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CN107012160A - 高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法及应用 - Google Patents

高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法及应用 Download PDF

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CN107012160A
CN107012160A CN201710215454.4A CN201710215454A CN107012160A CN 107012160 A CN107012160 A CN 107012160A CN 201710215454 A CN201710215454 A CN 201710215454A CN 107012160 A CN107012160 A CN 107012160A
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corynebacterium glutamicum
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genes
acid
strain
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王智文
毛雨丰
陈涛
赵学明
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Original Assignee
Tianjin University
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Abstract

本发明公开了一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法及应用，构建方法为：(1)在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中敲除pta‑ackA基因操纵子、actA基因及ldh基因；在染色体上的ppc基因的起始密码子前和pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子；(2)用pECXK99E连接基因pyc、基因gltA和基因sucE得到pEC‑pycsucEgltA；用pXMJ19连接基因aceA和基因aceB得到pX‑aceAaceB；(3)将pEC‑pycsucEgltA和pX‑aceAaceB导入步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株。本发明琥珀酸得率高，副产物少。

Description

高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术与应用领域，具体地涉及一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株及构建方法及应用。
背景技术
2004年，琥珀酸(又名丁二酸)被美国能源部列为十二个最有价值的平台化合物之一，又因其被广泛地用作可降解塑料、食品的鲜味剂和医药中间体的合成原料，所以一直被当作一种高附加值产品而被广大研究者研究。2010年的琥珀酸以及其衍生物的全球市场年需求量就已高达三千万吨，并且将会继续逐年递增。而据2013年的统计结果，琥珀酸年产量尚不足30万吨，市场缺口极大。当前，化学法仍是琥珀酸合成的主要工艺，但随着传统化工产业对环境危害的不断加重，生物发酵合成琥珀酸受到了越来越多的关注。
微生物发酵生产琥珀酸，指的是通过细菌或者真核生物的发酵方法，以淀粉、糖、甘油或其它微生物能够与传统的化学合成法相比较，生物法具有许多优势。首先化学合成法的成本较高且生产过程中伴随着大量重污染的有毒有害的副产物产生。而微生物合成法采用碳水化合物这种可再生原料作为初始碳源，这种方法具有低成本，对环境友好，储备量丰富，可再生等诸多优点。其次，微生物合成琥珀酸的过程中，每生成1摩尔琥珀酸的同时固定1摩尔二氧化碳，因此这种方法不仅摆脱了对石油资源的依赖，减轻当今石油工业的资源短缺的现状，而且开辟了温室气体二氧化碳再利用的新途径。目前对于微生物宿主的选择是多种多样的，包括天然分泌琥珀酸的厌氧微生物以及基因工程菌。研究最多的是：产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes，产琥珀酸曼氏杆菌Mannheimiasucciniciproducens，产琥珀酸厌氧螺菌Anaerobiospirillum succiniciproducens，大肠杆菌Escherichia coli，酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae以及谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum。
谷氨酸棒杆菌是一种兼性厌氧、生长快速的革兰氏阳性菌,作为一株成熟的工业规模氨基酸生产菌株，近年来活跃于各种化学品、生物材料(二元胺、二羧酸、二元醇以及高分子聚合物等)以及生物燃料(乙醇、高级醇等)的生物转化过程中。在厌氧条件下，谷氨酸棒杆菌的细胞生长受到抑制，但是细胞仍有能力进行糖代谢，并大量积累比如L-乳酸，琥珀酸和乙酸等有机酸。因此，研究者们结合代谢工程操作手段与好氧富集菌体-厌氧高密度发酵工艺，在谷氨酸棒杆菌高产琥珀酸方面做出了一定的研究。
南京工业大学通过低能离子束注入技术对谷氨酸棒杆菌进行诱变得到突变株SA001，消除了菌株副产物乳酸的积累，大幅提高了琥珀酸的得率(郝宁，严明，许晟等.一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌。申请号CN201010578530.6)。但总体产酸水平较低，且产率偏低。江南大学通过基因工程改造得到的谷氨酸棒状杆菌Δldh-pDXW-8/ppc/pyc基因工程菌通过好氧培养-厌氧高密度发酵，产酸能力有了较大的提升，在厌氧阶段积累了75g L-1(张伟国，刘学胜，钱和等.一种高产丁二酸的谷氨酸棒杆菌工程菌及其构建方法。申请号CN201310080870.X)。但没有针对副产品乙酸生成途径进行改造，琥珀酸得率较低，不利于工业规模放大。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
