CN107002137A

CN107002137A - 单分子rna检测

Info

Publication number: CN107002137A
Application number: CN201580063399.0A
Authority: CN
Inventors: 钟声; 费尔南多·比亚塞
Original assignee: University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California San Diego UCSD
Priority date: 2014-09-22
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2017-08-01
Also published as: WO2016048842A1; JP2017529103A; EP3198037A4; US20170275681A1; EP3198037A1

Abstract

公开了一种用于检测至少一种靶核酸的方法。在一些实施方式中，所述至少一种靶核酸是在单个细胞内的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述方法包括使用量子点。一个实施方式涉及一种方法，该方法包括使用能与靶RNA(或其他核苷酸)结合的两种或更多种(在一些实施方式中，至少五种)核酸探针。在一些实施方式中，所述方法可用于检测一种或多种靶RNA。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA‑RNA相互作用的单分子分析。

Description

单分子RNA检测

相关技术描述

目前检测靶核酸的方法可能需要使用大量的探针，或者可能是昂贵的。因此，在其中使用的改善的方法和组合物是有利的。

发明内容

在下面编号的段落中提供了本发明的一些实施方式：

1、一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。

2、根据段落1所述的方法，其中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。

3、根据段落2所述的方法，其中，所述粒子是量子点。

4、根据段落1～3中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包括RNA。

5、根据段落1～5中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包括单个细胞内的单个RNA分子。

6、根据段落1～5中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针包括5种或更多种不同的探针。

7、根据段落1～6中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针的每一个均具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。

8、根据段落1～7中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针中的每一个均具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。

9、根据段落1～8中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针中的每一个均具有约30个核苷酸的长度。

10、根据段落1～9中任一项所述的方法，其中，检测多种靶核酸。

11、一种核酸探针，所述核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联。

12、根据段落11所述的核酸探针，其中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。

13、根据段落12所述的核酸探针，其中，所述粒子是量子点。

14、根据段落11～13中任一项所述的核酸探针，其中，所述至少一种可检测的组分与所述核酸探针共价连接。

15、根据段落11～14中任一项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。

16、根据段落11～15中任一项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。

17、根据段落11～16中任一项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针具有约30个核苷酸的长度。

18、一种试剂盒，其包括能与至少一种靶核酸杂交的多种不同的核酸探针，其中，所述多种不同的核酸探针中的每一个均与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联。

19、根据段落18所述的试剂盒，其中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。

20、根据段落19所述的试剂盒，其中，所述粒子是量子点。

21、根据段落18～20中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种可检测的组分与所述多种不同的核酸探针中的每一个均共价连接。

22、提供一种用于检测多种靶核酸的方法，其中所述方法包括使所述多种靶核酸与多组核酸探针接触，其中每组核酸探针均包括多种不同的核酸探针，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，其中每组核酸探针均与不同的靶核酸杂交；并且其中，每组核酸探针均与以高波长发射的可检测的组分相关联，所述高波长发射能与和其他组核酸探针相关联的可检测的组分的高波长发射区分开；并且其中，所述接触在所述多组核酸探针与所述多种靶核酸结合的条件下进行。

附图说明

图1.寡核苷酸与链霉亲和素包被的量子点偶联的示意图。如图所示，颜色浅的序列与寡核苷酸探针互补，所述寡核苷酸探针与量子点偶联。

图2.对单分子核糖核酸进行斑点鉴定和计数的步骤。(A)使用60×油物镜获取的原始图像(71个z-堆栈(z-stack)的切片编号29)。比例尺条代表约1μm。(B)应用拉普拉斯-高斯滤波器后的图像。(C)去卷积的图像，并且转换成16比特格式。(D)通过强度阈值规范对信号进行的数字鉴定。

图3.对所检测且计数的斑点的数字3D重建。对于所计数的斑点的可视化的(A)侧向视图和(B)顶部视图。

图4.使用QD-smRNA-FISH对RNA分子的定量。(a)使用标记有量子点的探针进行单分子RNA-FISH的示意图。如图所示，颜色浅的序列与探针互补。(b)干细胞中的Actb RNA分子的定量。如图所示，复制1位于第13、14、15、19、22、23、27、30～33和37位。(c)smRNA-FISH或QD-smRNA-FISH的探针相对于Actb基因的位置。(d)由标记有有机(Alexa555)染料和无机(QD 565)染料的探针检测到(箭头)的信号的共定位。

图5.5Malat1基因和Slc2a3基因的RNA共定位的实验证据。(a)为了测试Malat1的RNA和Slc2a3的RNA共定位假说进行双标记实验的描述。(b)Malat1RNA分子和(c)Slc2a3RNA分子的定量。(d)Malat1和Slc2a3的共定位RNA分子的定量。如图所示，柱形图的底部代表Malat1，具有对应数字的区域是重叠区，且柱形图的顶部代表Slc2a3。(e)使用不同染料和滤镜获得的代表性图像，其中示出了四种斑点的共定位(箭头)。

图6.用于测试探针标记的最佳混合物而进行的量子点和寡核苷酸的滴定。使用红色标记物标记qDot625+Actb寡核苷酸(oligo)，同时使用绿色标记物标记Actb寡核苷酸。在凝胶上示出凝胶上qDot625+Actb寡核苷酸和Actb寡核苷酸迁移的区域。

图7.对渐进荧光阈值处的斑点的计数。嵌入式图是三次连续计数的第一平台期附近的计数。如图所示，在嵌入式图(左图，图7A)中示出包括17000～27000任意荧光单位的区域，且在嵌入式图(右图，图7B)中示出包括30000～40000任意荧光单位的区域。

图8.Alexa 555和qDot 565的激发和发射的区别。(a，b)qDots和Alexa 555的激发波长是有区别的(激发器通道，b)。(c)使用对应的交换发射滤镜获取的Alexa 555和qDot565的RNA-FISH信号。

图9.qDot 525信号和qDot 605信号的区别。qDot 525和qDot 605的发射波长(实线)是分离的。左峰是Qdot 525，右峰是Qdot 605。(a)非重叠范围(发射器通道，b)的发射滤镜偶合(图像经Fluorescence SpectraViewer,Life Technologies绘制)。(c)使用对应的交换发射滤镜获取的qDot 525和qDot 605的RNA-FISH信号。

图10.具有双色smRNA-FISH的称为共定位的RNA。(A)检测到的所有斑点的体素分布(每一斑点均对应一个RNA分子)。中心圆点：平均尺寸。误差线：样品的标准偏差。(B)对鉴定出的斑点的平均体积和半径的描绘。(C)被称为共定位斑点的标准。(D)在覆盖两个细胞的视野中鉴定出的所有斑点的图形表示。箭头指向共定位的斑点，该共定位的斑点使用发射不同波长的荧光的染料成像。1像素～107nm。箭头代表Malat1和Scl2a3之间的共定位。

图11.图中示出不同尺寸的CdTe量子点的荧光光谱。不同尺寸的量子点由于量子限制而发射不同颜色的光。

定义

在下面的描述中，广泛地使用了许多术语。提供以下定义以便于理解本发明的替代物。

如本文所使用的，“一个/种(a)”或“一个/种(an)”可指一个/种或多于一个/种。

如本文所使用的，术语“约”指一数值，该数值包括用于确定数值的方法的固有的误差变化，或实验之间存在的变化。

如本文所使用的，“核酸探针”指可用于检测靶核酸(即靶DNA或靶RNA)的存在的多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)生成的片段，以及通过连接、断链、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任一种所生成的片段。核酸探针可由自然存在的核苷酸(如DNA和RNA)的单体，或自然存在的核苷酸的类似物(例如自然存在的核苷酸的对映体形式)，或两者的组合构成。当标记有在高波长处发射的量子点或类似粒子时，核酸探针或杂交探针可用于识别在各种微生物的核酸序列中存在的互补的片段或序列。核酸探针可包括长度可变的DNA或RNA片段。所述探针的大小可为自约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约200个、约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个、约900个或约1000个碱基长的大小范围内，或在上述数值中任意两个数值之间的任意其他长度。所述靶核酸序列的大小可包括约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个、约200个、约300个、约400个、约500个、约600个、约700个、约800个、约900个或约1000个碱基长，或在上述数值中的任意两个数值之间的任意其他长度。然后，探针可用于DNA或RNA样品中，以检测与探针中的序列互补的核苷酸序列(靶DNA链或靶RNA链)的存在。所述探针由此与单链核酸(DNA或RNA)杂交，由于探针和靶标之间的互补性，该单链核酸(DNA或RNA)的碱基序列允许探针-靶碱基进行配对。所述探针也可以首先变性(例如，通过加热或在碱性，如暴露于氢氧化钠的条件下)成单链DNA(ssDNA)，然后与靶ssDNA或靶RNA杂交。在一些实施方式中，提供了一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其中，所述方法包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述核酸是DNA。在一些实施方式中，所述核酸是RNA。在一些实施方式中，所述探针与所述靶核酸链内的靶序列结合。

在本文中所称的“靶(标)”或“靶核酸”是与核酸探针互补的核酸序列。在一些实施方式中，所述靶核酸包括在单个细胞内的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述靶核酸在细胞内，或在从一个细胞或多个细胞获得的核酸样品内。在一些实施方式中，所述核酸探针与单一的靶核酸链上的靶序列互补。在一些实施方式中，所述靶核酸链是RNA。在一些实施方式中，所述靶核酸链包括至少一种靶序列。在一些实施方式中，至少一种核酸探针与靶核酸链上的至少一种靶序列互补。

“RNA”指核糖核酸，并且是涉及基因的编码、解码、调节和表达中的多种生物学作用的聚合物分子。RNA通过催化生物反应、控制基因表达，或感知并传递对细胞信号的响应，而在细胞内起到积极作用。信使RNA将蛋白序列的信息携带至核糖体，并通过核糖体进行翻译。在一些实施方式中，提供了一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其中，所述方法包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述靶核酸包括在单个细胞内的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

术语“与……互补”指互补序列与参照多核苷酸序列的全部或一部分互补。举例来讲，核苷酸序列5’-“CATTAG”-3’对应于参考序列“CATTAG”，并且与参照序列3’-“GTAATC”-5’互补。在一些实施方式中，提供了一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其中，所述方法包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述不同的核酸探针与至少一种靶核酸互补。在一些实施方式中，所述至少一种靶核酸是DNA或RNA。在一些实施方式中，所述靶核酸是信使RNA(mRNA)。

本文所使用的“粒子”指微小的物体，例如纳米晶体，该微小的物体例如可通过发射高波长发射经历从高能态向低能态的粒子衰变。在本文所述的一些实施方式中，粒子发射出约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。

