CN107029281A - 一种可吸收止血材料的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可吸收止血材料的制备方法，通过以透明质酸或其盐为原料，在低温间歇式超声作用下进行交联反应以及与低温间歇超声处理的未交联透明质酸或其盐进行混合均匀，再超低温冷冻干燥得到。本发明通过低温超声溶解法大大缩短透明质酸溶解工序时间，降低产品生产过程被污染的几率；高分子量透明质酸或其盐通过提高溶液浓度，虽然也可延长体内降解时间满足伤口愈合时间，但是生产成本会增大很多，不利于企业降低生产成本的需求；中小分子量的透明质酸或其盐通过低温间歇超声条件下，进行化学交联反应后再与高分子量未交联透明质酸或其盐凝胶按照一定比例混合，得到的止血材料不仅提高防粘连性能，而且交联剂残留量低且能稳定在一定范围，降低游离交联剂带来的生物风险，同时降低企业生产成本。

Description

一种可吸收止血材料的制备方法

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种可吸收止血材料的制备方法。

背景技术

透明质酸是由β-D-葡萄糖醛酸和β-N-乙酰基氨基葡萄糖双糖单位通过交替的(1→4)和(1→3)糖苷键连接而成的天然高分子酸性粘多糖，是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，具有良好的理化性质及生物相容性。

按国家药典规定，透明质酸或其盐的原料外观性状为白色或类白色疏松纤维状物或无定形粉末，实际应用中透明质酸或其盐往往要被制备成水溶液，但由于透明质酸或其盐作为大分子物质，在溶解过程中，极易在表面形成一种胶体，使得溶解过程很耗时，溶解困难，因此在一般的透明质酸或其盐原料、制剂和凝胶生产中，在溶解工序过程里，需要花费大量时间和能耗，而且容易污染。

外科手术局部出血、组织粘连是一种常见的临床现象，但是没有及时采取措施，有可能导致严重的并发症，危及患者的生命安全。美国Xomed公司生产的MeroGel为透明质酸酯化衍生物组成的止血海绵，用于耳鼻喉科术后止血和防粘连。已经在国外上市的产品，由于透明质酸或是未经修饰或是被修饰程度低，在体内很容易被透明质酸酶等降解，降解速度过快，对其防粘连效果有所影响。

经过修饰的透明质酸或其盐会存在交联剂残留的问题，交联剂具有潜在的致癌毒性，而且交联剂的去除也会随着加入量的增加而难度增加，交联剂残留量稳定性差的问题也是业内公认的。欲要得到安全有效的交联透明质酸或其盐产品需要有效地提高交联剂利用率，采取有效措施尽可能的降低交联剂残留，保证交联剂残留量的稳定性，并且提高产品的生物相容性，诸多问题至今未得到妥善解决。

研究表明透明质酸经交联剂交联后被制成固体材料，其生物相容性好，生物可吸收性，体内降解速率能满足伤口愈合的需求，以及防粘连功能，能促进创面迅速愈合，是比较理想的止血材料。

发明内容

发明目的：为解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种可吸收止血材料的制备方法。

技术方案：为实现上述技术目的，本发明提出的一种可吸收止血材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将中小分子量透明质酸或其盐溶于碱溶液中，加入交联剂，在低温间歇式超声作用下进行交联反应，得到交联凝胶；

(2)另取高分子量透明质酸或其盐溶于水中，经低温超声处理，得到未交联凝胶；

(3)将步骤(1)得到的交联凝胶与步骤(2)得到的未交联凝胶进行一定比例混合均匀，再经低温冷冻干燥得到的固态材料。

(4)根据临床使用需求将步骤(3)得到的固态材料处理片状、薄膜状、块状或纤维状等形状。

其中，步骤(1)中所述的透明质酸或其盐的分子量为10万-100万道尔顿，步骤(2)中，所述的透明质酸或其盐的分子量为120-300万道尔顿。

优选地，步骤(1)中，所用的交联剂为二乙烯基砜、1，2，7，8-二环氧辛烷、1.4-丁二醇二缩水甘油醚或乙二醇二缩水甘油醚中的任意一种，优选1，4-丁二醇二缩水甘油醚。