本发明的第二个目的是提供一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法。
本发明的第三个目的是提供一种高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株在生产琥珀酸中的应用。
本发明的技术方案概述如下：
高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、乙酸生成途径actA基因以及乳酸生成途径ldh基因；在染色体上的回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子，再在染色体上的回补途径丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子；
(2)使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pECXK99E连接丙酮酸羧化酶基因pyc、柠檬酸合酶基因gltA和琥珀酸输出蛋白基因sucE得到pEC-pycsucEgltA；使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19连接异柠檬酸裂合酶基因aceA和苹果酸合酶基因aceB得到pX-aceAaceB；(3)将pEC-pycsucEgltA和pX-aceAaceB导入步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
上述方法构建的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
上述高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株在生产琥珀酸中的应用。
有益效果
本发明所构建的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株，经过98h的厌氧发酵，能够积累110g L-1的琥珀酸，得率为0.87g琥珀酸/g葡萄糖。不仅琥珀酸的产量得到很大的提高，而且减少了副产物的产生，提高了琥珀酸的得率。
附图说明
图1为pD-sacB敲除载体的图谱。
图2为谷氨酸棒杆菌无痕敲除原理示意图。
图3为pD-pta-ackA敲除载体的图谱。
图4为pD-actA敲除载体的图谱。
图5为pD-ldh敲除载体的图谱。
图6为pD-Psod-ppc整合载体的图谱。
图7为pD-Psod-pyc整合载体的图谱。
图8为pEC-pycsucEgltA表达载体的图谱。
图9为pX-aceAaceB表达载体的图谱。
图10为菌株CGL7厌氧条件下分批补料发酵示意图。
具体实施方式
本发明所用到的原始菌株谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032来源为ATCC(The Global Bioresource Center，http://www.atcc.org/)，购买于2012年10月。
重组质粒pK18mobsacB，表达质粒pXMJ19和pECXK99E购买于BioVector NTCC公司(http://www.biovector.net/)。
所用琥珀酸标准品从sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)购买。
所用限制性内切酶、去磷酸化酶、DNA连接酶等分子生物学试剂从thermo公司购买(http://www.thermoscientificbio.com/fermentas)，所用其他生化试剂从生工生物工程(上海)股份有限公司购买(http://www.sangon.com/)。
厌氧条件下，谷氨酸棒杆菌的琥珀酸生产主要通过三羧酸循环(TCA)的还原臂，而丙酮酸羧化酶pyc及磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc是代谢流导向TCA还原臂的关键酶，因此对其进行过表达。同时由于乙醛酸循环途径在合成琥珀酸的过程中对于还原力的需求更低，因此也是很有潜力的琥珀酸生成途径。柠檬酸合酶基因gltA催化草酰乙酸和乙酰辅酶A生成柠檬酸，柠檬酸可以进一步生成异柠檬酸，是乙醛酸循环的重要前体物质。异柠檬酸裂合酶(aceA)催化异柠檬酸生成乙醛酸和琥珀酸，苹果酸合酶(aceB)催化乙醛酸生成苹果酸。为了打通乙醛酸循环，对上述三个酶的基因进行过表达。及时将细胞生成的琥珀酸转运到胞外是琥珀酸生产关键环节之一，因此对琥珀酸输出蛋白基因sucE进行过表达。经检索，目前未见有使用相同代谢工程改造谷氨酸棒杆菌以及利用其生产琥珀酸的报道。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下述实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但对本发明不作任何限制。
实施例1：pD-sacB敲除载体构建以及谷氨酸棒杆菌无痕敲除操作
(1)pD-sacB敲除载体构建
首先以HindIII切割后的pK18mobsacB线性片段作为模板，用引物sacB1/sacB2扩增sacB基因，约1.6kb。
将MunI/EcoRV双酶切的sacB基因连接到EcoRI/SmaI双酶切的pECXK99E上面，然后用如下的引物trcsacB1/trcsacB2，以pECXK99E-sacB质粒作为模板扩增含有trc启动子的trcsacB片段,约1.8kb。用引物pD1/pD2，以pK18mobsacB质粒作为模板扩增含有含有卡那霉素抗性和大肠杆菌复制子的pD片段,约2.6kb。最后将AatII酶切的片段trcsacB和pD进行连接得到pD-sacB。最终的pD-sacB质粒图谱如图1所示。
(2)谷氨酸棒杆菌无痕敲除操作
①基于sacB蔗糖致死原理的无痕敲除，如图2所示：
1.将构建好的敲除载体，如pD-sacB-AC质粒(AC代指欲敲除基因的上游PCR片段A和下游PCR片段C的融合而得的PCR片段AC)，通过电极转化到谷氨酸棒杆菌后,涂布于BHIS-Kan15(Kan15，指代培养基中含有终浓度为15ug/mL的卡那霉素)固体平板上，30℃培养48h左右。