所述的“量子点”指无机纳米晶体半导体。量子点的尺寸反映了所发射出的光的波长，这样能提供高度可调的色谱。量子点的尺寸是可控的，尺寸的增加可导致发射波长范围的增加。就这一点而言，量子点显示出独特的电子性质，这是粒子的高的表面/体积比的结果。最明显的结果是它们的荧光性，其中它们可产生由它们的尺寸所决定的有区别的颜色。量子点的尺寸可在自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的范围内。在本文所述的一些实施方式中，量子点包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。如图11所示，示例性量子点可在非常窄的波长范围内进行发射，但在跨越宽的光谱上被激发，这允许多路复用(multiplex)或组合不同的核酸探针，该不同的核酸探针具有发射不同波长的不同尺寸的量子点。如图11所示，示例性量子点可在450nm和850nm之间发射。量子点的尺寸越大，它的荧光光谱越红(更低的能量)。相反，小斑点发射出更蓝的光(更高的能量)。不受限制地，在下面的表1中示出了可与发射峰和所发射的颜色相关的示例性尺寸。

表1：量子点尺寸与发射波长的相关性。

在高波长，如在450nm和850nm之间的波长处，观察到量子点的发射。在一些实施方式中，量子点发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。在本文所述的一些实施方式中，量子点包括自约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。

所述量子点可由各种二元化合物制成。不受限制地，所述量子点可由例如硫化铅、硒化铅、硒化镉、硫化镉、砷化铟和磷化铟制成。在本文所述的一些实施方式中，量子点包括硫化铅、硒化铅、硒化镉、硫化镉、砷化铟或磷化铟。

为了检测探针与其靶序列的杂交，所述探针还可以带有量子点或发射高波长的类似粒子的标签(或“标记”)。然后，通过本领域技术人员已知的成像技术使杂交的探针可视化，来检测与探针具有中等至高度互补性的DNA序列或RNA转录物。对具有中等或高度相似性的序列的检测依赖于应用何种严格的杂交条件，例如高严格度，如高杂交温度和杂交缓冲液中的低盐，仅允许高度相似的核酸序列之间发生杂交，而低严格度，如较低温度和高盐，则允许序列相似性较低时就发生杂交。

取决于方法，所述探针可使用亚磷酰胺法来合成，或者它可以通过PCR扩增或克隆(两者都是较老的方法)来生成和标记。在体内使用探针的情况中，为了提高探针在体内的稳定性，优选不使用RNA，但可使用RNA类似物，尤其是吗啉衍生物。基于分子DNA或RNA的探针可用于筛选基因文库、使用印迹法来检测核苷酸序列，以及其他基因技术例如核酸微阵列和组织微阵列。在一些实施方式中，所述探针通过亚磷酰胺法来合成，或通过PCR扩增或克隆来生成和标记。在一些实施方式中，所述探针包括RNA类似物，例如吗啉衍生物。

本文所定义的“发射光谱”指由于原子或分子从高能态向较低能态跃迁所发射的电磁辐射的频谱。

具体实施方式

本发明公开了一种检测至少一种靶核酸的方法。在一些实施方式中，所述至少一种靶核酸是在单个细胞内的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述方法包含使用量子点。在一些实施方式中，所述方法使成本降低约1/3。

一个实施方式涉及一种方法，该方法包括使用能与靶RNA(或其他核苷酸)结合的两种或更多种(在一些实施方式中，至少五种)核酸探针。在一些实施方式中，所述核酸探针的长度为约30个核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸探针的长度为约10个至约100个核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸探针为约5个、约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个、约100个或约110个核苷酸长，或任意两个上述数值之间的任意数量的核苷酸。在一些实施方式中，所述核酸探针为约20个至约80个核苷酸长。在本文所述的一些实施方式中，核酸探针为约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个或约80个核苷酸之间的长度，或任意两个上述数值之间的任意长度。在一些实施方式中，每一核酸探针都包括至少一个量子点(以高波长发射为特征的类似粒子)。在一些实施方式中，所述量子点包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。在一些实施方式中，所述至少一个量子点或以高波长发射为特征的类似粒子发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。

在一些实施方式中，所述方法可用于检测一种或多种靶RNA。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

目前的方法依赖于使用与荧光染料连接的、含约20nt的约40种核酸探针。因为目前的染料具有有限的发射光谱，因此需要这么大量的探针。这样产生的成本为约1500美元/靶RNA。因为量子点固有的“闪烁”行为，之前还没有考虑过使用量子点(QD)来解决这个问题。因此，使用时，当观察样品时存在约10％的概率QD可能没有在发射。但是，在一些实施方式中，通过对同一靶标使用多个QD标记的探针(优选约5个)而避免了上述担心。这样允许5个QD与给定的靶RNA连接，因此所有QD同时不发射的概率为约105。这样将探针的数量从约40种降低至约5种。另外，还可提高探针-靶标的特异性和信噪比。

在一些实施方式中，所述方法允许同时评定多种靶RNA。这样是有利的，因为目前难以同时评定多种靶RNA，并且需要使用昂贵的显微镜。在一些实施方式中，所述方法允许使用在细胞成像实验室中通常使用的较便宜的显微镜。在一些实施方式中，所述方法可用于检测一种或多种靶RNA。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

本方法的一些应用包括检测细胞中的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述方法可与微阵列技术一起使用。

在一些实施方式中，所述方法可检测细胞中的单个RNA分子，从而数字量化任意基因的RNA转录物。在一些实施方式中，所述方法可用于检测一种或多种靶RNA。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞或原核细胞。在一些实施方式中，在所述细胞是真核细胞的情况中，所述细胞是人类细胞、癌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、肿瘤细胞、癌前细胞或小胶质细胞。取决于可用于通过RNA或DNA在细胞中的存在来追踪基因表达的分析，细胞类型可用于上述检测，以通过若干靶核酸在所述细胞内的存在或不存在，来分析疾病、疾病的进展，或预测特定的疾病。在一些实施方式中，所述方法使用量子点标记的单链DNA寡核苷酸与靶RNA的杂交，用于显微镜观察和量化。之前因为公知的闪烁问题，而认为量子点不能进行单分子研究。在一些实施方式中，这一问题得到缓解或被克服。在一些实施方式中，与对单分子RNA-FISH使用有机染料和多很多倍的寡核苷酸的技术相比，所述方法将成本降低至小于该类技术的成本的1/3，同时还提供了更清晰、更容易检测且更可信的信号。在一些实施方式中，所述量子点包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。在一些实施方式中，所述量子点发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。

对于给定基因的大部分科学发现是通过研究它的转录来获得的。由该生物现象(基因转录)获得的信息用于推断与从编码序列的结构一直到蛋白水平上的潜在的相互作用的，基因功能相关的重要参数。虽然已经从细胞群(例如：细胞培养物，或组织样品)收集到了关于基因表达的大部分信息，但是广阔的领域或研究已经将注意力引向了个体细胞。因此，单个细胞对于组织构成的重要性得到了研究者和资金来源的关注。在一些实施方式中，所述方法进一步包括获得感兴趣的基因的转录水平。在一些实施方式中，获得感兴趣的基因的转录水平可用于通过若干靶核酸在所述细胞内的存在或不存在，来分析疾病、疾病的进展，或预测特定的疾病。

尽管非常重要，但研究单个细胞的基因表达带来了技术挑战。在不引入技术偏见的情况下，目前仅一种技术能够获得单个细胞的基因表达的信息(Raj,A.,Peskin,C.S.,Tranchina,D.,Vargas,D.Y.,and Tyagi,S.(2006).Stochastic mRNA synthesis inmammalian cells.PLoS Biol.4,e309)。这种技术是荧光原位杂交，最近的技术改进已经允许研究者使用显微镜对感兴趣的基因的单分子核糖核酸进行成像(Raj,A.,van denBogaard,P.,Rifkin,S.A.,van Oudenaarden,A.,and Tyagi,S.(2008).Imagingindividual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.Nat.Methods 5,877–879；Batish,M.,Raj,A.,and Tyagi,S.(2011).Single molecule imaging of RNA insitu.Methods Mol.Biol.714,3–13.Raj,A.,and Tyagi,S.(2010).Detection ofindividual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeledprobes.Methods Enzymol.472,365–386；Shaffer,S.M.,Wu,M.-T.,Levesque,M.J.,andRaj,A.(2013).Turbo FISH:A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH.PLoS One8,e75120)。尽管这一进展是朝基因表达研究迈出的重大一步，但在一些实施方式中，本方法和组合物以比现有方法低很多的成本，大大改进了单分子核糖核酸的靶向检测。

在一些实施方式中，提供了通过使用与量子点偶联的多种不同的核酸探针进行荧光原位杂交，来检测单分子核酸的方法。例如，在一些实施方式中，利用了与量子点相关联的五个不同的核酸探针。在一些实施方式中，所述量子点可与核酸探针共价连接。在一些实施方式中，与量子点相关联的核酸探针可用于检测单分子。与量子点相关联的寡核苷酸也可用于使用新的技术对(培养的细胞或组织中的)RNA的数量进行计数。在一些实施方式中，所述方法将多于一个(设计数量)的量子点带向靶分子(例如RNA)。例如，在一些实施方式中，多个量子点被带向靶分子附近，彼此的信号相互补充，从而“抵消”“闪烁”时的丢失信号。量子点信号的丢失，被称为闪烁，已经成为它们应用于检测和量化分子的障碍。

量子点可通过本领域技术人员已知的多种技术缀合至核酸探针。不受限制地，在EDC N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下(Choi et al.In situ visualization of geneexpression using polymer-coated quantum-dot-DNA conjugates.Small 2009；5:2085e91；通过引用整体并入本文中)，对DNA进行胺修饰以经由形成酰胺键而与量子点表面偶联，以及寡核苷酸进行生物素化以附接至包被在链霉亲和素中的量子点(Kim et al.,Conjugation of DNA to Streptavidin-coated Quantum Dots for the Real-timeImaging of Gene Transfer into Live Cells,NSTI-Nanotech 2004,www.nsti.org,ISBN0-9728422-9-2Vol.3,2004；通过引用整体并入本文中)，可使量子点缀合至核酸探针。在一些实施方式中，量子点可在EDC N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的存在下，缀合至核酸。在一些实施方式中，可通过核酸的胺修饰，以经由形成酰胺键与量子点表面偶联，而使量子点缀合至核酸。在一些实施方式中，可通过核酸的生物素化，以附接包被在链霉亲和素中的量子点，而使量子点缀合至探针。在一些实施方式中，在核酸探针与靶核酸序列互补的情况下，探针进一步包括接头核酸，而QD共价附接至该接头核酸。在一些实施方式中，接头DNA允许在退火过程中保留量子点移动的自由度，进一步在QD的尺寸可能阻止退火的情况下，可使量子点与退火位点相距一定距离。可进一步执行改进退火条件的方法，而且这些方法是本领域技术人员已知的。例如，不与靶结合位点互补的短接头可包括约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个核酸，或任意两个上述数值之间的任意数量的核酸。在核酸探针的一些实施方式中，所述探针进一步包括核酸接头，其中所述核酸接头不与靶结合位点互补，其中所述核酸接头包括约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个核酸，或任意两个上述数值之间的任意数量的核酸，并且其中所述QD共价附接至所述核酸接头。