更具体地，步骤(1)中，透明质酸或其盐与交联剂的质量比40-100∶1。

步骤(1)中，将透明质酸或其盐溶于0.01-0.1M无机碱性水溶液中，形成浓度为2-12％的凝胶。

步骤(1)中，低温间歇式超声法的条件为：低温为0-10℃，优选10℃，超声频率不大于20KHz，优选20KHz，超声反应时间0.2-1h，静置0.2-3h，如此为一循环，循环反应2-5次，优选3次。

步骤(2)中，低温间歇式超声法的条件为：温度范围0-10℃，优选4℃，超声频率不大于20KHz，优选20KHz，超声时间0.2-1h，静置0.2-3h，如此为一循环，循环1-3次，优选2次。

所述交联凝胶和未交联透明质酸钠凝胶的浓度均为0.5-5％，其中，未交联透明质酸或其盐凝胶与交联凝胶质量比为10/0-1/9，即可完全采用未交联透明质酸或其盐凝胶或者与交联凝胶按照合适的比例进行混合。

优选地，步骤(1)的交联反应后将得到的交联凝胶进行缓冲液透析纯化，再用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为1.0～2.5％的中性交联透明质酸或其盐凝胶，然后与未交联透明质酸或其盐凝胶混合。

步骤(3)中，低温冷冻干燥的条件为：慢速预冻，一次升华温度低于-20℃，形成白色固态材料，材料厚度控制2-5mm。

透明质酸或其盐作为大分子物质，在溶解过程中，容易在表面形成一层胶体，阻碍水分子进入，从而使溶解过程很耗时，在生产过程中，透明质酸溶解工序需要花费大量的时间，而且产品也容易污染，本发明采用低温超声溶解法，一方面降低在溶解工序产品被污染的风险，又大大缩短了透明质酸或其盐的溶解时间，满足工业化生产的需要。

对中小分子量的透明质酸或其盐进行化学交联，高起始浓度，加少量的交联剂，交联反应过程采用低温间歇超声法，使得透明质酸分子与交联剂能充分反应，减少产品中游离交联剂。

高分子量的透明质酸或其盐在提高浓度条件下，也可以延长降解时间，但延长的时间也是有限的，而且生产成本会加大。本发明通过将交联透明质酸或其盐凝胶与高分子量未交联透明质酸或其盐凝胶按照一定比例进行充分混匀处理后经低温冷冻干燥得到交联剂含量低且稳定的可吸收止血材料，同时，又降低了生产成本。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)低温超声间歇溶解法大大缩短透明质酸溶解工序时间，降低产品生产过程被污染的几率；

(2)粘附组织封闭伤口，减少组织出血量，止血快，效果好。

(3)体内降解周期延长，满足伤口愈合时间，组织粘连情况得到改善，提高防粘连功能。

(4)冻干后材料中交联剂残留量达到行业标准要求且能稳定在一定范围，可实现规模化生产。

下面通过具体的实施例详细说明本发明的技术方案。下述实施例中，低温冷冻的条件为：慢速预冻，具体地，在0℃保持时间0.5～1.5h，达到材料共晶点时保持0.5～1h，低于共晶点以下2～3h，一次升华温度低于-20℃，形成白色固态材料，材料厚度控制2-5mm。

实施例1

将分子量为300万道尔顿的透明质酸钠溶解于注射用水中，控制温度4℃，超声频率为20KHz，间歇超声0.5h，静置1h，循环2次，制成浓度为2.5％透明质酸钠凝胶溶液，低温冷冻干燥得到厚度为2mm白色材料。

实施例2

将分子量为120万道尔顿的透明质酸钠溶解于注射用水中，控制温度4℃，超声频率为20KHz，间歇超声0.5h，静置1h，循环2次，制成浓度为1.0％透明质酸钠凝胶溶液，低温冷冻干燥得到厚度为5mm白色材料。

实施例3

将分子量为10万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶40，参与交联反应透明质酸钠浓度为12％，进行10℃，20KHz超声0.5小时，静置2小时，循环反应3次，使用透析袋对交联凝胶进行透析，定期更换透析液，去除交联剂，再用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为2.5％的中性交联透明质酸钠凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(实施例1制备的)按照质量比9∶1混合均匀，得到2.5％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为3mm白色材料。