2.待菌落长至可挑取大小(直径2-4mm)，对点LB-Kan25-Suc100(Kan25，指代培养基中含有终浓度为25ug/mL的卡那霉素，下同；Suc100，指代培养基中含有终浓度为100g/L的蔗糖，下同)与LB-Kan25平板，30℃培养12h，选取不在LB-Kan25-Suc100平板上面生长而在LB-Kan25上面长势良好的菌落挑至无抗LB试管中于30℃，220rpm，过夜培养(12h以上)。
3.无抗LB试管中的菌液稀释50倍，分别取20μL、40μL、60μL、80μL涂布于LB-Suc100平板。同时取稀释50倍菌液的80μL涂布于LB-Kan25-Suc100平板。最后取稀释5000倍的菌液50μL涂布于LB-Kan25平板。30℃培养24h。
4.观察平板长势，只有当LB-Kan25平板上长势良好而LB-Kan25-Suc100平板上却几乎不长时，才可进行下步筛选。从所有LB-Suc100平板上，选取50个单菌落，挑菌至试管培养后进行菌液PCR，电泳检验PCR片段长度，验证正确的重新挑菌至液体LB-Kan25试管中培养验证。
5.抽提无抗LB试管中菌液的基因组，再次进行PCR验证，片段长度与AC相符的即为成功突变的菌株，于-80℃冰箱保存。本发明对谷氨酸棒杆菌无痕敲除操作不做限定，参考文献1中公开了相关方法
其中，BHIS固体培养基：7.4g脑心浸粉与4g琼脂溶于100ml双蒸水，18.2g山梨糖溶于100mL双蒸水；脑心浸粉和山梨糖分开进行0.1Mpa压力下灭菌20min，使用时再等体积混匀。
LB液体培养基配方为：蛋白胨(10g/L)，酵母提取物(5g/L),NaCl(10g/L)，调节pH至7.0。0.1Mpa压力下灭菌20min。LB液体培养基中添加20g/L的琼脂LB固体培养基。
实施例2：副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、副产物乙酸生成途径actA基因与副产物乳酸生产途径ldh基因的敲除
(1)敲除乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子的具体操作如下：
利用pta1、pta2和pta3、pta4两对引物，以C.glutamicum ATCC 13032为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为870bp和929bp的上下游同源臂。经切胶回收后利用引物pta5、pta6，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的约1.6kb的拼接产物。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestXbaI/SalI双酶切，经连接、转化后得到pta-ackA基因操纵子敲除载体pD-pta-ackA(见图3)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032中，按照实施例1中所述方法得到pta-ackA基因操纵子敲除菌株CGL1。
(2)敲除乙酸生成途径actA基因的具体操作如下：
利用act1、act2和act3、act4两对引物，以C.glutamicum ATCC 13032为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为802bp和900bp的上下游同源臂。经切胶回收后利用引物act5、act6，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的约1.7kb的拼接产物。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestXbaI/SalI双酶切，经连接、转化后得到actA基因敲除载体pD-actA(见图4)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL1中，按照实施例1中所述方法得到actA基因敲除菌株CGL2。
(3)敲除乳酸生成途径ldh基因的具体操作如下：
利用ldh1、ldh2和ldh3、ldh4两对引物，以C.glutamicum ATCC 13032为模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶扩增分别得到大小为723bp和784bp的上下游同源臂。经切胶回收后利用引物ldh1、ldh4，同样使用KOD-plus高保真DNA聚合酶进行融合PCR扩增，得到上下游同源臂的约1.5kb的拼接产物。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digestEcoRI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到ldh基因敲除载体pD-ldh(见图5)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL2中，按照实施例1中所述方法得到ldh基因敲除菌株CGL3。
实施例3：染色体上回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子、染色体上丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子
(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因强启动子Psod的插入的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。sodppc1和sodppc2用于扩增基因ppc的上游片段(557bp)。sodppc3和sodppc4用于扩增sod基因的启动子(192bp)。sodppc5和sodppc6用于扩增基因ppc的起始片段(563bp)。分别将3个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用sodppc1和sodppc6作为引物，扩增得到三个片段的融合产物(1.3kb)。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到ppc基因插入染色体强启动子Psod载体pD-Psod-ppc(见图6)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL3中，按照实施例1中所述方法得到染色体ppc基因插入强启动子Psod菌株CGL4。
(2)丙酮酸羧化酶pyc基因强启动子Psod的插入的具体操作如下：