通过使用少(预计的)量的不同的核酸探针能检测靶核酸单分子，其中不同的核酸探针经设计以杂交在核酸的至少一个特定序列上，并且偶联有量子点。在一些实施方式中，预计数量(例如5个或更多个)的量子点的累积荧光用于标记、检测和量化靶分子。

之前的使用量子点标记的探针所进行的荧光原位杂交，依赖于对每个寡核苷酸的唯一量子点分子进行成像(Yang,H.,Wanner,I.B.,Roper,S.D.,and Chaudhari,N.(1999).An optimized method for in situ hybridization with signal amplification thatallows the detection of rare mRNAs.J.Histochem.Cytochem.47,431–446；Chan,P.,Yuen,T.,Ruf,F.,Gonzalez-maeso,J.,&Sealfon,S.C.(2005).Method for multiplexcellular detection of mRNAs using quantum dot fluorescent in situhybridization.Nucleic acids research,33(18),1–8.doi:10.1093/nar/gni162；Choi,Y.,Kim,H.P.,Hong,S.M.,Ryu,J.Y.,Han,S.J.,&Song,R.(2009).In situ Visualizationof Gene Expression Using Polymer-Coated Quantum-Dot–DNA Conjugates.Small,5(18),2085–2091.doi:10.1002/smll.200900116；Akita,H.,Umetsu,Y.,Kurihara,D.,&Harashima,H.(2011).Dual imaging of mRNA and protein production:Aninvestigation of the mechanism of heterogeneity in cationic lipid-mediatedtransgene expression.International Journal of Pharmaceutics,415,218–220.doi:10.1016/j.ijpharm.2011.05.051；Ioannou,A.,Eleftheriou,I.,Lubatti,A.,Charalambous,A.,&Skourides,P.A.(2012).High-resolution whole-mount in situhybridization using Quantum Dot nanocrystals.Journal of biomedicine&biotechnology,2012,627602.doi:10.1155/2012/627602)。这种策略对靶向单个核糖核酸的成像是无效的，因为量子点具有间歇发射荧光的固有性质，因此在光激发时显示出开/关的发射状态(Wu,S.,Zhao,X.,Zhang,Z.,and Xie,H.(2006).Quantum-Dot-Labeled DNAProbes for Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)in the MicroorganismEscherichia coli.1062–1067；Smith,A.M.,Duan,H.,Mohs,A.M.,and Nie,S.(2008).Bioconjugated quantum dots for in vivo molecular and cellularimaging.Adv.Drug Deliv.Rev.60,1226–1240)。以十分之一秒(decisecond)级、不同的间隔观察到了这种现象，也被称为闪烁(Wu,S.,Zhao,X.,Zhang,Z.,and Xie,H.(2006).Quantum-Dot-Labeled DNA Probes for Fluorescence In Situ Hybridization(FISH)in the Microorganism Escherichia coli.1062–1067；Friedrich,M.,Nozadze,R.,Gan,Q.,Zelman-femiak,M.,Ermolayev,V.,Wagner,T.U.,and Harms,G.S.(2009).Biochemicaland Biophysical Research Communications Detection of single quantum dots inmodel organisms with sheet illuminationmicroscopy.Biochem.Biophys.Res.Commun.390,722–727)，使得使用一个量子点对与一个探针杂交的单分子核糖核酸进行稳定成像是不现实的。因此，在光激发时，一个分子可能被成像或可能不被成像，从而损害对核糖核酸分子的准确计数。

目前对核糖核酸单分子的成像和检测依赖于使用经有机染料标记的约40种探针(20个核苷酸长)。在一些实施方式中，经量子点标记的、预计的少量(例如5种或更多种)探针用于实现单个核糖核酸分子的成像。在一些实施方式中，所述探针为约30个核苷酸长，但可使用适于本文所述应用的任意长度。在一些实施方式中，所述探针的长度在约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个核苷酸之间，或在两个上述数值之间的任意其它长度。在一些实施方式中，与目前可用的方法(例如基于有机染料的方法)相比，本文所述的方法使单分子检测的成本降低了几倍。从两家公司获得的寡核苷酸合成的成本估算示出，在一些实施方式中，所述方法可使每个靶核糖核酸的寡核苷酸合成成本降低约5倍(价格参见下面的表2)。表2.由两家独立的公司估计的寡核苷酸合成的成本。注意到，在5种寡核苷酸的生物素标记和40种寡核苷酸的氨基标记之间，成本相差约为5倍。

在一些实施方式中，所述方法可检测比基于有机染料的方式更小的RNA。这是因为基于有机染料的方式需要RNA的长度足以同时杂交40种寡核苷酸，而本文所述的一些实施方式能检测较短的RNA，因为仅需要2种或更多种探针的杂交。在一些实施方式中，所述方法可检测小RNA，其中小RNA的尺寸是约10nt、约20nt、约30nt、约40nt、约50nt、约60nt、约70nt、约80nt、约90nt、约100nt、约110nt、约120nt、约130nt、约140nt、约150nt、约160nt、约170nt、约180nt、约190nt或约200nt的长度，或在任意两个上述数值之间的任意其他长度。

在一些实施方式中，本方法使用光稳定性无机荧光染料(量子点)，与其他方法相比，使用较少的探针以较低的成本来实现单分子核糖核酸的成像和检测。

通过使用量子点的荧光原位杂交来靶向检测核糖核酸的现有技术(Yang,H.,Wanner,I.B.,Roper,S.D.,and Chaudhari,N.(1999).An optimized method for in situhybridization with signal amplification that allows the detection of raremRNAs.J.Histochem.Cytochem.47,431–446；Chan,P.,Yuen,T.,Ruf,F.,Gonzalez-maeso,J.,&Sealfon,S.C.(2005).Method for multiplex cellular detection of mRNAs usingquantum dot fluorescent in situ hybridization.Nucleic acids research,33(18),1–8.doi:10.1093/nar/gni162；Choi,Y.,Kim,H.P.,Hong,S.M.,Ryu,J.Y.,Han,S.J.,&Song,R.(2009).In situ Visualization of Gene Expression Using Polymer-CoatedQuantum-Dot–DNA Conjugates.Small,5(18),2085–2091.doi:10.1002/smll.200900116；Akita,H.,Umetsu,Y.,Kurihara,D.,&Harashima,H.(2011).Dual imaging of mRNA andprotein production:An investigation of the mechanism of heterogeneity incationic lipid-mediated transgene expression.International Journal ofPharmaceutics,415,218–220.doi:10.1016/j.ijpharm.2011.05.051；Ioannou,A.,Eleftheriou,I.,Lubatti,A.,Charalambous,A.,&Skourides,P.A.(2012).High-resolution whole-mount in situ hybridization using Quantum Dotnanocrystals.Journal of biomedicine&biotechnology,2012,627602.doi:10.1155/2012/627602)没有实现，或甚至接近实现单分子或单细胞分辨率的检测。这些方法旨在对作为整体的很多细胞和很多RNA的总体信号进行粗略定量。这些方法技术变化很大，因此不被认为有希望用于精确定量。

单分子核糖核苷酸靶向检测的现有技术是基于使用几种短的、偶联了有机染料(例如Cy3、Cy5或其他商业化替代品)的寡核苷酸(40～48种寡核苷酸，20个核苷酸长)(Raj,A.,van den Bogaard,P.,Rifkin,S.A.,van Oudenaarden,A.,&Tyagi,S.(2008).Imagingindividual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.Naturemethods,5(10),877–9.doi:10.1038/nmeth.1253；Batish,M.,Raj,A.,&Tyagi,S.(2011).Single molecule imaging of RNA in situ.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),714,3–13.doi:10.1007/978-1-61779-005-8_1；Raj,A.,&Tyagi,S.(2010).Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiplesingly labeled probes.Methods in enzymology,472,365–86.doi:10.1016/S0076-6879(10)72004-8；Shaffer,S.M.,Wu,M.-T.,Levesque,M.J.,&Raj,A.(2013).Turbo FISH:AMethod for Rapid Single Molecule RNA FISH.PloS one,8(9),e75120.doi:10.1371/journal.pone.0075120)。

本方法的一些实施方式使用偶联有量子点的、预计数量的(例如5种或更多种)不同的核酸探针。在一些实施方式中，设计并合成每种探针，使其具有与靶核糖核酸互补的30个核苷酸的序列。在一些实施方式中，合成定制的探针，使其在每个核苷酸的5末端处连接有生物素。但是，应理解生物素接头可位于探针中的任意位置。例如，在一些实施方式中，生物素接头可附接至探针的5’端和/或3’端。在一些实施方式中，所述探针进一步包括核酸接头，其中所述接头不与靶结合位点互补，其中所述核酸接头包括约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10个核酸或上述数值的任意两个之间的任意数量的核酸，并且其中所述核酸接头与量子点共价结合。在一些实施方式中，所述量子点发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他的高发射波长。在一些实施方式中，所述量子点包括约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。

在本文所述的一些方法中，从公司购买经链霉亲和素包被的量子点。将所述量子点添加到含寡核苷酸混合物的微管中。以1μM量子点/0.5μM寡核苷酸的比率进行实验。但是，应理解可测试与量子点混合的探针的各组合物的适当比率。缀合在室温(24℃)下进行30分钟。量子点和寡核苷酸的溶液与适当的缓冲液混合以进行杂交，并且将该溶液与含贴壁细胞的盖玻片接触。使用缀合的探针，测试荧光原位杂交的固定和透化策略的两种不同方案。使用下面两种方案之一进行的杂交都是成功的：a)细胞经多聚甲醛固定，并且经triton 1×透化；或者，b)细胞经甲醇固定和透化。

如本文所述的，使用本方法的一些实施方式，使用五种偶联有量子点的寡核苷酸进行荧光原位杂交，在小鼠的体外培养的干细胞中有效检测到了肌动蛋白β基因的单分子核糖核酸。

单分子RNA-FISH是在很多实验室中使用的越来越受欢迎的技术。该技术的主要缺点是它的令人生畏的成本，一个基因约1500美元。对于实验室来说，很难以这样的成本来研究数十个或数百个基因。在一些实施方式中，本方法将成本降低至一个基因少于500美元，并且可用于单分子RNA-FISH市场的快速增长的市场。