实施例4

将分子量为10万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶40，参与交联反应透明质酸钠浓度为12％，进行10℃，20KHz超声0.5小时，静置2小时，循环反应5次，使用透析袋对交联凝胶进行透析，定期更换透析液，去除交联剂，再用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为2.5％的中性交联透明质酸凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(实施例1制备的)按照质量比5∶5混合均匀，得到2.5％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为3mm白色材料。

实施例5

将分子量为10万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶40，参与交联反应透明质酸钠浓度为12％，进行10℃，20KHz超声0.5小时，静置2小时，循环反应5次，使用透析袋对交联凝胶进行透析，定期更换透析液，去除交联剂，再用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为2.5％的中性交联透明质酸凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(实施例1制备的)按照质量比1∶9混合均匀，得到2.5％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为3mm白色材料。

实施例6

将分子量为100万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶100，参与交联反应透明质酸钠浓度为4％，进行10℃，20KHZ超声0.5小时，静置2小时，循环反应5次，使用透析袋对交联凝胶进行透析，定期更换透析液，去除交联剂，用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为1.0％的中性交联透明质酸钠凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(实施例2制备的)按照质量比9∶1混合均匀，得到1.0％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为5mm固态材料。

实施例7

将分子量为100万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶100，参与交联反应透明质酸钠浓度为4％，进行10℃，20KHZ超声0.5小时，静置2小时，循环反应5次，使用透析袋对交联凝胶进行透析，定期更换透析液，去除交联剂，用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为1.0％的中性交联透明质酸凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(实施例2制备的)按照质量比5∶5混合均匀，得到1.0％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为5mm固态材料。

实施例8

将分子量为100万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶100，参与交联反应透明质酸钠浓度为4％，进行10℃，20KHZ超声0.5小时，静置2小时，循环反应5次，使用透析袋对交联凝胶进行透析，定期更换透析液，去除交联剂，用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为1.0％的中性交联透明质酸钠凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(实施例2制备的)按照质量比1∶9混合均匀，得到1.0％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为5mm固态材料。

对比例1：

将分子量为300万道尔顿的透明质酸钠溶解于注射用水中，室温调件下，搅拌混合，静止过夜，制成浓度为2.5％透明质酸钠凝胶溶液，低温冷冻干燥得到厚度为2mm白色材料。

对比例2：

将分子量为10万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶40，参与交联反应透明质酸钠浓度为12％，除不采用超声处理其他条件都相同得到浓度为2.5％的中性交联透明质酸钠凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(除不采用超声处理其他条件同实施例1制备)按照质量比5∶5混合均匀，得到2.5％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为5mm白色材料。

对比例3：

将分子量为100万道尔顿的透明质酸钠加入到0.05M氢氧化钠溶液中，加入BDDE交联剂，使BDDE与透明质酸钠的质量比为1∶100，参与交联反应透明质酸钠浓度为12％，除不采用超声处理其他条件都相同得到浓度为3％的中性交联透明质酸钠凝胶。

将中性交联透明质酸钠凝胶与未交联透明质酸钠凝胶(除不采用超声处理其他条件同实施例2制备)按照质量比5∶5混合均匀，得到1.0％混合透明质酸钠凝胶，低温冷冻干燥得到厚度为3mm白色材料。

性能测定：

对实施例1～8及对比例1～3制备的材料进行性能测定，具体如下：

(1)初始污染菌对比：

各实施例每个进行5个样品初始污染菌的检测，求平均值。检测结果如表1所示。

(2)材料对小鼠肝脏止血时间对比：

在小白鼠肝脏切除部分肝叶，形成10mm×10mm的出血创面，将样品2cm×2cm大小的样品覆盖在出血面，开始计时，样品覆盖后需轻压10s，伤口停止出血的时间为止血时间。每种止血材料平行做3例，计算其平均止血时间，结果如表1所示。

(3)材料在抗酶解性对比：

耐酶性：精密称取实施例中得到的材料(透明质酸含量为0.5g)加入0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)5mL和透明质酸酶液(100U/mL)5mL，混合均匀，置于37℃水浴中酶解24h，然后在100℃煮沸10min灭活。0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液1.0ml，加水定容至10ml。采用改良咔唑显色法测定糖醛酸含量，乘以2.07后折算为加入酶液的样品中交联透明质酸钠的含量a；未加酶液样品中的交联透明质酸钠含量为b，计算酶降解率＝a/b×100％。酶降解率越低，表明凝胶的耐酶性越好，凝胶在体内填充的效果维持时间长。结果如表1所示。