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。sodpyc1和sodpyc2用于扩增基因pyc的上游片段(522bp)。sodpyc3和sodpyc4用于扩增sod基因的启动子(192bp)。sodpyc5和sodpyc6用于扩增基因pyc的起始片段(512bp)。分别将3个片段切胶纯化回收后，以等摩尔比例的片段作为模板，用sodpyc1和sodpyc6作为引物，扩增得到三个片段的融合产物(1.3kb)。然后将融合产物和pD-sacB质粒使用Thermo Fast digest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到pyc基因插入染色体强启动子Psod载体pD-Psod-pyc(见图7)。将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL4中，按照实施例1中所述方法得到染色体pyc基因插入强启动子Psod菌株CGL5。
实施例4：使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pECXK99E过表达丙酮酸羧化酶基因pyc、柠檬酸合酶基因gltA和琥珀酸输出蛋白基因sucE
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-pyc1和p-pyc2用于扩增基因pyc片段(约3kp)。然后将片段和pECXK99E质粒使用Thermo Fastdigest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到pyc基因表达载体pEC-pyc,测序检测无误。以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-sucE1和p-sucE2用于扩增基因sucE以及其本身启动子的片段(约2.2kp)。然后将片段和pEC-pyc质粒使用Thermo Fast digest XbaI/SbfI双酶切，经连接、转化后得到pyc、sucE基因表达载体pEC-pycsucE,测序检测无误。以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-gltA1和p-gltA2用于扩增基因gltA片段(约1.3kp)。然后将片段和pEC-pycsucE质粒使用Thermo Fast digest SbfI单酶切，经连接、转化后得到pyc、sucE和gltA基因表达载体pEC-pycsucEgltA(见图8),将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL5中，得到pECXK99E过表达丙酮酸羧化酶基因pyc、柠檬酸合酶基因gltA和琥珀酸输出蛋白基因sucE的菌株CGL6。
实施例5：使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19过表达异柠檬酸裂合酶(aceA)和苹果酸合酶(aceB)
以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-aceA1和p-aceA 2用于扩增基因aceA片段(约1.3kp)。然后将片段和pXMJ19质粒使用Thermo Fastdigest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到aceA基因表达载体pX-aceA,测序检测无误。以C.glutamicum ATCC 13032基因组为模板，以如下引物进行PCR扩增。p-aceB1和p-aceB2用于扩增基因aceB片段(约2.2kp)。然后将片段和pX-aceA质粒使用Thermo Fastdigest XbaI/HindIII双酶切，经连接、转化后得到aceA和aceB基因表达载体pX-aceAaceB(见图9),将测序结果正确的质粒通过电转导入谷氨酸棒杆菌CGL6中，得到pXMJ19过表达异柠檬酸裂合酶(aceA)和苹果酸合酶(aceB)的CGL7。
本发明中的菌株代号如CGL1～CGL7等是为了方便描述，但不应理解为对本发明的限定。表1菌株构建所用引物序列
实施例6：利用构建的菌株进行两阶段高密度分批补料琥珀酸厌氧发酵
琥珀酸发酵采用两阶段操作法:
第一阶段，取一管CGL7菌株-80℃保藏的对数期种子培养液冰上融化后全部接入装有50mLCGIII液体培养基的500mL锥形瓶中。30℃，220rpm过夜培养，按照10％接种量转接至装有800mlCGIII种子培养基的3000ml锥形瓶,30℃，220rpm振荡培养至后对数期，此时OD600约等于20。
第二阶段，把CGIII培养液无菌转入到预冷的400mL离心管中，4℃，5000g离心15分钟。用4℃预冷的CGXII培养基冲洗回收的菌体一次，用预冷的CGXII培养基重新悬浮菌体，然后将菌体离心转入到1.5L小型发酵罐中，发酵初始OD600约等于110，初始葡萄糖浓度约为36g L-1，添加230mM NaHCO3提供羧化反应所需要的CO2。分别在5.5h，18h和37.5h进行三次补料，包括80％(v/w)葡萄糖母液和固体NaHCO3。整个过程发酵罐保持封闭状态，转速350rpm，采用15M KOH控制发酵pH为6.8-7.0。经98h发酵之后，琥珀酸浓度达到110g L-1(930mM)，平均琥珀酸得率为0.87g(g glucose)-1。副产物乙酸浓度为3g L-1，丙酮酸浓度为0.7g L-1(见图10)。
CGIII培养基配方为:葡萄糖(30g L-1),蛋白胨(10g L-1),酵母抽提物(10g L-1),NaCl(10g L-1),3-morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)(21g L-1)(pH 7.0)。
CGXII培养基配方为:葡萄糖(30g L-1),(NH4)2SO4(5g L-1),urea(5g L-1),KH2PO4(1g L-1),K2HPO4(1g L-1),MgSO4·7H2O(0.25g L-1),CaCl2(10mg L-1),FeSO4·7H2O(10mg L-1),MnSO4·H2O(0.1mg L-1),ZnSO4·7H2O(1mg L-1),CuSO4·5H2O(0.2mg L-1),NiCl2·6H2O(20μg L-1),biotin(0.4mg L-1),MOPS(21g L-1)(pH 7.0)。