单细胞RNA定量是快速增长的市场。首先，政府支出明显重新定向到单细胞分析。NIH计划在2012～2017年独自开始投入超过9000万美元用于单细胞分析(www.nih.gov/news/health/oct2012/nibib-15.htm)。NIH总监办公室创建了用于单细胞项目的共同基金(www.commonfund.nih.gov/singlecell/)，这意味着要进行更大的投资。从工业部门来看，单细胞分析对于癌症、干细胞和神经分析也有上升的趋势。归根结底，细胞异质性是这些分析的关键问题。这些快速增长的兴趣将产生对用于单分子RNA检测的探针的高需求。

通过研究给定基因的表达，来获得关于该给定基因的大部分科学发现。从基因转录获得的信息用于推断与，从编码序列的结构一直到蛋白水平上的潜在的相互作用的基因功能，相关的重要参数。虽然已经从细胞群(例如：细胞培养物，或组织样品)收集到了关于基因表达的大部分信息，但是广阔的领域或研究已经将注意力引向了单细胞。目前，识别正常组织和患病组织中的细胞异质性进一步突出了在单细胞中进行准确的RNA检测和定量的重要性。

对基因转录的准确定量带来了技术挑战。大部分可用的方法都设计来粗略估计基因转录物的拷贝数量(计数)，包括实时qPCR(Valleron W,Laprevotte E,Gautier EF,Quelen C,Demur C,et al.(2012)Specific small nucleolar RNA expression profilesin acute leukemia.Leukemia 26:2052-2060)、基因表达微阵列(Schena M,Shalon D,Davis RW,Brown PO(1995)Quantitative monitoring of gene expression patternswith a complementary DNA microarray.Science 270:467-470)和RNA测序(Chu Y,CoreyDR(2012)RNA sequencing:platform selection,experimental design,and datainterpretation.Nucleic Acid Ther 22:271-274)。在执行近似法的生物化学或生物物理步骤过程中，不可避免地引入了技术偏见。此外，对单细胞水平上的RNA定量提出了进一步的挑战。用于单细胞分析的大部分方法需要在测量之前扩增RNA，包括NanostringnCounter(参见(Nanostring(2014)nCounter Single Cell Gene Expression))中的图3)、SMART-seq(Ramskold D,Luo S,Wang YC,Li R,Deng Q,et al.(2012)Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells.NatBiotechnol 30:777-782)和Fluidigm C1-BioMark(Moignard V,Macaulay IC,Swiers G,Buettner F,Schutte J,et al.(2013)Characterization of transcriptional networksin blood stem and progenitor cells using high-throughput single-cell geneexpression analysis.Nat Cell Biol 15:363-372)。RNA扩增步骤在这些测量方法中加入了技术偏见。据我们所知，仅有一种技术能够对单细胞中的RNA拷贝数量进行可靠的计数(Raj A,Peskin CS,Tranchina D,Vargas DY,Tyagi S(2006)Stochastic mRNA synthesisin mammalian cells.PLoS biology 4:e309)。单分子RNA荧光原位杂交(smRNA-FISH)技术可视化基因的每一个RNA分子，这样能直接对RNA分子进行计数(Batish M,Raj A,Tyagi S(2011)Single molecule imaging of RNA in situ.Methods in molecular biology(Clifton,NJ)714:3-13:Raj A,van den Bogaard P,Rifkin SA,van Oudenaarden A,Tyagi S(2008)Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeledprobes.Nature methods 5:877-879；Shaffer SM,Wu M-T,Levesque MJ,Raj A(2013)Turbo FISH:A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH.PloS one 8:e75120)。这一关键特征使该数字技术(smRNA-FISH)与其他近似法技术区分开。另外，smRNA-FISH不需要扩增来定量单细胞中的RNA分子，从而消除了在单细胞分析中的技术偏见的主要来源。

标准smRNA-FISH的主要限制是需要大量的寡核苷酸探针。该技术需要每一基因约40种寡核苷酸探针，以将～40个有机荧光分子(染料)附接至每一个RNA分子，这样累积了明显高于背景的信号。在常规仪器(荧光显微镜)下，该技术由于难以将信号和噪音分离开而不能使用较少的探针来工作。只要可获得超分辨率成像的仪器，就可以降低探针数量(Lubeck E,Cai L(2012)Single-cell systems biology by super-resolution imagingand combinatorial labeling.Nat Methods 9:743-748)。但是，这样的仪器价格约为500000美元，大部分研究实验室无力购买。下面，我们在提到典型的荧光显微镜时，仅讨论可购得的仪器。在一些实施方式中，如本文所述，荧光显微镜用于检测靶核酸。在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

需要大量的探针显现出几个缺点。首先，标准smRNA-FISH不能相对测定小RNA分子或特定靶向RNA分子上的小区域。40种左右的探针必须没有重叠，以能同时附接至靶标，这需要靶序列的最小长度为1000个碱基。但是，50％以上的人类mRNA分子比1000个碱基短(参见(Takahashi H,Lassmann T,Murata M,Carninci P(2012)5’end-centered expressionprofiling using cap-analysis gene expression and next-generationsequencing.Nat Protoc 7:542-561)中的图4)。此外，约75％的人类lncRNA比1000个碱基短；snoRNA和tRNA通常在70～95个碱基之间，snRNA为约150个碱基。总之，人类的转录组主要由长度在70～1000个碱基之间的RNA分子构成，而标准smRNA-FISH不能测定这样的RNA分子。即使RNA分子长于1000个碱基，也不可能获得完整的转录物进行杂交。RNA分子的多个部分可能已经与蛋白结合(Ray D,Kazan H,Cook KB,Weirauch MT,Najafabadi HS,et al.(2013)A compendium of RNA-binding motifs for decoding gene regulation.Nature499:172-177)或被紧紧捆绑(Tripathi V,Ellis JD,Shen Z,Song DY,Pan Q,et al.(2010)The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1regulates alternative splicingby modulating SR splicing factor phosphorylation.Mol Cell 39:925-938)，因此大大减少了可用于探针杂交的部分。此外，因为RNA分子的蛋白结合的部分常常是未知的，因此使探针的一小部分杂交失败可能产生假阴性。由于相同的原因，所述技术不能特异性研究RNA分子的特定区域(<1000个碱基)。因此，标准smRNA-FISH不能用于研究RNA-RNA相互作用或RNA剪接。在本文的一些实施方式中，提供了一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其中，所述方法包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述一种靶核酸是RNA。在一些实施方式中，所述RNA包括70～1000个碱基。在一些实施方式中，所述RNA包括70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个、500个、600个、700个、800个、900个或1000个碱基，或在任意两个上述数值之间的任意数量的碱基。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

其次，合成40种寡核苷酸(每一种25个碱基)的成本约为370美元(每一基因)。对于测定多个基因来说，这一成本会迅速提高。

第三，难以平行测定多个基因。这是由于两个原因。每一基因需要不同的荧光染料。但是，不同的有机染料显现出极不相同的光稳定性(Lichtman JW,Conchello JA(2005)Fluorescence microscopy.Nat Methods 2:910-919；Panchuk-Voloshina N,HauglandRP,Bishop-Stewart J,Bhalgat MK,Millard PJ,et al.(1999)Alexa dyes,a series ofnew fluorescent dyes that yield exceptionally bright,photostable conjugates.JHistochem Cytochem 47:1179-1188)，从而难以获得水平一致的信号。有机染料的发射通常遵循长尾分布，从而难以消除来自另一染料的信号的污染(泄漏)。甚至更难以同时解决这两个问题，而同时解决这两个问题是平行测定多个基因所需的。尽管已经尝试了双色smRNA-FISH(ref)，但是我们不觉得平行对多个基因的转录物拷贝数量进行准确计数能够获得任何成功。另外，还存在对泄漏和不同程度的光稳定性的担心。

本文所述的一些实施方式通过QD-smRNA-FISH，使用量子点标记的单链DNA寡核苷酸与靶RNA杂交，用于进行单分子检测和计数。在本文所述的一些实施方式中，提供了用于QD-smRNA-FISH的方法，其中所述方法包括使量子点标记的单链DNA寡核苷酸与靶RNA杂交，用于进行单分子检测和计数。量子点是无机染料，与有机染料相比，具有更高的光稳定性和更大的荧光发射(Resch-Genger U,Grabolle M,Cavaliere-Jaricot S,Nitschke R,NannT(2008)Quantum dots versus organic dyes as fluorescent labels.Nature methods5:763-775)。据我们所知，这是量子点首次用于单分子计数中。也是量子点首次应用于使个体RNA分子可视化。尽管量子点已经用于使蛋白分子成像(Zrazhevskiy P,Gao X(2013)Quantum dot imaging platform for single-cell molecular profiling.Nat Commun4:1619；Smith AM,Nie S(2012)Compact quantum dots for single-molecule imaging.JVis Exp.)，但普遍认为量子点不适用于单分子计数。这是由于公知的“闪烁”问题，即信号是间歇性的(Medintz IL,Uyeda HT,Goldman ER,Mattoussi H(2005)Quantum dotbioconjugates for imaging,labelling and sensing.Nat Mater 4:435-446；Roch N,Florens S,Bouchiat V,Wernsdorfer W,Balestro F(2008)Quantum phase transitionin a single-molecule quantum dot.Nature 453:633-637)。如果量子点用于标记单分子，那么在任意的成像时间，量子点的随机子集会是看不见的，从而无法检测到单分子的随机子集。

在本文所述的一些实施方式中，提供了用于QD-smRNA-FISH的方法，其中，所述方法包括使量子点标记的单链DNA寡核苷酸与靶RNA杂交，用于进行单分子检测和计数。在一些实施方式中，所述量子点用于单分子计数。在一些实施方式中，应用量子点，以使个体RNA分子可视化。在一些实施方式中，至少一个量子点或以高波长发射为特征的类似粒子发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。在一些实施方式中，所述量子点包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

想到了解决这一问题的主意。该主意是通过将几个量子点附接至每一靶分子，它们信号的互补应当补偿任一单量子点的中断信号。因此，靶分子的累积信号将是连续的。任意时间的图像获取将不丢失任何分子。在本文所述的实施方式中的验证实验中，使用5种探针的QD-smRNA-FISH鉴定出与使用43种探针的标准smRNA-FISH相同的RNA分子。所需探针数量的降低使得能够测定在80～1000个碱基之间的RNA，而标准RNA-FISH不能测定这样的RNA。因此，使用上述QD-smRNA FISH法获得了出乎意料的优点。还能对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。此外，QD-smRNA-FISH提供了一种平行分析多个基因的简单方法。最后但并非最不重要的一点是，该方法将试剂成本降低了很多倍，因为寡核苷酸合成是成本。

