的治疗靶点。

毫无疑问，更深入的基因组分析会产生更丰富和更深层次的分子亚型，但是如何从中找到药物靶点是我们要解决的关键问题。一种方法是应用生物信息学工具来预测分子功能。Carro等人应用生物信息学的逆向工程算法从TCGAGBM数据库中发现了两个转录因子C/EBPβ和STAT3，它们能调节间充质表达样式，并有明显的抗肿瘤作用。Sumazin等人用另一种生物信息驱动的方法开发了一种多变量分析工具(HERMES)，能从全基因组转录和miRNA谱的综合分析中系统地推断出microRNA作用的候选靶点。用这种方法，他们揭示了一个丰富的转录后microRNA调控网络，鉴定出了PTEN缺失在促进肿瘤生长中的核心作用，即通过microRNA依赖性的调节网络。Genovese等人应用另外一种算法揭示了一条新的，受miR-34a调节的，转化生长因子(TGF)-β依赖的信号通路。因此，应用生物信息学工具来预测疾病发生中的关键分子，结合实验模型的功能验证，已经开始产生一系列具有临床价值的理论。

另一种方法，集中在评估异常分子所汇聚的核心信号通路及它们对下游效应器的影响。Brennan等人对20个GBM组织样本中57个信号蛋白分子(包括已知信号通路中的翻译后修饰蛋白)进行分析，结果揭示了三条信号通路：EGFR亚组，以EGFR激活及PI3K信号增强为特点；(b)PDGF亚组，特点是PDGFR信号通路；(c)NF1亚组，其下游信号效应器不明确。对TCGA基因表达亚型的分析表明EGFR、PDGFRA、NF1的改变彼此之间是不交叉的，这些发现都是基于TCGA定义的三条核心信号通路(RTK/RAS/PI3K、p53及RB1通路)。

总之，综合的基因组学及蛋白组学分析为理解GBM的发病机制及开发新的治疗方法提供了新的分子基础。并且氨基酸突变分析有可能拓展我们对蛋白质突变在其它癌症中的理解。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海市第十人民医院

<120> 恶性胶质瘤的一种诊断标志物

<130> /

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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<213> 人工序列

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tgggtgtgaa ccatgagaag t 21

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<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgagtccttc cacgatacca a 21

Claims

1.NES基因作为诊断标志物在制备恶性胶质瘤诊断产品中的应用。

2.NES基因的表达产物作为诊断标志物在制备恶性胶质瘤诊断产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，NES基因的表达产物为nestin蛋白。

4.检测NES基因或其表达产物的试剂在制备恶性胶质瘤诊断产品中的应用。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的恶性胶质瘤为多形性胶质母细胞瘤。

6.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的恶性胶质瘤诊断产品用于恶性胶质瘤的诊断或预后判断。

7.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于，所述的诊断产品为试剂盒、芯片或试纸。