(4)材料中交联剂残留量对比：

称取交联透明质酸钠凝胶材料于含有透明质酸酶1000U/ml的生理平衡液中，37℃恒温箱放置至透明质酸钠凝胶材料完全降解后，使用荧光法检测降解液中的交联剂含量，然后推算出凝胶中交联剂含量。结果如表1所示。

(5)材料在动物体内防粘连作用对比：

实验动物为SD大鼠，体重220±40g，雌雄不分，每组动物10只。实验大鼠均使用2％无巴比妥钠腹腔注射进行麻醉，麻醉后开腹手术，逐层切开，暴露腹腔，距回肠部5cm处选取3cm回肠段，用干纱布来回摩擦20次，肠管充血并有点状出血点，空白对照组不加任何材料直接关腹，试验组在摩擦主要部位放置3cm×3cm试验材料轻轻按压后关腹。各组在相同条件下饲养，术后3周全部处死动物。

粘连程度肉眼分级：参考Nair等[1]制定的5级分类法，确定粘连分级标准。完全无粘连为0级，计0分；内脏间或内脏与腹壁间1条粘连带为I级，计1分；内脏间或内脏与腹壁间2条粘连带为II级，计2分；多于2条粘连带而内脏未直接粘连至腹壁为III级，计3分；内脏直接粘连到腹壁，不管粘连带多少为IV级，计4分，总评分越高说明组织粘连程度越严重。结果如表1所示。

通过表1的结果可知，本发明通过低温超声间歇溶解法大大缩短透明质酸溶解工序时间，降低产品生产过程被污染的几率，另外利用本发明得到的材料粘附组织封闭伤口，减少组织出血量，止血快，效果好，通过冻干可使材料中交联剂残留量达到行业标准要求且能稳定在一定范围，可实现规模化生产。

表1

Claims (10)

1.一种可吸收止血材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将中小分子量透明质酸或其盐溶于碱性水溶液中，加入交联剂，在低温间歇式超声作用下进行交联反应，再通过透析纯化处理得到交联凝胶；

(2)另取高分子量透明质酸或其盐溶于水中，经低温超声处理，得到未交联透明质酸或其盐的凝胶；

(3)将步骤(1)得到的交联凝胶与步骤(2)得到的未交联凝胶进行混合均匀，再经低温冷冻干燥得到的固态材料；

(4)根据临床使用需求将步骤(3)得到的固态材料处理片状、薄膜状、块状或纤维状。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的中低分子量透明质酸或其盐的分子量为10万-100万道尔顿，步骤(2)中，所述的高分子量透明质酸或其盐的分子量为120-300万道尔顿。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所用的交联剂为二乙烯基砜、1，2，7，8-二环氧辛烷、1，4-丁二醇二缩水甘油醚或乙二醇二缩水甘油醚中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，透明质酸或其盐与交联剂的质量比为40-100∶1。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，将透明质酸或其盐溶于0.01-0.1M无机碱性水溶液中，形成浓度为2-12％的凝胶。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，低温间歇式超声法的条件为：低温为0-10℃，超声频率不大于20KHz，超声反应时间0.2～1h，静置1～3h，如此为一循环，循环反应2-5次。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，低温间歇式超声法的条件为：温度范围0-10℃，超声频率不大于20KHz，超声时间0.2～1h，静置1～3h，如此为一循环，循环1-3次。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联凝胶和未交联凝胶的终浓度均为0.5-5％。其中，未交联凝胶与交联凝胶质量比为10/0～1/9。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)的交联反应后将得到的交联凝胶在磷酸缓冲液或生理盐水中透析纯化，再用注射用水冲洗盐离子，得到浓度为0.5-5％的中性交联透明质酸或其盐凝胶，然后与未交联透明质酸或其盐凝胶混合。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，低温冷冻干燥的条件为：慢速预冻，一次升华温度低于-20℃，形成白色固态材料，材料厚度控制2-5mm。