在一些实施方式中，提供了一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其中，所述方法包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

多重水平的分子性质之间的相互作用引起了对RNA-RNA相互作用的存在、但了解很少的功能的极大兴趣。这种对RNA-RNA相互作用的渐增的追求引导研究者开发出表征miRNA-RNA相互作用的重要工具(Chi SW,Zang JB,Mele A,Darnell RB(2009)ArgonauteHITS-CLIP decodes microRNA-mRNA interaction maps.Nature 460:479-486；Helwak A,Kudla G,Dudnakova T,Tollervey D(2013)Mapping the human miRNA interactome byCLASH reveals frequent noncanonical binding.Cell 153:654-665).Despite limitedevidence(Batista PJ,Chang HY(2013)Long noncoding RNAs:cellular address codesin development and disease.Cell 152:1298-1307)，提出了长的非编码RNA(lncRNA)与蛋白编码RNA(mRNA)相互作用，用于基因表达的转录后调节的假说(Amaral PP,Dinger ME,Mercer TR,Mattick JS(2008)The eukaryotic genome as an RNA machine.Science319:1787-1789)。为此，计算模型提供了用于假说驱动的预测lncRNA-mRNA对的工具(KatoY,Sato K,Hamada M,Watanabe Y,Asai K,et al.(2010)RactIP:fast and accurateprediction of RNA-RNA interaction using integer programming.Bioinformatics26:i460-466；Wenzel A,Akbasli E,Gorodkin J(2012)RIsearch:fast RNA-RNAinteraction search using a simplified nearest-neighbor energymodel.Bioinformatics 28:2738-2746)，但还没有设计出实验方式来验证RNA-RNA相互作用。使用相互作用的RNA在细胞中物理上彼此接近的原理，建议本文所述的实施方式可用于通过应用QD-smRNA-FISH对RNA-RNA相互作用进行成像和可视化，来缩小RNA-RNA相互作用的计算机预测和实验证据之间的差距。

结果

QD-smRNA-FISH技术的开发。设计了靶向特定感兴趣的RNA的多种QD-标记的探针(图4a)。靶mRNA的序列提供于SEQ ID NO:59中(还参见Genbank登记号gi 145966868，其公开的内容通过引用整体并入本文中)。对于本文章中的所有QD-smRNA-FISH实验，每一基因使用5种寡核苷酸。每一寡核苷酸均被设计为25～30个碱基，且合成以包含一个附接至5’端的生物素(IDT，表2)。当QD经链霉亲和素(Invitrogen)包被时，以0.5μM寡核苷酸/1μM QD的比率，在室温保持30分钟来完成标记(图6)。通过测试来自标准smRNA-FISH的杂交方案(Shaffer SM,Wu M-T,Levesque MJ,Raj A(2013)Turbo FISH:A Method for RapidSingle Molecule RNA FISH.PloS one 8:e75120)(方法，补充文本)的试剂和参数的一些变化，对QD-smRNA-FISH的杂交和成像方案进行优化。在探针杂交和成像之后，通过首先应用拉普拉斯-高斯滤波器(Sage D,Neumann FR,Hediger F,Gasser SM,Unser M(2005)Automatic tracking of individual fluorescence particles:application to thestudy of chromosome dynamics.IEEE transactions on image processing:apublication of the IEEE Signal Processing Society 14:1372-1383)，然后计数3D绘制的信号斑点(Bolte S,Cordelières FP(2006)A guided tour into subcellularcolocalization analysis in light microscopy.Journal of microscopy 224:213-232)(方法)，使用ImageJ(Schneider CA,Rasband WS,Eliceiri KW(2012)NIH Image toImageJ:25years of image analysis.Nature methods 9:671-675)对原始图像进行处理。观察到最终计数对于所使用的阈值是不敏感的(图7)。

表3.在QD-smRNA-FISH实验中使用的寡核苷酸。

QD-smRNA-FISH信号是连续的。测试了QD-smRNA-FISH的发射间歇性。设计了用于Actb mRNA的5种杂交探针(表3)，并且这5种杂交探针与QD偶联。探针杂交之后，以在任意两次图像采集之间1秒的间隔，采集同一实验样品的50张图像。为了简化分析，仅在一个焦平面(堆栈)上采集各图像。这样使之成为更严格的测试，因为采集多堆栈图像会提供RNA分子在任意堆栈采集过程中发射信号的更大的概率。在50张图像的任一张中都没有丢失斑点(systemsbio.ucsd.edu/qdsmrnafish/，其公开的内容通过引用整体并入本文中)，从而证明了我们的累积信号是非间歇性的理论。

QD-smRNA-FISH与标准smRNA-FISH的对比。测试QD-smRNA-FISH定量RNA分子的能力。如上所述，在同一杂交的样品上采集多堆栈图像。在图像处理之后，每一成像的细胞(N＝82)(图4b)鉴定出11±9(平均值±标准偏差)个Actb mRNA分子。为了测定使用该实施方式QD-smRNA-FISH探查RNA分子的准确性，设计了43种探针并且用Alexa555进行标记，以将斑点与靶向同一RNA的不同组的染料和探针(表4，图4c)的共定位进行对比。使用5种探针的QD-smRNA-FISH，能鉴定出经Alexa555标记的43种探针鉴定出的几乎所有的相同斑点(图5d)。观察到的共定位不可能是由染料在滤波器之间的交叉成像造成的，因为染料在不同的波长被激发(方法，表5，图8)。因此，使用五种探针进行的QD-smRNA-FISH实现了与使用经有机染料标记的43种探针进行的smRNA-FISH相当的准确性。就这一点而言，可以得出结论，当与使用经有机染料标记的43种探针的smRNA-FISH相比时，QD-smRNA-FISH得到了令人惊讶的更有效的效果。

表4.在smRNA-FISH实验中使用的寡核苷酸。

表5.用于成像的立方体(cube)的说明。

使用QD-smRNA-FISH测试RNA-RNA相互作用。假设Malat1 lncRNA和Slc2a3 mRNA在小鼠的胚胎干(mES)细胞中彼此相互作用。因此，进行靶向两种RNA的双重探测QD-smRNA-FISH实验，以测试两个基因的转录物在细胞质中的共定位(图5a)。分析27个E14mES细胞，并且分别定量Malat1和Slc2a3RNA的7.6和4.5分子。～1.7的Malat1/Slc2a3转录物之间的分子比率略低于qPCR测量所观察到的比率(Malat1/Slc2a3～5.1)。这一微小差异可能是由于qPCR定量了细胞核中的Malat1转录物(Hutchinson JN,Ensminger AW,Clemson CM,LynchCR,Lawrence JB,et al.(2007)A screen for nuclear transcripts identifies twolinked noncoding RNAs associated with SC35splicing domains.BMC genomics 8:39)，而我们的QD-smRNA-FISH靶向细胞质中的转录物。有趣的是，QD-smRNA-FISH显示了Malat1在小鼠ES细胞质中的丰度是高度可变的。当Malat1的转录物计数在1至24的范围内变动时，Slc2a3的转录物计数在2至7的范围内变动(图5b，图5c)。

接下来，研究了是否存在示出Malat1和Slc2a3杂交共定位在同一细胞中的信号。如果两个经不同染料标记的有区别的斑点的质心在x、y、z坐标的每一坐标中都近于2像素(214nm)，则确定两个RNA分子共定位(图9)(Ghavi-Helm Y,Klein FA,Pakozdi T,CiglarL,Noordermeer D,et al.(2014)Enhancer loops appear stable during developmentand are associated with paused polymerase.Nature512:96-100.)。表达Malat1或Slc2a3的27个细胞中的10个细胞含有两个基因的重叠的RNA分子。总体来讲，检测到16对共定位的RNA分子(图5d)，一个细胞中的出现频率在1至3的范围内变动(图5e)。两种基因的RNA分子示出在细胞质中随机分布，因此推测经不同染料标记的两种斑点的出现频率不是随机事件(p-值＝4×10^-40，超几何测试)。因此，提供了在四级结构中，来自不同基因的RNA分子的相互作用的实验证据。

讨论

这种新技术的基本思想是利用一组量子点的随机信号间歇性的互补作用。量子点停留在开或关的状态的时间间隔可在几毫秒至几秒的范围内变动(Durisic N,WisemanPW,Grutter P,Heyes CD(2009)A common mechanism underlies the dark fractionformation and fluorescence blinking of quantum dots.ACS Nano 3:1167-1175；YaoJ,Larson DR,Vishwasrao HD,Zipfel WR,Webb WW(2005)Blinking and nonradiant darkfraction of water-soluble quantum dots in aqueous solution.Proc Natl Acad SciU S A 102:14284-14289)。量子点通常有一半以上的时间处于开的状态(33.Durisic N,Wiseman PW,Grutter P,Heyes CD(2009)A common mechanism underlies the darkfraction formation and fluorescence blinking of quantum dots.ACS Nano 3:1167-1175；Yao J,Larson DR,Vishwasrao HD,Zipfel WR,Webb WW(2005)Blinking andnonradiant dark fraction of water-soluble quantum dots in aqueoussolution.Proc Natl Acad Sci U S A 102:14284-14289；Frantsuzov PA,Volkan-KacsoS,Janko B(2013)Universality of the fluorescence intermittency in nanoscalesystems:experiment and theory.Nano Lett13:402-408)。如果假定不同量子点的发射间歇是独立的，则在任意给定的时间点，附接有5个量子点的RNA分子不发射荧光信号的概率约为0.03(1/2⁵)。因为典型的图像采集在不同的时间点扫描15个以上的焦平面(堆栈)，因此在3个连续堆栈中，RNA分子不被检测到的概率约为10^-4～10^-6，对于单细胞中RNA分子计数来说是非常小的。如果需要，则可对QD-smRNA-FISH样品进行多次成像，这就完全消除了量子点集合体(conglomerate)处于关的状态的概率。凭经验来讲，在50个连续采集的图像中的任一图像中，甚至在单一堆栈中也没有发现处于关的状态的任何集合体(systemsbio.ucsd.edu/qdsmrnafish/，其公开的内容通过引用整体并入本文中)。此外，QD-smRNA-FISH鉴定出与使用连续信号的smRNA-FISH相同的靶标(图4c)。总之，与普遍的想法相反，理论上推导出且实验验证了量子点可应用于单分子计数。