本发明构建的菌株，其基因型为C.glutamicum 13032ΔldhΔpta-ackAΔactA；Psod-pycPsod-ppc，pEC-pycsucEgltA pX-aceAaceB，KanR CmR。其可以利用葡萄糖生产较高浓度较高得率的琥珀酸。
本发明的菌株的构建，其步骤的前后顺序不限定，本领域的技术人员按本发明公开的内容达到本发明的目的均属于本发明的保护范围。
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SEQUENCE LISTING
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<160> 44
<170> PatentIn version 3.3
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agataagctt aaatccgtga agctggcacc 30
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gtgaaagagt gtttaaagta gttatagctg ccaattattc cggg 44
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gtcatcgcgt aaaaaatcag tcatgggtaa aaaatccttt cgta 44
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tacgaaagga ttttttaccc atgactgatt ttttacgcga tgac 44
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agattctaga atgcgacggc ggatgttctt 30
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gataaagctt gctgtggcag tgaccaaccg 30
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tagctgccaa ttattccggg 20
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cccggaataa ttggcagcta tagagtaatt attcctttca acaagagacc 50
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gaagatgtgt gagtcgacat gggtaaaaaa tcctttcgta 40
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tacgaaagga ttttttaccc atgtcgactc acacatcttc 40
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ctagtctaga ctttaggaaa cgacgacgat caagt 35
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agatcctgca ggtgcgctta aggggtcaat gc 32
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atatcctgca ggccgtaatc cggaagagtt t 31
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atatcctgca ggctaaattt agcgctcctc gc 32
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agtaagcttg aaaggaggcc cttcagatgt caaacgttgg aaagccacg 49
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acgtctagac tagttgtgga actggccttc ttc 33
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tagtctagag aaaggaggcc cttcagatga ctgaacagga actgttgtct gc 52
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<213> 人工合成
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acggatatcg atgcaggtaa gcgtcgaaaa gc 32

Claims (3)

1.高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除副产物乙酸生成途径pta-ackA基因操纵子、乙酸生成途径actA基因以及乳酸生成途径ldh基因；在染色体上的回补途径磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc基因的起始密码子前引入Psod强启动子，再在染色体上的回补途径丙酮酸羧化酶pyc基因的起始密码子前引入Psod强启动子；
(2)使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pECXK99E连接丙酮酸羧化酶基因pyc、柠檬酸合酶基因gltA和琥珀酸输出蛋白基因sucE得到pEC-pycsucEgltA；使用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19连接异柠檬酸裂合酶基因aceA和苹果酸合酶基因aceB得到pX-aceAaceB；
(3)将pEC-pycsucEgltA和pX-aceAaceB导入步骤(1)获得的谷氨酸棒杆菌中，得到高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
2.权利要求1所述的方法构建的高产琥珀酸的谷氨酸棒杆菌菌株。
3.权利要求2所述菌株在生产琥珀酸中的应用。
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