QD-smRNA-FISH的主要优点在于，它依赖于较少的寡核苷酸探针。资本密集型的成本约从每一基因370美元降低至46美元。更重要的是，它能靶向具有1000或更少碱基的RNA分子。这样的RNA分子包括大部分的RNA，这些RNA太短而无法通过传统的smRNA-FISH来测定。由于相同的原因，QD-smRNA-FISH具有靶向RNA分子特定区域的独特优点。这样能对RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

QD-smRNA-FISH的另一优点是适于平行测定多个基因的RNA产物。这曾因为两个原因而是一项困难的工作。首先，“虽然染料和荧光蛋白在数十年中是荧光成像的主要依靠，但它们的荧光在观察个体分子所必须的高光子通量下不稳定，从而仅能进行几秒钟的观察，之后信号就完全丢失”(Smith AM,Nie S(2012)Compact quantum dots for single-molecule imaging.J Vis Exp.)。靶向不同基因所需的其他染料在扫描第一染料(基因)的过程中可能已经发生了光漂白。纳米晶体的光稳定性(photo stable)比有机染料高(Resch-Genger U,Grabolle M,Cavaliere-Jaricot S,Nitschke R,Nann T(2008)Quantumdots versus organic dyes as fluorescent labels.Nature methods 5:763-775；LeeLY,Ong SL,Hu JY,Ng WJ,Feng Y,et al.(2004)Use of semiconductor quantum dotsfor photostable immunofluorescence labeling of Cryptosporidium parvum.ApplEnviron Microbiol 70:5732-5736)，从而能重复扫描同一实验样品。其次，尤其在同时使用3种或更多种不同的染料时，有机染料可能彼此污染。相比之下，量子点具有特殊的荧光光谱，它们都具有荧光强度的狭窄的高斯分布(Resch-Genger U,Grabolle M,Cavaliere-Jaricot S,Nitschke R,Nann T(2008)Quantum dots versus organic dyes asfluorescent labels.Nature methods 5:763-775)。这一特征构成了在一个测定中复用几个量子点的基础。此外，发射的光谱位置按照粒子尺寸是可调的(Resch-Genger U,Grabolle M,Cavaliere-Jaricot S,Nitschke R,Nann T(2008)Quantum dots versusorganic dyes as fluorescent labels.Nature methods 5:763-775)。因为，用于一个特定波长的粒子的尺寸非常相似，因此发射曲线的宽度也很窄。对于商业化的QD来说，在靶波长附近100nm的窗口内发射大部分的强度。与滤波器的适当选择有关的特定QD的荧光的这种狭窄发射，有利于QD用于在同一细胞中使用不同的染料探测多重靶标的实验中。实验已经示出对细胞的双重探测，在靶向两种不同波长的QD之间具有明确的信号区别(JaiswalJK,Mattoussi H,Mauro JM,Simon SM(2003)Long-term multiple color imaging oflive cells using quantum dot bioconjugates.Nature biotechnology 21:47-51；WuX,Liu H,Liu J,Haley KN,Treadway JA,et al.(2003)Immunofluorescent labeling ofcancer marker Her2and other cellular targets with semiconductor quantumdots.Nature biotechnology 21:41-46)。使用靶向三种(Han M,Gao X,Su JZ,Nie S(2001)Quantum-dot-tagged microbeads for multiplexed optical coding ofbiomolecules.Nature biotechnology 19:631-635)或四种(Goldman ER,Clapp AR,Anderson GP,Uyeda HT,Mauro JM,et al.(2004)Multiplexed toxin analysis usingfour colors of quantum dot fluororeagents.Anal Chem 76:684-688)波长的QD，进行进一步的多重复用也是可能的。

方法

寡核苷酸通过将生物素附接至它们的5’端来合成(表2，表3，IDT)。通过将寡核苷酸与偶联有链霉亲和素的染料，以0.5μM寡核苷酸/1μM染料的比率在室温孵育30分钟(图6)，来实现标记。将ES细胞接种到预先经聚-D-赖氨酸(5μM,Sigma)和层粘连蛋白(0.01mg/μl,Sigma)包被的玻璃底微腔室(1.5,Lab Teck)上。孵育2小时之后，在无核酸酶的PBS中洗涤细胞，并且使用甲醇在-20℃进行透化。使用已确立的smRNA-FISH方案(Shaffer SM,WuM-T,Levesque MJ,Raj A(2013)Turbo FISH:A Method for Rapid Single Molecule RNAFISH.PloS one 8:e75120)的改进版，进行FISH实验。使用在杂交缓冲液中的约15μM寡核苷酸，在40℃持续30分钟来进行杂交。通过在37℃持续30分钟的两次洗涤(SSC 2×,甲酰胺10％)，去除过量的探针和染料。然后，在SSC 2×缓冲液(pH 7.5)中对细胞进行成像。

在Olympus IX83倒置显微镜上，进行宽场荧光成像，其中Olympus IX83倒置显微镜配备有用于所使用的染料(表4,Chroma)的适当立方体(cube)和60×油浸物镜(NA＝1.4,Olympus)。使用ORCA-R2CCD相机(Hamamatsu)，以在z-轴上0.2μm的间隔捕捉图像。

成像之后，在ImageJ(Schindelin J,Arganda-Carreras I,Frise E,Kaynig V,Longair M,et al.(2012)Fiji:an open-source platform for biological-imageanalysis.Nature methods 9:676-682)中，对原始图像堆栈进行处理。首先应用拉普拉斯-高斯滤波器(Sage D,Neumann FR,Hediger F,Gasser SM,Unser M(2005)Automatictracking of individual fluorescence particles:application to the study ofchromosome dynamics.IEEE transactions on image processing:a publication ofthe IEEE Signal Processing Society 14:1372-1383)，并且考虑整个z-堆栈。然后图像被反转为黑白值，之后将16位值重分配成灰度深度。其次，以500个荧光任意单位的递增阈值间隔(图7)，计数3D绘制的信号斑点(Bolte S,Cordelières FP(2006)A guided tourinto subcellular colocalization analysis in light microscopy.Journal ofmicroscopy 224:213-232)。此外，如果斑点的体积(体素)在8～125像素³的范围内，则认为它们代表RNA分子。以三次连续的相等计数的阈值间隔，获得每一图像堆栈中的斑点的数量(图7)。观察到，选择超过该平台期的荧光强度，会减少约一个单位经鉴定的斑点数量，同时没有鉴定出真正斑点的概率可能增加。这一标准能对斑点进行可靠的定量，且不用考虑图像背景。

除了计数之外，还收集斑点各自的x-y-z质心的数据。如果两个经不同染料标记的有区别的斑点的质心在x、y、z坐标的每一坐标中都近于2像素(214nm)，则推断两个RNA分子共定位(图10)。

使用下面的原理，指导对杂交和成像的方案进行优化。

寡核苷酸的长度和数量

之前的smRNA-FISH方案使用了靶向感兴趣基因的20个碱基长的≥12种寡核苷酸。本文中，使用了25～30个碱基长的5种寡核苷酸。对应于一个mRNA分子的斑点的信号检测依赖于与探测该RNA分子的寡核苷酸结合的各染料的累积荧光强度。因为QD具有比有机染料(Resch-Genger et al.,2008)更高的荧光强度，因此探针数量大大降低。使用25～30个碱基长的5种寡核苷酸工作能从背景中分辨出荧光斑点，其通常由分散的单一QD构成。之前的研究示出，当定量RNA分子的相对丰度时，30个碱基长的5种寡核苷酸会在敏感性和特异性之间实现适当的平衡(Relogio et al.,2002)。

寻找QD与寡核苷酸的适当比率

进行寻找量子点与寡核苷酸的适当比率的实验，以使寡核苷酸经QD的标记最大化。这也降低了未附接的寡核苷酸和QD的数量。未标记的寡核苷酸可能竞争探测位点，如果附接至RNA分子，则不会发射荧光。不与寡核苷酸缀合的QD可能被冲洗掉，从而会增加背景。

10～50μM的探针浓度

目前的turbo FISH方案以400μM的浓度，保持30秒至10分钟时间段使探针杂交。目前的这一方案对于每一核苷酸使用10～50μM的浓度。所使用的探针浓度小10倍，从而优化了我们用于每一实验的成本。为了进行补偿，可延长杂交时间。

杂交时间

因为杂交缓冲液中存在较少的探针，因此将杂交时间从30秒延长至30分钟。此外，QD比有机染料(Resch-Genger et al.,2008)大，因此可能需要更长的时间使其结构渗透进入细胞。

冲洗时间

将探针冲洗30分钟，因为QD比有机染料大，因此退出细胞结构可能需要更长的时间。

根据上述内容，应理解用于例示的目的而描述了本公开的各实施方式，并且可在不脱离本公开的范围和精神的情况下进行各种修改。相应地，本文公开的各实施方式不意于限制，由所附的权利要求书示出真正的范围和精神。

额外的实施方式

在一些实施方式中，提供了一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其中，所述方法包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种靶核酸的至少一种探针。在一些实施方式中，多组探针可用于检测多种靶核酸，其中每一组探针都与发射不同且可区分的高波长的检测组分相关联。在一些实施方式中，所述核酸探针被导向一个靶核酸链上的与探针互补的有区别的序列。在一些实施方式中，所述不同的探针靶向一个靶核酸链上的不同或有区别的靶核酸序列。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种或两种靶核酸的至少两种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种或三种靶核酸的至少三种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种或四种靶核酸的至少四种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种、四种或五种靶核酸的至少五种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种、四种、五种或六种靶核酸的至少六种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种靶核酸的至少七种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种靶核酸的至少八种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或九种靶核酸的至少九种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括针对至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种靶核酸的至少十种探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针包括五种或更多种不同的探针。在一些实施方式中，所述多种不同的核酸探针中的每一个都具有在约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个核苷酸之间的长度，或在两个上述数值之间的任意其他长度。在一些实施方式中，所述量子点发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。在本文所述的一些实施方式中，所述量子点包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。在一些实施方式中，所述粒子是量子点。在一些实施方式中，所述靶核酸包括RNA。在一些实施方式中，所述靶核酸包括在单个细胞内的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述多种不同的探针包括5种或更多种不同的探针。在一些实施方式中，所述多种不同的探针具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。在一些实施方式中，所述多种不同的探针具有在约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个核苷酸之间的长度，或两个上述数值之间的任意其他长度。在一些实施方式中，所述多种不同的探针具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。在一些实施方式中，所述多种不同的探针具有约30个核苷酸的长度。在一些实施方式中，检测多种靶核酸。在一些实施方式中，所述核酸探针进一步包括核酸接头，其中所述接头不与靶结合位点互补，其中所述核酸接头包括约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个或约10个核酸或在任意两个上述数值之间的任意数量的核酸，并且其中所述核酸接头与量子点共价结合。在一些实施方式中，其中使所述探针与所述靶核酸接触进行约0.5分钟、约1分钟、约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟或约40分钟，或在任意两个上述数值之间的任意其他时间。在一些实施方式中，所述方法进一步包括，在杂交或接触所述至少一种靶核酸之后，冲洗掉所述探针，持续30分钟。在一些实施方式中，所述探针具有约10、约20、约30、约40或约50μM的浓度，或在任意两个上述数值之间的任意其他浓度。在一些实施方式中，所述方法进一步包括对体内的RNA剪接和RNA-RNA相互作用进行单分子分析。

在一些实施方式中，提供了核酸探针。所述核酸探针可与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。在一些实施方式中，所述粒子是量子点。在一些实施方式中，所述粒子发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。在一些实施方式中，所述粒子或量子点包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的任意其他尺寸。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分与所述核酸探针共价连接。在一些实施方式中，量子点可在EDC N-羟基琥珀酰亚胺的存在下缀合至核酸探针。在一些实施方式中，所述量子点通过核酸的胺修饰，以经由形成酰胺键与量子点表面偶联，而缀合至核酸。在一些实施方式中，通过核酸的生物素化，以附接包被在链霉亲和素中的量子点，而使所述量子点缀合至探针。在一些实施方式中，其中所述核酸探针与靶核酸序列互补，所述探针进一步包括接头核酸，而QD共价附接至该接头核酸。在一些实施方式中，接头DNA允许在退火过程中保留量子点移动的自由度，进一步在QD的尺寸可能阻止退火的情况下，可使量子点与退火位点相距一定距离。在一些实施方式中，所述核酸探针具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。在一些实施方式中，所述核酸探针具有约10个、约20个、约30个、约40个、约50个、约60个、约70个、约80个、约90个或约100个核苷酸的长度，或任意两个上述数值之间的任意其他长度。在一些实施方式中，所述核酸探针具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。在一些实施方式中，所述核酸探针具有约30个核苷酸的长度。

在一些实施方式中，提供了一种试剂盒。所述试剂盒包括能与至少一种靶核酸杂交的多种不同的核酸探针，其中所述多种不同的核酸探针中的每一个都与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。在一些实施方式中，所述粒子发射约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm或约850nm的高发射波长，或在任意两个上述数值之间的任意其他高发射波长。在一些实施方式中，所述粒子包括自约1纳米、约2纳米、约3纳米、约4纳米、约5纳米、约6纳米、约7纳米、约8纳米、约9纳米、约10纳米或约11纳米的尺寸，或在任意两个上述数值之间的的任意其他尺寸。在一些实施方式中，所述粒子是量子点。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分与所述多种不同的核酸探针中的每一个共价连接。在一些实施方式中，量子点可在EDC N-羟基琥珀酰亚胺的存在下缀合至核酸探针。在一些实施方式中，通过核酸的胺修饰，以经由形成酰胺键与量子点表面偶联，而使所述量子点缀合至核酸。在一些实施方式中，通过核酸的生物素化，以附接包被在链霉亲和素中的量子点，而使所述量子点缀合至探针。在一些实施方式中，其中所述核酸探针与靶核酸序列互补，所述探针进一步包括接头核酸，而QD共价附接至该接头核酸

在一些实施方式中，提供了一种用于检测多种靶核酸的方法，其中所述方法包括使所述多种靶核酸与多组核酸探针接触，其中每组核酸探针都包括与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联的多种不同的核酸探针，其中每组核酸探针与不同的靶核酸杂交，并且其中每组核酸探针都与以高波长发射的可检测的组分相关联，所述高波长发射可与和其他组核酸探针相关联的可检测的组分的高波长发射区分开，并且其中所述接触在所述多组核酸探针与所述多种靶核酸结合的条件下进行。在一些实施方式中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。在一些实施方式中，所述粒子是量子点。在一些实施方式中，所述靶核酸包括RNA。在一些实施方式中，所述靶核酸包括DNA。在一些实施方式中，所述靶核酸包括在单个细胞内的单个RNA分子。在一些实施方式中，所述靶核酸包括在单个细胞内的单个DNA分子。在一些实施方式中，所述多种不同的探针包括5种或更多种不同的探针。在一些实施方式中，所述多种不同的探针具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。在一些实施方式中，所述多种不同的探针具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。在一些实施方式中，所述多种不同的探针中的每一个都具有约30个核苷酸的长度。在一些实施方式中，检测多种靶核酸。

本文列出的以下参考文件均通过引用整体并入本文中。

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68.Ioannou,A.,Eleftheriou,I.,Lubatti,A.,Charalambous,A.,&Skourides,P.A.(2012).High-resolution whole-mount in situ hybridization using QuantumDot nanocrystals.Journal of biomedicine&biotechnology,2012,627602.doi:10.1155/2012/627602

69.Raj,A.,van den Bogaard,P.,Rifkin,S.A.,van Oudenaarden,A.,&Tyagi,S.(2008).Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeledprobes.Nature methods,5(10),877–9.doi:10.1038/nmeth.1253

70.Batish,M.,Raj,A.,&Tyagi,S.(2011).Single molecule imaging of RNA insitu.Methods in molecular biology(Clifton,N.J.),714,3–13.doi:10.1007/978-1-61779-005-8_1

71.Raj,A.,&Tyagi,S.(2010).Detection of individual endogenous RNAtranscripts in situ using multiple singly labeled probes.Methods inenzymology,472,365–86.doi:10.1016/S0076-6879(10)72004-8

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序列表

<110> Zhong, Sheng 钟声

Biase, Fernando 费尔南多·比亚塞

<120> 单分子RNA检测

SINGLE MOLECULE RNA DETECTION

<130> UCSD090.001PR

<160> 60

<170> FastSEQ用于Windows版本4.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 1

tctcaaacat gatctgggtc atcttttcac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 2

gttggcatag aggtctttac ggatgtcaac 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

caatgatctt gatcttcatg gtgctaggag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

ttttgtcaaa gaaagggtgt aaaacgcagc 30

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 5

cgttccagtt tttaaatcct gagtcaaaag 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 6

aaggtctcac atcacacact cact 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 7

caaagaacag acatgacctg aagt 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 8

ttctaatagc agcagattgg aacag 25

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 9

aacaaccact actccaaaca cttg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 10

ctcaacactc agcctgttac tcat 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 11

tagccacaat acagacaaag ctcat 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 12

ctcaaagaag gctacgtaga tcaag 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 13

agaaagttgg aggtccagtt acaa 24

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 14

cgtccttgaa gattcctgtt gagta 25

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 15

cctatcatat gcagggttct cct 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 16

tgcaaagaag ctgtgctcgc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 17

tgtggaccgg caacgaagga 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 18

atatcgtcat ccatggcgaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 19

acgatggagg ggaatacagc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 20

cacataggag tccttctgac 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 21

gtacttcagg gtcaggatac 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 22

gttggtaaca atgccatgtt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 23

acacgcagct cattgtagaa 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 24

tgatctgggt catcttttca 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 25

ggggtgttga aggtctcaaa 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 26

ctggatggct acgtacatgg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 27

agaggcatac agggacagca 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 28

catcacaatg cctgtggtac 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 29

tcgtagatgg gcacagtgtg 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 30

atggcgtgag ggagagcata 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 31

atcttcatga ggtagtctgt 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 32

ctgtggtggt gaagctgtag 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 33

ttgatgtcac gcacgatttc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 34

atctcctgct cgaagtctag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 35

tagtttcatg gatgccacag 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 36

ggtctttacg gatgtcaacg 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 37

gacagcactg tgttggcata 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 38

tgggtacatg gtggtaccac 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 39

agagcagtaa tctccttctg 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 40

gatcttcatg gtgctaggag 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 41

gctcaggagg agcaatgatc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 42

ccgatccaca cagagtactt 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 43

acagtgaggc caggatggag 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 44

gatccacatc tgctggaagg 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 45

actcatcgta ctcctgcttg 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 46

tagaagcact tgcggtgcac 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 47

aacgcagctc agtaacagtc 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 48

ggttttgtca aagaaagggt 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 49

ttcaccgttc cagtttttaa 20

<210> 50

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 50

atgtttgctc caaccaactg 20

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 51

tcagccacat ttgtagaact 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 52

cctgtaacca cttatttcat 20

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 53

cttttgggag ggtgagggac 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 54

cacagaagca atgctgtcac 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 55

aaaaagggag gcctcagacc 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 56

gaccaaagcc ttcatacatc 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 57

ttggtctcaa gtcagtgtac 20

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 58

gtgtaaggta aggtgtgca 19

<210> 59

<211> 1889

<212> RNA

<213> 小鼠

<220>

<221> CDS

<222> (80)...(1207)

<400> 59

cugucgaguc gcguccaccc gcgagcacag cuucuuugca gcuccuucgu ugccggucca 60

cacccgccac caguucgcc aug gau gac gau auc gcu gcg cug guc guc gac 112

Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp

1 5 10

aac ggc ucc ggc aug ugc aaa gcc ggc uuc gcg ggc gac gau gcu ccc 160

Asn Gly Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro

15 20 25

cgg gcu gua uuc ccc ucc auc gug ggc cgc ccu agg cac cag ggu gug 208

Arg Ala Val Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val

30 35 40

aug gug gga aug ggu cag aag gac ucc uau gug ggu gac gag gcc cag 256

Met Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln

45 50 55

agc aag aga ggu auc cug acc cug aag uac ccc auu gaa cau ggc auu 304

Ser Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile

60 65 70 75

guu acc aac ugg gac gac aug gag aag auc ugg cac cac acc uuc uac 352

Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr

80 85 90

aau gag cug cgu gug gcc ccu gag gag cac ccu gug cug cuc acc gag 400

Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu

95 100 105

gcc ccc cug aac ccu aag gcc aac cgu gaa aag aug acc cag auc aug 448

Ala Pro Leu Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met

110 115 120

uuu gag acc uuc aac acc cca gcc aug uac gua gcc auc cag gcu gug 496

Phe Glu Thr Phe Asn Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val

125 130 135

cug ucc cug uau gcc ucu ggu cgu acc aca ggc auu gug aug gac ucc 544

Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser

140 145 150 155

gga gac ggg guc acc cac acu gug ccc auc uac gag ggc uau gcu cuc 592

Gly Asp Gly Val Thr His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu

160 165 170

ccu cac gcc auc cug cgu cug gac cug gcu ggc cgg gac cug aca gac 640

Pro His Ala Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp

175 180 185

uac cuc aug aag auc cug acc gag cgu ggc uac agc uuc acc acc aca 688

Tyr Leu Met Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr

190 195 200

gcu gag agg gaa auc gug cgu gac auc aaa gag aag cug ugc uau guu 736

Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val

205 210 215

gcu cua gac uuc gag cag gag aug gcc acu gcc gca ucc ucu ucc ucc 784

Ala Leu Asp Phe Glu Gln Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser

220 225 230 235

cug gag aag agc uau gag cug ccu gac ggc cag guc auc acu auu ggc 832

Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly

240 245 250

aac gag cgg uuc cga ugc ccu gag gcu cuu uuc cag ccu ucc uuc uug 880

Asn Glu Arg Phe Arg Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu

255 260 265

ggu aug gaa ucc ugu ggc auc cau gaa acu aca uuc aau ucc auc aug 928

Gly Met Glu Ser Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met

270 275 280

aag ugu gac guu gac auc cgu aaa gac cuc uau gcc aac aca gug cug 976

Lys Cys Asp Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu

285 290 295

ucu ggu ggu acc acc aug uac cca ggc auu gcu gac agg aug cag aag 1024

Ser Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys

300 305 310 315

gag auu acu gcu cug gcu ccu agc acc aug aag auc aag auc auu gcu 1072

Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala

320 325 330

ccu ccu gag cgc aag uac ucu gug ugg auc ggu ggc ucc auc cug gcc 1120

Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala

335 340 345

uca cug ucc acc uuc cag cag aug ugg auc agc aag cag gag uac gau 1168

Ser Leu Ser Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp

350 355 360

gag ucc ggc ccc ucc auc gug cac cgc aag ugc uuc uag gcggacuguu 1217

Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe *

365 370 375

acugagcugc guuuuacacc cuuucuuuga caaaaccuaa cuugcgcaga aaaaaaaaaa 1277

auaagagaca acauuggcau ggcuuuguuu uuuuaaauuu uuuuuaaagu uuuuuuuuuu 1337

uuuuuuuuuu uuuuuuuuaa guuuuuuugu uuuguuuugg cgcuuuugac ucaggauuua 1397

aaaacuggaa cggugaaggc gacagcaguu gguuggagca aacauccccc aaaguucuac 1457

aaauguggcu gaggacuuug uacauuguuu uguuuuuuuu uuuuuuuggu uuugucuuuu 1517

uuuaauaguc auuccaagua uccaugaaau aagugguuac aggaaguccc ucacccuccc 1577

aaaagccacc cccacuccua agaggaggau ggucgcgucc augcccugag uccaccccgg 1637

ggaaggugac agcauugcuu cuguguaaau uauguacugc aaaaauuuuu uuaaaucuuc 1697

cgccuuaaua cuucauuuuu guuuuuaauu ucugaauggc ccaggucuga ggccucccuu 1757

uuuuuugucc ccccaacuug auguaugaag gcuuuggucu cccugggagg ggguugaggu 1817

guugaggcag ccagggcugg ccuguacacu gacuugagac caauaaaagu gcacaccuua 1877

ccuuacacaa ac 1889

<210> 60

<211> 1889

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> CDS

<222> (80)...(1207)

<220>

<223> β肌动蛋白cDNA

<400> 60

ctgtcgagtc gcgtccaccc gcgagcacag cttctttgca gctccttcgt tgccggtcca 60

cacccgccac cagttcgcc atg gat gac gat atc gct gcg ctg gtc gtc gac 112

Met Asp Asp Asp Ile Ala Ala Leu Val Val Asp

1 5 10

aac ggc tcc ggc atg tgc aaa gcc ggc ttc gcg ggc gac gat gct ccc 160

Asn Gly Ser Gly Met Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro

15 20 25

cgg gct gta ttc ccc tcc atc gtg ggc cgc cct agg cac cag ggt gtg 208

Arg Ala Val Phe Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val

30 35 40

atg gtg gga atg ggt cag aag gac tcc tat gtg ggt gac gag gcc cag 256

Met Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Glu Ala Gln

45 50 55

agc aag aga ggt atc ctg acc ctg aag tac ccc att gaa cat ggc att 304

Ser Lys Arg Gly Ile Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile

60 65 70 75

gtt acc aac tgg gac gac atg gag aag atc tgg cac cac acc ttc tac 352

Val Thr Asn Trp Asp Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr

80 85 90

aat gag ctg cgt gtg gcc cct gag gag cac cct gtg ctg ctc acc gag 400

Asn Glu Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu

95 100 105

gcc ccc ctg aac cct aag gcc aac cgt gaa aag atg acc cag atc atg 448

Ala Pro Leu Asn Pro Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met

110 115 120

ttt gag acc ttc aac acc cca gcc atg tac gta gcc atc cag gct gtg 496

Phe Glu Thr Phe Asn Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Ala Val

125 130 135

ctg tcc ctg tat gcc tct ggt cgt acc aca ggc att gtg atg gac tcc 544

Leu Ser Leu Tyr Ala Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser

140 145 150 155

gga gac ggg gtc acc cac act gtg ccc atc tac gag ggc tat gct ctc 592

Gly Asp Gly Val Thr His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu

160 165 170

cct cac gcc atc ctg cgt ctg gac ctg gct ggc cgg gac ctg aca gac 640

Pro His Ala Ile Leu Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp

175 180 185

tac ctc atg aag atc ctg acc gag cgt ggc tac agc ttc acc acc aca 688

Tyr Leu Met Lys Ile Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr

190 195 200

gct gag agg gaa atc gtg cgt gac atc aaa gag aag ctg tgc tat gtt 736

Ala Glu Arg Glu Ile Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val

205 210 215

gct cta gac ttc gag cag gag atg gcc act gcc gca tcc tct tcc tcc 784

Ala Leu Asp Phe Glu Gln Glu Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser

220 225 230 235

ctg gag aag agc tat gag ctg cct gac ggc cag gtc atc act att ggc 832

Leu Glu Lys Ser Tyr Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly

240 245 250

aac gag cgg ttc cga tgc cct gag gct ctt ttc cag cct tcc ttc ttg 880

Asn Glu Arg Phe Arg Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu

255 260 265

ggt atg gaa tcc tgt ggc atc cat gaa act aca ttc aat tcc atc atg 928

Gly Met Glu Ser Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Phe Asn Ser Ile Met

270 275 280

aag tgt gac gtt gac atc cgt aaa gac ctc tat gcc aac aca gtg ctg 976

Lys Cys Asp Val Asp Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu

285 290 295

tct ggt ggt acc acc atg tac cca ggc att gct gac agg atg cag aag 1024

Ser Gly Gly Thr Thr Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys

300 305 310 315

gag att act gct ctg gct cct agc acc atg aag atc aag atc att gct 1072

Glu Ile Thr Ala Leu Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala

320 325 330

cct cct gag cgc aag tac tct gtg tgg atc ggt ggc tcc atc ctg gcc 1120

Pro Pro Glu Arg Lys Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala

335 340 345

tca ctg tcc acc ttc cag cag atg tgg atc agc aag cag gag tac gat 1168

Ser Leu Ser Thr Phe Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp

350 355 360

gag tcc ggc ccc tcc atc gtg cac cgc aag tgc ttc tag gcggactgtt 1217

Glu Ser Gly Pro Ser Ile Val His Arg Lys Cys Phe *

365 370 375

actgagctgc gttttacacc ctttctttga caaaacctaa cttgcgcaga aaaaaaaaaa 1277

ataagagaca acattggcat ggctttgttt ttttaaattt tttttaaagt tttttttttt 1337

tttttttttt ttttttttaa gtttttttgt tttgttttgg cgcttttgac tcaggattta 1397

aaaactggaa cggtgaaggc gacagcagtt ggttggagca aacatccccc aaagttctac 1457

aaatgtggct gaggactttg tacattgttt tgtttttttt tttttttggt tttgtctttt 1517

tttaatagtc attccaagta tccatgaaat aagtggttac aggaagtccc tcaccctccc 1577

aaaagccacc cccactccta agaggaggat ggtcgcgtcc atgccctgag tccaccccgg 1637

ggaaggtgac agcattgctt ctgtgtaaat tatgtactgc aaaaattttt ttaaatcttc 1697

cgccttaata cttcattttt gtttttaatt tctgaatggc ccaggtctga ggcctccctt 1757

ttttttgtcc ccccaacttg atgtatgaag gctttggtct ccctgggagg gggttgaggt 1817

gttgaggcag ccagggctgg cctgtacact gacttgagac caataaaagt gcacacctta 1877

ccttacacaa ac 1889

Claims

1.一种用于检测至少一种靶核酸的方法，其包括使所述至少一种靶核酸与多种不同的核酸探针接触，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，所述接触在所述多种不同的核酸探针与所述至少一种靶核酸结合的条件下进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述粒子是量子点。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包括RNA。

5.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述靶核酸包括单个细胞内的单个RNA分子。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针包括5种或更多种不同的探针。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针中的每一种均具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针中的每一种均具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述多种不同的探针中的每一种均具有约30个核苷酸的长度。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，检测多种靶核酸。

11.一种核酸探针，所述核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联。

12.根据权利要求11所述的核酸探针，其中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。

13.根据权利要求12所述的核酸探针，其中，所述粒子是量子点。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的核酸探针，其中，所述至少一种可检测的组分与所述核酸探针共价连接。

15.根据权利要求11～14中任一项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针具有在约10个核苷酸和约100个核苷酸之间的长度。

16.根据权利要求11～15中任一项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针具有在约20个核苷酸和约80个核苷酸之间的长度。

17.根据权利要求11～16中任一项所述的核酸探针，其中，所述核酸探针具有约30个核苷酸的长度。

18.一种试剂盒，其包括能与至少一种靶核酸杂交的多种不同的核酸探针，其中，所述多种不同的核酸探针中的每一种均与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述至少一种可检测的组分包括具有高波长发射的粒子。

20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中，所述粒子是量子点。

21.根据权利要求18～20中任一项所述的试剂盒，其中，所述至少一种可检测的组分与所述多种不同的核酸探针中的每一种均共价连接。

22.一种用于检测多种靶核酸的方法，其包括使所述多种靶核酸与多组核酸探针接触，其中每组核酸探针均包括多种不同的核酸探针，所述多种不同的核酸探针与具有高波长发射的至少一种可检测的组分相关联，其中每组核酸探针均与不同的靶核酸杂交；并且其中，每组核酸探针均与以高波长发射的可检测的组分相关联，所述高波长发射能与和其他组核酸探针相关联的可检测的组分的高波长发射区分开；并且其中，所述接触在所述多组核酸探针与所述多种靶核酸结合的条件下进行。